CN104098657A - 一种猪圆环病毒2型免疫保护多肽与疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及猪圆环病毒技术领域，特别涉及一种猪圆环病毒2型免疫保护多肽，氨基酸序列见序列表中序列1-4。含有猪圆环病毒2型免疫保护多肽的疫苗。P5013和P1300疫苗首免后42-63d时ELISA抗体滴度和中和抗体滴度明显升高；淋巴细胞增殖应答以及IL-4和IFN-γ细胞因子显著高于对照组，P5013疫苗免疫组抗体水平和细胞免疫水平最高；小鼠试验表明P5013合成肽疫苗诱导产生的PCV2免疫反应最强高。猪体试验发现，P5013合成多肽疫苗可以诱导猪体产生PCV2特异免疫反应，并降低PCV2强毒攻击后引起的病毒血症、减轻其临床症状和病理损伤，对PCV2具有免疫保护作用。

Description

一种猪圆环病毒2型免疫保护多肽与疫苗

技术领域    

本发明涉及猪圆环病毒技术领域，特别涉及一种猪圆环病毒2型免疫保护多肽，还涉及使用此猪圆环病毒2型免疫保护多肽制备的疫苗。

背景技术   

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus 2，PCV2）属于圆环病毒科圆环病毒属成员，可以引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）和猪皮炎肾病综合征（PDNS）等多种疾病，给全球养猪业带来了巨大经济损失。Cap蛋白是PCV2的型特异性抗原，具有良好的免疫原性，通过免疫可以有效产生中和抗体，中和病毒感染，可有效诱导保护性免疫反应抵抗病毒攻击。目前，商品化疫苗有PCV2灭活疫苗和PCV2杆状病毒灭活疫苗，但存在疫苗抗原纯度不高和疫苗价格昂贵等缺点。PCV2 Cap蛋白有多个抗原表位，但其多肽疫苗免疫保护作用尚无报道。

发明内容   

为了解决以上现有技术中对PCV2 Cap蛋白抗原有无相关免疫保护作用的问题，本发明提供了一种猪圆环病毒2型免疫保护多肽。

本发明还提供了一种合成肽疫苗诱导产生的PCV2免疫反应强、可以诱导猪体产生PCV2特异免疫反应、降低PCV2强毒攻击后引起的病毒血症、减轻其临床症状和病理损伤的猪圆环病毒2型免疫保护多肽疫苗。 

本发明是通过以下步骤得到的： 

一种猪圆环病毒2型免疫保护多肽，氨基酸序列如序列表中序列1所示。

一种猪圆环病毒2型免疫保护多肽，氨基酸序列如序列表中序列2所示。 

一种猪圆环病毒2型免疫保护多肽，氨基酸序列如序列表中序列3所示。 

一种猪圆环病毒2型免疫保护多肽，氨基酸序列如序列表中序列4所示。 

一种猪圆环病毒2型免疫保护多肽疫苗，含有上述任一项所述的猪圆环病毒2型免疫保护多肽。 

所述的猪圆环病毒2型免疫保护多肽疫苗，优选多肽蛋白浓度为100μg/mL。 

所述的猪圆环病毒2型免疫保护多肽疫苗，优选将猪圆环病毒2型免疫保护多肽用DMSO溶解后加入灭菌的PBS缓冲液，将多肽蛋白浓度调整为100μg/mL，与ISA50V佐剂等体积混合，乳化呈油包水型即得。 

本发明的有益效果： 

（1）根据PCV2基因序列，设计合成4种多肽P4101、P5013、P2914和P1300，采用ISA50V佐剂配制P4101、P5013、P2914和P1300疫苗，小鼠免疫试验结果显示，P5013和P1300疫苗首免后42-63d时ELISA抗体滴度和中和抗体滴度明显升高，并显著高于P4101和P2914免疫组（P<0.05）；淋巴细胞增殖应答以及IL-4和IFN-γ细胞因子显著高于对照组相比差异显著（P<0.05），而且，P5013疫苗免疫组抗体水平和细胞免疫水平最高；

（2）小鼠试验发现，其中P5013合成肽疫苗诱导产生的PCV2免疫反应最强高。猪体试验发现，P5013合成多肽疫苗可以诱导猪体产生PCV2特异免疫反应、降低PCV2强毒攻击后引起的病毒血症、减轻其临床症状和病理损伤，首次证明本研究设计的P5013多肽对PCV2具有免疫保护作用，可用于研制PCV2疫苗。

附图说明   

图1  多肽疫苗免疫小鼠PCV2 ELISA抗体（A）和中和抗体（B）水平测定结果，

图2  多肽疫苗免疫小鼠的淋巴细胞增殖应答，

图3  多肽疫苗免疫小鼠脾细胞体外诱导的IFN-γ（A）和IL-4（B）应答，

图4  免疫猪体PCV2 ELISA抗体（A）和中和抗体（B）测定结果，

图5 Real-time PCR 标准曲线，X axis: Log copies of pT-SH;  Y axis: Ct values，

图6攻毒后各组猪病毒血症（A）和淋巴组织中病毒含量（B）检测，

图7 试验猪肺脏及淋巴结显微病变（HE染色，400×），a- P1503疫苗组； b- Cap疫苗组； c-攻毒对照组。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明： 

实施例1：多肽及疫苗制备

主要试剂和材料

猪圆环病毒2型（PCV2）SH 株由本实验室分离鉴定保存；ISA50V佐剂购自法国SEPPIC公司；羊抗小鼠IgG-HRP、SPA-HRP和DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程公司；其他常规用试剂为国产或进口分析纯。

多肽序列与合成 

根据PCV2 Cap蛋白抗原表位和T细胞表位氨基酸序列，设计如下4条多肽，由上海默悉生物科技有限公司合成，纯度90%以上。

：如序列表中序列1所示， 

P5013：如序列表中序列2所示，

P2914：如序列表中序列3所示，

P1300：如序列表中序列4所示。

1.3  疫苗制备 

将合成多肽用少量DMSO溶解后加入灭菌的PBS缓冲液，将蛋白浓度调整为100μg/mL，与ISA50V佐剂等体积混合，乳化呈油包水型即可，4℃保存。

2.1  试验动物和免疫程序 

取5周龄清洁级ICR小鼠（扬州大学实验动物中心）75只，随机分为5组，每组15只。第1-4组分别接种P4101、P5013、P2914和P1300 四种多肽疫苗，首免每只背部皮下多点注射0.2mL，于首免后21d进行加强免疫，每只背部皮下多点注射0.2mL。第5组不免疫作为阴性对照（标记为control组）。于首免后21d、42d、63d每组分别随机取5只眼球采血分离血清，用于ELISA抗体、中和抗体、细胞增殖应答及细胞因子分泌水平等检测，评价两种亚单位疫苗的免疫效果。

2.2  ELISA抗体的检测 

用原核表达的重组Cap蛋白包被酶标板，用碳酸盐包被缓冲液（pH9.6）将蛋白浓度调整为10μg/mL，每孔加入100μL，37℃放置2小时，4℃过夜，PBST 洗涤3次；每孔加入200μL 5%脱脂乳，37℃封闭2小时，PBST洗涤3次，拍干。血清样品从1:50开始进行2倍稀释，37℃作用1.5h，弃去孔中样品，PBST 洗涤3次，拍干；每孔加入1:20000稀释的酶标二抗 HRP-SPA（检测猪血清）或HRP-羊抗小鼠IgG（检测小鼠血清），37℃作用1h，弃去孔中样品，PBST 洗涤3次，拍干；将TMB显色液A、B液等体积混合，每孔加入100 μL，反应10-15min，加入50μL2M H2SO4终止反应，在酶标仪上读取OD450值。以P/N＞2.1的血清最大稀释度作为该血清的效价。

ELISA抗体结果（图1A）显示，4个多肽免疫组在21d均有抗体产生；至42-63d时，P5013和P1300两免疫组抗体水平已升至较高滴度（1:5000以上），明显高于其它各组，差异显著（P<0.01）。 

2.3  中和抗体的检测 

将PK-15细胞种植96孔细胞板，待检血清56℃灭活30 min，10000 rpm离心5 min除菌后，小心吸出上清，用维持液（2%DMEM）将血清按1∶4、1∶8、1∶16、1∶32，……，作2的连续倍比稀释；具体操作如下：取待检血清及阴性对照血清150 μL，56℃灭活30 min后，10000 rpm离心5 min，小心吸出上清120 μL，加入到360 μL的DMEM中，将血清作1∶4稀释，混匀后再从中取出240 μL加入到240 μL新的维持液中，作1∶8稀释，依次类推；将病毒用维持液稀释至含2000 TCID50/100 μL，然后将稀释的血清与等体积的病毒液（含2000 TCID50/100 μL）混合，于37℃水浴作用1h。弃去已长满单层PK-15细胞的96孔培养板中的营养液，将血清病毒混合液加入到细胞孔中，100μL/孔，每个血清稀释度作4个重复孔，37℃培养3d。同时设定以下对照：（Ⅰ）病毒-阴性血清对照，（Ⅱ）阴性血清对照，（Ⅲ）空白对照。并进行间接免疫荧光试验，结果判定，当病毒-阴性血清对照孔出现荧光，而阴性血清及空白对照孔均未出现荧光时记录每个血清稀释度的荧光孔数。以能够完全抑制荧光的血清最大稀释度作为待检血清的中和效价。

中和试验结果（图1B）显示，首免后21天可检测到PCV2中和抗体，首免后42-63天中和抗体滴度继续升高，其中P5013和P1300多肽组中和抗体滴度可达1:16以上，明显高于其它两个多肽组，但差异不显著（P>0.05）。 

比较而言，P5013多肽能诱导产生更高的体液免疫应答，更好地刺激机体产生特异性的ELISA和中和抗体。 

2.4  淋巴细胞增殖试验 

将PCV2 SH株病毒液用含10%血清的RPMI-1640培养基调节至20μg/mL作为刺激抗原，每孔加入100 μL，对照孔加入100μL 含10%血清的RPMI-1640培养基，各作3个重复孔。37℃下培养66 h，然后每孔加入40μL MTT（5mg/mL），37℃下继续培养4 h。吸弃培养液，每孔加入100 μL DMSO，振荡融解结晶，测定OD570nm的值。计算刺激指数：刺激指数SI＝刺激孔的OD值/未刺激孔的OD值。

分别在首免后42和63天分离鼠的淋巴细胞，进行PCV2特异性的淋巴细胞增殖试验，结果表明，首免后42天各组均没有明显淋巴细胞的特异性的增殖，首免后63天可检测到两个免疫组的淋巴细胞增殖应答，其中，P5013和CB1230多肽免疫组的淋巴细胞增殖应答高于其它多肽免疫组，但差异不显著（P>0.05），非免疫对照组即control组未产生淋巴细胞的增殖（图2），表明P5013和CB1230多肽可以诱导小鼠产生淋巴细胞增殖应答。 

2.5  细胞因子的测定 

收集免疫后63d时淋巴细胞增殖实验中各组刺激孔72 h的细胞上清，混匀后测定其中IL-4及IFN-γ含量，按美国R＆D公司鼠IL-4及IFN-γ说明书进行。

分别在首免后6周和首免后9周，应用美国R＆D公司的Mouse IL-4及Mouse IFN-γ ELISA检测试剂盒，检测免疫鼠的脾细胞体外经特异性PCV2抗原刺激后细胞因子分泌水平。结果见图3，表明首免后42天各组IL-4及IFN-γ细胞因子应答均较低，首免后63天周，P5013免疫组均产生IL-4及IFN-γ细胞因子应答，其次为P1300组，相对对照组差异显著（P<0.05），结果表明，4 个多肽均可以诱导小鼠产生细胞因子应答。 

比较小鼠试验各项数据，P5013多肽的体液免疫应答及细胞免疫应答水平均高于其它多肽，故选择P5013多肽进行猪体免疫攻毒试验。 

3.1  试验动物和免疫程序 

20头25~30日龄断奶仔猪，经PCR和RT-PCR检测PCV2和PRRSV为阴性，ELISA检测抗体阴性。随机分为4组，每组5头。第一组肌肉注射P5013多肽疫苗，1mL/头，第二组肌肉注射商品PCV2杆状病毒载体灭活疫苗（表达PCV2 Cap蛋白基因，全长234aa,德国勃林格殷格翰公司生产,批号309-415A)，1mL/头，第三、四组不接种分别作为攻毒对照（Control）和空白对照（NC），首次免疫后21天采用相同方法加强免疫。隔离饲养，观察各组有无异常表现（发热、腹泻、精神不好）以及注射部位有无红肿反应。首免后第35天进行攻毒，每头猪攻毒2mL（PCV2 SH株，105.5 TCID50/mL，滴鼻，每个鼻孔1 mL），攻毒后第4、7天每头猪腋下和臀部四点注射经弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（1mg/mL），同时腹腔注射10 mL巯基乙酸培养基，第11、19天腹腔注射10 mL巯基乙酸培养基。所有猪在攻毒后25天均剖杀。攻毒后，每天上午测量每头猪直肠温度，上下午两次观察有无异常临床表现（精神沉郁、咳嗽、呼吸困难、皮肤被毛、食欲减退），并进行病变等级判定。首免后21天、35天，攻毒后25天采血分离血清用于抗体水平的检测；攻毒后7、11、19天分别采血，分离血清，用于病毒血症的检测。攻毒当天和剖杀时每头猪分别称重，用于计算每头猪相对日增重（RDWG=（剖杀时体重-攻毒时体重）/25/攻毒时体重）。剖杀时观察每头猪肺脏、淋巴结等脏器大体病变，取淋巴结、肺脏于10%缓冲福尔马林固定，用于组织切片制作和免疫组化实验。

3.2  ELISA抗体的检测 

抗体检测方法同小鼠血清抗体检测方法，酶标记抗体改为1:20000稀释的SPA-HRP。

3.3  中和抗体的检测 

分别于一免后21天、二免后14天采集血清，测定中和抗体，方法同2.3。

首免后21和35天血清ELISA抗体与中和抗体检测结果见图4，首免后21天（21dpi），P5013疫苗免疫组产生ELISA抗体1:800左右，中和抗体可达到1：10左右；加强免后14天（35dpi）免疫组血清ELISA抗体已达到较高水平（1:5000左右），高于PCV2 Cap蛋白亚单位疫苗组，中和抗体可达到1：32，与PCV2 Cap蛋白亚单位疫苗组相似，而对照组均未检测到ELISA抗体及中和抗体，表明该多肽疫苗能有效刺激机体产生体液免疫应答。 

3.4  仔猪攻毒后体温变化与临床症状 

两个疫苗免疫组猪临床表现正常，未见异常反应。攻毒后10内，攻毒对照组有2头猪体温超过了40℃，攻毒后11天开始，1头猪开始表现出精神沉郁，不愿走动，被毛粗乱。空白对照组保持正常。  

3.5  相对日增重

结果如表1。攻毒后第0和第25天每头猪称重，结果显示，攻毒后25天攻毒对照组猪体增重较低，有两头消瘦严重出现负增重，两个疫苗免疫组及空白对照组的每头猪均有明显增重。计算相对日增重，两个疫苗免疫组RDWG与空白对照组相似（P>0.05），但明显高于攻毒对照组（P<0.05）。

表1  攻毒后各实验组猪相对日增重 

 3.6  血清及淋巴组织中PCV2病毒含量的检测

3.6.1  样品DNA提取

血清DNA提取：取200μl血清，加入400μlPBS，终浓度1%的SDS和终浓度50μg/mL的蛋白酶K，56℃水浴30min，加入等体积的酚，振荡混匀，12000rpm离心10min；小心吸取上清至新的EP管，加入等体积的酚/氯仿，振荡混匀，12000rpm离心10min；小心吸取上清至新的EP管，加入等体积的氯仿，振荡混匀，12000rpm离心10min；小心吸取上清至新的EP管，加入1/10体积的3M乙酸钠（pH5.2）和2.5倍体积的预冷的无水乙醇，-20℃过夜沉淀DNA；12000rpm离心15min，弃上清，沉淀用75%乙醇洗涤一次，室温干燥；最后加入20μL无菌双蒸水溶解DNA，-20℃保存备用。

组织DNA提取：取0.2g腹股沟淋巴结组织，剪碎，加入1.2mL PBS后匀浆，反复冻融三次，4000rpm离心10min，取50ul上清于新的EP管，加入500ul DNAZOL，涡旋混匀后室温静置10min；加入250ul预冷的无水乙醇，混匀后于4℃静置5min；12000 rpm离心10min，弃上清，沉淀用75%乙醇洗涤一次，室温干燥；最后加入20μL无菌双蒸水溶解DNA，-20℃保存备用。 

3.6.2  Real-time PCR 

Real-time PCR反应体系为：DNA 2μL，2×Power SYBR Green PCR MasterMix （TOYOBO公司）10μL，引物F/R各1μL（终浓度400nM，F:5’-CCAGGAGGGCG- TTCTGACT-；R:5’-CGTTACCGCTGGAGAAGGAA-3’），无菌双蒸水补足体积至20μL。置ABI 7300 real time PCR仪上进行，反应程序为：预变性95℃ 2min，95℃ 15s，60℃ 1min，进行40个循环。同时设定阴性对照并用阳性质粒模板pT-SH 10倍倍比稀释作为模板，按同样方法操作，绘制标准曲线，根据样品Ct值和标准曲线计算出相应的拷贝数。

根据样品Ct值和标准曲线（图5）计算对应DNA拷贝数，结果见图6：所有猪在攻毒后均产生病毒血症，7天时攻毒组病毒即达较高水平（10e5.1拷贝/0.1mL），免疫组处于较低水平；至11和19天攻毒组继续升高并维持较高水平（10e7.3拷贝/0.1mL），免疫组亦有所上升，但仍明显低于前者，攻毒25天后测定淋巴组织中的病毒含量，疫苗免疫组病毒达10e4.0拷贝/0.1mg，明显低于攻毒对照组（10e7.5拷贝/0.1mg）。说明两个疫苗免疫虽不能完全阻止病毒血症的产生，但却可以延缓病毒血症产生的时间，降低病毒血症的强度，减轻病毒感染。 

3.7  病理学观察 

3.7.1  眼观病变

在剖检时主要对肺脏和淋巴结病变进行观察，肺脏的实变、水肿、出血等，淋巴结水肿、出血情况，肾脏、脾脏、肝脏等病变情况，逐一记录。

3.7.2  组织切片制作及组织病理学观察 

剖杀时采集肺脏、淋巴结迅速置10%缓冲福尔马林中固定，24h后将组织修成0.5cm ×0.5cm×2-3mm 的小块，再置4%多聚甲醛中固定12h。流水冲洗过夜，梯度酒精脱水：75%：1h，75%：1h，85%：1h，85%：1h，95%：1h，95%：1h，100%：1h，100%：1h。二甲苯中透明10min左右，置60℃石蜡中透蜡2-3h，最终将组织块包埋于旧石蜡中。将蜡块修整到比组织块略大，在切片机上5μm厚度连续切片。每份样品切片贴于3-5个玻片上。室温保存，用于HE染色。

HE染色时，将切片置60℃烤箱中烤片30min，二甲苯脱蜡2次，每次5-10min。梯度酒精水化：100%，5min，×2次；95%，5min，×2次；85%，5min，×2次；75%，5min，×2次；去离子水1-2min。苏木精染色1min，水洗蓝化（在显微镜下掌握染色程度，过度可用盐酸酒精分化）。伊红染色30s-1min，水洗1-2min。梯度酒精脱水：75%，5min，×2次；85%，5min，×2次；95%，5min，×2次；100%，5min，×2次。二甲苯透明：5-10min，×2次。取出待二甲苯未挥发完全时中性树胶封片。置显微镜下观察。肺脏和淋巴结的病变分为三级（-：无病变；+：有轻微病变；++：中等程度病变；+++：严重病变）。 

攻毒后25天剖杀所有猪，取腹股沟淋巴结及肺脏器官进行大体病变观察，结果显示，除空白对照组，攻毒对照组猪肺脏存在不同程度的实变、萎陷和出血点，淋巴结出现明显水肿、出血，但免疫组和空白对照组猪各脏器眼观基本正常。 

取肺脏、淋巴结制成病理切片，进行HE染色，结果见图7。在光学显微镜下观察肺脏病变，攻毒组病变严重者可见明显的间质性肺炎表现，间质增生，肺泡壁增厚，肺泡腔缩小，肺泡腔或器官内有出血和炎性渗出物。两个疫苗免疫组的肺脏则基本正常，个别出现轻微间质增生，肺泡壁增厚。空白对照组均正常。淋巴结检测结果发现攻毒组淋巴结出现淋巴细胞缺失，淋巴滤泡边界模糊或消失，免疫组和空白组基本正常。各组肺脏、淋巴结组织病变计分结果见表2，表明两个疫苗免疫能明显减轻肺脏、淋巴结组织学病变（P<0.05），证明P5013合成肽疫苗具有较好免疫保护作用，免疫效果与商品化的PCV2亚单位疫苗相似。 

表2  各组猪肺脏淋巴结眼观病变及组织病理学变化情况 

-表示无病变；+表示轻微病变；++表示中等程度病变；+++表示严重病变

各组数据以平均值±SD表示，统计分析采用SPSS 16.0 软件通过ANOVA、Least significance difference （LSD） 方法进行计算，P<0.05时差异显著。

根据PCV2基因序列，设计合成4种多肽P4101、P5013、P2914和P1300，采用ISA50V佐剂配制P4101、P5013、P2914和P1300疫苗，小鼠免疫试验结果显示，P5013和P1300疫苗首免后42-63d时ELISA抗体滴度和中和抗体滴度明显升高，并显著高于P4101和P2914免疫组（P<0.05）；淋巴细胞增殖应答以及IL-4和IFN-γ细胞因子显著高于对照组相比差异显著（P<0.05），而且，P5013疫苗免疫组抗体水平和细胞免疫水平最高。采用P5013多肽疫苗进行猪体免疫试验，结果为：该疫苗两次免疫可诱导机体产生较高的ELISA抗体和中和抗体，与对照组差异极显著（P<0.01）；攻毒后多肽免疫组猪仅出现短时间的发热，无明显临床症状，相对日增重与攻毒对照组差异显著（P<0.05）。免疫组的病毒血症和淋巴结病毒载量明显降低（P<0.05）、病理学变化方面与空白对照组相似，但明显轻于攻毒对照组，免疫效果与商品化的亚单位疫苗相似。证明P5013多肽疫苗对PCV2感染具有较好免疫保护作用，可成为防控PCVD的新型候选疫苗。 

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。 

<110>南京农业大学

<120>一种猪圆环病毒2型免疫保护多肽与疫苗

<160>4

<210>1

<211>52

<212>PRT

<213>人工合成

 

<220>

<223>

 

<400>1

ArgSerHisLeuGly GlnIleLeuArgArg ArgProTrpLeuVal HisProArgHisArg TyrArgTrpArgArg

              5               10              15              20              25

LysAsnGlyIlePhe AsnThrArgLeuSer ArgThrPheGlyTyr ThrValLysArgThr ProAlaLeuAlaAsp

              30              35              40              45              50

ArgGlu

     52

<210>2

<211>54

<212>PRT

<213>人工合成

 

<220>

<223>

 

<400>2

TyrThrValLysArg ThrThrValThrThr ProSerTrpAlaLeu AlaValAspMetMet ArgPheLysIleAsp

              5               10              15              20             25

AspPheValProPro ProAlaLeuAlaAsp ArgGluGlyGlyGly ThrAsnSerArgTyr PheThrProLysPro

             30               35              40              45              50

ValLeuAspSer

          54

<210>3

<211>62

<212>PRT

<213>人工合成

 

<220>

<223>

 

<400>3

GlyAspArgGlyVal GlySerThrAlaLeu AlaValIleLeuAsp AspAsnPheValThr LysAlaLeuAlaThr

              5               10             15              20              25          

AlaLeuAlaLeuThr TyrAspProTyrVal AsnTyrSerSerGly ProAlaLeuAlaAsp ArgGluAsnValAsp

             30              35              40              45               50

HisValGlyLeuGly AlaLeuAlaAlaLeu AlaPhe

             55               60      62

<210>4

<211>53

<212>PRT

<213>人工合成

 

<220>

<223>

 

<400>4

ProSerTrpAlaLeu AlaValAspMetMet ArgPheLysIleAsp AspPheValProPro ProAlaLeuAlaAsp

              5              10              15              20             25

ArgGluGlyGlyGly ThrAsnSerArgTyr PheThrProLysPro ValLeuAspSerThr IleAspTyrPheGln

             30              35              40               45             50

ProAsnAsn

        53

Claims (7)

1.一种猪圆环病毒2型免疫保护多肽，其特征在于氨基酸序列如序列表中序列1所示。

2.一种猪圆环病毒2型免疫保护多肽，其特征在于氨基酸序列如序列表中序列2所示。

3.一种猪圆环病毒2型免疫保护多肽，其特征在于氨基酸序列如序列表中序列3所示。

4.一种猪圆环病毒2型免疫保护多肽，其特征在于氨基酸序列如序列表中序列4所示。

5.一种猪圆环病毒2型免疫保护多肽疫苗，其特征在于含有权利要求1-4中任一项所述的猪圆环病毒2型免疫保护多肽。

6.根据权利要求5所述的猪圆环病毒2型免疫保护多肽疫苗，其特征在于多肽蛋白浓度为100μg/mL。

7.根据权利要求5所述的猪圆环病毒2型免疫保护多肽疫苗，其特征在于将猪圆环病毒2型免疫保护多肽用DMSO溶解后加入灭菌的PBS缓冲液，将多肽蛋白浓度调整为100μg/mL，与ISA50V佐剂等体积混合，乳化呈油包水型即得。