一种预防动脉硬化的药物组合物及其制备方法
技术领域本发明涉及用原儿茶醛与维生素E组成的药物组合物,该药物组合物的制备的制备方法,以及该药物组合物在预防与治疗动脉硬化的医学用途。
背景技术动脉粥样硬化(Atherosclerosis)是动脉硬化中最常见而重要的类型,其特点是受累动脉的内膜有类脂质沉着,复合糖类积聚,纤维组织增生和钙沉着,并有动脉中层的病变。动脉粥样硬化主要累及大型及中型的肌弹力型动脉,以主动脉、冠状动脉及脑动脉为多见,常导致管腔闭塞或管壁破裂出血等严重后果。统计发现,最近几年动脉粥样硬化持续处在老年人群体检疾病谱的首位。老年人群动脉粥样硬化的发生,与年龄直接相关。老年人组与年轻人组的体检对照发现:31至40岁、41至50岁、51至60岁的动脉粥样硬化检出率,分别为0%、10.34%、33.57%。之后年龄越大,检出率越高。动脉粥样硬化常导致血栓形成、供血障碍等,可以引起老年人的心脑血管意外。目前,动脉硬化性疾病已经是发达国家人口死亡的主要原因,中国人患病率近年来逐渐增高。据我国的尸检统计资料,病变的总检出率、狭窄检出率和平均级别均以前降支最高,其余依次为右主干、左主干或左旋支、后降支。性别差异:20~50岁病变检出率,男性显著高于女性;60岁以后男女无明显差异。冠状动脉粥样硬化常伴发冠状动脉痉挛,痉挛可使原有的管腔狭窄程度加剧,甚至导致供血的中断,引起心肌缺血及相应的心脏病变(如心绞痛、心肌梗死等),并可成为心源性猝死的原因。
动脉粥样硬化是导致一系列心、脑血管病的基础,其形成的机理现在认为主要与“氧化的低密度脂蛋白”有关,氧化的低密度脂蛋白(Ox-LDL)是动脉粥样硬化的核心,当血液中的低密度脂蛋白(LDL)被活性氧(ROS)等自由基氧化后,就会进入血管壁,损坏血管壁的内皮细胞,并且让内皮细胞间隙变大;同时,Ox-LDL还可刺激单核细胞游走进入血管壁;部分OX-LDL可被巨噬细胞以及血管的平滑肌细胞所吞噬,形成泡沫细胞,同时Ox-LDL还可使上述两种泡沫细胞坏死崩解,形成糜粥样坏死物,导致粥样硬化斑块形成。
氧化的低密度脂蛋白(Ox-LDL)在整个动脉粥样硬化形成过程中起了核心作用,不是过去认为的“低密度脂蛋白”或者“血脂”或者“胆固醇”,如果LDL不被氧化为Ox-LDL,机体的单核细胞认为LDL是“自己人”,不会对低密度脂蛋白(LDL)进行吞噬并形成泡沫细胞,只有当低密度脂蛋白(LDL)被氧化成Ox-LDL后,才被机体的单核细胞等炎症介质认为是异己成分,并对之进行吞噬,消灭,最终形成泡沫细胞。因此防止LDL氧化为Ox-LDL是遏制动脉粥样硬化的关键所在,而不是我们常规理解的降低胆固醇、降低血脂、降低低密度脂蛋白(LDL)等。
维生素E是目前较为公认的抗氧化剂,70多年前,研究人员发现,用酸败的菜油喂养大鼠,可引起大鼠不育,而正常的菜油则不会,由此发现了一种与生殖有关的维生素,即维生素E,又叫做生育酚。10多年后,科学家确定了维生素E的分子结构,不久还合成了该维生素。随着研究的深入,发现维生素E还有抗氧化作用,促进神经系统发育等作用。维生素E的抗氧化作用已经被反复证明,其可对抗人体内产生的过氧化物——自由基,对动脉硬化的防治已及抗癌、抗衰老有积极作用。
维生素E是生物膜上的主要抗氧化剂,自由基是广泛存在于各种化学反应中的活泼基团,对人体正常生理代谢具有重要的功能。倘若自由基过量,从而引起自由基链式反应,则将导致细胞膜不饱和脂肪酸的脂质过氧化,新产生的大量脂质过氧化物会损伤细胞膜及细胞内的大分子蛋白质与核酸,对机体造成损伤。维生素E的抗自由基功能是由于其自身结构是一种苯骈吡喃的衍生物,在其苯环上有一个活泼的羟基,具有还原性,其次在五碳环上有一饱和的侧链,这两点决定了维生素E具有还原性和亲脂性。当自由基进入脂相,发生链式反应时,维生素E起到捕捉自由基作用。维生素E对抗自由基脂质过氧化作用的效率很高。它与细胞膜上的混合氧化酶系统的蛋白质接触时,同这个酶系统所生成的自由基作用,生成一种相对稳定的维生素E自由基,阻断脂质过氧化的自由基链式反应,从而保护细胞膜上的不饱和脂肪酸免受自由基的攻击,维持细胞膜的完整性。维生素E抑制低密度脂蛋白(LDL)氧化修饰,延缓动脉粥样硬化的发生。血浆中的LDL是心脏病的危险因子,LDL被氧化修饰后,被吞噬细胞以不规则方式吞噬,转化为泡沫细胞,泡沫细胞是动脉硬化脂纹的标志。补充维生素E,LDL的修饰作用减弱,动脉硬化的发病率下降。当维生素E缺乏时,细胞膜的通透性障碍,电子显微镜观察到心脏、肌肉线粒体膜破裂,细胞损伤,这些损害导致细胞凋亡加速,衰老速度加快,血管细胞损伤则是动脉硬化的病理基础。
现已证明,维生素E具有下述药理作用:
1.促进垂体促性腺激素的分泌,促进精子的生成和活动,增加卵巢功能,卵泡增加,黄体细胞增大并增强孕酮的作用。缺乏时生殖器官受损不易受精或引起习惯性流产。
2.改善脂质代谢,缺乏时导致血浆胆固醇(TC)与甘油三脂(TG)的升高,形成动脉粥样硬化。
3.对氧敏感,易被氧化,故可保护其他易被氧化的物质,如不饱和脂肪酸,维生素A和ATP等。减少过氧化脂质的生成,保护机体细胞免受自由基的毒害,充分发挥被保护物质的特定生理功能。
4.稳定细胞膜和细胞内脂类部分,减低红细胞脆性,防止溶血。缺乏时出现溶血性贫血。
5.大剂量可促进毛细血管及小血管的增生,改善周围循环。
临床常用于:抗氧化,保护机体细胞免受自由基的毒害;改善脂质代谢,预防冠心病、动脉粥样硬化;抗衰老和抗癌,预防器质性衰退疾病;预防炎症性皮肤病、脱发症;改善性冷淡、月经不调、不孕;改善血液循环、保护组织、降低胆固醇、预防高血压;防止血液的凝固,减少斑纹组织的产生;预防与治疗静脉曲张;保护红血球使之不容易破裂,预防溶血性贫血等。
但大剂量服用维生素E也可以造成不良反应,有研究报告,长期服用大剂量维生素E可引起各种疾病。其中较严重的有:血栓性静脉炎或肺栓塞,或两者同时发生,这是由于大剂量维生素E可引起血小板聚集和形成;血压升高,停药后血压可以降低或恢复正常;男女两性均可出现乳房肥大、头痛、头晕、眩晕、视力模糊、肌肉衰弱、皮肤豁裂、唇炎、口角炎、荨麻疹;糖尿病或心绞痛症状明显加重;激素代谢紊乱,凝血酶原降低;血中胆固醇和甘油三酯水平升高;血小板增加与活力增加及免疫功能减退。成人服用相对大剂量的维生素E(右旋-α-生育酚400~800mg/d)经年累月而无任何明显损害。服用800~3200mg/d者,偶尔会出现肌肉衰弱,疲劳,呕吐和腹泻.维生素E>1000mg/d时的最明显的毒性作用是对维生素K作用的拮抗并增强了口服香豆素抗凝剂的作用,此可导致明显的出血。
原儿茶醛能改善微循环,抑制二磷酸腺苷所致的血小板凝集和血栓形成,并能使血液粘度下降。可以预防维生素E引起血小板聚集和形成的不良反应。原儿茶醛为中药丹参的水溶性有效成分之一,英文名称(Protocatechuic aldehyde),化学名为Benzaldehyde,3,4-dihydroxy-,3,4-二羟基苯甲醛;其物理性质为淡米色针状结晶(水或甲苯)或灰白色粉末,双晶形。熔点(m.p.)153℃~154℃。K=2.8×10-8(25℃)。易溶于乙醇、丙酮、醋酸乙酯、乙醚和热水,溶于冷水,不溶于苯和氯仿。在水中的溶解度(g/100ml):5(20℃);33(99℃);在乙醇中的溶解度:79(78℃)。有引湿性,在水中易氧化变色。分子式C7H6O3,相对分子量138.12。药用的原儿茶醛主要从中药丹参提取,也有从冬青科植物四季青的叶中提取。原儿茶醛的主要药理作用有:
1.扩张冠状动脉,增加冠脉血流量作用:原儿茶醛对心血管系统可增加冠脉流量、降低心肌兴奋性和传导性,对急性心肌缺血缺氧所致的心肌损伤具有明显保护作用。
2.对心脏和外周血管的作用:研究表明,丹参水溶性成分原儿茶醛扩张心脑血管作用较二萜醌类的丹参酮更强,是抗心肌缺血的主要成分。
3.抑制血小板聚集作用:原儿茶醛能改善微循环,抑制二磷酸腺苷所致的血小板凝集和血栓形成,并能使血液粘度下降。原儿茶醛对胶原诱导的血小板聚集有抑制作用。
4.具有广谱抗菌抗炎作用:原儿茶醛是老头草治疗肾炎的主要有效成分之一。
5.抗氧化作用:从丹参水溶性部分分离出的7种酚酸类化合物:丹酚酸A、丹酚酸B、原儿茶醛、原儿茶酸、丹参素、咖啡酸及迷迭香酸,对生物膜的过氧化损伤均有很强的保护作用,体外有抑制TNF-a诱导的白细胞与血管内皮细胞黏附,有抑制血管内皮细胞黏附分子ICAM-1、VCAM-1表达的作用。
6.钙拮抗作用:原儿茶醛与丹参素有降低成人红细胞胞浆Ca2+浓度的作用,并表现出剂量依赖性,二者合并用药,药效相加,作用与丹参注射液相似,是丹参注射液钙拮抗作用的主要有效成分。
7.修复受损静脉瓣膜,治疗静脉曲张:原儿茶醛能有效降低组织器官的纤维化、溶解血纤维蛋白,促进纤维化的细胞再生、修复受损静脉瓣膜,从而有效地防上血液的倒流、治愈静脉曲张;
8.其他作用:对脑组织缺血、再灌注损伤有保护作用;可增强耐缺氧能力改善肾功能。
发明内容本发明提出用具有抗氧化作用的维生素E和原儿茶醛两个药组成高效低毒的预防和治疗动脉硬化的药物组合物,两药合用,维生素E与细胞膜上的混合氧化酶系统的蛋白质接触时,同这个酶系统所生成的自由基作用,生成一种相对稳定的维生素E自由基,阻断脂质过氧化的自由基链式反应,从而保护细胞膜上的不饱和脂肪酸免受自由基的攻击,维持细胞膜的完整性,维生素E还能抑制低密度脂蛋白(LDL)氧化修饰,延缓动脉粥样硬化的发生。原儿茶醛可通过抑制TNF-a诱导的白细胞与血管内皮细胞黏附,抑制血管内皮细胞黏附分子ICAM-1、VCAM-1表达的作用对生物膜的过氧化损伤有很强的保护作用,帮助已经损失的生物膜得到修复。由于这两个药的作用环节不同,可使该药物组合物的抗氧化作用增强,疗效更显著;此外,长期服用大剂量维生素E可引起血小板聚集,导致血栓性静脉炎或肺栓塞,还有乳房肥大、头痛、头晕、眩晕、视力模糊、肌肉衰弱、皮肤豁裂、唇炎、口角炎、荨麻疹;糖尿病或心绞痛症状明显加重;激素代谢紊乱,凝血酶原降低;血中胆固醇和甘油三酯水平升高;血小板增加与活力增加及免疫功能减退,原儿茶醛能抑制二磷酸腺苷所致的血小板凝集和血栓形成,并能使血液粘度下降,对胶原诱导的血小板聚集有抑制作用,可以减少或取消维生素E导致血栓性静脉炎或肺栓塞等不良反应。据此,我们提出了维生素E与原儿茶醛组成抗动脉硬化的药物组合物的研究的理论和思路,我们研究发现维生素E与原儿茶醛组成的复方制剂,维生素E与原儿茶醛的药物配比以1~3∶1较好,其最佳的配比是2∶1。
本发明提出的一组防治动脉硬化的药物组合物的制备工艺,是指以原儿茶醛与维生素E两种药物进行配伍,加上药剂学方面的辅料,制成供临床应用片剂,软胶囊剂,颗粒剂,冲剂,口服液,注射剂,其主要制备工艺如下:
1.软脉片剂的制备方法
配方:维生素E100g,原儿茶醛50g,磷酸氢钙185g,淀粉100g,95%乙醇500ml,15%淀粉浆适量,5%三硅酸镁7.5g,3%微晶纤维素7.5g。
制备方法:将100g维生素E溶于500ml95%乙醇,按等量递增法与磷酸氢钙充分混匀,取50g原儿茶醛用研钵研磨成粉,过80目筛,加100g淀粉搅拌均匀,以15%淀粉浆适量制软材,14目筛网制粒,40℃以下通风干燥,12目筛网整粒,整粒后的颗粒与7.5g三硅酸镁、7.5g微晶纤维素混匀后压片。
本处方共制成1000片,每片含维生素E100mg,原儿茶醛50mg,临床应用为每天3次,每次1~2片。
本配方还可按目前其他片剂生产工艺制备。
2.软脉软胶囊的制备方法
配方:维生素E100g,原儿茶醛50g,明胶485g,甘油190ml,姜黄素3.85g,水400ml,大豆油400ml,蜂蜡30g,卵磷脂3.85g。
制备方法:(1)将30g蜂蜡加入400ml大豆油中,加热熔化,稍冷,加入卵磷脂,取等量维生素E与含蜂蜡与卵磷脂的大豆油,搅拌使混合均匀,加入剩余含蜂蜡与卵磷脂的大豆油混合均匀,再将此油相倒入盛有处方量的原儿茶醛的研钵中,边倒边研,使原儿茶醛均匀分散在油相中,抽真空脱尽气泡:在真空度-0.1Mpa以下和温度90-100℃左右进行2小时脱气。
(2)称取处方量的明胶和甘油、明胶、水,以及处方量的姜黄素,明胶先用约80%水浸泡使其充分溶胀后,将剩余的水与甘油混合,置煮胶锅中加热70℃,加入明胶液,搅拌使之完全熔融均匀约1-1.5h,加入姜黄色素,搅拌使混合均匀,放冷,保温60℃静置,除去上浮的泡沫,虑过,测定胶液粘度,使胶液粘度约为40mps-1左右。
(3)制片压丸:将上述胶液放入保温箱内,温度保持在80-90℃之间,机压制胶片,将合成及格的胶片及内容物药液通过自动旋转制囊机压制成软胶囊,自动旋转制囊机生产过程中,控制压丸温度35-40℃,滚膜转速3转/分左右,控制室内温度为20-25℃,空气相对湿度40%以下。
(4)定形及整形:将压制成的软胶囊在网机内20℃下吹风定形,待定形4小时后,并整形。
(5)洗擦丸:用乙醇在洗擦丸机种洗去胶囊表面油层,吹干洗液。
(6)干燥晾丸:将已经乙醇洗涤后的软胶囊于网机内吹干约6小时
(7)拣丸:将干燥后的软降囊进行人工拣丸或机械拣丸,拣去大小丸,异性丸、明显网印丸、漏丸,瘪丸,薄壁丸,气泡丸等,将合格的软胶囊放入洁净干燥的容器中,称量
(8)检验、包装
制成1000颗,每颗含维生素E100mg,原儿茶醛50mg。
本配方还可按目前其他软胶囊生产工艺制备。
3、软脉颗粒剂的制备方法
配方:维生素E100g,原儿茶醛50g,磷酸氢钙,13.3kg,95%乙醇8.21,糊精7.7kg,15%淀粉浆适量。
制备工艺:将处方量的维生素E溶于95%乙醇中,按等量递增法与磷酸氢钙充分混匀,取处方量的原儿茶醛用研钵研磨成粉,加糊精搅拌均匀,以15%淀粉浆适量制成软材,16目筛网制粒,40℃以下通风干燥,12目筛网整粒,共制成颗粒剂1000包,每包含维生素E100mg,原儿茶醛50mg。
本配方还可按目前其他颗粒剂生产工艺制备。
4、软脉静脉注射乳剂的制备方法
配方:维生素E20g,原儿茶醛10g,大豆卵磷脂3.0g,乳化剂F688.66g,注射用大豆油30ml,1,2-丙二醇77ml,注射用水266ml。
制备方法:将处方量的维生素E、注射用大豆油、大豆卵磷脂、F68放进干燥乳钵中,充分研磨均匀,制得油相,将处方量的原儿茶醛、1,2-丙二醇与注射用水放进烧杯超声溶解,混合均匀得到水相。
将水相缓缓滴加入油相中,并于高速搅拌30min制得初乳,350W超声2.5min并过纳米机循环6次,充氮气熔封于安瓶中,100℃灭菌15min。
制成400支,规格:1ml/支,维生素E50mg,原儿茶醛25mg/ml。
本配方还可按目前其他注射剂生产工艺制备。
本发明还可将维生素E和原儿茶醛按2∶1的配方比例,按传统工艺制备为冲剂,口服液,注射剂及其他可用于临床的制剂。
本发明的维生素E和原儿茶醛的配方比例,维生素E的比例可以在0.5~5∶1的范围,较好的比例是1~3∶1;最佳比例是2∶1。
实施例一
为观察本发明由原儿茶醛与维生素E两药组成的“软脉1号”制剂软化血管的作用,本研究采用超生理剂量VitaminD3联合高脂乳剂的方法建立小鼠动脉钙化模型,以胸主动脉肉眼观察与胸主动脉HE病理切片观察,以及血脂、红细胞和血红蛋白的变化为指标,评价“软脉1号”制剂对超生理剂量VitaminD3联合高脂乳剂所致小鼠动脉钙化的药理作用。
(一)材料与方法
1.1药物,“软脉1号”制剂:按本发明的制备工艺制备,每100ml含维生素E400mg、原儿茶醛200mg。普伐他汀钠片(中美上海施贵宝制药有限公司),胆固醇(国药集团化学试剂有限公司),丙基硫氧嘧啶片(广东华南药业集团有限公司),吐温-80(天津市大茂化学试剂厂),1,2-丙二醇(上海阳光生物技术有限公司),胆酸钠(郑州市程达化工产品有限公司),血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-c)、高密度脂蛋白(HDL-c)试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司),高脂乳剂:称取胆固醇50g、胆酸钠10g分别加到1,2丙二醇200ml中充分混匀,与吐温-8050ml、丙基硫氧嘧啶5g充分混匀,最后加猪油500g充分混合。
1.2动物分组与给药40只3月龄清洁级KM小鼠,雌雄各半,由广东医学院实验动物中心提供。动物适应性喂养1周后随机分成4组,分别为正常对照组、VitaminD3+高脂乳剂模型组、普伐他汀钠组和“软脉1号”制剂组。动物分组当天定为第1天,分别在第1、2、3天连续灌胃给予模型组、普伐他汀钠组、“软脉1号”制剂组VitaminD340万U/kg-1.d-1,正常组灌胃给予等量蒸馏水。实验第4天开始给药,每天一次,除正常组外,其余各组先给予预防药灌胃,再给予高脂乳剂灌胃,正常组给予等量蒸馏水灌胃,灌胃剂量均为0.1ml/10g。普伐他汀组给药剂量为10mg/kg-1.d-1,“软脉1号”制剂组给药剂量为0.1ml/10g。实验全程自由饮食,实验周期为6周。
1.3取材及指标检测实验结束后,眼球取血处死小鼠,剥离沿心脏至髂总动脉分支处全长动脉,立即用10%中性磷酸福尔马林固定24h。肉眼观察血管外壁后,取出修整血管,沿主动脉弓左锁骨下动脉分支下行约0.5cm处,切取长约1cm的胸主动脉投入70%乙醇,按照下述顺序进行脱水、透明和包埋:80%乙醇12h,95%乙醇(I)1.5h,95%乙醇(II)1.5h,100%(I)0.5h,100%(II)0.5h,二甲苯10min,浸蜡(I)1.5h,浸蜡(II)1.5h,包埋,修整蜡块,取管腔横切面连续切片(4um),展于载玻片上,烤箱60℃烤30min,再行HE染色,中性树胶封片,镜下观察胸主动脉的形态学变化。血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-c)、高密度脂蛋白(HDL-c)按试剂盒说明书步骤检测。全血半自动测定仪测定红细胞数(RBC)、血红蛋白(HGB)和平均红细胞血红蛋白(MCH)含量。
1.4统计学处理采用spass统计分析软件进行统计学分析处理,数据以表示,采用单因素方差分析方法处理数据。
(二)结果
2.1胸主动脉肉眼观察与组织学观察
2.1.1胸主动脉的肉眼观察正常对照组胸主动脉血管外壁光滑,呈淡粉色半透明状,柔软而富有弹性,触之光滑无沙粒感,管壁厚度均匀。模型组胸主动脉血管外壁凹凸不平,团块状灰白色突起弥漫性分布,管壁僵硬易断,触之有沙粒感,管壁厚薄不均。普伐他汀钠组胸主动脉血管外壁凹凸不平,团块状灰白色突起弥漫性分布,有沙粒感,管壁厚薄不均。“软脉1号”制剂组比模型组有所改善,胸主动脉血管外壁凹凸不平减轻,团块状灰白色突起弥漫性分布减少,有沙粒感,管壁厚薄比较均匀。
2.1.2胸主动脉的镜下观察正常组观察可见胸主动脉血管壁结构清晰,血管内中外膜分界清楚,内皮细胞完整、突向管腔排布,内弹性膜与中层弹性纤维均呈粉染、清晰,波浪状走向,弹性纤维间平滑肌细胞呈梭形,排列整齐而均匀,管壁无黑色钙质沉积,内外弹性膜结构完整。模型组观察可见胸主动脉血管内皮细胞消失,有大量黑色钙质沉积于中层弹性纤维中,管壁弹性纤维间距扩大,弹性纤维结构模糊、分辨不清,走向变直,部分断裂,平滑肌细胞坏死消失,内外弹性膜结构不完整。普伐他汀钠组可见胸主动脉少量血管内皮细胞凸向管腔,内弹性膜与中层弹性纤维分界不清,弹性纤维间平滑肌细胞数量减少且排列混乱,弹性纤维间距增大,可见呈波浪状的弹性纤维变直或断裂,有大量黑色钙质沉积于中层弹性纤维中。“软脉1号”制剂组观察可见胸主动脉较多血管内皮细胞凸向管腔,内弹性膜与中层弹性纤维均呈粉染、清晰,弹性纤维间平滑肌细胞数量增多且排列比较整齐,弹性纤维间距减少,可见呈波浪状的弹性纤维,黑色钙质在弹性纤维中沉积较少。
2.1.3荧光显微镜观察正常对照组观察可见胸主动脉血管内外弹性膜和弹性纤维均呈波浪状,完整,结构清晰可见。模型组观察可见胸主动脉血管内外弹性膜模糊不清,弹性纤维间距扩大,波浪状的弹性纤维变平变直甚至断裂,结构模糊不清。普伐他汀钠组观察可见胸主动脉血管内外弹性膜模糊不清,弹性纤维呈变直、断裂或消失。“软脉1号”制剂组观察可见胸主动脉内外弹性膜和弹性纤维呈波浪状且清晰可见。
2.2小鼠血清血脂含量的测定
各组小鼠血清血脂含量检测结果见表1:
表1各组小鼠血脂含量检测结果比较
与正常组比较,*p<0.05;与模型组比较,^p<0.05;与普伐他汀组比较,※p<0.05
从表1结果可见,与正常组比较,模型组TC和HDL-c升高(p<0.05),与模型组比较,“软脉1号”制剂组TC降低(p<0.05)。与普伐他汀钠组比较,“软脉1号”制剂组LDL-c降低(p<0.05)。
2.3小鼠红细胞与血红蛋白的检测
对小鼠红细胞与血红蛋白检测的结果见表2:
表2各组小鼠红细胞与血红蛋白检测结果比较
与正常组比较,*p<0.05;与模型组比较,^p<0.05;与普伐他汀钠组比较,※p<0.05
从表2结果可见,与正常组比较,模型组HGB和MCH含量降低(p<0.05)。与模型组比较,“软脉1号”制剂组HGB、MCH含量升高(p<0.05)。
(三)讨论
3.1用超生理剂量维生素D3联合高脂乳剂方法可致小鼠胸主动脉产生钙化
本实验用超生理剂量维生素D3联合高脂乳剂方法给药6周后,肉眼观察模型组小鼠胸主动脉血管外壁凹凸不平,团块状灰白色突起弥漫性分布,管壁僵硬易断,触之有沙粒感,管壁厚薄不均。高倍镜下观察可见胸主动脉血管内皮细胞消失,有大量黑色钙质沉积于中层弹性纤维中,管壁弹性纤维间距扩大,弹性纤维结构模糊、分辨不清,平滑肌细胞坏死消失,内外膜结构不完整。在荧光显微镜下观察可见胸主动脉弹性纤维间距扩大,波浪状的弹性纤维变平变直甚至断裂,结构模糊不清,提示采用超生理剂量维生素D3联合高脂乳剂方法确实可以造成小鼠动脉出现钙化的表现。本实验用超生理剂量维生素D3联合高脂乳剂能升高小鼠血清TC和HDL-c(p<0.05),降低HGB和MCH含量(p<0.05),提示了超生理剂量维生素D3联合高脂乳剂可引起高胆固醇血症,降低血红蛋白含量,导致红细胞携氧能力降低,减少氧供,这与血管内皮细胞损伤从而导致动脉钙化的发生有密切关系,而HDL-c升高可能是为了清除血清过多的胆固醇酯,而对高胆固醇膳食的一种代偿性反应。
动脉钙化的形成过程是一个与骨发育相似的主动的、高度可调控的多病因、多途径、多种机制参与的复杂生物学过程。我们研究发现用动物油和维生素D3联合诱导小鼠动脉钙化可能是以软骨内成骨的方式进行,提示动脉钙化和骨质疏松存在密切关系。骨组织中参与骨代谢的成骨细胞和破骨细胞在血管中均存在相应的细胞与之相对应而且这两种相似组织的矿化作用正好相反,提示血管钙化和骨质疏松可能存在着十分相似甚至相同的病因和调节机制。目前研究表明动脉钙化与氧化应激、炎症、细胞凋亡、骨调节蛋白表达异常、高钙血症、高磷血症、脂蛋白代谢紊乱等机制均有关系。维生素D为固醇类衍生物,通过与维生素D受体结合,调节骨和钙磷代谢,是一种骨代谢调节因子。研究发现维生素D3与动脉钙化关系密切,涉及多种机制,包括复杂的系统生理学、骨-血管-肾-内分泌轴,引起血管内皮细胞的损伤和血管平滑肌细胞的增殖。正常治疗剂量维生素D3不会造成动脉钙化,但超过正常剂量的维生素D3即可诱导动脉钙化的表现,所以维生素D3广泛应用于建立动物动脉钙化模型的研究。高脂饮食能引起小鼠氧化应激和脂质代谢紊乱,导致血管内皮细胞损伤和平滑肌细胞增殖,可加重动脉钙化的程度。
3.2普伐他汀钠对血管钙化的影响
肉眼观察普伐他汀钠组胸主动脉血管外壁凹凸不平,团块状灰白色突起弥漫性分布有沙粒感,管壁厚薄不均。高倍镜下观察可见胸主动脉少量血管内皮细胞凸向管腔,内弹性膜与中层弹性纤维分界不清,弹性纤维间平滑肌细胞数量减少且排列混乱,弹性纤维间距增大,可见呈波浪状的弹性纤维变直或断裂,有大量黑色钙质沉积于中层弹性纤维中。荧光显微镜下观察可见胸主动脉弹性纤维呈变直、断裂和消失,提示普伐他汀钠对血管钙化并无明显改善作用。与模型组比较,普伐他汀钠对CHO、LDL-c、HDL-c、RBC、HGB、MCH均无统计学意义,提示普伐他汀钠此剂量不能通过降血脂作用和提高红细胞携氧能力来减轻血管钙化。
3.3“软脉1号”制剂对血管钙化有减轻作用
肉眼观察“软脉1号”制剂胸主动脉血管病变比模型组有所改善,血管外壁凹凸不平减轻,团块状灰白色突起弥漫性分布减少。高倍镜下观察可见胸主动脉较多血管内皮细胞凸向管腔,内弹性膜与中层弹性纤维均呈粉染、清晰,弹性纤维间平滑肌细胞数量增多且排列比较整齐,弹性纤维间距减少,可见呈波浪状的弹性纤维,黑色钙质在弹性纤维中沉积较少。荧光显微镜下观察可见胸主动脉弹性纤维呈波浪状且清晰可见,提示“软脉1号”制剂能改善血管钙化。与模型组比较,“软脉1号”制剂组能降低CHO(p<0.05),升高HGB、MCH含量(p<0.05),提示“软脉1号”制剂可能通过降血脂、提高氧供来减轻血管钙化。与普伐他汀钠组比较,“软脉1号”制剂组不仅能明显地减轻胸主动脉动脉钙化程度而且能降低血清LDL-c(p<0.05),提示“软脉1号”制剂比普伐他汀钠更能预防血管钙化的发生发展。
结论:“软脉1号”制剂对超生理剂量维生素D3联合高脂乳剂造成的小鼠血管钙化具有预防作用。