CN104105706A - 用于治疗疾病的抗人sema4A抗体 - Google Patents

Abstract

本文提供可用于治疗自身免疫性疾病、癌症和其它疾病的抗人sema4A抗体。抗人sema4A抗体可抑制由IL-4、抗CD3、抗CD-28和重组sema4A诱导的T细胞增殖和Th2分化。

Description

用于治疗疾病的抗人sema4A抗体

技术领域

本发明主要涉及人sema4A的调节，尤其涉及抑制人sema4A以阻断由抗CD3、抗CD-28、IL-4、重组sema4A和树突细胞诱导的增殖和Th2分化以及治疗疾病。

相关申请的交叉引用

本申请要求2011年10月6日提交的美国临时专利申请号61/543,877的权益和优先权，其通过引用的方式并入本文。

关于联邦资助的研究或开发的声明

本发明是在由国立卫生研究院授予的R01AI062888-01下由政府支持做出的。所述政府享有本发明的某些权利。

联合研究协议参与方的名称

无

对序列表的引用

本公开包括作为2012年10月5日创建的，名称为序列表.txt的，依照37C.F.R.§1.52(e)(v)的文本文件递交的序列表，具有46,124字节大小，其通过引用并入本文。所附序列描述和序列表遵守如37C.F.R.§§1.821-1.825中所阐述的适用于专利申请中的核苷酸和/或氨基酸序列公开的规则。所述序列表包含如符合Nucleic Acids Res.13:3021-3030(1985)和Biochemical J.219(No.2):345-373(1984)中描述的IUPAC-IUBMB标准所定义的用于核苷酸序列特性的单字母代码和用于氨基酸的三字母代码。用于核苷酸和氨基酸序列的符号和格式遵守37C.F.R.§1.822中阐述的规则。

背景技术

信号素类为大的、保守的分泌性或膜结合性配体家族，其对生长锥起排斥或吸引提示的作用。基于功能域和序列相似性将信号素家族分成亚类。Rice,D.,et al.,Severe Retinal Degeneration Associated with Disruption of Semaphorin4A,Investigative Ophthalmology&Visual Science,Vol.45,No.8(2004)。Sema4A为第IV类信号素。在小鼠中，有证据表明sema4A由骨髓来源的及脾脏DC以及由B细胞和活化的T细胞表达。sema4A可通过其受体TIM2刺激T细胞增殖，其诱导IL-2产生并且据报道在用抗CD40单克隆抗体刺激B细胞后上调。Kumanogoh,A.,et al.Nature,419:629-33,2002。已表明，sema4A缺陷小鼠表现出有缺陷的Th1响应。sema4A似乎参与了T细胞的引发以及Th1/Th2响应的调节。Kumanogoh,A.et al.Immunity,22:305-16,2005。然而，迄今为止，sema4A在人免疫系统中的生物学功能还没有研究。

发明内容

人sema4A蛋白由抗原呈递细胞，比如树突细胞和活化的生发中心B细胞，以及CD4+Th2细胞高表达。我们发现，重组的sema4A蛋白强烈地促进被IL-4、抗CD3、抗CD28和重组的sema4A诱导的人CD4+T细胞增殖和Th2分化。同时，中和mAb可阻断生物学功能。同样地，人sema4A(本文也称为“hsema4A”或者更通常地称为“sema4A”或“Sema4A”)呈现重要的和有利的治疗靶点。

本文提供了结合人sema4A的新的单克隆和人源化抗体。这些抗体在本文有时也称为“抗人sema4A抗体(anti-human sema4A antibody)”或“抗人sema4A抗体(anti-human sema4A antibodies)”，但是也可称为分离的抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或简单抗体，如以单数或复数所呈现的。

所教导的抗人sema4A抗体用于治疗或预防急性或慢性疾病和病况。在一个方面，结合人sema4A的分离的抗体，或其抗原结合部分被描述并且是有效的癌症治疗。所述抗人sema4A抗体也可用于治疗人自身免疫疾病、变应性疾病、炎性疾病、移植物抗宿主疾病和移植物排斥。

还提供了基于人sema4A的这些抗体结合剂的组合物、方法、试剂盒和制品。这些抗人sema4A抗体可为治疗和/或诊断剂并用于靶向与人sema4A和其受体人免疫球蛋白样转录物4(hILT-4)、人T细胞免疫球蛋白结构域和人粘蛋白结构域3(hTIM-3)和人免疫球蛋白样转录物2(hILT-2)信号途径的表达和/或活性相关的病理状况。

此外，如本文描述的分离的抗体结合人sema4A，并可结合由下列基因编码的人sema4A：NCBI登录号HGNC:10729，Genpept登录号64218，或者与其具有百分之90同源性的基因。本文提供的分离的抗体还可结合具有下列GenBank登录号之一的人sema4A受体：10288、84868和10859。

如本文所提供的，示例性的结合人sema4A的分离的抗体包括：(a)包含SEQID NO:36的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO.48的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQID NO.49的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；以及(f)包含SEQ ID NO.50的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。

此外，结合人sema4A的分离的抗体的另一实例包括：(a)包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO.66的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO.67的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；以及(f)包含SEQ ID NO.68的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。

或者，分离的抗体可具有包含SEQ ID NO:36或54的氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:37或55的氨基酸序列的重链可变区CDR2；和/或包含SEQ ID NO:38或56的氨基酸序列的重链可变区CDR3，或与其具有百分之90同源性的重链可变区CDR。

而且，分离的抗体可具有包含SEQ ID NO:48或66的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:49或67的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和/或包含SEQ ID NO:50或68的氨基酸序列的轻链可变区CDR3，或与其具有百分之90同源性的重链可变区CDR。

所述分离的抗体可具有包含SEQ ID NO:51或69的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO:51或69的氨基酸序列具有至少百分之90同一性的氨基酸序列的轻链可变区(“VL”)。所述分离的抗体可具有包含SEQ ID NO:39、45、57或63的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO:39、45、57或63的氨基酸序列具有至少百分之90同一性的氨基酸序列的重链可变区(“VH”)。同样地，作为实例，所述分离的抗体可包含SEQ ID NO:39、45、57或63的重链可变序列和SEQ ID NO:51的轻链可变序列，或者与其具有百分之90同源性的序列。类似地，所述分离的抗体可具有SEQ ID NO:39、45、57或63的重链可变序列和SEQ ID NO:69的轻链可变序列或与其具有百分之90同源性的序列。

所述分离的抗体可具有由SEQ ID NO:52或70的核酸序列，或与SEQ ID NO:52或70的核苷酸序列具有至少百分之90同一性的核酸序列编码的可变轻链。所述分离的抗体可具有由SEQ ID NO:40、46、58或64的核酸序列，或与SEQID NO:40、46、58或64的核苷酸序列具有至少百分之90同一性的核酸序列编码的可变重链。

本文还提供了单克隆抗体。所述单克隆抗体可具有包含SEQ ID NO:73、75或77的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO:73、75或77的氨基酸序列具有至少百分之90同一性的氨基酸序列的可变轻链。还提供了具有包含SEQ ID NO:72、74或76的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO:72、74或76的氨基酸序列具有至少百分之90同一性的氨基酸序列的可变重链的单克隆抗体。

其它抗体可具有下列部件的任何一种或多种：可变轻链；可变重链；或重链或轻链可变区CDR1、CDR2或CDR3，每个部件均包含如本文描述的和在序列表中标识的SEQ ID NO:1直到77的氨基酸或核酸序列，或者包含与SEQ IDNO:1直到77的序列之一具有至少百分之90同一性的氨基酸或核酸。

本文还提供编码本文教导的任何抗人sema4A抗体的分离的核酸。本文还提供包含编码本文描述的任何抗人sema4A抗体的核酸的宿主细胞。还提供产生抗体的方法(比如包含编码本文描述的任何抗sema4A抗体的核酸的宿主细胞)包括培养所述宿主细胞以便抗体产生，和/或从所述宿主细胞回收抗体。

附图说明

为了获得且能够更详细地理解其中本发明的上文列举的特征、方面和优势以及其它将变得显而易见的方式，通过参照本发明的实施方案而可能具有上文简要概括的本发明的更加特定的描述，这些实施方案图示在形成该说明书一部分的附图中。然而，要注意的是，附图仅仅示出本发明的一些实施方案，并且因此不被视为本发明的范围的限制，因为本发明可承认其它同样有效的实施方案。

图1A，1A1，1B和1C显示sema4A在人mDC的表达。

图2A和2B提供人扁桃体中的sema4A的免疫组织学染色。

图3A和3B描绘抗人sema4A单克隆抗体阻断mDC和T细胞之间的相互作用。

图4A，4B，4C和4D显示sema4A增强CD4+幼稚T细胞增殖。

图5A，5B，5C，5D和5E显示抗人sema4A单克隆抗体在TCR触发下阻断sema4A介导的CD4+T细胞增殖。

图6A，6B，6C和6D显示sema4A调节Th2致敏的CD4+Th的Th2细胞因子分泌。

图7A，7B，7C和7D显示sema4A在T细胞活化和Th2培养条件下上调CRTH2+记忆Th2细胞产生Th2细胞因子和下调Th1细胞因子。

图8A，8B，8C，8D，8E，8F，8G，8H和8I显示抗sema4A单克隆抗体在CD4+Th2细胞中抑制由sema4A诱导的Th2细胞因子(IL-4,IL-5和IL-13)产生。

图9显示第一批的抗人sema4A单克隆抗体的鉴定。

图10A，10B，10C，10D和10E显示抗人sema4A单克隆抗体克隆号126-65，126-28和126-63的功能测定结果。

图11A，11B，11C和11D显示抗人sema4A单克隆抗体克隆号126-25和126-31的功能测定结果。

图12显示第二批的抗人sema4A单克隆抗体的鉴定。

图13显示抗人sema4A单克隆抗体克隆号161-70-1，161-90，161-96B，161-110B，161-117，161-118A和161-66的功能测定结果。

图14显示抗人sema4A单克隆抗体克隆号161-15B，161-18B，161-33，161-35，161-44，161-49和161-51的功能测定结果。

图15显示结合L/sema4A的LB70抗体的分析结果。

图16A和16B显示结合L/sema4A的LB51抗体的分析结果。

图17A和17B显示抗人Sema4A mAb阳性克隆检测PMBC上猕猴Sema4A的表达。

图18A，18B，18C和18D显示针对hSema4A的两株人源化mAb的分析结果。

图19A和19B显示sema4A受体克隆与人T细胞表达cDNA文库筛选。

图20A和20B显示sema4A受体结合sema4A转染的细胞系。

图21A和21B显示受体-Fc融合蛋白阻断由rhSema4A介导的人CD4+T细胞增殖。

图22A，22B和22C显示sema4A在人哮喘肺组织中特异性过表达。

图23显示小鼠161-51-1VH cDNA的核苷酸序列连同所导出的氨基酸序列。该图还提供以单字母代码显示的氨基酸残基。信号肽序列为斜体。成熟VH的N端氨基酸残基(Q)为双下划线和黑体。根据Kabat et al.(1991)的定义的CDR序列为下划线的。

图24显示小鼠161-51-1VL cDNA的核苷酸序列连同所导出的氨基酸序列。该图还提供以单字母代码显示的氨基酸残基。信号肽序列为斜体。成熟VL的N端氨基酸残基(E)为双下划线和黑体的。根据Kabat et al.(1991)的定义的CDR序列为下划线的。

图25显示小鼠161-70-1VH cDNA的核苷酸序列连同所导出的氨基酸序列。该图还提供以单字母代码显示的氨基酸残基。信号肽序列为斜体。成熟VH的N端氨基酸残基(E)为双下划线和黑体的。根据Kabat et al.(1991)的定义的CDR序列为下划线的。

图26显示小鼠161-70-1VL cDNA的核苷酸序列连同所导出的氨基酸序列。氨基酸残基以单字母代码显示。信号肽序列为斜体。成熟VL的N端氨基酸残基(D)为双下划线和黑体的。根据Kabat et al.(1991)的定义的CDR序列为下划线的。

图27显示小鼠161-15B-1VH cDNA的核苷酸序列连同所导出的氨基酸序列。氨基酸残基以单字母代码显示。信号肽序列为斜体。成熟VH的N端氨基酸残基(Q)为双下划线和黑体的。根据Kabat et al.(1991)的定义的CDR序列为下划线的。

图28显示小鼠161-15B-1VL1cDNA的核苷酸序列连同所导出的氨基酸序列。氨基酸残基以单字母代码显示。信号肽序列为斜体。成熟VL的N端氨基酸残基(N)为双下划线和黑体的。根据Kabat et al.(1991)的定义的CDR序列为下划线的。

图29显示小鼠161-15B-1VL2cDNA的核苷酸序列连同所导出的氨基酸序列。氨基酸残基以单字母代码显示。信号肽序列为斜体。成熟VL的N端氨基酸残基(A)为双下划线和黑体的。根据Kabat et al.(1991)的定义的CDR序列为下划线的。

图30提供抗人sema4A人源化抗体HuLB51的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列。HuLB51VH1基因两侧为SpeI和HindIII位点(下划线的)并且连同所导出的氨基酸序列一起显示。氨基酸残基以单字母代码显示。信号肽序列为斜体。成熟VH的N端氨基酸残基(Q)为双下划线。根据Kabat et al.(Sequences ofProteins of Immunological Interests,Fifth edition,NIH Publication No.91-3242,U.S.Department of Health and Human Services,1991)的定义的CDR序列为下划线的。内含子序列以斜体显示。

图31提供抗人sema4A人源化抗体HuLB51的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列。两侧为SpeI和HindIII位点(下划线的)的HuLB51VH2基因的核苷酸序列连同所导出的氨基酸序列一起显示。氨基酸残基以单字母代码显示。信号肽序列为斜体。成熟VH的N端氨基酸残基(Q)为双下划线。根据Kabat et al.(1991)的定义的CDR序列为下划线的。内含子序列以斜体显示。

图32提供抗人sema4A人源化抗体HuLB51的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列。两侧为NheI和EcoRI位点(下划线的)的HuLB51VL基因的核苷酸序列连同所导出的氨基酸序列一起显示。氨基酸残基以单字母代码显示。信号肽序列为斜体。成熟VL的N端氨基酸残基(D)为双下划线。根据Kabat et al.(1991)的定义的CDR序列为下划线的。内含子序列以斜体显示。

图33提供抗人sema4A人源化抗体的重链可变区HuLB70VH1的核苷酸和氨基酸序列。两侧为SpeI和HindIII位点(下划线的)的HuLB70VH1基因的核苷酸序列连同所导出的氨基酸序列一起显示。氨基酸残基以单字母代码显示。信号肽序列为斜体。成熟VH的N端氨基酸残基(Q)为双下划线。根据Kabat etal.(1991)的定义的CDR序列为下划线的。内含子序列以斜体显示。

图34提供抗人sema4A人源化抗体的重链可变区HuLB70VH2的核苷酸和氨基酸序列。两侧为SpeI和HindIII位点(下划线的)的HuLB70VH2基因的核苷酸序列连同所导出的氨基酸序列一起显示。氨基酸残基以单字母代码显示。信号肽序列为斜体。成熟VH的N端氨基酸残基(Q)为双下划线。根据Kabat etal.(1991)的定义的CDR序列为下划线的。内含子序列以斜体显示。

图35提供抗人sema4A人源化抗体的轻链可变区HuLB70VL的核苷酸和氨基酸序列。两侧为NheI和EcoRI位点(下划线的)的HuLB70VL基因的核苷酸序列连同所导出的氨基酸序列一起显示。氨基酸残基以单字母代码显示。信号肽序列为斜体。成熟VL的N端氨基酸残基(D)为双下划线。根据Kabat et al.(1991)的定义的CDR序列为下划线的。内含子序列以斜体显示。

具体实施方式

本文提供了结合人sema4A受体的单克隆、嵌合和人源化抗体(本文有时称为“抗人sema4A抗体”和/或其其它变体)。这些抗体用于治疗或预防其病理学涉及人sema4A的急性或慢性疾病或病况。在一个方面，描述了结合人sema4A并为有效的癌症治疗或针对自身免疫疾病的治疗的分离的人抗体，或其抗原结合部分。本文公开的任何抗人sema4A抗体均可用作药剂。所述抗人sema4A抗体的任何一种或多种可用于治疗一种或多种本文描述的各种各样的癌症或自身免疫疾病。

本文提供的抗人sema4抗体阻断CD4+T细胞增殖和Th2分化。如下文描述的，所述抗人sema4A抗体可为结合人sema4A的单克隆或多克隆抗体。所述单克隆和/或多克隆抗体的来源可为兔子、大鼠和小鼠。而且，所述抗人sema4A抗体可为嵌合抗体，亲和力成熟抗体，人源化抗体或人抗体。此外，所述抗人sema4A抗体可为抗体片段，或Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2或scFv。

如本文所呈现的，抗人sema4嵌合抗体包含来自移植到异种非人类的非人类供体的抗原结合序列、人类或人源化序列(例如，框架和/或恒定区序列)。所述非人类供体可为小鼠、大鼠或兔子。同样，所述抗原结合序列可为合成的，例如通过诱变(例如，噬菌体展示筛选等)获得的。嵌合抗体具有鼠类V区和人类C区。鼠类轻链V区可融合到人κ轻链。鼠类重链V区可融合到人IgG1C区。

如本文描述的分离的抗体结合人sema4A，并且可结合由下列基因编码的人sema4A：NCBI登录号HGNC:10729，Genpept登录号64218，或与其具有百分之90同源性的基因。本文提供的分离的抗体还可结合具有下列GenBank登录号之一的人sema4A受体：10288，84868和10859。

如本文所教导的，示例性的结合人sema4A的分离的抗体包括：(a)包含SEQID NO:36的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO.48的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQID NO.49的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；以及(f)包含SEQ ID NO.50的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。

此外，结合人sema4A的分离的抗体的另一实例包括：(a)包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO.66的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO.67的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；以及(f)包含SEQ ID NO.68的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。

或者，分离的抗体可具有包含SEQ ID NO:36或54的氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:37或55的氨基酸序列的重链可变区CDR2；和/或包含SEQ ID NO:38或56的氨基酸序列的重链可变区CDR3，或与其具有百分之90同源性的重链可变区CDR。

而且，分离的抗体可具有包含SEQ ID NO:48或66的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:49或67的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和/或包含SEQ ID NO:50或68的氨基酸序列的轻链可变区CDR3，或与其具有百分之90同源性的重链可变区CDR。

所述分离的抗体可具有包含SEQ ID NO:51或69的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO:51或69的氨基酸序列具有至少百分之90同一性的氨基酸序列的轻链可变区(“VL”)。所述分离的抗体可具有包含SEQ ID NO:39、45、57或63的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO:39、45、57或63的氨基酸序列具有至少百分之90同一性的氨基酸序列的重链可变区(“VH”)。同样地，作为实例，所述分离的抗体可包含SEQ ID NO:39、45、57或63的重链可变序列和SEQ ID NO:51的轻链可变序列，或者与其具有百分之90同源性的序列。类似地，所述分离的抗体可具有SEQ ID NO:39、45、57或63的重链可变序列和SEQ ID NO:69的轻链可变序列或与其具有百分之90同源性的序列。

所述分离的抗体可具有由SEQ ID NO:52或70的核酸序列，或与SEQ ID NO:52或70的核苷酸序列具有至少百分之90同一性的核酸序列编码的可变轻链。所述分离的抗体可具有由SEQ ID NO:40、46、58或64的核酸序列，或与SEQID NO:40、46、58或64的核苷酸序列具有至少百分之90同一性的核酸序列编码的可变重链。

本文还提供了单克隆和嵌合抗体。这些抗体可具有包含SEQ ID NO:73、75或77的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO:73、75或77的氨基酸序列具有至少百分之90同一性的氨基酸序列的可变轻链。还提供了具有包含SEQ ID NO:72、74或76的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO:72、74或76的氨基酸序列具有至少百分之90同一性的氨基酸序列的可变重链的单克隆抗体。

其它抗体可具有下列部件的任何一种或多种：可变轻链；可变重链；或重链或轻链可变区CDR1、CDR2或CDR3，每个部件均包含如本文描述的和在序列表中标识的SEQ ID NO:1直到77的氨基酸或核酸序列，或者包含与SEQ IDNO:1直到77的序列之一具有至少百分之90同一性的氨基酸或核酸。

如本文所教导的，另外的示例性的结合人sema4A的分离的抗体包括：(a)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO.6的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO.7的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；以及(f)包含SEQ ID NO.8的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。

此外，结合人sema4A的分离的抗体的另一实例包括：(a)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO.16的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO.17的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；以及(f)包含SEQ ID NO.18的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。

此外，结合人sema4A的分离的抗体的另一实例包括：(a)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO.26的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO.27的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；以及(f)包含SEQ ID NO.28的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。

此外，结合人sema4A的分离的抗体的另一实例包括：(a)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO.26的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO.27的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；以及(f)包含SEQ ID NO.28的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。

此外，结合人sema4A的分离的抗体的另一实例包括：(a)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO.31的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO.32的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；以及(f)包含SEQ ID NO.33的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。

或者，分离的抗体可具有包含SEQ ID NO:1、11或21的氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:2、12或22的氨基酸序列的重链可变区CDR2；和/或包含SEQ ID NO:3、13或23的氨基酸序列的重链可变区CDR3，或与其具有百分之90同源性的重链可变区CDR。

而且，分离的抗体可具有包含SEQ ID NO:6、16、26或31的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:7、17、27或32的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和/或包含SEQ ID NO:8、18、28或33的氨基酸序列的轻链可变区CDR3，或与其具有百分之90同源性的重链可变区。

本文还提供编码本文所教导的抗人sema4A抗体的任一个的分离的核酸。本文进一步提供包含编码本文所述抗人sema4A抗体的任一个的核酸的宿主细胞。进一步提供了产生抗体(比如包含编码本文所述抗sema4A抗体的任一个的核酸的宿主细胞)的方法，包括培养宿主细胞以便产生抗体，和/或从所述宿主细胞回收抗体。

人源化抗体可由单克隆抗体序列产生并且包括在FR中具有氨基酸替代的那些抗体和在嫁接的CDR中有改变的亲和力成熟变体。所述CDR或FR中替代的氨基酸不限于供体或受体抗体中存在的那些。本文提供的抗体可进一步包括Fc区域的氨基酸残基改变，其导致效应子功能改善包括增强CDC和/或ADCC功能与B细胞杀伤。其他抗体可包括具有改善稳定性的特定变化的那些。

定义

术语“抗体”包括包含四条多肽链的免疫球蛋白分子，两条重链(H)和两条轻链(L)通过二硫键互相连接。每条重链包含重链可变区(本文简称为HCVR或VH)和重链恒定区。所述重链恒定区包含三个结构域，CH1、CH2和CH3。每个轻链包含轻链可变区(本文简称为LCVR或VL)和轻链恒定区。所述轻链恒定区包含一个结构域CL。所述VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。

一般地，术语“癌症(cancer)”和“癌的(cancerous)”是指或描述哺乳动物中典型特征为未调节的细胞生长的哺乳动物中的生理状况。更具体地，可使用本文描述的抗体的任何一种或多种或其变体治疗或预防的癌症包括但不限于癌(carcinoma)、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。这样的癌症的更具体的实例包括但不限于鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric or stomach cancer)(包括胃肠癌和胃肠道间质癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(livercancer)、膀胱癌、肝癌(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾腺癌、肾癌或肾癌(kidney or renal cancer)、肝癌(liver cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)和各种类型的头颈癌、黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、肢端雀斑样黑素瘤、结节状黑素瘤，以及B细胞淋巴瘤(低级/滤泡非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡NHL；中级弥散性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞NHL；高级小的非裂解细胞NHL；肿瘤体积较大的(bulky disease)NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关的淋巴瘤；和Waldenstrom氏巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性成淋巴细胞性白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞白血病；和移植后淋巴增生性障碍(PTLD)，以及瘢痣病相关的异常血管增生，水肿(比如与脑肿瘤相关的)和梅格思综合征。

“分离的”抗体为已从其天然环境组分中鉴定和分离和/或回收的那个。其天然环境的污染组分为会干扰抗体的诊断或治疗用途的材料，并且可包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质的溶质。将抗体纯化(1)至如Lowry法确定的大于95％重量的抗体，并且更优选地大于99％重量，(2)至足以通过使用转杯式测序仪获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或者(3)至使用考马斯亮蓝或优选银染在还原或非还原条件下通过SDS-PAGE表现均一。分离的抗体包括在重组细胞内原位的抗体，因为抗体的天然环境的至少一种组分将不存在。然而，所述分离的抗体可通过至少一个纯化步骤制备。

“分离的”核酸分子为从至少一种污染核酸分子鉴定和分离的核酸分子，在抗体核酸的天然来源中所述核酸分子通常与所述污染核酸分子缔合。分离的核酸分子不同于其天然存在的形式或环境。因此，分离的核酸分子可以与存在于天然细胞中的核酸分子区分开。但是，分离的核酸分子包括在通常表达抗体的细胞中包含的核酸分子，其中，例如核酸分子的染色体定位不同于天然细胞的染色体定位。

术语“Kabat编号”、“Kabat定义”和“Kabat标记”在本文可互换使用。本领域公认的这些术语指的是编号氨基酸残基的系统，所述氨基酸残基比抗体或其抗原结合部分的重链和轻链可变区中的其它氨基酸残基更可变(即高变的)(Kabat等(1971)Ann.NY Acad,Sci.190:382-391以及Kabat,E.A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,U.S.Department ofHealth and Human Services,NIH公开号91-3242)。

术语“依照Kabat的可变域残基编号”或“依照Kabat的氨基酸位置编号”以及其变体指的是Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中用于抗体的重链可变域或轻链可变域编辑的编号系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨基酸，对应于可变域FR或CDR的缩短或插入。对于给定抗体的残基的Kabat编号可通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列的同源区进行比对而确定。

“结合亲和力”通常指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，如本文使用的，“结合亲和力”指反映结合对(例如抗体与抗原)的成员之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)表示。亲和力可通过本领域已知的常用方法进行测量，包括本文中所描述的那些。低亲和力抗体通常缓慢结合抗原并且趋于容易解离，而高亲和力抗体通常较快地结合抗原并且趋于保持较长时间的结合。本领域已知测量结合亲和力的多种方法，其中任何一种都可用于本发明的目的。

如本文使用的，术语“载体”意图指能够转运已与其连接的另一种核酸分子的核酸分子。一种载体类型是“质粒”，其指另外的DNA片段可连接其中的环状双链DNA环。另一种载体类型是噬菌体载体。另一种载体类型是病毒载体，其中另外的DNA片段可连接到病毒基因组。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自我复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可在引入宿主细胞时整合到宿主细胞的基因组中，从而随宿主基因组复制。此外，某些载体能够指导与其可操作地连接的基因的表达。这种载体在本文中被称为“重组表达载体”(或者，简单地，为“重组载体”)。一般，重组DNA技术中有用的表达载体通常以质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。

如本文中可互换使用的，“多核苷酸”或“核酸”指任意长度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，修饰的核苷酸或碱基，和/或它们的类似物，或者可通过DNA或RNA聚合酶或者通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，比如甲基化核苷酸或它们的类似物。如果存在，可在聚合物组装前后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸序列可被非核苷酸组分所中断。可在合成后进一步修饰多核苷酸，比如通过偶联标记物。其它类型的修饰包括例如“加帽”，用类似物替代一个或多个天然存在的核苷酸，核苷酸间修饰比如，例如用不荷电的连接(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酸酰胺化物(phosphoamidates)、氨基甲酸酯等)以及用荷电的连接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些，包含悬垂部分比如例如蛋白质(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、多聚-L-赖氨酸等)的那些，用嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)的那些，包含螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的那些，包含烷化剂的那些，用修饰的连接(例如，α异头核酸等)以及未修饰形式的多核苷酸的那些。多核苷酸中并非所有的连接需要是相同的。前面的描述适用于本文提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。

如本文使用的，“寡核苷酸”通常指长度通常但不一定小于约200个核苷酸的短的、通常单链的、通常合成的多核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并非互相排斥的。以上对多核苷酸的描述同样并且完全可适用于寡核苷酸。

术语“抗体”和“免疫球蛋白”在最广义上可互换使用，并且包括单克隆抗体(例如全长的或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要它们表现出期望的生物学活性)，以及还可包括某些抗体片段。抗体可为人的、人源化的和/或亲和力成熟的。

术语“可变”是指可变结构域的某些部分的序列在抗体之间广泛不同并且用于各特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的事实。然而，可变性不是均匀分布在整个抗体的可变结构域中。其集中在轻链和重链可变结构域中的称为互补决定区(CDR)或高变区的三个区段中。可变结构域的更高度保守的部分称为框架(FR)区。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，主要采取通过三个CDR(其形成环形连接)连接的β-折叠(β-sheet)构型，并且在一些情况下形成β-折叠结构的部分。各链中的CDR通过FR区与来自另一条链的CDR紧密地结合在一起，有助于抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,National Institute of Health,Bethesda,Md.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出不同的效应子功能，比如抗体在抗体依赖性细胞毒性中的参与。

抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个具有单一的抗原结合位点，和残余的“Fc”片段，其名称反映其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原的F(ab')₂片段。

“Fv”为包含完整抗原识别和结合位点的最小的抗体片段。在两链Fv种类中，该区由紧密的、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv种类中，一个重链可变域和一个轻链可变域可通过柔性肽接头共价连接，使得轻链和重链能以与两链Fv种类中的类似的“二聚体”结构结合。每个可变域的三个CDR正是以这种构型相互作用以限定VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。六个CDR共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使单个可变域(或仅包含抗原特异的三个CDR的办个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管以比完整结合位点低的亲和力。

Fab片段也含有轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab’片段因重链CH1结构域的羧基末端增加几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸而不同于Fab片段。Fab'-SH是本文中对其中恒定域的半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab’的称谓。F(ab')₂抗体片段最初是作为在它们之间具有铰链半胱氨酸的成对Fab'片段生成的。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。

来自任何脊椎动物种类的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”基于其恒定域的氨基酸序列可以归于两个明显不同的类型(称为κ和λ)之一。

取决于其重链的恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可归于不同的种类。有五个主要类别的免疫球蛋白：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，这些中的几种可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG₁，IgG₂，IgG₃，IgG₄，IgA₁和IgA₂。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定域分别称为α，β，ε，γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。

“抗体片段”仅包含完整抗体的一部分，其中所述部分优选保留当该部分存在于完整抗体中时通常与之相关的至少一种、优选大部分或所有功能。抗体片段的实例包括Fab，Fab'，F(ab')₂和Fv片段；双抗体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点并因此保留结合抗原的能力。在另一个实施方案中，抗体片段，例如包含Fc区的抗体片段，保留当Fc区存在于完整抗体中时通常与之相关的至少一种生物学功能，比如FcRn结合、抗体半衰期调节、ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，抗体片段为具有基本类似于完整抗体的体内半衰期的单价抗体。例如，这样的抗体片段可包含与能够赋予该片段以体内稳定性的Fc序列连接的抗原结合臂。

术语“高变区”、“HVR”或“HV”，在用于本文时指抗体可变域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的的区域。通常，抗体包含六个高变区：三个在VH中(H1，H2，H2)，三个在VL中(L1，L2，L3)。本文中使用和涵盖许多高变区的叙述。Kabat互补决定区(CDR)是以序列可变性为基础的并且是最常使用的(Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。Chothia改为指结构环的位置(Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM高变区代表Kabat CDR和Chothia结构环之间的折衷，并且得到Oxford Molecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触”高变区是以可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。

高变区可包含如下“延伸的高变区”：VL中的24-36(L1)，46-56(L2)和89-97(L3)以及VH中的26-35(H1)，47-66或49-66或50to66(H2)以及93-101或93-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变域残基是依照Kabat等，见上文编号的。

“框架”或“FR”残基为除了如本文定义的高变区残基的那些可变域残基。

“人源化”形式的非人(例如，鼠)抗体为含有来自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体为其中受体的高变区残基被具有期望特异性、亲和力和能力的非人种类比如小鼠、大鼠、兔子和非人灵长类的高变区残基所取代的人免疫球蛋白。在一些情况下，所述人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人残基所取代。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中找不到的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含基本上所有或至少一个，以及典型地两个可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，并且所有或基本上所有的FR为人免疫球蛋白序列的FR。所述人源化抗体任选地也将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型地人免疫球蛋白的的恒定区。

“嵌合”抗体(免疫球蛋白)的重链和/或轻链的全部或部分与来自特定种类或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而所述链的其余部分与来自另一种类或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们表现出期望的生物学活性。如本文使用的人源化抗体为嵌合抗体的一个亚型。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。通常，所述scFv多肽进一步包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。

“抗原”为抗体可选择性与其结合的预定抗原。靶抗原可为多肽、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其它天然存在的或合成的化合物。

术语“双抗体(diabody)”指具有两个抗原结合位点的小的抗体片段，该片段在同一条多肽链(VH-VL)中包含与轻链可变域(VL)相连接的重链可变域(VH)。通过使用太短以至于不允许相同链上的两个结构域之间配对的接头，迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点。

“人抗体”为具有与由人产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列和/或已使用如本文公开的制备人抗体的任何技术制备的抗体。人抗体的这一定义特异性排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

“亲和力成熟”抗体为在抗体的一个或多个CDR中具有一处或多处改变、导致抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。

“阻断性”抗体或“拮抗性”抗体为抑制或降低其所结合的抗原的生物学活性的抗体。优选的阻断性或拮抗性抗体基本上或完全抑制抗原的生物学活性。以类似的方式，本文使用的术语“激动剂”包括促进、增强或刺激其所结合的抗原的生物学活性的任何分子。

“病症”或“疾病”为将受益于用本发明的物质/分子或方法治疗的任何病况。这包括慢性和急性病症或疾病，其包括使哺乳动物倾向于所讨论病症的那些病理状况。与T细胞活化和增殖有关的并且要被治疗的病症的非限制性实例包括人自身免疫性和炎症性疾病以及移植物抗宿主疾病和移植物排斥。这些疾病包括但不限于类风湿性关节炎、红斑狼疮、自身免疫性糖尿病、移植、多发性硬化、骨关节炎、Crohn氏病、溃疡性结肠炎，和自身免疫性疾病比如狼疮和混合自身免疫性疾病、胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、糖尿病、实验性自身免疫性脑脊髓炎、急性播散性脑脊髓炎、关节炎、类风湿性关节炎、实验性自身免疫性关节炎、重症肌无力、甲状腺炎、桥本氏病、原发性黏液水肿(primarymyxedema)、甲状腺功能亢进、恶性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、Addison氏病、早绝经、男性不育、青少年糖尿病、Goodpasture氏综合征、寻常天疱疮、类天疱疮、交感性眼炎、晶状体源性葡萄膜炎、自身免疫性溶血性贫血(autoimmune haemolyticanaemia)、先天性白细胞减少(idiopathic leucophenia)、原发性胆汁性肝硬化、慢性活动性肝炎Hbs-ve、隐源性肝硬化、溃疡性结肠炎、Sjogren氏综合征、硬皮病、Wegener氏肉芽肿病、多发性肌炎/皮肌炎、盘状LE、牛皮癣、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征、再生障碍性贫血、自身免疫性肝炎、乳糜泻、Graves氏病、格林-巴利综合征(GBS)、特发性血小板减少性紫癜、斜视眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)、视神经炎、ORd氏甲状腺炎、天疱疮、多发性关节炎、原发性胆汁性肝硬化、Reiter氏综合征、高安氏病、颞动脉炎、温抗体型自身免疫性溶血性贫血、Wegener氏肉芽肿病、普秃、Behcet氏病、Chagas氏病、慢性疲劳综合征、家族性自主神经异常、子宫内膜异位、化脓性大汗腺炎、间质性膀胱炎、神经性肌强直、肉状瘤病、硬皮病、溃疡性结肠炎、白癜风、外阴痛、炎症性皮肤病、变应性接触性皮炎、H.pylory胃炎、慢性鼻腔炎症性疾病(chronic nasal inflammatory disease)、动脉硬化和移植物抗宿主疾病。

本文的“自身免疫性疾病”是这样的疾病或病症，起因于并针对个体自身的组织或器官或其共分离或表现或由其导致的病况。在许多这些自身免疫性和炎症性病症中，可能存在许多临床和实验室标志物，包括但不限于血丙种球蛋白过多、高水平的自身抗体、组织中的抗原-抗体复合物沉积、受益于皮质类固醇或抑制免疫力的治疗，以及受影响的组织中的淋巴细胞聚集。

如本文使用的，“治疗”指试图改变被治疗的个体或细胞的天然过程的临床干预，并且可以为了预防或在临床病理期间进行。期望的治疗效果包括防止疾病的发生或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接的病理后果、降低疾病进展速率、改善或减轻疾病状态和缓解或改善预后。

“个体”为脊椎动物比如哺乳动物或人。哺乳动物包括但不限于家畜(比如牛)、运动动物、宠物(比如猫、狗和马)、灵长类、小鼠和大鼠。

“有效量”指以必要的剂量和时间段对达到期望的治疗或预防结果有效的量。

本发明的物质/分子、激动剂或拮抗剂的“治疗有效量”可根据影响因素比如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及所述物质/分子、激动剂或拮抗剂在所述个体中引起期望的响应的能力而变化。治疗有效量也为其中所述物质/分子、激动剂或拮抗剂的任何毒性或有害效应被治疗上的有益效应超过的量。“预防有效量”指以必要的剂量和时间段对达到期望的预防结果有效的量。通常但非必然地，由于在疾病早期之前或疾病早期在受试者中使用预防剂量，所以预防有效量将小于治疗有效量。

如上文所指出的，还没有研究sema4A在人免疫系统中的生物学功能。在先前的研究中，我们表明CRTH2+记忆Th2细胞在维持与变应性疾病有关的Th2响应中起重要作用。具体地，我们发现CRTH2+记忆Th2细胞一旦活化可立即快速产生高水平的Th2细胞因子IL-4、IL-5和IL-13。此外，我们发现TSLP活化的DC诱导CD4+Th2记忆细胞的稳健扩增和进一步的Th2进程(Wang,YH等.Immunity.24(6):827-38,2006)。通过大量的微阵列表达分析，我们发现人CRTH2+Th2记忆细胞选择性地表达两种表面受体包括IL-25受体和Sema4A。(Want,YH等.J Exp Med.204(8):1837-47,2007)。

第一次，我们证明Sema4A在人体中在共刺激T细胞增殖和调节Th2响应中具有独特的功能。为了探讨Sema4A的机制，我们生成几个批次的针对人Sema4A的单克隆抗体并进行抗体的功能测定。然后，我们获得了可阻止重组人Sema4A介导的T细胞增殖和Th2分化的总计16个克隆的单克隆抗体。

本发明的组合物和制备其的方法

本发明包含组合物，包括药物组合物(其包含抗人sema4a抗体)，和包含编码抗人sema4a抗体的序列的多核苷酸。如本文使用的，组合物包含结合人sema4a的一种或多种抗体，和/或包含编码结合人sema4a的一种或多种抗体的序列的一种或多种多核苷酸。这些组合物可进一步包含合适的载体，比如药学上可接受的赋形剂包括缓冲液，这是本领域中众所周知的。

所述抗人sema4A抗体是单克隆的。本文提供的抗人sema4A抗体的Fab、Fab'、Fab'-SH和F(ab')₂片段也包含在本发明的范围之内。这些抗体片段可通过传统的手段比如酶消化产生，或者可通过重组技术生成。此类抗体片段可为嵌合的或人源化的。这些片段可用于下文列举的诊断和治疗目的。

单克隆抗体从基本上同源的抗体群获得，即包含所述群的个体的抗体是相同的，除了可小量存在的可能天然发生的突变外。

本文提出的抗sema4A抗体可通过使用组合库筛选具有期望活性(activity)或活性(activities)的合成抗体克隆而制备。在原理上，通过筛选噬菌体文库来选择合成抗体克隆，所述噬菌体文库含有展示融合至噬菌体外壳蛋白的各种抗体可变区片段(Fv)的噬菌体。表达能够结合所需抗原的Fv片段的克隆被吸附至抗原并因此与文库中的非结合克隆分开。然后将结合的克隆从抗原上洗脱，并且可通过额外的抗原吸附/洗脱循环进一步富集。

抗人Sema4A单克隆抗体

抗人sema4A单克隆抗体的生成可通过例如用按既定方案转染人sema4A的小鼠细胞系免疫小鼠来进行。

我们设计了详尽的筛选以检测通过抑制Tr1细胞的生成和功能引发sema4A信号传递的那些克隆(即，激动剂抗体)。进一步纯化那些克隆。针对sema4A的激动剂抗体可被人源化并单独或与抗肿瘤疫苗和其它佐剂联合用于人类抗肿瘤治疗的临床方案。几种不同的肿瘤类型可为这些抗体的靶标，包括黑素瘤、淋巴瘤和乳腺癌。

BALB/c雌性小鼠也可用于脚垫或皮下免疫。每个小鼠应用转染人sema4A的小鼠L细胞(L-sema4A)注射。小鼠必须在注射后几天处死并且去除腿弯部淋巴结(来自脚垫免疫)或脾脏(来自皮下免疫)。然后以1:1的比例将细胞与SP2.0骨髓瘤细胞融合以使用既定方案产生杂交瘤克隆。然后分泌单克隆抗体的杂交瘤克隆可通过ELISA试验对于它们与L-sema4A细胞的结合特异性进行筛选。结合L-sema4A细胞而非L亲本细胞的杂交瘤上清可通过流式细胞术分析进一步测试其在L-sema4A和SUPM2-sema4A细胞上的结合。

嵌合和人源化抗体

人源化(有时也称为“重塑(reshaping)”或“CDR移植”)是用于降低来自异种来源(包括但不限于啮齿动物)的单克隆抗体的免疫原性以及用于提高人免疫系统的活性的一种既定技术。尽管使用分子生物学技术产生工程化单克隆抗体的技术是已知的，但是啮齿动物补体决定区(“CDR”)向人框架的简单移植不总是重构最初的单克隆抗体的结合亲和力和特异性。

为了人源化抗体，人源化抗体的设计成为复制最初分子的功能中的关键步骤。这种设计包括各种选择：CDR的范围，使用的人框架以及将来自啮齿动物单克隆抗体的残基到人框架区的取代(回复突变)。这些回复突变的位点大部分已通过序列/结构分析或通过可变区的3D结构的同源模型分析进行鉴定。

近来，噬菌体文库已用于改变所选择的位点的氨基酸。类似地，许多方法已被用于选择将啮齿动物CDR移植至其中的最适合的人框架。早期实验使用有限亚型的良好表征的人单克隆抗体(其中结构常常但不总是可得的)，不考虑与啮齿动物单克隆抗体的序列同一性(所谓的固定的框架方法)。一些小组使用与啮齿动物可变区具有高度氨基酸序列同一性(同源匹配或最佳拟合)的可变区；其他人使用共有或种系序列而还有其他人选择来自几种不同的人单克隆抗体的每个轻链可变区或重链可变区内的框架序列的片段。还有用在人单克隆抗体中存在的最常见的残基取代表面啮齿动物残基的所开发的人源化方法(“表面重建”或“贴面”)和使用不同范围定义的CDR的那些。

人源化抗sema4A抗体的表达

本发明的抗体或抗体部分可通过免疫球蛋白轻链和重链基因在宿主细胞中的重组表达而制备。为了重组表达抗体，宿主细胞用携带编码抗体的免疫球蛋白轻链和重链的DNA片段的一种或多种重组表达载体转染，从而使得轻链和重链在宿主细胞中表达，优选地，分泌至宿主细胞在其中培养的培养基中，所述抗体可从该培养基回收。使用标准的重组DNA方法以获得抗体重链和轻链基因，将这些基因整合入重组表达载体并将该载体引入宿主细胞，比如在Sambrook,Fritsch和Maniatis(编辑),Molecular Cloning；A Laboratory Manual,第二版,ColdSpring Harbor,N.Y.,(1989),Ausubel,F.M.等(编辑)Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publishing Associates,(1989)和由Boss等在美国专利第4,816,397号中描述的那些。

抗体和抗体片段和变体可从各种动物细胞生产，优选地从哺乳动物细胞，特别优选鼠和人细胞。同样，重组DNA表达系统可包括利用已经被工程化以生产高水平的特定蛋白的宿主细胞和表达构建体的那些。这样的宿主细胞和表达构建体可包括大肠杆菌(Escherichia coli)；携带来源于质粒或病毒(噬菌体)的表达构建体；酵母比如Sacharomyces cerevisieae或Fichia pastoras，携带游离的或染色体整合的表达构建体；昆虫细胞和病毒比如Sf9细胞和杆状病毒；以及哺乳动物细胞，携带游离的或染色体整合的(包括但不限于逆转录病毒)表达构建体(这类方法例如可参见稿件Verma等,J.Immunol.Methods216:165-181,1998)。抗体也可在植物中生产(这类方法例如可参见美国专利第6,046,037号；Ma等,Science268:716-719,1995)或通过噬菌体展示技术生产(这类方法例如可参见Winter等,Annu.Rev.Immunol.12:433-455,1994)。

表现所期望的活性水平和结合特异性/亲和力的人抗sema4A抗体可进一步通过标准重组DNA技术操作以例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VL或VH的DNA片段与编码另一蛋白比如抗体恒定区或柔性接头的另一DNA片段可操作地连接。如在本文背景下使用的，术语“可操作地连接”意图指两个DNA片段被连接以使由两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在框内。

在另一方面，编码VH区的分离的DNA可通过将编码VH的DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子可操作地连接而转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在本领域中是已知的(参见例如Kabat,E.A.等.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)并且通过标准PCR扩增可获得包含这些区段的DNA片段。所述重链恒定区可以是IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，IgE，IgM或IgD恒定区以及Kabat描述的其任何同种异型变体(Kabat,E.A.等.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)，但是最优选为IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，编码VH的DNA可与仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子可操作地连接。

编码VL区的分离的DNA可通过将编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的另一DNA分子可操作地连接而转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列在本领域中是已知的(参见例如Kabat,E.A.等.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,U.S.Department ofHealth and Human Services,NIH Publication No.91-3242)并且通过标准PCR扩增可获得包含这些区段的DNA片段。所述轻链恒定区可为κ或λ恒定区。

为了创建scFv基因，编码VH和VL的DNA片段与编码柔性接头(例如编码氨基酸序列(Gly.sub.4-Ser).sub.3)的另一片段可操作地连接，从而使得VH和VL序列可表达为连续的单链蛋白，所述VL和VH区通过所述柔性接头连接(参见例如Bird等(1988)Science242:423-426；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883；McCafferty等,Nature(1990)348:552-554)。

本文所述抗体的氨基酸序列修饰是所预期的。例如，可期望提高抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗体的氨基酸序列变体通过将适当的核苷酸变化引入抗体核酸，或通过肽合成来制备。这样的修饰包括例如将抗体的氨基酸序列中的残基缺失和/或插入和/或取代。可进行缺失、插入和取代的任意组合以达到最终的构建体，只要最终的构建体具有所期望的特征。氨基酸变化可在制得序列的同时被引入受试者抗体氨基酸序列中。

用于鉴定抗体的某些残基或区域为诱变优选位点的有效方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham and Wells(1989)Science,244:1081-1085所描述的。在这里，鉴定了靶残基的残基或基团(例如，带电荷残基比如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)并由中性或带负电荷氨基酸(最优选丙氨酸或多丙氨酸)取代以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后显示对取代功能敏感的那些氨基酸位点通过在或对取代的位点引入其它变体进行完善。因此，虽然预先确定了引入氨基酸序列变体的位点，但是突变本身的性质不需要预先确定。例如，为分析在给定位点突变的性能，在靶密码子或靶区域进行丙氨酸扫描或随机诱变并筛选所表达的免疫球蛋白的所期望的活性。

氨基酸序列插入包括长度范围为一个残基至包含一百或更多残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N末端或C末端与增加抗体的血清半衰期的酶(例如用于ADEPT)或多肽的融合。抗体的另一类型的氨基酸变体改变抗体的原始糖基化模式。这样的改变包括缺失抗体中存在的一个或多个碳水化合物部分和/或加入抗体中不存在的一个或多个糖基化位点。

另一类型的变体为氨基酸取代变体。这些变体具有由不同残基取代的抗体分子中的至少一个氨基酸残基。最有兴趣进行取代诱变的位点包括超变区，但是FR改变也是预期的。保守取代在通过引用并入本文的美国专利第7,812,133号表1中第43栏第55列至第44栏第49列以及在“优选的取代”的标题下。如果这样的取代导致生物学活性的变化，则可引入表1中称为“示例性取代”或如下文参考氨基酸分类而进一步描述的更实质性改变并筛选产物。

此外，抗体的生物学特性的实质性修改通过选择取代来完成，所选的取代在它们对维持(a)取代区多肽骨架的结构，例如片层或螺旋构型，(b)靶位点处该分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的大小的影响上显著不同。天然存在的残基根据共有的侧链特性可分为:(1)疏水性：正亮氨酸，甲硫氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸、异亮氨酸；(2)中性亲水：半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺；(3)酸性：天冬氨酸，谷氨酸；(4)碱性：组氨酸，赖氨酸，精氨酸；(5)影响链定向的残基：甘氨酸，脯氨酸；和(6)芳香族：色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。非保守取代将限定这些类之一的成员被改变为另一类。

为了表达本文描述的抗体或抗体部分，将如上文所述获得的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入表达载体，以使所述基因与转录调控序列和翻译调控序列可操作地连接。在本上下文中，术语“可操作地连接”意图指抗体基因连接入载体，使得所述载体内的转录调控序列和翻译调控序列发挥其调节抗体基因转录和翻译的预期功能。选择与使用的表达宿主细胞相配的表达载体和表达调控序列。抗体轻链基因和抗体重链基因可插入单独的载体，或更典型地，两种基因插入同一个表达载体。所述抗体基因通过标准方法(例如在抗体基因片段和载体上连接互补限制性位点，或如果没有限制性位点则平末端连接)插入所述表达载体。

重组表达载体可编码有助于抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。抗体链基因可克隆至载体以使信号肽在框内与抗体链基因的氨基末端连接。所述信号肽可为免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白的蛋白的信号肽)。

如上文所指出的，除了抗体链基因外，本发明的重组表达载体携带调控抗体链基因在宿主细胞中表达的调节序列。术语“调节序列”意图包括调控抗体链基因的转录或翻译的启动子、增强子和其它表达调控元件(例如多腺苷酸化信号)。这样的调节序列在例如Goeddel；Gene Expression Technology:Methods inEnzymology185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)中进行描述。可以理解的是，表达载体的设计，包括调节序列的选择，可能取决于诸如有待转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白表达的水平等的因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选的调节序列包括在哺乳动物细胞中引导高水平蛋白表达的病毒元件，比如来源于以下病毒的启动子和/或增强子：巨细胞病毒(CMV)(比如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(比如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒。对于病毒调节元件和其序列的进一步描述，参见例如Stinski的美国专利申请第5,168,062号，Bell等的美国专利申请第4,510,245号以及Schaffner等的美国专利申请第4,968,615号，Bujard等的美国专利申请第5,464,758号和Bujard等的美国专利申请第5,654,168号。

除了抗体链基因和调节序列外，本发明的重组表达载体可携带另外的序列，比如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起点)和选择标记基因。所述选择标记基因有助于载体已经引入其中的宿主细胞的选择(参见例如，均为Axel等的美国专利第4,399,216，4,634,665和5,179,017号)。例如，所述选择标记基因通常赋予载体已经引入其中的宿主细胞以对药物比如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于甲氨蝶呤选择/扩增的dhfr.sup.-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。

为了表达轻链和重链，编码重链和轻链的表达载体通过标准技术转染入宿主细胞中。各种形式的术语“转染”意图包括通常用于将外源DNA引入原核生物宿主细胞或真核生物宿主细胞的各种各样的技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖转染等。尽管理论上可在原核生物宿主细胞或真核生物宿主细胞中表达本发明抗体，但是在真核生物宿主细胞中并最优选哺乳动物宿主细胞中表达抗体是最优选的，因为这样的真核生物细胞、尤其是哺乳动物细胞较原核生物细胞更可能装配和分泌适当折叠的免疫活性抗体。用于表达本文描述的重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国苍鼠卵巢细胞(CHO细胞)(比如Urlaub和Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA77:4216-4220中描述的、与DHFR选择标记一起使用的(例如如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159:601-621中所描述的)dhfr-CHO细胞)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当编码抗体基因的重组表达载体被引入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞足以允许抗体在宿主细胞中表达、所述抗体分泌至宿主细胞在其中生长的培养基中的时间生产所述抗体。使用标准蛋白纯化方法可从培养基中回收抗体。

宿主细胞也可以用来产生完整抗体的一部分，例如Fab片段或scFv分子。应该理解的是，关于上述程序的各种改变也在本发明的范围内。例如，可期望用编码本发明抗体的轻链或重链(但不是两者)的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术也可用来去除结合sema4A非必需的编码轻链和重链之一或二者的DNA的一些或全部。本发明的抗体也包括从这样的截短DNA分子所表达的分子。另外，可以使用标准化学交联方法交联本发明抗体与第二种抗体制备双功能抗体，其中一条重链和一条轻链是本发明的抗体，而另一条重链和轻链是非sema4A抗原特异性的。

本文教导的任何抗人sema4A抗体可通过设计合适的抗原筛选程序以选择感兴趣的噬菌体克隆，然后使用来自感兴趣的噬菌体克隆的Fv序列和Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,NIH Publication91-3242,Bethesda Md.(1991),vols.1-3中描述的合适的恒定区(Fc)序列构建全长抗人sema4A抗体克隆而获得。

在这种情况下，抗体的抗原结合域由两个大约110个氨基酸的可变(V)区构成，两个可变区分别来自轻链(VL)和重链(VH)，均呈现三个高变环或互补决定区(CDR)。可变域可在噬菌体上功能性地展示，或是作为单链Fv(scFv)片段，其中VH和VL通过短的、柔性肽共价连接，或是作为Fab片段，其中它们各自与恒定域融合且非共价相互作用。如本文使用的，编码scFv的噬菌体克隆和编码Fab的噬菌体克隆统称为“Fv噬菌体克隆”或“Fv克隆”。

VH和VL基因的全集可以通过聚合酶链反应(PCR)分别克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以搜索抗原结合克隆。来自免疫来源的文库提供对免疫原有高亲和力的抗体，无需构建杂交瘤。或者，可以克隆未免疫的全集，用于为广泛的非自身的以及自身的抗原提供单一的人抗体来源，无需任何免疫。最后，未免疫的文库还可通过从干细胞克隆未重排的V基因节段，并使用包含随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区和实现体外重排而合成制备。

丝状噬菌体可通过与次要外壳蛋白pIII融合而用于展示抗体片段。所述抗体片段可展示为单链Fv片段，其中VH和VL结构域通过柔性多肽间隔物在同一多肽链上相连，或展示为Fab片段，其中一条链与pIII融合且另一条链分泌至细菌宿主细胞周质，在此装配Fab-外壳蛋白结构，其通过置换一些野生型外壳蛋白而展示在噬菌体的表面上。

通常，编码抗体基因片段的核酸由获自人类或动物的免疫细胞获得。如果偏向抗人sema4A克隆的文库是所期望的，那么用sema4A免疫受试者以产生抗体响应，并回收脾细胞和/或循环B细胞或其它外周血淋巴细胞(PBL)用于文库构建。

偏向抗人sema4A克隆的人抗体基因片段文库通过在携带功能性人免疫球蛋白基因阵列(且缺乏功能性内源抗体产生系统)的转基因小鼠中产生抗人sema4A抗体响应，使得sema4A免疫导致B细胞产生针对sema4A的人抗体而获得。

或者，使用来自未免疫供体的脾细胞和/或B细胞或其他PBL提供可能的抗体全集的更好的呈现，并且还允许使用其中sema4A不是抗原的任何动物(人或非人)物种构建抗体文库。

对于体外掺入抗体基因的文库构建，从受试者收获干细胞以提供编码未重排的抗体基因节段的核酸。感兴趣的免疫细胞可从多种动物物种，比如人、小鼠、大鼠、兔类、luprine、犬、猫、猪、牛、马和鸟类物种等获得。

从感兴趣的细胞回收编码抗体可变基因节段(包括VH和VL节段)的核酸并进行扩增。就重排的VH和VL基因文库而言，所需DNA可通过如下获得：从淋巴细胞分离基因组DNA或mRNA，然后用与重排的VH和VL基因的5’末端和3’末端匹配的引物进行聚合酶链反应(PCR)，从而制备多样性V基因全集用于表达。

抗体片段的全集可通过以数种方式将VH和VL基因全集组合在一起而构建。可以在不同载体中创建各个全集，并在体外或通过组合感染例如loxP系统在体内重组所述载体。所述体内重组方法利用Fab片段的双链性质来克服由大肠杆菌转化效率施加的文库容量的限制。未免疫的VH和VL全集分别克隆，一个克隆入噬菌粒，另一个克隆入噬菌体载体。然后将两个文库通过噬菌体感染含噬菌粒的细菌而合并，这样使得每个细胞包含不同的组合并且文库的容量仅由存在的细胞数目限制(大约10¹²个克隆)。两种载体均包含体内重组信号，使得VH和VL基因重组至单一复制子上并共包装成噬菌体病毒粒。这些巨型文库提供了大量的良好亲和力(约10^-8M的K_d ^-1)的多样性抗体。

或者，可以将全集循序克隆至同一载体，或者通过PCR装配到一起，然后克隆。PCR装配还可用于用编码柔性肽间隔物的DNA连接VH和VL DNA以形成单链Fv(scFv)全集。在另一种技术中，“细胞内PCR装配”用于通过PCR在淋巴细胞内组合VH和VL基因，然后克隆所连接基因的全集。

通过未免疫文库(天然的或合成的)产生的抗体可为中等亲和力(大约10⁶至10⁷M¹的K_d ^-1)，但还可以通过次级文库的构建和再选择体外模拟亲和力成熟。

另外，可以通过随机突变一个或多个CDR来进行亲和力成熟，例如在选出的个体Fv克隆中使用携带跨越感兴趣的CDR的随机序列的引物进行PCR并筛选更高亲和力的克隆。WO9607754(公布于1996年3月14日)描述了用于在免疫球蛋白轻链的互补决定区中诱导突变形成以创建轻链基因文库的方法。另一种有效途径为将通过噬菌体展示选出的VH或VL结构域与来自未免疫供体的天然存在的V结构域变体的全集重组，并在数轮链改组中筛选更高亲和力。该技术允许产生具有10^-9M范围的亲和力的抗体和抗体片段。

制备抗人Sema4A单克隆抗体以及其随后的抗体产生

本发明的抗人sema4A单克隆抗体可使用最初由Kohler等,Nature,256:495(1975)记载的杂交瘤方法制备，或者可通过重组DNA方法制备(U.S.Pat.No.4,816,567)。

在杂交瘤方法中，对小鼠或其它适当的宿主动物，比如仓鼠进行免疫以诱导产生或能够产生将与免疫所用蛋白质特异性结合的抗体的淋巴细胞。或者，可体外免疫淋巴细胞。然后，使用合适的融合剂(比如聚乙二醇)使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principlesand Practice,59-103页(Academic Press,1986))。

将由此制备的杂交瘤细胞在优选包含抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质的合适的培养基中接种和生长。优选的骨髓瘤细胞为有效地融合，支持选出的产生抗体的细胞稳定高水平的产生抗体，并且对于培养基敏感的那些。

测定其中杂交瘤细胞正生长的培养基产生针对人sema4A的单克隆抗体。通过杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性可通过免疫沉淀或通过体外结合测定比如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)确定。单克隆抗体的结合亲和力例如可通过Munson等,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析确定。

鉴定出产生所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，克隆可通过有限稀释程序进行亚克隆并按标准方法生长。用于此目的的合适的培养基包括，例如，D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，所述杂交瘤细胞可作为腹水肿瘤在动物中体内生长。

由所述亚克隆分泌的单克隆抗体通过常见的免疫球蛋白纯化程序比如，例如，蛋白-A-Sepharose、羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法适当地从培养基、腹水液或血清中分离。

下文表I到IV中提供了结合人sema4A的特异性单克隆抗体。

表I

针对人Sema4A的单克隆抗体

克隆号	IG同种型	FACS染色	封闭	组织学染色
					126-25B-1	IgG1	是	是	否
126-28-1	IgG2a	是	是	是
					126-31B-1	IgG2a	是	否	否
126-63-1	IgG1	是	是	否
					126-65B-1	IgG2b+IgG1	是	是	否
161-15B	IgG1	是	是	否
					161-18B	IgG1	是	是	是
161-33	IgG2B	是	否	否
					161-35	IgG2A	是	是	否
161-44	IgG2B	是	是	是
					161-49	IgG2B	是	是	否
161-51	IgG1	是	是	否

161-66	IgG2A	是	是	否
					161-70	IgG2A	是	是	是
161-90	IgG2A	是	是	是
					161-96B	IgG2B	是	是	否
161-110B	IgG2A	是	是	否
					161-117	IgG2A	是	是	否
161-118A	IgG2A	是	否	否

表II 对FACS染色和封闭起作用的单克隆抗体克隆

克隆号	IG同种型	FACS染色	封闭
				126-25B-1	IgG1	是	是
126-28-1	IgG2a	是	是
				126-63-1	IgG1	是	是
126-65B-1	IgG2b+IgG1	是	是
				161-15B	IgG1	是	是
161-18B	IgG1	是	是
				161-35	IgG2A	是	是
161-44	IgG2B	是	是
				161-49	IgG2B	是	是
161-51	IgG1	是	是
				161-66	IgG2A	是	是
161-70	IgG2A	是	是
				161-90	IgG2A	是	是

161-96B	IgG2B	是	是
				161-110B	IgG2A	是	是
161-117	IgG2A	是	是

表III 对FACS染色、封闭和组织学染色起作用的克隆

克隆号	IG同种型	FACS染色	封闭	组织学染色
					126-28-1	IgG2a	是	是	是
161-18B	IgG1	是	是	是
					161-44	IgG2B	是	是	是
161-70	IgG2A	是	是	是
					161-90	IgG2A	是	是	是

表IV 仅对FACS染色起作用的克隆

克隆号	IG同种型	FACS染色	封闭	组织学染色
					126-31B-1	IgG2a	是	否	否
161-33	IgG2B	是	否	否
					161-118A	IgG2A	是	否	否

小鼠161-51-1、161-70-1和161-15B-1单克隆抗体的可变区基因的克隆和测序

将小鼠161-51-1、161-70-1和161-15B1杂交瘤细胞在含10％胎牛血清(HyClone,Logan,UT)和1mM丙酮酸钠的RPMI-1640培养基中在37℃在7.5％CO₂培养箱中培养。使用TRIzol试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)按照供应商的方案从大约8x10⁶个杂交瘤细胞提取总RNA。使用SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech,Mountain View,CA)按照供应商的方案合成以寡dT为引物的cDNA。使用分别与小鼠γ和κ链恒定区退火的3'引物和SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒中提供的5’-RACE引物(通用引物A混合物或巢式通用引物A)，用Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs,Beverly,MA)通过聚合酶链反应(PCR)扩增161-51-1、161-70-1和161-15B-1重链和轻链的可变区cDNA。对于161-51-1和161-15B-1的重链可变区(VH)的PCR扩增，结合小鼠γ-1基因的3'引物具有序列5'-GCCAGTGGATAGACAGATGG-3'(MCG1)。对于161-70-1VH的PCR扩增，结合小鼠γ-2a基因的3'引物具有序列5'-GCCAGTGGATAGACCGATGG-3'(MCG2A)。对于全部三个抗体的轻链可变区(VL)的PCR扩增，3'引物具有序列5'-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3'(MCK)。将扩增的VH和VL cDNA克隆入pCR-Blunt II-TOPO载体(Invitrogen)用于序列确定。在Tocore(Menlo Park,CA)进行可变区的DNA测序。每个抗体测序数条重链和轻链克隆，鉴定与典型的小鼠重链和轻链可变区同源的独特序列。

161-51-1VH和VL共有的cDNA序列连同推导的氨基酸序列分别示于图23和24。在各图中，信号肽序列为斜体的并且根据Kabat等(Sequences of Proteins ofImmunological Interests,第五版,NIH公开号.91-3242,U.S.Department of Healthand Human Services,1991)的定义的CDR序列为下划线的。同样地，161-70-1VH和VL共有的cDNA序列连同推导的氨基酸序列分别示于图25和26。161-15B-1VH的共有cDNA序列连同推导的氨基酸序列分别示于图27。至于161-15B-1VL，获得两个有效的(productive)VL序列。来自161-15B-1杂交瘤细胞的九个有效的VL序列中的七个具有如图28中的161-15B-1VL1所示的序列。所述九个有效的VL序列中的两个具有如图29中的161-15B-1VL2所示的序列。仅仅一种有效的VH序列示于图27从161-15B-1杂交瘤细胞获得。下文表V提供了与本文描述的人源化抗体有关的信息。

表V

人源化mAb

抗Sema4A mAb人源化(酸洗脱)

克隆名称	批次号
		ChLB51	批次12/6/11
HuLB51#1	批次1/12/12
		HuLB51#2	批次1/5/12
ChLB70，	批次12/30/11

HuLB70#1	批次1/13/12
		HuLB70#2	批次1/12/12

ChLB51：嵌合161-51-1；HuLB51-1和HuLB51-2：人源化161-51-1的两种

形式；

ChLB70：嵌合161-70-1；HuLB70-1和HuLB70-2：人源化161-70-1的两种

形式；

*HuLB51-1和HuLB51-2的VH区中的一个aa彼此不同

*HuLB70-1和HuLB70-2的VH区中的一个aa彼此不同

基于来自抗体产生细胞的分离的多核苷酸序列的抗体产生

编码抗体多肽组件的多核苷酸序列可使用标准重组技术获得。如上文所指出的，所需多核苷酸序列可从抗体产生细胞比如杂交瘤细胞分离和测序。或者，多核苷酸可使用核苷酸合成器或PCR技术合成。

一旦获得，就将编码多肽的序列插入能够在真核宿主或原核宿主中复制和表达异源性多核苷酸的重组载体。本领域中可获得的和已知的许多载体可用于此目的。适当载体的选择将主要取决于要插入载体的核酸的大小和要用载体转化的特定的宿主细胞。

每个载体含有不同的组件，取决于其功能(异源性多核苷酸的扩增或表达，或两者兼具)和其与其存在的特定宿主细胞的相容性。所述载体组件通常包括但不限于：复制起点、选择标记基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入和转录终止序列。

宿主细胞可用表达载体和/或核酸转化、转导或转染并在改良为适于诱导启动子、选择转化株或扩增编码所需序列的基因的培养基中培养。对于原核细胞，可使用本领域中已知的标准的蛋白纯化方法。下列程序为合适的纯化程序的示例：在免疫亲和柱或离子交换柱上的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、在二氧化硅或阳离子交换树脂比如DEAE上的色谱分析、聚焦层析、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、以及使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤。

当使用真核宿主细胞产生抗体时，所述载体组件通常包括但不限于下列中的一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。供真核宿主细胞中使用的载体也可包含信号序列或在感兴趣的成熟蛋白或多肽的N末端具有特定剪切位点的其它多肽。优选选择的异源信号序列为被宿主细胞识别和处理(即，通过信号肽酶切开)的信号序列。在哺乳动物细胞表达中，哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导(viral secretoryleader)，例如单纯性疱疹gD信号可供使用。将这样的前体区域的DNA在读码框中与编码抗体的DNA连接。通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点组件。例如，通常使用SV40起点仅因为其包含早期启动子。

在真核宿主细胞中使用的表达和克隆载体可包含选择基因，也称为可选标记。典型的选择基因编码这样的蛋白质：(a)赋予对抗生素或其它毒素，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素，的抗性，(b)互补营养缺陷型，只要有关，或者(c)提供无法从复合培养基中获得的关键营养物质。选择方案的一个实例利用药物阻滞(arrest)宿主细胞的生长。那些被异源基因成功转化的细胞产生赋予药物抗性的蛋白，从而在选择中存活。这样的显性选择的实例使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。适合用于哺乳动物细胞的可选标记的另一个实例为能够鉴定出能摄取抗体核酸，比如DHFR，胸苷激酶，金属硫蛋白-I和-II、优选灵长类金属硫蛋白基因，腺甙脱氨酶，鸟氨酸脱羧酶等，的细胞的那些。

本文描述的抗体和方法可用于预防或治疗炎症性疾病和病况，比如骨关节炎、类风湿关节炎、Crohn氏病、溃疡性结肠炎，以及自身免疫性疾病比如狼疮和混合性自身免疫性疾病。例如，本文描述的抗体可用于治疗多种自身免疫性和炎症性疾病，包括向需要其的受试者施用治疗有效量的抗体，其中所述自身免疫性疾病或炎症性疾病为下列疾病中的任意一种或多种：胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、糖尿病、多发性硬化、实验性自身免疫性脑脊髓炎、急性播散性脑脊髓炎、关节炎、类风湿性关节炎、实验性自身免疫性关节炎、重症肌无力、甲状腺炎、桥本氏病、原发性黏液水肿、甲状腺功能亢进、恶性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、Addison氏病、早绝经、男性不育、青少年糖尿病、Goodpasture氏综合征、寻常天疱疮、类天疱疮、交感性眼炎、晶状体源性葡萄膜炎、自身免疫性溶血性贫血、先天性白细胞减少、原发性胆汁性肝硬化、慢性活动性肝炎Hb_s-ve、隐源性肝硬化、溃疡性结肠炎、Sjogren氏综合征、硬皮病、Wegener氏肉芽肿病、多发性肌炎/皮肌炎、盘状LE、全身性红斑狼疮、Chron氏病、牛皮癣、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征、再生障碍性贫血、自身免疫性肝炎、乳糜泻、Graves氏病、格林-巴利综合征(GBS)、特发性血小板减少性紫癜、斜视眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)、视神经炎、ORd氏甲状腺炎、天疱疮、多发性关节炎、原发性胆汁性肝硬化、Reiter氏综合征、高安氏病、颞动脉炎、温抗体型自身免疫性溶血性贫血、Wegener氏肉芽肿病、普秃、Behcet氏病、Chagas氏病、慢性疲劳综合征、家族性自主神经异常、子宫内膜异位、化脓性大汗腺炎、间质性膀胱炎、神经性肌强直、肉状瘤病、硬皮病、溃疡性结肠炎、白癜风、外阴痛、炎症性皮肤病、变应性接触性皮炎、H.pylory胃炎、慢性鼻腔炎症性疾病、动脉硬化和移植物抗宿主疾病。

更具体地，如本文提到的“自身免疫性疾病”是这样的疾病或病症，起因于并针对个体自身的组织或器官或其共分离或表现或由其导致的病况。自身免疫性疾病可指由与正常的体组织和抗原反应的抗体的B细胞的产生造成的或加重的病况。并且，自身免疫性疾病为可牵涉对自身抗原(例如核抗原)的表位特异的自身抗体分泌的疾病。

自身免疫性疾病或病症可通过本文描述的任一种或多种抗体治疗和/或预防，包括但不限于关节炎(类风湿性关节炎比如急性关节炎、慢性类风湿性关节炎、痛风或痛风性关节炎、急性痛风性关节炎、急性免疫性关节炎、慢性炎症性关节炎、退行性关节炎、II型胶原诱导的关节炎、感染性关节炎、莱姆关节炎、增生性关节炎、牛皮癣关节炎、斯提耳氏病(Still's disease)、脊椎关节炎、和青少年发病的类风湿性关节炎、骨关节炎、慢性进行性关节炎(arthritis chronicaprogrediente)、变形性关节炎、原发性慢性多发性关节炎(polyarthritis chronicaprimaria)、反应性关节炎以及强直性脊柱炎)、炎症性过度增生性皮肤病、牛皮癣比如斑块状牛皮癣、滴状牛皮癣(gutatte psoriasis)、脓疱性牛皮癣和灰指甲、特应性包括特应性疾病比如枯草热和乔布氏综合征(Job's syndrome)、皮炎包括接触性皮炎、慢性接触性皮炎、剥脱性皮炎、变应性皮炎、变应性接触性皮炎、疱疹样皮炎、钱币状皮炎(nummular dermatitis)、脂溢性皮炎、非特异性皮炎、原发刺激性接触性皮炎和特应性皮炎、X连锁的高IgM综合征、变应性眼内炎症性疾病、荨麻疹比如慢性变应性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹、包括慢性自身免疫性荨麻疹、肌炎、多肌炎/皮肌炎、青年期皮肌炎、中毒性表皮坏死松解症、硬皮病(包括全身性硬皮病)、硬化症如全身性硬化症、多发性硬化(MS)如脊索-视神经MS、原发进行性MS(PPMS)和复发-缓解型MS(RRMS)、进行性全身性硬化症、动脉粥样硬化、动脉硬化症、散播性硬化症(sclerosis disseminata)、共济失调型硬化症、视神经脊髓炎(NMO)、炎性肠病(IBD)(例如，Crohn氏病、自身免疫介导的胃肠疾病、结肠炎比如溃疡性结肠炎、结肠炎溃疡(colitisulcerosa)、微观结肠炎、胶原性结肠炎、息肉性结肠炎、坏死性小肠结肠炎和透壁性结肠炎，以及自身免疫性炎症性肠病)、肠炎、坏疽型脓皮症、结节性红斑、原发硬化性胆管炎、呼吸窘迫综合征，包括成人或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、脑膜炎、全部或部分葡萄膜的炎症、虹膜炎、脉络膜炎、自身免疫性造血系统病症(an autoimmune hematological disorder)、类风湿性脊椎炎、类风湿性滑膜炎、遗传性血管性水肿、脑膜炎中的颅神经损伤(cranial nerve damageas in meningitis)、妊娠疱疹、妊娠性类天疱疮、阴囊瘙痒症(pruritis scroti)、自身免疫性卵巢功能早衰、由于自身免疫性病况的突发性听力损失、IgE介导的疾病比如过敏性和变应性和特应性鼻炎、脑炎比如Rasmussen脑炎以及边缘和/或脑干脑炎、葡萄膜炎例如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽肿性葡萄膜炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、晶状体抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎、具有和不具有肾病综合征的肾小球肾炎(GN)比如慢性或急性肾小球肾炎诸如原发性GN、免疫介导的GN、膜性GN(膜性肾病)、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、膜-或膜性增生性GN(MPGN)包括I型和II型和快速进行性GN、增生性肾炎、自身免疫性多腺体内分泌衰竭、龟头炎包括浆细胞性局限性龟头炎、龟头包皮炎、离心性环状红斑、持久性色素异常性红斑、多形性红斑、环状肉芽肿、光泽苔癣、硬化性萎缩性苔癣、单纯慢性苔癣、小棘苔癣、扁平苔癣、层状鱼鳞癣、表皮松解性角化过度、恶化前角化病、坏疽性脓皮病、变应性病况和响应、变应性反应、湿疹包括变应性或特应性湿疹、缺脂性湿疹、汗不良性湿疹和水泡性掌跖湿疹、哮喘例如哮喘支气管炎、支气管哮喘和自身免疫性哮喘、涉及T细胞浸润和慢性炎症响应的病况、针对外来抗原的免疫反应例如妊娠期间胎儿的ABO血型、慢性肺部炎性疾病、自身免疫性心肌炎、白细胞粘附缺陷、狼疮包括狼疮性肾炎、狼疮性脑炎、小儿狼疮、非肾性狼疮、肾外狼疮、盘状狼疮和盘状红斑狼疮、脱发性狼疮、全身性红斑狼疮(SLE)例如表皮SLE或亚急性表皮SLE、新生儿狼疮综合征(NLE)和播散性红斑狼疮、青少年发病型糖尿病(I型)包括小儿胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、成人发病型糖尿病(II型糖尿病)、自身免疫性糖尿病、特发性尿崩症、糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病、糖尿病性大动脉紊乱、细胞因子和T淋巴细胞介导的与急性和迟发性超敏感性相关的免疫响应、结核病、肉状瘤病、肉芽肿病包括淋巴瘤样肉芽肿病、韦格纳肉芽肿病、粒细胞缺乏、血管炎包括脉管炎、大血管脉管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(Takayasu)动脉炎)、中等血管脉管炎(包括川崎病和结节性多动脉炎/结节性动脉周围炎)、微观多动脉炎、免疫脉管炎、CNS脉管炎、皮肤脉管炎、高敏感性脉管炎、坏死性脉管炎例如全身性坏死性脉管炎以及ANCA相关的脉管炎例如Churg-Strauss脉管炎或综合征(CSS)和ANCA相关的小血管脉管炎、颞动脉炎、再生障碍性贫血、自身免疫性再生障碍性贫血、Coombs阳性贫血、Diamond Blackfan贫血、溶血性贫血或免疫溶血性贫血包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、恶性贫血、阿狄森氏病、纯红细胞性贫血或发育不良(PRCA)、凝血因子VIII缺乏、血友病A、自身免疫性嗜中性白血球减少症、全血细胞减少、白细胞减少、涉及白细胞血球渗出的疾病、CNS炎性疾病、阿尔茨海默氏病、帕金森病、多脏器损伤综合征例如败血症、外伤或出血继发的那些、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜病、抗磷脂抗体综合征、变应性神经炎、Behcet氏病/综合征、Castleman综合征、Goodpasture综合征、雷诺综合征、Sjogren综合征、Stevens-Johnson综合征、类天疱疮例如大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮、天疱疮(包括寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、天疱疮粘膜性类天疱疮和红斑性天疱疮)、自身免疫性多内分泌病、Reiter氏病或综合征、热损伤、先兆子痫、免疫复合物病症例如免疫复合物性肾炎、抗体介导的肾炎、多发性神经病、慢性神经病例如IgM型多发性神经病或IgM抗体介导的神经病变、血小板减少(例如如心肌梗死患者所发展的)包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、输血后紫癜(PTP)、肝素诱发的血小板减少症和自身免疫性或免疫介导的血小板减少症例如特发性血小板减少性紫癜(ITP)包括慢性或急性ITP、巩膜炎例如特发性角膜-巩膜炎、巩膜外层炎、睾丸和卵巢的自身免疫性疾病包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎、原发性甲状腺功能减退、甲状旁腺功能减退、自身免疫性内分泌疾病包括甲状腺炎例如自身免疫性甲状腺炎、桥本氏病、慢性甲状腺炎(桥本氏甲状腺炎)或亚急性甲状腺炎、自身免疫性甲状腺疾病、特发性甲状腺功能减退、Grave氏病、多腺体综合征例如自身免疫性多腺体综合征(或多腺体内分泌综合征)、副肿瘤综合征包括神经系统副肿瘤综合征例如兰伯特-伊顿肌无力综合征或伊顿-兰伯特综合征、僵人或僵人综合征、脑脊髓炎例如变应性脑脊髓炎(allergic encephalomyelitis)或变应性脑脊髓炎(encephalomyelitisallergica)和实验性变应性脑脊髓炎(EAE)、重症肌无力例如胸腺瘤相关的重症肌无力、小脑退化、神经性肌强直、斜视眼阵挛或斜视眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)和感觉神经病变、多灶性运动神经病、Sheehan综合征、自身免疫性肝炎、慢性肝炎、类狼疮肝炎、巨细胞性肝炎、慢性活动性肝炎或自身免疫性慢性活动性肝炎、淋巴间质性肺炎(LIP)、闭塞性细支气管炎(非移植)对比NSIP、格林-巴利综合征，Berger氏病(IgA肾病)、特发性IgA肾病、线性IgA皮肤病、急性热性嗜中性白细胞皮肤病、角质层下脓疱皮肤病、短暂性棘层松解性皮肤病、肝硬化例如原发性胆汁性肝硬变和肺硬变、自身免疫性肠病综合征、腹腔疾病或乳糜泻、口炎性腹泻(麸质肠病)、难治性口炎性腹泻(refractory sprue)、特发性口炎性腹泻、冷沉球蛋白血症、肌萎缩侧索硬化(ALS；Lou Gehrig病)、冠状动脉疾病、自身免疫性耳病例如自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性听力损失、多软骨炎例如难治性或复发性或复发多软骨炎、肺泡蛋白沉积症、Cogan综合征/非梅毒性间质性角膜炎、贝耳氏麻痹、Sweet病/综合征、自身免疫性酒渣鼻、带状疱疹相关疼痛、淀粉样变性、非癌性淋巴细胞增多、原发淋巴细胞增多包括单克隆的B细胞淋巴细胞增多(例如，良性单克隆性丙种球蛋白病和意义未定的单克隆丙种球蛋白病，MGUS)、周围神经病变、副肿瘤综合征、离子通道病例如癫痫、偏头痛、心律失常、肌肉失常、耳聋、失明、周期性麻痹和CNS的离子通道病、孤独症、炎性肌病、局灶性或节段性或局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)、内分泌性眼病、葡萄膜视网膜炎、脉络膜视网膜炎、自身免疫性肝脏疾病、纤维肌痛、多发性内分泌衰竭、Schmidt综合征、肾上腺炎、胃萎缩、早老性痴呆症、脱髓鞘性疾病例如自身免疫性脱髓鞘性疾病和慢性炎症性脱髓鞘性多神经病、Dressler综合征、斑秃(alopecia greata)、全秃、CREST综合征(钙质沉着、雷诺氏现象、食管运动功能障碍、指端硬化和毛细血管扩张症)、男性和女性的自身免疫性不育例如由于抗精子抗体、混合性结缔组织病、Chagas氏病、风湿热、习惯性流产、农民肺、多形性红斑、心脏切开术后综合征、Cushing氏综合征、养鸟人肺、变应性肉芽肿血管炎、良性淋巴细胞性血管炎、Alport综合征、肺泡炎例如变应性肺泡炎和纤维化肺泡炎、间质性肺病、输血反应、麻风病、疟疾、寄生虫病例如利什曼病、kypanosomiasis、血吸虫病、蛔虫病、曲霉病，Sampter综合征、Caplan综合征、登革热、心内膜炎、心内膜心肌纤维化、弥漫性间质性肺纤维化、间质性肺部纤维化、肺纤维化、特发性肺纤维化、囊胞性纤维化、眼内炎、持久性隆起性红斑、胎儿成红细胞增多病、嗜酸性筋膜炎、Shulman综合征、Felty综合征、丝虫病、睫状体炎例如慢性睫状体炎、异时性睫状体炎、虹膜睫状体炎(急性或慢性)或Fuch睫状体炎、Henoch-Schonlein紫癜、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、SCID、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、埃可病毒感染、败血症、内毒素血症、胰腺炎、甲状腺毒症、细小病毒感染、风疹病毒感染、疫苗接种后综合征、先天性风疹感染、EB病毒感染、腮腺炎、Evan氏综合征、自身免疫性性腺衰竭、Sydenham氏舞蹈病、链球菌感染后肾炎、血栓闭塞性脉管炎、甲状腺毒症、脊髓痨、绒膜炎、巨细胞多肌痛、慢性过敏性肺炎、干燥性角结膜炎、流行性角结膜炎、特发性肾炎综合征、微小病变性肾病、良性家族性和缺血再灌注损伤、移植器官再灌注、视网膜自身免疫病、关节炎症、支气管炎、慢性阻塞性呼吸道/肺疾病、矽肺、口疮、口疮性口炎、动脉硬化病症、aspemiogenese、自身免疫性溶血、Boeck氏病、冷沉球蛋白血症、Dupuytren挛缩、晶状体蛋白过敏性眼内炎(endophthalmiaphacoanaphylactica)、过敏性肠炎、麻风结节性红斑、特发性面神经瘫痪、慢性疲劳综合征、风湿热(febris rheumatica)、Hamman-Rich病、感觉神经性听力损失、阵发性血红蛋白尿(haemoglobinuria paroxysmatica)、性腺机能减退、局限性回肠炎(ileitis regionalis)、白细胞减少、传染性单核细胞增多症、横贯性脊髓炎、原发性特发性黏液水肿、肾病、交感性眼炎、肉芽肿性睾丸炎、胰腺炎、多神经根炎、坏疽性脓皮症、Quervain甲状腺炎、获得性脾萎缩、非恶性胸腺瘤、白癜风、中毒性休克综合征、食物中毒、涉及T细胞浸润的病况、白细胞粘附缺陷、细胞因子和丁淋巴细胞介导的急性和迟发超敏性相关的免疫响应、涉及白血球渗出的疾病、多器官损伤综合征、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜病、变应性神经炎、自身免疫性多内分泌病、卵巢炎、原发性黏液水肿、自身免疫性萎缩性胃炎、交感性眼炎、风湿性疾病、混合性结缔组织病、肾病综合征、胰岛炎、多内分泌腺衰竭、自身免疫性多腺体综合征I型、成年发作的特发性甲状旁腺功能减退(AOIH)、心肌病例如扩张型心肌病、后天性大疱性表皮松解(EBA)、血色素沉积症、心肌炎、肾病综合征、原发性硬化性胆管炎、化脓性或非化脓性鼻窦炎、急性或慢性鼻窦炎、筛骨、额骨、上颌骨或蝴蝶骨鼻窦炎、嗜曙红细胞相关病症例如嗜曙红细胞增多、肺浸润嗜曙红细胞增多、嗜酸细胞增多性肌痛综合征、Loffler综合征、慢性嗜酸性肺炎、热带肺嗜酸性粒细胞增多、支气管肺曲霉病、曲霉肿或包含嗜酸性粒细胞的肉芽肿、过敏症、血清反应阴性的脊柱关节病、多内分泌自身免疫病、硬化性胆管炎、巩膜、巩膜外层、慢性粘膜皮肤念珠菌病、Bruton综合征、婴儿的短暂的低丙种球蛋白血症、Wiskott-Aldrich综合征、共济失调毛细血管扩张综合征、血管扩张、与胶原病相关的自身免疫性病症、风湿病、神经系统疾病、淋巴结炎、血压响应降低、血管功能障碍、组织损伤、心血管局部缺血、痛觉过敏、肾缺血、脑缺血和伴随血管形成的疾病、变应性超敏感症、肾小球肾炎、再灌注损伤、缺血性再灌注失调、心肌或其他组织的再灌注损伤、淋巴瘤气管支气管炎、炎症性皮肤病、具有急性炎症元件的皮肤病、多器官功能衰竭、大疱性疾病、肾皮质坏死、急性化脓性脑膜炎或其他中枢神经系统炎症性病症、眼和眼眶炎性病症、粒细胞输血相关的综合征、细胞因子诱导的毒性、嗜眠发作、急性严重的炎症、慢性顽固性炎症、肾盂炎、动脉内增生、消化性溃疡、心瓣炎和子宫内膜异位症。

本文描述的抗体可具有各种各样的学术、医疗和商业用途。所述抗体可用于不同类型的诊断性测试，例如，体外或体内检测各种各样的疾病或药物(药品(pharmaceutical))、毒素或其它蛋白包括激素的存在。本文描述的抗体可用于测试疾病，例如，在患者的血清或血液中。所述疾病可包括人Sema4A相关的疾病或与人Sema4A不相关的疾病或适应症，包括各种癌症、炎性或自身免疫性疾病。抗体也可用于癌症的放射免疫检测和放射免疫治疗，并且一些新的测试方法可使用所描述的这些抗体以仅靶向特定细胞类型即癌症的细胞膜。

本文描述的抗体可被制成试剂盒和其它诊断包的一部分。同样地，本文提供了用于与本文的预处理方法一起使用的诊断试剂盒或制品。所述诊断试剂盒可包含下列中的任一种或多种：拮抗物/抗体/药物参照材料；阳性对照中和抗体(优选地食蟹猕猴的山羊)；蛋白A+G柱(例如蛋白A/G柱)；去脂试剂；免疫球蛋白亲和纯化缓冲剂(例如结合、洗脱和中和缓冲剂)；补体血清；细胞的测定稀释剂；说明书或文献；小瓶冷冻细胞(例如WIL2细胞)；细胞标记试剂(例如CELL TITER GL0.RTM.)等。举例来说，诊断试剂盒可包括但不限于：(a)去脂试剂；(b)用于免疫球蛋白的亲和纯化的缓冲剂(例如结合和洗脱缓冲剂)和(c)指导诊断试剂盒的使用者在对来自自身免疫性疾病或癌症受治疗者的生物学样品进行基于细胞的生物测定(例如中和抗体测定)之前使用试剂盒预处理所述样品(例如以避免血清干扰的问题)的说明书。诊断试剂盒任选还包含下列中的任一种或多种：药物参照材料、阳性对照中和抗体、补体血清、细胞的测定稀释剂和细胞标记试剂等。

本文描述的抗体和其它发现还提供了高通量筛选的方法。

实施例I

CD4+CD11c+mDC比人PBMC中的其它亚型表达更高的Sema4A

微阵列基因表达分析显示在人PBMC当中，与包括B细胞、单核细胞、NK细胞、T细胞和pDC的其它亚型相比，CD4+CD11c+mDC表达高水平的Sema4A(图1A)。如图1B所示，这通过Q-PCR分析进行了验证。使用我们实验室产生的小鼠抗人Sema4A mAb和流式细胞术，我们发现静息的CD4+CD11c+mDC表达表面Sema4A，而培养基培养的mDC表达高水平表面Sema4A(图1C)。

实施例II

人骨髓DC和人扁桃体中的生发中心B细胞表达高水平的sema4A

如图2A所示，使用针对人Sema4A的小鼠单克隆抗体，我们对人扁桃体的冰冻切片进行免疫组织学染色显示，Sema4A由生发中心B细胞和滤泡间区域的DC表达。如图2B所示，用抗CD11c(红色)和Sema4A(绿色)染色的双重免疫荧光进一步显示，生发中心B细胞和滤泡间区域的CD11c+DC亚型表达Sema4A。

实施例III

Sema4A参与mDC和T细胞相互作用

通过细胞分选将CD4+CD11c+mDC从人PBMC分离，用培养基培养19小时，然后在抗Sema4A封闭性mAb或mIgG的存在下与CFSE标记的同种异体幼稚型CD4+T细胞以T:mDC为5:1的比例共培养7天。在图3B中，根据CFSE稀释，已用培养基预处理的同种异体mDc诱导的T细胞增殖可通过抗sema4A中和mAb以协同方式抑制。这种现象不能在mIgG对照组观察到，如图3A所示。

实施例IV

Sema4A共刺激人CD4+幼稚型T细胞的增殖

我们将Sema4A转染的细胞系确定为APC。用该细胞系，我们在次优剂量的OKT3的存在下将纯化的CD4+幼稚型T细胞培养7天，如图4A中所示进行CFSE稀释，以及图4B的在三个供体中的总细胞数计数显示，Sema4A转染的细胞可刺激CD4+幼稚T细胞扩增。随后，我们检测了Sema4A-Ig融合蛋白是否具有相同的刺激CD4+幼稚型T细胞增殖的功能。如图4C和4D所示，根据CFSE稀释，Sema4A–Ig融合蛋白对调节CD4+幼稚型T细胞增殖具有协同效应。

实施例V

人抗Sema4A单克隆抗体在OKT3和抗-CD28的存在下阻断Sema4A介导的T细胞增殖

首先通过细胞分选纯化CD4+幼稚型T细胞，然后用CSFE标记，然后在抗Sema4A单克隆抗体或mIgG的存在下在天然条件下(抗CD3和抗CD28)与Sema4A转染的L细胞或亲本L细胞一起培养7天。如图5A&5B中所示，根据CFSE稀释，与亲本L细胞培养组相比较，Sema4A+L细胞培养组中的T细胞增殖增强。

如图5A&5B中所示，mIgG不能阻止由Sema4A刺激的T细胞扩增。而就Sema4A+L细胞培养而言，针对Sema4A的三个mAb可抑制Sema4A介导的T细胞扩增(图5C，5D&5E)。

实施例VI

Sema4A促进幼稚型CD4+T细胞向TH2分化

将通过细胞分选从人外周血分离的CD4+Tn细胞分别在天然条件(抗CD3加上抗CD28)，或Th1条件(抗CD3、抗CD28、抗IL-4和IL-12)，或Th2条件(抗CD3、抗CD28、抗IFNg、IL-4)下与表达人Sema4a的L细胞或亲本L细胞一起培养7天。所培养的T细胞通过抗CD3加上抗CD28再刺激24小时，通过ElSA(R&D系统)测量释放至培养上清中的细胞因子。如图6A-D中所示，Th1条件致敏的CD4+幼稚型T细胞产生高水平的IFN-g，而Th2条件致敏的幼稚型CD4+T细胞产生Il-4，IL-5和IL-13。Sema4A致敏的抗CD3/抗CD28激活CD4+幼稚型T细胞产生Th2细胞因子IL-13、IL-5以及稍少的IL-4，但不怎么产生IFN-g。最明显地，Sema4A加上Th2条件致敏的CD4+幼稚型T细胞产生大量的IL-4、IL-5和IL-13，其比通过常规的Th2条件诱导的Th2细胞产生的高4-5倍。Sema4A对Th1条件诱导的Th1细胞没有显著的效应。

实施例VII

Sema4A促进IL-4诱导的CRTH2+TH2记忆型T细胞产生TH2细胞因子

首先通过细胞分选纯化CRTH2+记忆型T细胞，然后分别在天然条件(抗CD3加上抗CD28)，或Th1条件(抗CD3、抗CD28、抗IL-4和IL-12)，或Th2条件(抗CD3、抗CD28、抗IFNg、IL-4)下与表达Sema4a的L细胞或亲本L细胞一起培养7天。所培养的T细胞通过抗CD3加上抗CD28再刺激24小时，通过ElSA(R&D系统)测量释放至培养上清的细胞因子。Sema4A单独促进CRTH2+TH2记忆型T细胞产生TH2细胞因子，并且Sema4A在促进CRTH2+TH2记忆型细胞产生Th2细胞因子中与Th2条件具有强烈的协同效应(图7A-7D)。相比之下，Sema4A对在TH1条件下培养的CRTH2+TH2记忆细胞没有显著的效应。

实施例VIII

抗Sema4A单克隆Ab阻断Sema4A介导的TH2细胞因子的产生

将通过细胞分选从人外周血分离的CD4+Tn细胞分别在天然条件(抗CD3加上抗CD28)，或Th1条件(抗CD3、抗CD28、抗IL-4和IL-12)，或Th2条件(抗CD3、抗CD28、抗IFNg、IL-4)下，在有/没有针对人Sema4A的中和mAb的情况下，与表达人Sema4A的L细胞或亲本L细胞一起培养7天。所培养的T细胞通过抗CD3加上抗CD28再刺激24小时，通过ElSA(R&D系统)测量细胞因子产生。图8A直至8I显示，在3个供体中，针对Sema4A的中和mAb可阻断Th2细胞因子IL-4(图8A-C)、IL-5(图8D-F)和IL-13(图8G-I)产生，其在Th2条件致敏的CD4+幼稚型T细胞中已被Sema4A上调。

实施例IX

人源化mAb克隆161-51和161-70的功能测定

首先通过细胞分选纯化CD4+幼稚型T细胞，用CSFE标记，然后在人源化抗hSema4A单克隆抗体克隆161-51、161-70或小鼠抗hSema4A mAb克隆161-51、161-70或mIgG的存在下、在天然条件(抗CD3和抗CD28)下与亲本L细胞或Sema4A转染的L细胞一起培养7天。如图18A-D所示，同亲本L细胞培养组相比，Sema4A+L细胞培养组中的T细胞增殖增强。与小鼠mAb相比，人源化mAb对抑制由hSema4A介导的T细胞增殖具有非常强的阻断功能。

实施例X

用表达cDNA文库筛选克隆Sema4A受体

首先通过细胞分选分离CD4+Tn细胞，然后用固定的OKT3加上抗CD28刺激13小时直到Sema4A的假定受体可通过FACS与Sema4A-Fc融合蛋白染色检测。从预激活的CD4+T细胞分离总cDNA并通过ATGC公司构建表达cDNA文库。所述cDNA文库表达细胞系通过用靶细胞中的逆转录病毒转染cDNA文库产生并用Sema4A-Fc染色和分选进行富集(图19A)。将富集的阳性细胞的基因组分离并用作具有特异性引物设计的模板。应用基因组PCR和克隆技术扩增来自cDNA文库的插入的cDNA(图19B)。

实施例XI

重组hILT4-Fc、hILT2-Fc和hTIM3-FC阻断Sema4A介导的CD4+T细胞增殖

用CFSE标记纯化的CD4+幼稚型T细胞增殖，然后在重组hILT4-Fc、hILT2-Fc和hTIM3-FC融合蛋白单独或以剂量依赖的方式组合存在下、与次优剂量的OKT3加上hSema4A-Fc一起培养7天(hIgG Fc作为对照组)。通过CFSE稀释检测T细胞增殖。如图21A所示，每个方形中的数字表示增殖T细胞的百分比。图21B显示，通过CFSE稀释，受体-Fc对抑制由hSema4A介导的CD4+T细胞增殖具有协同效应。

实施例XII

Sema4A在哮喘肺组织中过表达

通过Q-PCR分析测试hsema4A在人肺组织中在RNA水平的相对表达。分离来自哮喘的肺组织或健康供体组织的总RNA并作为模板将所述RNA反转录为cDNA，用hsema4A(“人sema4A”)作为特异性引物。实施Q-PCR分析。如图22A所示评估hsema4A的表达。每个点表示一个供体并且每组中的短线表示平均表达。

准备人冰冻切片中的hSema4A表达的免疫组织学测试。如图22B所示，在人正常肺组织中不能检测到Sema4A。如由图22C的数据进一步显示地，Sema4A高度并且特异性地表达于人哮喘肺组织中浸润的细胞上。

Claims (16)

1.一种结合人sema4A的分离的抗体，其包含：(a)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO.48的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO.49的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；以及(f)包含SEQ ID NO.50的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。

2.一种结合人sema4A的分离的抗体，其包含：(a)包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO.66的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO.67的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；以及(f)包含SEQ ID NO.68的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。

3.一种结合人sema4A的分离的抗体，其包含重链可变区CDR1，所述重链可变区CDR1包含SEQ ID NO:36或54的氨基酸序列；或者包含一种抗体，所述抗体包含与SEQ ID NO:36或54的氨基酸序列具有百分之90同源性的氨基酸序列。

4.一种结合人sema4A的分离的抗体，其包含重链可变区CDR2，所述重链可变区CDR2包含SEQ ID NO:37或55的氨基酸序列；或者包含一种抗体，所述抗体包含与SEQ ID NO:37或55的氨基酸序列具有百分之90同源性的氨基酸序列。

5.一种结合人sema4A的分离的抗体，其包含重链可变区CDR3，所述重链可变区CDR3包含SEQ ID NO:38或56的氨基酸序列；或者包含一种抗体，所述抗体包含与SEQ ID NO:38或56的氨基酸序列具有百分之90同源性的氨基酸序列。

6.一种结合人sema4A的分离的抗体，其包含轻链可变区CDR1，所述轻链可变区CDR1包含SEQ ID NO:48或66的氨基酸序列；或者包含一种抗体，所述抗体包含与SEQ ID NO:48或66的氨基酸序列具有百分之90同源性的氨基酸序列。

7.一种结合人sema4A的分离的抗体，其包含轻链可变区CDR2，所述轻链可变区CDR2包含SEQ ID NO:49或67的氨基酸序列；或者包含一种抗体，所述抗体包含与SEQ ID NO:49或67的氨基酸序列具有百分之90同源性的氨基酸序列。

8.一种结合人sema4A的分离的抗体，其包含轻链可变区CDR3，所述轻链可变区CDR3包含SEQ ID NO:50或68的氨基酸序列；或者包含一种抗体，所述抗体包含与SEQ ID NO:50或68的氨基酸序列具有百分之90同源性的氨基酸序列。

9.一种结合人sema4A上的表位的分离的抗体，所述表位被具有包含SEQID NO.39、45、57或63的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID No.51或69的氨基酸序列的轻链可变区的抗体，或者具有与其有至少百分之90同源性的氨基酸序列的抗体识别。

10.权利要求1至9任一项所述的抗体，其用作药物。

11.权利要求1至9任一项所述的抗体，其用于治疗自身免疫性疾病。

12.权利要求1至9任一项所述的抗体，其用于治疗癌症。

13.权利要求1至9任一项所述的抗体在制造药物中的用途，其中所述药物用于治疗癌症或自身免疫性疾病。

14.一种在有需要的患者中治疗自身免疫性疾病的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的抗人sema4A抗体，其中T细胞增殖和/或Th2分化被阻断。

15.一种在有需要的患者中治疗癌症的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的抗人sema4A抗体，其中T细胞增殖和/或Th2分化被阻断。

16.一种在有需要的患者中治疗变应性疾病的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的抗人sema4A抗体，其中T细胞增殖和/或Th2分化被阻断。