CN104099381A - 一种生产羟基脂肪酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供一种生产羟基脂肪酸的方法，是用脂氧化酶催化具有顺，顺-1,4-戊二烯结构的多不饱和脂肪酸原料来生产羟基化脂肪酸，该脂氧化酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。本发明中使用的克隆酶PhLOX2具有多种功能，能通过一步反应结合还原反应催化长链多不饱和脂肪酸，特别是C20脂肪酸产生单位点和双位点羟基化脂肪酸，适用于以鱼油等含C20脂肪酸丰富的原料为底物制备多种产物，反应条件温和易控，反应效率高，无有害物质产生，反应成本低，且能与多种底物反应，获得多种羟基化脂肪酸。有望使普通鱼油等原料有升值几百倍的潜力。

Description

一种生产羟基脂肪酸的方法

技术领域

本发明属于长链羟基脂肪酸的生产方法技术领域，尤其涉及一种利用单酶生产羟基脂肪酸的方法。

背景技术

羟基脂肪酸是指脂肪酸分子长链中的碳位具有羟基团的脂肪酸，羟基脂肪酸分子中的羟基给予脂肪酸特别的性质，它具有更高的反应活性，可应用于表面活性剂、化妆品中的成分；用于机械工业金属润滑、防锈剂；化学工业中的塑化剂、乳化剂、稳定剂；食品工业中的抗菌剂；医药工业的抗菌、抗炎、抗肿瘤产品等。更重要的是作为单体在合成高分子聚合物时提供最长的单体分子碳链，使合成材料性能更优越，是当今绿色聚合物材料研究开发中最理想的单体成分之一，可作为生物可降解聚合物材料的理想原料。因此，羟基脂肪酸在化学工业、医药、食品及绿色聚合物材料工业具有十分重要的应用前景。

羟基脂肪酸主要是通过饱和或不饱和脂肪酸的羟基化即分子修饰而得到。目前常用的技术是化学合成法。但化学合成反应路线复杂及给分离带来更大的困难，是一种不经济的方法。国内外研究学者也尝试通过筛选各种微生物生产羟基脂肪酸，比如以芽孢菌属生产羟基脂肪酸。近年来，也有研究采用基因工程的技术制备羟基脂肪酸。到目前为止，羟基脂肪酸的微生物转化研究开发还很有限。

可作为底物进行生物转化的长链脂肪酸种类很多，但迄今为止，绝大部分以工业化生产为目的底物都是C12-18脂肪酸，且以植物脂肪酸为主，而且形成的位点以ω-1，ω-2，ω-3羟基化脂肪酸为主。例如有研究采用植物油料作物中的油酸、亚油酸及部分酯作为反应底物。但是以长链C20以上的报道很少，国外有研究发现，14,21-双羟基DHA能够用于处理糖尿病人的伤口；来源于花生四烯酸和EPA的羟基脂肪酸可作为抗炎症和前消散脂类介质的作用，可以减少抗生素的用量。可见，C20以上的脂肪酸在医药领域有其特殊的应用。由于生产羟基化脂肪酸的酶是一类细胞色素P450酶系统，目前所发现的微生物酶系对底物作用专一性要求有局限性，产物单一，生产不同的羟基脂肪酸需要利用不同的酶，对工业化生产造成不便。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术而提供一种通过一步酶反应结合还原反应获得多种羟基脂肪酸的方法。

本发明的方法，是用脂氧化酶(PhLOX2)催化具有顺,顺-1,4-戊二烯结构的多不饱和脂肪酸原料来生产羟基化脂肪酸，该脂氧化酶包含有：

1)氨基酸序列为SEQ ID NO:2的酶

2)在1)中酶的氨基酸上经过取代、缺失、添加一个或氨基酸，由1)所衍生的，且具有1)中酶功能的脂氧化酶。

用于编码上述脂氧化酶的基因，其一种优选核苷酸序列为SEQ ID NO:1；

本发明的方法，其一种优选的步骤如下：

1)在脂氧化酶溶液中加入游离的多不饱和脂肪酸原料，混匀形成反应液，将反应液在15～20℃反应15min-2h；

2)在步骤1)的反应液中加入还原剂，或还原体系；硼氢化钠。

3)在步骤2)的反应液中加入乙酸乙酯，4℃避光震摇萃取，收集上层乙酸乙酯相，然后在下层相中再加入乙酸乙酯重复抽提一次或以上后收集上层有机相，合并收集液；

4)在上述收集液中加入预冷的去离子水，震荡混匀充分，冰浴后获得的有机溶剂相，氮气吹干或在旋转蒸发浓缩后,甲醇重溶获得制备的羟基脂肪酸。

作为实施例的优选，脂氧化酶溶液中酶的浓度为10-30mg/L；原料加入的浓度为100μM-400mM。

进一步，所述原料包括γ-亚麻酸(GLA)、花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳四烯酸(DHA)中的任一种或几种。

上述的原料，其一种优选为C20脂肪酸或包含有C20脂肪酸的油脂；

其中包含有C20脂肪酸的油脂，优选为鱼油。

作为实施例的优选，还原剂为硼氢化钠；或谷胱甘肽氧化酶和还原型谷胱甘肽。

本发明中使用的克隆酶PhLOX2具有多种功能，能通过一步反应结合还原反应催化长链多不饱和脂肪酸，特别是C20脂肪酸产生单位点和双位点羟基化脂肪酸，适用于以鱼油等含C20脂肪酸丰富的原料为底物制备多种产物，反应条件温和易控，反应效率高，无有害物质产生，反应成本低，且能与多种底物反应，获得多种羟基化脂肪酸。有望使普通鱼油等原料有升值几百倍的潜力。

附图说明

图1为实施例2中PhLOX2催化γ-亚麻酸的LC示意图，产物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别为6-HOTE、9-HOTE、13-HOTE；

图2为实施例3中PhLOX2催化花生四烯酸的LC示意图，产物Ⅰ、Ⅱ分别为8-HETE、9,13-diHETE；

图3为实施例4中PhLOX2催化二十碳五烯酸的LC示意图，产物Ⅰ、Ⅱ分别为8-HEPE、9,13-diHEPE。

图4为实施例5中PhLOX2催化二十二碳四烯酸的LC示意图，产物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分别为7-DHE、10-DHE、7,14-diDHE、4,20-diDHE；

具体实施方式

申请人在研究中发现，脂氧化酶(PhLOX2)能催化多种不饱和脂肪酸原料来生产羟基化脂肪酸，从而促成了本发明。

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1：脂氧化酶PhLOX2的筛选

本发明所使用的脂氧化酶PhLOX2基因来自坛紫菜，克隆过程中首先从坛紫菜中提取总RNA，根据坛紫菜转录组相关脂氧合酶基因序列设计特异性引物，通过3’RACE和5’RACE技术扩增出包含完整开放阅读框的cDNA序列，重组到表达载体pET-28a，转化至大肠杆菌E.coli BL21，筛选出阳性克隆，通过诱导表达产生表达量为2mg/L菌液的多功能克隆酶PhLOX2，具体步骤如下：

1、采用Takara RNAiso Plus kit(Takara，日本)，以trizol法提取坛紫菜叶状体的总RNA。采用Takara primescript RT reagent kit(Takara，日本)，对提取的坛紫菜叶状体总RNA进行反转录得到坛紫菜叶状体总cDNA。

对坛紫菜叶状体转录组进行分析，提取坛紫菜脂氧合酶基因相关序列，采用Primer primer5软件设计特异性引物对，进行坛紫菜脂氧合酶Phlox2核心片段的克隆，其中特异性引物序列信息如下：

lox2-f(5'-GCTGACGATGCCCAAGTACTG-3')

lox2-r(5'-GCTGCTGTTGTTGGGTTCCT-3')，扩增1879bp片段。以坛紫菜叶状体cDNA为模板进行PCR扩增，PCR体系为(ddH₂O17.2μL，10×PCRbuffer(Mg²⁺plus)2.5μL，dNTP(各2.5mM)2.0μL，Phlox2-f/Phlox2-r1.0/1.0μL，cDNA1.0μL，rTaq(5U/μL)0.3μL)。PCR程序为(95℃5min，95℃1min，55℃35s，72℃2min，35循环，72℃10min)。

以Phlox2核心片段为模板，分别设计用于3’端和5’端延伸的特异性引物，进行RACE(rapid-amplification of cDNA ends，cDNA末端快速扩增技术)扩增。

3’RACE特异性引物：

lox2-3f1：5'-GCGGTCGTCTCCATCATCTTCC-3'

lox2-3f2：5'-TCTTCCAGACGCTCTTTGCGCAC-3'；

5’RACE特异性引物：

lox2-5r1：5'-TGATGCCAATCGTGTCCTGGAAGTG-3'

lox2-5r2：5'-AGGGACTTGCCCAGCGAAAAGAGGAGC-3'。

克隆5’和3’端的未知序列，PCR扩增体系为(5'-cDNA/3'-cDNA2.5μL，UPM(10X)5.0μL，GSP1/GSP2(10μM)1.0μL，10X Buffer5.0μL，ddH₂O34.5μL，dNTP Mix(10mM)1.0μL，50X Advantage2Polymerase Mix1.0μL)。PCR扩增程序为(95℃5min，95℃1min，65℃35s，72℃1min，35循环，72℃10min)。

得到RACE产物序列后，采用MEGA5软件进行比对拼接，总长为3284bp(SEQ ID NO:1)，包含一个完整的编码框ORF，编码899aa的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。

2、Phlox2原核表达的重组体系构建

在Phlox2的ORF两端设计一对带NdeΙ/HindΙΙΙ酶切位点的特异性引物：

PhLOX2-CDS-F：5'GGAATTCCATATGATGGCGCACACCG3'

PhLOX2-CDS-R：5'CCCAAGCTTCTAAATGTCAATCGACAGGG3'。

以叶状体cDNA为模板，扩增Phlox2完整ORF。克隆的目的片段首先连接到pMD-18T上形成LOX-18T的重组克隆载体，通过转化E.coli DH5α进行测序，以检测目的片段的编码正确性。以PET-28a为表达载体，通过NdeΙ/HindΙΙΙ分别对PhLOX2-18T和PET-28a进行双酶切，双酶切体系为(10×NEBuffer25μL，质粒DNA2μg，NdeΙ/HindΙΙΙ(2000U/mL)1.0/1.0μL，ddH2O至50μL)。酶切反应条件为37℃，4h。切胶回收目的条带，构建重组载体，体系如下：(10×T4DNA ligase Buffer2.5μL，PET-28a vector50ng，PhLOX2-18T vector135ng，T4ligase(25000U/mL)1U，ddH2O至25μL)。16℃条件下连接过夜。重组质粒于大肠杆菌BL21中转化，挑选单克隆检测阳性克隆。并送测序以确定重组载体的编码正确性。得到的真阳性克隆PhLOX2-28a-BL21于含15％甘油的LB+Kana+(50μg/mL)液体培养基中，-70℃下储存保菌。

3、PhLOX2蛋白的诱导和纯化

将实施例2中获得的克隆菌株活化、扩培，以0.1mM IPTG诱导表达。诱导条件为20℃，100rpm，14～20h。诱导完成后，以5000rpm，4℃，15min离心收集菌体。去上清培养液，再用10mL细胞裂解液buffer A-ΙΙ(50mM Tris-HCl，pH8.0，200mM NaCl，10％(v/v)glycerol，0.1％tween20)充分重悬菌体。以6500rpm，20s-破碎/2min-冰浴的程序进行菌体破碎匀浆(Bertin technologiesPrecellys24Dual，法国)，循环4次。12000rpm，4℃，10min离心匀浆液，并收集上清。

采用6×His-Tagged Protein Purification Kit(CWBIO，中国)对上清液进行目的蛋白的纯化，并以含10mM、50mM、150mM、500mM咪唑的洗脱液进行梯度洗脱和收集目的蛋白。

实施例2：

在0.5mL25mg/L浓度的由实施例1所得的脂氧化酶PhLOX2蛋白纯化溶液中加入100μM的γ-亚麻酸，混匀后在20℃下孵育15min，获得酶反应液。加入4U谷胱甘肽氧化酶和3mM还原型谷胱甘肽作为还原剂，20℃下继续孵育15min。

产物提取和检测方法为：在反应液中加1mL乙酸乙酯(色谱纯)，4℃避光振摇1h。12000rpm，4℃，离心10min，收集上层乙酸乙酯相，并在下层相中再加入0.5mL乙酸乙酯重复抽提一次后收集上层有机相。然后合并两次收集液，加入1mL预冷的去离子水，震荡混匀充分，冰浴5min，以洗去水溶性杂质。12000rpm，4℃，离心10min，取上层乙酸乙酯相。氮气吹干后加入0.5mL色谱甲醇重溶。利用LC-MS分析羟基脂肪酸的产生种类，LC检测条件：采用Hypersil Gold C18色谱柱(2.1mm×100mm，3μm)，柱温：30℃；流动相：乙腈(A)-0.2％乙酸水溶液(B)；洗脱梯度：0-40min，30％～100％A；流速：0.2mL·min-1；进样量：10μL。目的产物，进行二级LC/MS分析。质谱条件:采用电喷雾电离源负离子电离模式，喷雾电压2500V，鞘气(N2)压力25L·min^-1；辅助气(N₂)流量5Arbs，离子传输毛细管温度320℃，采用选择反应监测(SRM)扫描模式，采集时间均为0.2s，碰撞气采用氩气，压力1.5mTorr。通过底物积分面积的减少来评价转化率，转化率为79.21％。从LC图(图1)中可以看出所得的的羟基脂肪酸包括6-HOTE,9-HOTE,13-HOTE；

实施例3

在5mL25mg/L浓度的由实施例1所得的克隆酶PhLOX2蛋白纯化溶液中加入100mM的花生四烯酸，混匀后在20℃孵育1h，获得酶解反应液。加入1g/ml硼氢化钠作为还原剂，20℃下继续孵育20min。

产物提取和检测方法为：在反应液中加10mL乙酸乙酯(色谱纯)，4℃避光振摇1h，分离上层乙酸乙酯相，并在下层相中再加入5mL乙酸乙酯重复抽提一次后收集上层有机相。然后合并两次收集液，加入10mL预冷的去离子水，震荡混匀充分，冰浴5min，以洗去水溶性杂质。分离上层乙酸乙酯相，25℃下旋转蒸发至恒重，加入5mL色谱甲醇重容。利用LC-MS分析底物转化率，LC检测条件：采用Hypersil Gold C18色谱柱(2.1mm×100mm，3μm)，柱温：30℃；流动相：乙腈(A)-0.2％乙酸水溶液(B)；洗脱梯度：0-40min，30％～100％A；流速：0.2mL·min-1；进样量：10μL。目的产物，进行二级LC/MS分析。质谱条件:采用电喷雾电离源负离子电离模式，喷雾电压2500V，鞘气(N2)压力25L·min^-1；辅助气(N₂)流量5Arbs，离子传输毛细管温度320℃，采用选择反应监测(SRM)扫描模式，采集时间均为0.2s，碰撞气采用氩气，压力1.5mTorr。如图2所示，发现底物转化率达到100％，其中图2中上面的图谱线表示反应后，下面的图谱线表示反应前，图中的数字表示经过PhLOX2催化并经还原剂还原后的产物，包括为8-HETE和9,12-diHETE。

实施例4：

在5mL30mg/L浓度的由实施例1所得的克隆酶PhLOX2蛋白纯化溶液中加入200mM的二十二碳六烯酸DHA，混匀后在20℃下孵育1.5h，获得酶解反应液。加入50U谷胱甘肽氧化酶和50mM还原型谷胱甘肽作为还原剂，20℃下继续孵育30min。

产物提取和检测方法为：在反应液中加10mL乙酸乙酯(色谱纯)，4℃避光振摇1h，分离上层乙酸乙酯相，并在下层相中再加入8mL乙酸乙酯重复抽提一次后收集上层有机相。然后合并两次收集液，加入15mL预冷的去离子水，震荡混匀充分，冰浴5min，以洗去水溶性杂质。分离上层乙酸乙酯相，25℃下旋转蒸发至恒重，加入5mL色谱甲醇重容。利用LC-MS分析底物转化率，LC检测条件：采用Hypersil Gold C18色谱柱(2.1mm×100mm，3μm)，柱温：30℃；流动相：乙腈(A)-0.2％乙酸水溶液(B)；洗脱梯度：0-40min，30％～100％A；流速：0.2mL·min-1；进样量：10μL。目的产物，进行二级LC/MS分析。质谱条件:采用电喷雾电离源负离子电离模式，喷雾电压2500V，鞘气(N2)压力25L·min^-1；辅助气(N₂)流量5Arbs，离子传输毛细管温度320℃，采用选择反应监测(SRM)扫描模式，采集时间均为0.2s，碰撞气采用氩气，压力1.5mTorr。如图3所示，发现底物转化率达到95％，其中图3中上面的图谱线表示反应后，下面的图谱线表示反应前，图中的数字表示经过PhLOX2催化并经还原剂还原后的产物，包括为7-HDHE、10-HDHE、7,14-diDHE和4,20-diHDHE。

实施例5：

在0.5mL10mg/L浓度的由实施例1所得的克隆酶PhLOX2蛋白纯化溶液中加入400μM的EPA，混匀后在20℃下孵育15min，获得酶解反应液。后加入0.8g/ml硼氢化钠作为还原剂，20℃下继续孵育15min。

产物提取和检测方法为：在反应液中加1mL乙酸乙酯(色谱纯)，4℃避光振摇1h。12000rpm，4℃，离心10min，收集上层乙酸乙酯相，并在下层相中再加入0.5mL乙酸乙酯重复抽提一次后收集上层有机相。然后合并两次收集液，加入1mL预冷的去离子水，震荡混匀充分，冰浴5min，以洗去水溶性杂质。12000rpm，4℃，离心10min，取上层乙酸乙酯相，氮气吹干后加入0.5mL色谱甲醇重容。利用LC-MS分析底物转化率，LC检测条件：采用Hypersil GoldC18色谱柱(2.1mm×100mm，3μm)，柱温：30℃；流动相：乙腈(A)-0.2％乙酸水溶液(B)；洗脱梯度：0-40min，30％～100％A；流速：0.2mL·min-1；进样量：10μL。目的产物，进行二级LC/MS分析。质谱条件:采用电喷雾电离源负离子电离模式，喷雾电压2500V，鞘气(N2)压力25L·min^-1；辅助气(N₂)流量5Arbs，离子传输毛细管温度320℃，采用选择反应监测(SRM)扫描模式，采集时间均为0.2s，碰撞气采用氩气，压力1.5mTorr。如图4所示，发现底物转化率达到49.0％，其中图4中上面的图谱线表示反应后，下面的图谱线表示反应前，图中的数字表示经过PhLOX2催化并经还原剂还原后的产物，包括8-HEPE和9,12-diHEPE。

上述的结果表明，本发明所筛选的脂氧化酶PhLOX2能催化具有顺,顺-1,4-戊二烯结构的多不饱和脂肪酸原料来生产羟基化脂肪酸，具有应用的前景。

Claims (9)

1.一种生产羟基脂肪酸的方法，其特征在于，所述的方法是用脂氧化酶催化具有顺,顺-1,4-戊二烯结构的多不饱和脂肪酸原料来生产羟基化脂肪酸，所述的脂氧化酶包含有：

1)氨基酸序列为SEQ ID NO:2的酶

2)在1)中酶的氨基酸上经过取代、缺失、添加一个或氨基酸，由1)所衍生的，且具有1)中酶功能的脂氧化酶。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的脂氧化酶，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法包括如下的步骤：

1)在脂氧化酶溶液中加入游离的多不饱和脂肪酸原料，混匀形成反应液，将反应液在15～20℃反应15min-2h；

2)在步骤1)的反应液中加入还原剂或还原体系；

3)在步骤2)的反应液中加入乙酸乙酯，4℃避光震摇萃取，收集上层乙酸乙酯相，然后在下层相中再加入乙酸乙酯重复抽提一次或以上后收集上层有机相，合并收集液；

4)在上述收集液中加入预冷的去离子水，震荡混匀充分，冰浴后获得的有机溶剂相，氮气吹干或在旋转蒸发浓缩后,甲醇重溶获得制备的羟基脂肪酸。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的脂氧化酶溶液中酶的浓度为10-30mg/L；原料加入的浓度为100μM-400mM。

5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述的原料为γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳四烯酸中的任一种或几种。

6.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述的原料为C20脂肪酸或包含有C20脂肪酸的油脂。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述的包含有C20脂肪酸的油脂为鱼油。

8.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的还原剂为硼氢化钠。

9.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的还原体系为谷胱甘肽氧化酶和还原型谷胱甘肽。