CN104107422A - 重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂的注射用药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含有重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂的注射用药物组合物，其中重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂由大肠杆菌表达纯化制得，具有如SeqIDNo.2所示的序列，注射用药物组合物含有重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲盐及多元醇。本发明进一步涉及含有重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂的注射液及冻干粉针剂。本发明涉及的重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂注射用药物组合物具有安全、稳定、便于运输及存放等优点，适于工业化生产。

Description

重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂的注射用药物组合物

技术领域

本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂的注射用药物组合物。

背景技术

天然的胰高血糖素样肽-1受体激动剂（Exendin-4）是南美洲大毒蜥的唾液中分离出来的一种由39个氨基酸残基组成的生物活性多肽（Eng，J等，J.Biol.Chem.，267:7402-05，1992）。其氨基酸序列如下[SEQ.ID.NO.1]：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH₂。

Exendin-4与人体内的胰高血糖素样肽-1（GLP-1）有53％的同源性（Goke等，J.Biol Chem.，268: 19650-55，1993），研究发现，Exendin-4在动物和人体内产生与GLP-1相似的生物学活性，并且Exendin-4的作用时间较GLP-1明显延长 （Eng J.，exendin-4对db/db小鼠高血糖的作用延长，Diabetes，45(增刊2): 152A(摘要554)，1996），显示出促胰岛素活性，US5424286提出Exendin-4用于治疗糖尿病及防止高血糖的用途。

安米林公司和礼来公司合作开发了化学合成的Exendin-4注射液，2005年FDA批准其在美国上市，商品名为Byetta，用于对单独使用二甲双胍、磺脲类药物或二甲双胍和磺脲类药物联用治疗未能获得良好控制的 II型糖尿病。

重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂（rExendin-4，简写为rE4）是利用基因工程手段生产的多肽，分子量为4187Da，其氨基酸序列如下[SEQ.ID.NO.2]：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser。

利用基因工程技术制备重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂（rE4）可以满足规模化大生产的需求，同时可以极大程度的降低成本，CN1693459、CN1635117、CN1455001、CN102618552A等申请均公开了利用基因工程技术制备rE4的方法，该方法具有操作简单、成本低廉、环境友好等优点。

基因工程技术生产rE4可能残留大肠杆菌菌体蛋白等杂蛋白及外源残留DNA，rE4制剂的稳定性受到以上因素影响，不同于化学合成法制备E4的制剂。现有技术中的E4制剂组方不能满足rE4制剂的稳定性、安全性等需求。注射液具有使用方便等优点；冻干粉针剂具有易于运输、储存等优点，稳定性较好；均可作为rE4的剂型进行研究开发。

安米林药品公司的专利CN1384755A公开了一种药用制剂，它包含exendin或exendin激动剂肽，缓冲剂、等重量克分子渗透浓度调节剂，所述药用制剂的pH为约3.0-7.0。液体和冻干多剂量制剂还包含0.005%-1.0%的防腐剂，该防腐剂选自间甲酚、酚、苄醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯，缓冲剂为醋酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐或谷氨酸盐。等重量克分子渗透剂为碳水化合物或多元醇，碳水化合物选自半乳糖、阿拉伯糖和乳糖，多元醇选自山梨醇、甘露醇、肌醇、甘油、木糖醇和聚乙二醇。该专利的药物制剂含有防腐剂，将该专利组方应用于重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂制剂，其注射液放置时偶见rE4聚集并原纤化，从而在若干小时可变粘或混浊，因而变得不适于注射。而将其制备为冻干剂时，辅料或防腐剂可能与杂蛋白或外源DNA发生物理化学反应，随后在溶于水形成注射液的过程中发生沉淀，影响制剂稳定性。

CN101444618A公开了一种含有艾塞那肽的药物制剂，其特征在于：所述的药物制剂含有艾塞那肽、能够维持制剂在水溶液状态下pH值为3.0-7.0的缓冲液及增强艾塞那肽稳定性的辅料，所述的辅料可任选自葡萄糖、蔗糖、甲硫氨酸、甘露醇或甘氨酸的一种或几种。所述缓冲液可任选自磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、巴比妥缓冲液或柠檬酸缓冲液。可制备成为冻干粉针剂。该方案侧重低剂量E4制剂，且在研究中发现，其所用辅料应用于rE4制剂时偶见析出沉淀的现象，影响制剂稳定性。

发明内容

利用基因工程技术制备重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂（rE4）的方法具有操作简单、成本低廉、环境友好等优点，可以广泛的应用在rE4的工业化大生产当中。由于基因工程技术制备的rE4中杂质组分与化学合成的艾塞那肽不同，大肠杆菌表达的rE4产品经纯化后可能存在少量杂蛋白、外源残留DNA，影响制剂稳定性。现有技术的含有艾塞那肽的药物制剂不能够满足重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂制剂安全性、稳定性的需求，从而限制了rE4相关制剂的上市。

本发明的发明人通过大量的试验，尝试各种缓冲体系及共溶剂处方，筛选了一种适用于大肠杆菌表达的重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂（rE4）的注射用药物组合物，该组合物具有良好的安全性和稳定性，适于规模生产和后期储存运输。

本发明提供一种含有重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂的注射用药物组合物，其中重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂由大肠杆菌表达纯化制得，具有如Seq ID No.2所示的序列，其特征在于含有重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲盐及多元醇。

生物制品一般具有复杂的结构，需要选择合适的缓冲体系，并严格控制缓冲液的pH值，确保生物制品的浓度、纯度及活性不会因为外界环境的变化而发生改变。本发明的发明人在研究初期分别对大量的缓冲体系进行了筛选，通过大量稳定性试验发现，柠檬酸缓冲体系能够较大程度的保持rE4的稳定性。

本发明所述注射用药物组合物在配置过程中柠檬酸-柠檬酸钠缓冲盐浓度可选10~30mM，优选20mM。

本发明的发明人在研究中发现，柠檬酸缓冲盐浓度对于rE4注射用药物组合物的稳定性亦具有一定影响，通过缓冲盐浓度试验，证实缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，浓度为20mM时rE4药物组合物在溶液状态下的稳定性得到最优化。

本发明所述注射用药物组合物中多元醇为山梨醇、甘露醇中的一种或其组合。

糖类、多元醇、氨基酸及其衍生物、无机盐、甘油、多聚物如聚乙二醇(PEG)等一般被称为蛋白质的共溶剂（分离纯化中蛋白质的不稳定性及其对策，冯小黎等，生物工程进展，2000，Vol.20，67~71）。糖和多元醇可以增加蛋白质药物在水中的稳定性，常用的糖类包括蔗糖、葡萄糖、海藻糖和麦芽糖，而常用的多元醇有甘油、甘露醇、山梨醇、PEG和肌醇等。一些氨基酸如甘氨酸、精氨酸、天冬氨酸和谷氨胺酰等，可以增加蛋白质药物在给定pH下的溶解度，并可提高其稳定性，亦可作为多肽类药物的稳定剂。本发明的发明人发现多元醇的加入能够提高rE4的稳定性，大量试验发现山梨醇或甘露醇的加入可以提高rE4注射液的稳定性；同时，山梨醇或甘露醇的加入可以防止温度升高或冻干复溶过程中rE4的变性。

本发明的发明人在研究过程中对缓冲体系-共溶剂（糖类、多元醇、氨基酸）进行了正交试验，结果证实使用柠檬酸缓冲体系及山梨醇或甘露醇作为共溶剂的注射用药物组合物可以最大程度保持rE4制剂的稳定性。

本发明提供一种含有重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂的注射用药物组合物，所述注射用药物组合物为注射液，该注射液由以下组分组成：

组分 含量

重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂 100~300份

柠檬酸 860~4130份

柠檬酸钠 1020~5210份

多元醇 10000~50000份

注射用无菌水 适量；

优选地，该注射液由以下组分组成：

组分 含量

重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂 250份

柠檬酸 1160份

柠檬酸钠 4260份

多元醇 30000份

注射用无菌水 适量。

具体实施过程中，本发明提供的注射剂可以由以下组份组成：

；

具体实施过程中，优选地，该注射液可以由以下组分组成：

；

以上具体实施方案不应对本发明的范围构成限制。

本发明的发明人对制剂中rE4的含量进行了研究，发现rE4浓度过高或过低均会造成蛋白结晶、析出沉淀，影响rE4稳定性及生物学活性。

本发明所述的注射液，其pH为4.0~6.0，优选5.0~5.8；进一步优选为5.6。

本发明的发明人在研究中发现，柠檬酸缓冲盐浓度及pH对于rE4注射液的稳定性亦具有一定影响，通过pH试验，证实缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲盐，pH在4.0~6.0时，注射液稳定性良好；pH在5.0~5.8时，注射液稳定性较好；pH为5.6时注射液的稳定性得到最优化。

本发明所述的注射液，其中还可以含有防腐剂，防腐剂为苯酚2000-3000份，浓度为0.2~0.3%（重量/溶液体积，w/v）；优选的为2500份，浓度为0.25%。

本发明还提供一种含有重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂的注射用药物组合物，所述注射用药物组合物为冻干粉针剂，每支冻干粉针剂由以下组分组成：

组分 含量

重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂 50~200份

柠檬酸 862~4129份

柠檬酸钠 1015~5206份

多元醇 10000~50000份；

优选地，每支冻干粉针剂由以下组分组成：

组分 含量

重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂 120份

柠檬酸 2450份

柠檬酸钠 2360份

多元醇 30000份。

具体实施过程中，本发明提供的冻干粉针剂可以由以下组分组成：

；

具体实施过程中，优选地，该冻干粉针剂由以下组分组成：

；

以上具体实施方案不应对本发明的范围构成限制。

本发明提供的冻干粉针剂在溶液状态下pH为4.0~6.0，优选4.5~5.5。

本发明的发明人在研究中发现，柠檬酸缓冲盐浓度及pH对于rE4冻干粉针剂在冻干-复溶过程中的稳定性亦具有一定影响，通过缓冲盐浓度试验及pH试验，证实缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲盐，在配制溶液过程中，柠檬酸缓冲盐浓度为20mM，pH在4.0~6.0时，冻干-复溶的过程中rE4浓度及生物学活性不改变；在pH4.5~5.5的柠檬酸缓冲液中稳定性最优，冻干-复溶及长期存放均不会影响制剂稳定性。

本发明的发明人在实验过程中发现，防腐剂可能与rE4原液中存在的外源残留DNA或杂蛋白产生相互作用，因而对rE4制剂在冻干-复溶过程中的稳定性存在一定影响。冻干时不加入防腐剂可避免rE4制剂冻干-复溶过程产生结晶或沉淀。使用时如需短期保存，则可在复溶时选择将冻干粉溶于含有防腐剂的注射用水。

使用该制备方法制得的rE4冻干粉针剂，rE4稳定无变性，长期放置性状无改变，复溶为注射液过程中无蛋白沉淀，注射液蛋白含量无变化、生物学活性无明显改变，符合制剂相关要求。使用时可将该冻干粉溶于无菌注射用水或含有0.2~0.3%（重量/溶液体积，w/v）苯酚的注射用无菌水中；优选地，将1支冻干粉溶于480μL注射用无菌水或480μL含有0.25%（重量/溶液体积，w/v）苯酚的注射用无菌水中。

本发明还提供一种制备含有重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂的注射用药物组合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

①分别称取适量柠檬酸、柠檬酸钠、多元醇，用注射用无菌水溶解，配制成稀释缓冲液；

②使用稀释缓冲液将检定合格重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂原液稀释至终浓度；

③用孔径为0.22μm的滤膜除菌；

④分装；

⑤任选地，分装后成品及时冷冻并进行冻干，得到冻干粉针剂，冻干全过程中制品温度不高于25℃；

任选地，注射用药物组合物制备为注射液时，可称取适量苯酚加入注射用无菌水中溶解。当制备为注射液时，步骤④可分装为1.2mL/支。

本发明还提供含有重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂的注射用药物组合物在制备用于治疗II型糖尿病的药物中的用途。

本发明利用基因工程技术制备重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂（rE4）作为有效成分，经过大量试验研究辅料及其配比，最终选择适用于rE4的注射用药物组合物。rE4的生产具有成本低、环境友好等优点，本发明涉及的rE4组合物具有安全、稳定、便于运输及存放等优点，适于工业化生产，可以满足相关市场需求。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的具体说明，不应对本发明的范围构成限制。

实施例中所用rE4参考CN1693459、CN1635117、CN1455001、CN102618552A等申请中公开的方案，由本发明人利用基因工程技术构建表达载体，经发酵、纯化制得。所用rE4原液经HPLC检测，浓度>98%；使用基于细胞测活的ELISA方法，通过测定样品刺激细胞产生的cAMP浓度来检测样品的活性，rE4原液活性≥1.12×10⁶AU/mg；杂质采用《中国药典》2010年版第三部附录IX、XII中的方法检测，均符合规定。

检测方法

参考：

《中国药典》2010年版三部附录Ⅲ B 高效液相色谱法；

仪器：高效液相色谱仪，超纯水机，超声波清洗器；

试剂耗材：Source 5色谱柱，微孔过滤膜，乙腈，三氟乙酸；

流动相A：取50 mL乙腈，1 mL三氟乙酸，用18.2 MΩ.㎝以上超纯水定容至1000 mL，混匀后用0.22 µm的有机膜抽滤后超声脱气；

流动相B：取950 mL乙腈，1 mL 三氟乙酸，用18.2 MΩ.㎝以上超纯水定容至1000 mL，混匀后用0.22 µm的有机膜抽滤后超声脱气；

样品处理：产品原液检测需将rE4原液稀释至合适浓度,成品检测需将rE4成品制剂1 mL直接放入进样小瓶中，如果样品量少于500 µl应选用套管进行检测；

上样及检测：用自动进样器进样，每个样品进20 µL，柱温为40℃，流速为1.0 mL/min，检测波长215 nm，以流动相A平衡柱子至基线，以100%A+0%B到30%A+70%B梯度洗脱35 min，记录图谱。测定其主峰的面积，计算相应的含量。

生物活性检测

原理：rE4与细胞上受体结合，刺激细胞内生物活性物质增加，表现为细胞内cAMP浓度增加。细胞内cAMP浓度增加与rE4呈剂量相关；

仪器：生物安全柜，CO₂培养箱，MM-I型微量振荡器，酶标仪，台式离心机；

试剂耗材：rExendin-4标准品，细胞系：RIN-m5F细胞（大鼠胰岛瘤细胞，ATCC，CRL-11605⁺），RPMI 1640基础培养基，胎牛血清，0.25%胰蛋白酶，DMSO，BSA，IBMX，cAMP 酶联免疫分析试剂盒，96孔细胞培养板，移液器；RPMI 1640完全培养基：RPMI 1640基础培养基＋10％胎牛血清；rE4稀释液：RPMI 1640基础培养基＋0.1％BSA（牛血清白蛋白）＋1 mM IBMX，现配现用；IBMX浓缩液（100 mM）：溶于DMSO（二甲基亚砜）；磷酸盐缓冲液（PBS）：NaCl 8.0 g、NaHPO₄ 1.44 g、KCl 0.2 g、KH₂PO₄ 0.2 g、1 L纯水溶解，高压灭菌25分钟；细胞消化液：0.25%胰蛋白酶，4℃保存；

检测方法：

①取对数生长期细胞，消化、计数、调整细胞密度为1.5×10⁵/mL，以200 μL/孔接种于96孔细胞板，37℃ 5％CO₂培养待细胞贴满；

②更换96孔细胞板细胞液为RPMI 1640基础培养基，100 μL/孔，37℃ 5％CO₂继续培养12小时；

③用新鲜制备的rE4稀释液预稀释rE4标准品、待测品；同时用rE4稀释液做为阴性对照（称为IBMX对照）；

④去除培养基，加入各样品和阴性对照（100 μL/孔），37℃反应5分钟；

⑤去除rE4反应液，PBS洗细胞1次，去净残留液体；

⑥每孔加入120 μl试剂盒提供的细胞裂解液，37℃裂解细胞10分钟；96孔细胞板600 g离心10分钟，取上清进行ELISA实验；

⑦采用ELISA竞争性抑制法测定细胞刺激产生的cAMP浓度，实验操作按照试剂盒说明进行；

⑧用Origin8.5软件或其它软件进行数据处理和分析；

⑨计算：以cAMP浓度为横坐标，以OD值为纵坐标绘制标准曲线，根据回归曲线计算阴性对照孔和实验组孔（不同浓度标准品、原液或制剂）中的cAMP浓度；

不同浓度标准品、待测品刺激产生的cAMP浓度为对应实验组cAMP浓度减去阴性对照孔cAMP浓度的值；

以标准品或待测品稀释倍数的对数值为横坐标，对应孔细胞刺激产生cAMP浓度为纵坐标绘制曲线，通过直线方程分别计算出标准品和待测品半效量稀释倍数；

rExendin-4样品比活性的计算：

。

实施例 1 ： rE4 冻干粉针剂的制备

组分 重量（g）

重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂 0.12

柠檬酸 2.45

柠檬酸钠 2.36

甘露醇 30

①根据以上处方量分别称取柠檬酸、柠檬酸钠、甘露醇，加800mL注射用水预溶解；

②加入适量rE4原液；

③注射用水定容至1000mL，溶液pH为4.5，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲盐浓度为20mM；

④用0.22μm的滤膜除菌过滤；

⑤按照1mL/支分装后冻干。

实施例 2 ： rE4 注射液的制备

组分 重量（g）

重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂 0.25

柠檬酸 1.16

柠檬酸钠 4.26

甘露醇 30

苯酚 2.5

①根据以上处方量分别称取柠檬酸、柠檬酸钠、甘露醇、苯酚，加800mL注射用水预溶解；

②加入适量rE4原液；

③注射用水定容至1000mL，溶液pH为5.6，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲盐浓度为20mM；

④用0.22μm的滤膜除菌过滤；

⑤按照1.2mL/支分装。

实施例 3~7 ： rE4 浓度考察

参照实施例1的处方及其制备工艺，只是将冻干粉针剂规格分别改为0.03、0.05、0.10、0.15、0.20mg/支，制备得到冻干粉针剂。

实施例 8~12 ： rE4 浓度考察

参照实施例2的处方及其制备工艺，只是将注射液中rE4浓度分别改为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4mg/mL，制备得到注射液。

实施例 13~17 ：不同缓冲体系的考察

分别参照实施例1、2的处方及其制备工艺，只是将缓冲体系分别改为相同浓度的磷酸缓冲液（pH5.8）、醋酸缓冲液（pH4.5）、谷氨酸缓冲液（pH5.5）、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH4.5）、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液（pH5.0），制备得到冻干粉及注射液。

实施例 18~21 ：不同柠檬酸盐浓度的考察

分别参照实施例1、2的处方及其制备工艺，只是在配制溶液过程中将柠檬酸-柠檬酸钠缓冲体系浓度改为5mM、10mM、30mM、50mM，制备得到冻干粉及注射液。

实施例 22~29 ：不同共溶剂的考察

分别参照实施例1、2的处方及其制备工艺，只是将共溶剂改为等浓度的山梨醇、甘油、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖、木糖醇、甘氨酸、甲硫氨酸，制备得到冻干粉及注射液。

实施例 30~33 ：共溶剂浓度的考察

分别参照实施例1、2的处方及其制备工艺，只是将甘露醇浓度改为5mg/支、10mg/支、50mg/支、100mg/支，制备得到冻干粉及注射液。

实施例 34 ：缓冲体系及共溶剂正交试验

参照实施例2的处方及其制备工艺，按照表1配比缓冲体系（20mM）及共溶剂(30mg/mL)，制备rE4注射液，考察不同处方的rE4注射液的稳定性差别

实验设备：模拟运输试验机（东莞市源科检测仪器有限公司生产）

参数：速度：100-300rpm；振幅: 1英寸25.4mm，最大载重: 100Kg；工作时间：9999H/M/S；电机功率：1HP；最大电流：4A；工作台尺寸：100cm×120cm

实验方法：将表1中组方制备所得rE4注射液，在温度2~8℃下，置于模拟运输试验机上进行模拟运输试验，振幅为25.4mm、频率4Hz，试验速度240rpm，测试时间1小时

在实验前和实验结束静置30min，样品10000g离心后取上清检测rE4浓度。rE4浓度采用HPLC检测

实验结果：见表1

表1 不同处方注射液稳定性（以rE4浓度（μg/mL）计）

结论：以柠檬酸-柠檬酸钠作为缓冲体系、甘露醇或山梨醇作为共溶剂制备的rE4注射液具有较佳的稳定性，使用柠檬酸-柠檬酸钠作为缓冲体系、甘露醇作为共溶剂的rE4注射液具有最佳的稳定性。

实施例 35~41 ：注射液不同 pH 的考察

分别参照实施例1、2的处方及其制备工艺，只是调整柠檬酸-柠檬酸三钠的比例，将pH改为3.0、4.0、5.0、5.5、5.8、6.0、6.6，制备得到冻干粉及注射液。

实施例 42~44 ：防腐剂的考察

参照实施例1处方及其制备工艺，只是在其中加入0.25%苯酚、间甲酚、苄醇作为防腐剂，制备冻干粉。

实施例 45 ：防腐剂对于冻干粉复溶的影响

使用实施例1的冻干粉及实施例42~44的冻干粉制备以下几组注射液

A：实施例1制备的rE4冻干粉溶于480μL无菌注射用水；

B：实施例1制备的rE4冻干粉溶于480μL无菌苯酚-水溶液，苯酚含量为0.25%；

C~E：实施例42~44制备的rE4冻干粉分别溶于480μL无菌注射用水

制备结束静置30min，取样，检验样品的外观，样品置于离心管10000g离心后观察可见异物、取上清HPLC测定rE4浓度

实验结果：见表2

表2防腐剂对于冻干粉复溶的影响

可见，在制备冻干粉的过程中加入防腐剂，防腐剂可能会在冻干过程中与rE4和/或其杂蛋白、外源残留DNA发生反应，导致复溶过程中多肽变性、析出，影响制剂稳定性。

对比例 1 ：参考已开发上市的 BYETTA® 的制剂处方

组分 含量

rE4 250μg/mL

醋酸-醋酸钠缓冲盐（pH4.5） 20mM

甘露醇 30mg/mL

间甲酚 2.2mg/mL

分别照实施例1、2的制备工艺，制备得到冻干粉针剂及注射液。

对比例 2 ： CN101444618A 实例二 2 ) 制剂处方 2

参考CN101444618A实例二2)制剂处方2的组方，将其中艾塞那肽改为rE4，其他操作同CN101444618A实例二2)制剂处方2，分别制备冻干粉针剂及注射液。

实施例 46 ： rE4 冻干粉针剂稳定性实验

实验目的：考察不同处方的rE4冻干粉针剂的稳定性差别；

实验药品：实施例1、3~7、13~33、35~41、对比例1~2所得rE4冻干粉针剂；

实验设备：模拟运输试验机（东莞市源科检测仪器有限公司生产）；

实验方法：将实施例1、3~7、13~33、35~41、对比例1~2所得rE4冻干粉针剂分别溶于480μL注射用无菌水，在温度2~8℃下，置于模拟运输试验机上进行模拟运输试验，振幅为25.4mm、频率4Hz，试验速度240rpm，测试时间1小时。在实验前和实验结束静置30min，取样，检验样品的外观、可见异物，样品10000g离心后取上清检测生物学活性、rE4浓度。生物学活性采用基于细胞测活的ELISA方法，通过测定样品刺激细胞产生的cAMP浓度来检测样品的活性；rE4浓度采用HPLC检测；

实验结果：见表3

表3：rE4冻干粉针剂的稳定性

结论：

1、rE4浓度对rE4冻干粉针剂的稳定性具有一定影响，每支冻干粉含有rE4 50~200份（0.05~0.20mg，溶于480μL注射用水）制剂稳定性合格，冻干-复溶多肽性质无改变；每支冻干粉含有rE4 120份（0.12mg，溶于480μL注射用水）制剂稳定性较优，冻干-复溶不会对rE4浓度、生物学活性产生影响。从稳定性、制剂成本、患者用药方便等多方面综合考虑，每支冻干粉中含rE4的量为120份（0.12mg，溶于480μL注射用水）时冻干粉针剂稳定性最佳；

2、缓冲体系种类对rE4冻干粉针剂的稳定性也有一定影响。当缓冲体系为柠檬酸体系时，制剂稳定性最佳。当配制溶液时柠檬酸-柠檬酸钠浓度为10~30mM时制剂稳定性较佳，冻干-复溶时理化性质、生物学活性无改变，配制溶液时柠檬酸-柠檬酸钠缓冲盐浓度为20mM时制剂稳定性最佳。即，冻干粉针剂含有柠檬酸862~4129份、柠檬酸钠1015~5206份时冻干粉针剂稳定性较优，含有柠檬酸2450份、柠檬酸钠360份时稳定性最佳；

3、共溶剂的种类对rE4注射液的稳定性也有一定影响。当共溶剂为山梨醇或甘露醇时，制剂稳定性较佳；当共溶剂为甘露醇时，制剂稳定性最佳；当共溶剂为其它糖、多元醇或氨基酸时，rE4注射液的稳定性降低，冻干-复溶时可见结晶或沉淀。冻干粉针剂中多元醇为10000~50000份（10mg/支~50mg/支）时制剂稳定性较佳，多元醇为30000份（30mg/支）时制剂稳定性最佳；

4、rE4冻干粉针剂在配制溶液时pH在4.0~6.0时制剂较稳定，pH4.5~5.5时rE4冻干粉针剂最为稳定，冻干-复溶时理化性质、溶液pH值、生物学活性无改变。

实施例 46 ： rE4 注射液稳定性实验

实验目的：考察不同处方的rE4注射液的稳定性差别；

实验药品：实施例2、8~33、35~41、对比例1~2所得rE4注射液；

实验设备：模拟运输试验机（东莞市源科检测仪器有限公司生产）；

参数：速度：100-300rpm；振幅: 1英寸25.4mm，最大载重: 100Kg；工作时间：9999H/M/S；电机功率：1HP；最大电流：4A；工作台尺寸：100cm×120cm；

实验方法：将实施例2、8~33、35~41、对比例1~2所得rE4注射液，在温度2~8℃下，置于模拟运输试验机上进行模拟运输试验，振幅为25.4mm、频率4Hz，试验速度240rpm，测试时间1小时。在实验前和实验结束静置30min，取样，检验样品的外观、可见异物，样品10000g离心后取上清检测生物学活性、rE4浓度。生物学活性采用基于细胞测活的ELISA方法，通过测定样品刺激细胞产生的cAMP浓度来检测样品的活性；rE4浓度采用HPLC检测；

实验结果：见表4

表4：rE4注射液的稳定性

结论：

1、rE4浓度对rE4注射液的稳定性具有一定影响，注射液中含rE4的量为100~300份（0.1~0.3mg/mL）时，制剂稳定性合格。从稳定性、制剂成本、患者用药方便等多方面综合考虑，注射液中含rE4的量为250份（0.25mg/mL）时，为最佳蛋白质量；

2、缓冲体系种类对rE4注射液的稳定性也有一定影响。当缓冲体系为柠檬酸体系时，制剂稳定性最佳。当柠檬酸-柠檬酸钠浓度为10~30mM时制剂稳定性较佳，浓度为20mM时制剂稳定性最佳。即注射液中含有柠檬酸60~4130份、柠檬酸钠1020~5210份时制剂稳定性较优；含有柠檬酸1160份、柠檬酸钠4260份时制剂稳定性最佳；

3、共溶剂的种类对rE4注射液的稳定性也有一定影响。当共溶剂为山梨醇或甘露醇时，制剂稳定性较佳；当共溶剂为甘露醇时，制剂稳定性最佳；当共溶剂为其它共溶剂时，rE4注射液的稳定性降低。注射剂中多元醇含量为10000份~50000份（10mg/mL~50mg/mL）时制剂稳定性较佳，含量为30000份（30mg/mL）时制剂稳定性最佳；

4、rE4制剂pH在4.0~6.0时制剂较稳定，pH5.0~5.8时rE4注射液制剂稳定性较佳，pH5.6时制剂最为稳定。

实施例 47 ：长期稳定性试验

将实施例1所得的rE4冻干粉针剂、实施例2所得的注射液贮存在冷藏柜中，温度保持在2~8℃，于0个月，3个月，6个月，9个月，12个月，18个月，24个月，36个月进行取样，冻干粉取出后复溶于480μL注射用无菌水中，静置30min，检验外观、可见异物、pH值、生物学活性、纯度（HPLC法）、rE4浓度，实验结果如下：

表5 rE4冻干粉针剂长期稳定性

表6 rE4注射液长期稳定性

结论：本发明所提供的rE4冻干粉针剂2~8℃贮存3年，注射液2~8℃贮存18个月，各项指标无明显变化，稳定性良好。

Claims (9)

1.一种含有重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂的注射用药物组合物，其中重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂由大肠杆菌表达纯化制得，具有如Seq ID No.2所示的序列，其特征在于含有重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲盐及多元醇。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于所述多元醇为山梨醇、甘露醇中的一种或其组合。

3.如权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于所述药物组合物为注射液，该注射液由以下组分组成：

组分 含量

重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂 100~300份

柠檬酸 860~4130份

柠檬酸钠 1020~5210份

多元醇 10000~50000份

注射用无菌水 适量；

优选地，该注射液由以下组分组成：

组分 含量

重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂 250份

柠檬酸 1160份

柠檬酸钠 4260份

多元醇 30000份

注射用无菌水 适量。

4.如权利要求3所述的注射液，其中还含有注射用无菌水，该注射液pH为4.0~6.0，优选5.0~5.8；进一步优选为5.6。

5.如权利要求4所述的注射液，其特征在于：注射液中还含有防腐剂，防腐剂为苯酚2000~3000份，优选的为2500份。

6.如权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于所述药物组合物为冻干粉针剂，其特征在于：每支冻干粉针剂由以下组分组成：

组分 含量

重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂 50~200份

柠檬酸 862~4129份

柠檬酸钠 1015~5206份

多元醇 10000~50000份；

优选地，每支冻干粉针剂由以下组分组成：

组分 含量

重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂 120份

柠檬酸 2450份

柠檬酸钠 2360份

多元醇 30000份。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物为冻干粉针剂，该冻干粉针剂在溶液状态下pH为4.0~6.0，优选4.5~5.5。

8.一种制备如权利要求1~7任一项所述的药物组合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

①分别称取适量柠檬酸、柠檬酸钠、多元醇，用注射用无菌水溶解，配制成稀释缓冲液；

②使用稀释缓冲液将检定合格重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂原液稀释至终浓度；

③用孔径为0.22μm的滤膜除菌；

④分装；

⑤任选地，分装后成品及时冷冻并进行冻干，得到冻干粉针剂，冻干全过程中制品温度不高于25℃；

任选地，注射用药物组合物制备为注射液时，可称取适量苯酚加入注射用无菌水中溶解。

9.上述权利要求中任一项所述的药物组合物在制备用于治疗II型糖尿病的药物中的用途。