CN104083772A - 靶向pax2用于治疗乳腺癌 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了通过抑制PAX2的表达来预防和/或治疗个体中乳腺癌的方法。在某些实施方案中,抑制PAX2表达的方法是给予个体编码PAX2siRNA的核酸。还提供了通过给予DEFB1或通过提高DEFB1的表达来治疗个体中癌症的方法。
Description
本申请要求于2010年2月18日提交的美国专利申请号12/708,294的优先权,以及于2009年8月24日提交的美国专利申请号12/546,292的优先权。
发明背景
乳腺癌是女性最常见的癌症原因,并且在美国是女性第二大常见的癌症死亡原因。虽然多数初期乳腺癌是基于发现乳腺影像异常来诊断的,但是肿块或乳腺组织坚实度的变化也可能是疾病的警报信号。过去几十年内提高乳腺癌风险意识已致使进行乳腺摄影筛查的女性数量增加,导致更早期检测癌症并且由此提高存活率。尽管如此,乳腺癌是45至55岁女性最常见的死亡原因。
已知许多类型的癌症是由遗传畸变即突变引起的。突变的积聚和细胞控制功能受损致使从正常组织到早期癌前的进行性表型变化,如上皮内瘤变(IEN)到日益严重的IEN到浅表癌以及最终到浸润性疾病。该过程通常在几年甚至十几年内相对缓慢地发生,虽然在一些情况下可能相对迅速。癌基因依赖是,癌细胞对维持恶性表型的单一癌基因的连续活化或过表达的生理依赖。这种依赖发生于标志肿瘤进程的其它变化的环境中。
浸润性癌症的长期进程为临床干预提供了时机。因此,重要的是鉴定指征癌前疾病的生物标志物,以便可以采取治疗措施预防或延缓浸润性癌症的发展。
发明概述
本发明一方面涉及预防或治疗个体中乳腺疾病的方法。所述方法包括向个体乳腺组织给予抑制PAX2表达或PAX2活性的组合物。
在一实施方案中,所述乳腺疾病是乳腺癌或乳腺上皮内瘤变 (MIN)。
在另一实施方案中,所述抑制PAX2表达包括向个体的乳腺癌组织或MIN组织给予编码PAX2siRNA的核酸。
在相关实施方案中,所述siRNA包含选自以下的序列:SEQ ID NO:3-6和11-15。
在另一实施方案中,所述组合物包含抑制PAX2与DEFB1启动子结合的寡核苷酸。
在相关实施方案中,所述寡核苷酸包含正向或反向的SEQ ID NO:1。
在相关实施方案中,所述寡核苷酸包含X1GGAACX2序列,其中X1和X2是与DEFB1编码序列中SEQ ID NO:1的邻近核苷酸互补的0至30个核苷酸。
在相关实施方案中,所述寡核苷酸包含选自以下的序列:SEQ IDNO:18-21,25,26,28和29。
在另一实施方案中,所述组合物包含RAS信号通路的阻断剂。
在另一实施方案中,所述组合物包含选自以下的拮抗剂:血管紧张素II的拮抗剂,血管紧张素II受体的拮抗剂,血管紧张素转化酶(ACE)的拮抗剂,丝裂原活化蛋白激酶(MEK)的拮抗剂,ERKl,2(细胞外信号调节激酶)的拮抗剂,以及信号转导及转录活化因子3(STAT3)的拮抗剂。
还公开了治疗个体中乳腺癌或MIN的方法,所述方法包括增强个体乳腺癌组织或MIN组织中的DEFB1表达。
在一实施方案中,增强DEFB1表达包括向个体的乳腺癌组织或MIN组织给予有效量的DEFB1。
在另一实施方案中,增强DEFB1表达包括向个体的乳腺癌组织或MIN组织给予有效量的编码DEFB1的表达载体。
还公开的是用于治疗个体乳腺疾病的方法,所述方法包括(a)测定来自所述个体的患病乳腺组织中PAX2-比-DEFB1的表达率;(b)测定来自所述个体的所述患病乳腺组织的ER/PR状态;以及(c)基于(a)和(b)的结果,向所述个体的乳腺组织给予组合物,所述组合物(1)抑制 PAX2表达或PAX2活性,(2)表达DEFB1,或(3)抑制PAX2表达或PAX2活性并且表达DEFB1。
附图简要说明
附图与说明书一起阐述本发明的一个或多个实施方案,用于说明本发明的原理。只要有可能,整个附图所使用的相同附图标记是指实施方案的相同或类似元件。
图1A至1D给出β-防御素-1(DEFB1)表达的定量RT-PCR(QRT-PCR)分析。
图2给出DEFB1诱导膜完整性和细胞形态改变的显微镜分析。黑色箭头指示膜波动,白色箭头指示凋亡小体。
图3给出前列腺癌细胞中DEFB1的细胞毒性分析。用PonA处理前列腺细胞系DU145、PC3和LNCaP来诱导DEFB1表达1-3天,之后进行MTT测定以确定细胞活力。结果表示为平均值±标准偏差,n=9。
图4A和4B给出由DEFB1诱导DU145和PC3细胞的细胞死亡。
图5给出DEFB1诱导之后的泛半胱天冬酶(pan-caspase)分析。
图6给出PAX2siRNA处理之后配对盒同源基因2(PAX2)蛋白表达的沉默。
图7给出对用PAX2siRNA处理之后的前列腺癌细胞生长的分析。
图8给出对siRNA沉默PAX2之后的细胞死亡的分析。结果表示为平均值±标准偏差,n=9。
图9给出对半胱天冬酶活性的分析。
图10给出对PAX2siRNA处理之后的凋亡因子的分析。
图11给出PAX2与DNA识别序列结合的模型。
图12示出DEFB1报告子构建体。
图13给出抑制PAX2导致DEFB1表达。
图14给出抑制PAX2导致DEFB1启动子活性增强。
图15给出DEFB1表达致使膜完整性受损。
图16给出PAX2抑制导致膜完整性受损。
图17A和17B给出PAX2与DEFB1启动子结合的ChIP分析。图 17A中,泳道1包含100bp的分子量标志物。泳道2是阳性对照,代表交联和免疫沉淀反应之前从DU145扩增的DEFB1启动子的160bp区。泳道3是阴性对照,代表无DNA进行的PCR。泳道4和5是阴性对照,分别代表用IgG从交联的DU145和PC3进行免疫沉淀反应的PCR。交联之后用抗-PAX2抗体免疫沉淀的25pg DNA(泳道6和8)和50pg DNA(泳道7和9)的PCR扩增分别显示DU145和PC3中160bp的启动子片段。图17B中,泳道1包含100bp分子量标志物。泳道2是阳性对照,代表交联和免疫沉淀反应之前从DU145扩增的DEFB1启动子的160bp区。泳道3是阴性对照,代表无DNA进行的PCR。泳道4和5是阴性对照,分别代表用IgG从交联的DU145和PC3进行免疫沉淀反应的PCR。交联之后用抗-PAX2抗体免疫沉淀的25pgDNA(泳道6和8)和50pg DNA(泳道7和9)的PCR扩增分别显示DU145和PC3中160bp的启动子片段。
图18给出PrdPD和PrdHD与DNA的预测结构。
图19给出不同配对结构域共有序列的比较。在图顶部示出Prd-配对-结构域±DNA复合物晶体学分析中所描述的蛋白±DNA接触的示意图。空框指示α-螺旋,阴影框指示β-折叠,以及粗线指示β-转角。接触的氨基酸由单字母代码给出。仅给出直接接触的氨基酸±碱基。空圈指示大沟接触,而红箭头指示小沟接触。该示意图是配对结构域蛋白所有已知共有序列的比对(仅给出正义链)。共有序列之间的垂直线指示保守的碱基对。位置编号在图底部给出。
图20给出靶向PAX2作为化学预防性策略。
图21给出血管紧张素II(Ang II)对DU145细胞中PAX2表达的影响。
图22A给出洛沙坦(Losartan,Los)对DU145细胞中PAX2表达的影响。
图22B给出AT2R阻断剂PD123319对DU145细胞中PAX2表达的影响。
图23给出Los阻断AngII对DU145中PAX2表达的影响。
图25A,图25B和图25C给出Los和MAP激酶抑制剂对DU145细胞中PAX2表达的影响。图25A给出用洛沙坦处理DU145细胞阻抑 磷酸化-ERK1/2和PAX2表达;图25B给出MEK激酶抑制剂和AICAR阻抑PAX2蛋白表达;图25C给出MEK激酶抑制剂和洛沙坦阻抑磷酸化-STAT3蛋白表达。
图26A和26B给出Los和MEK激酶抑制剂对DU145细胞中PAX2活化的影响。
图27给出AngII在hPrEC细胞中增加PAX2表达而降低DEFB1表达。
图28给出AngII信号转导和PAX2前列腺癌的示意图。
图29给出阻断PAX2表达作为前列腺癌疗法的示意图。
图30给出用Gleason评分对DEFB1和PAX2表达的比较。
图31A和31B给出PAX2-DEFB1比值作为前列腺癌发展的预测因子。
图32给出Donald预测因子(DPF)是基于相对的PAX2-DEFB1表达率。
图33A和33B给出对人前列腺组织中hBD-1表达的分析。
图34A和34B给出对前列腺细胞系中hBD-1表达的分析。图34A给出与hPrEC细胞相比,hBD-1诱导之前和之后前列腺癌细胞系中hBD-1的表达水平。一个星号代表相比hPrEC统计学更高的表达水平。两个星号代表相比hBD-1诱导之前的细胞系统计学显著的表达水平(学生t-检验,p<0.05)。图34B给出通过免疫细胞化学验证前列腺癌细胞系DU145中的异常hBD-1表达。将hPrEC细胞对hBD-1进行染色作为阳性对照(A:DIC和B:荧光)。用hBD-1转染DU145细胞并诱导18小时(C:DIC和D:荧光)。比例尺=20μM。
图35给出前列腺癌细胞中hBD-1的细胞毒性分析。各柱子代表一式三份进行三个独立试验的平均值±标准误。
图36A和图36B给出正常、PIN和肿瘤的LCM人前列腺组织切片中hBD-1和cMYC表达的QRT-PCR分析。每种基因的表达表示为与β-肌动蛋白相比的表达率。图36A给出正常、PIN和肿瘤切片中hBD-1表达水平的比较。图36B给出正常、PIN和肿瘤切片中cMYC表达水平的比较。
图37给出用siRNA敲低PAX2之后的hBD1表达的QRT-PCR分析。hBD-1表达水平表示为与β-肌动蛋白相比的表达率。星号代表与PAX2siRNA处理之前的细胞系相比统计学更高的表达水平(学生t-检验,p<0.05)。
图38A和38B给出PAX2siRNA处理之后PAX2蛋白表达的沉默。图38A给出通过Western印迹分析检测HPrEC前列腺原代细胞(泳道1)以及DU145(泳道2),PC3(泳道3)和LNCaP(泳道4)前列腺癌细胞中的PAX2表达。将印迹清除并重新探测作为内参的β-肌动蛋白,以确保等量上样。图38B给出对用PAX2siRNA双螺旋转染之后证实PAX2表达敲低的全部DU145,PC3和LNCaP的Western印迹分析。同样地,将印迹清除并重新探测作为内参的β-肌动蛋白。
图39给出对用PAX2siRNA处理之后的前列腺癌细胞生长的分析。比例尺=20μm。
图40给出对siRNA沉默PAX2之后的细胞死亡的分析。结果表示为平均值±标准偏差,n=9。
图41给出对半胱天冬酶活性的分析。比例尺=20μm.
图42A至42C给出对PAX2siRNA处理之后的凋亡因子的分析。结果表示为平均值±标准偏差,n=9。星号代表统计学差异(p<0.05)。
发明详述
本发明一方面提供预防或治疗个体中乳腺癌的方法。所述方法包括给予个体组合物,所述组合物包含PAX2表达或PAX2活性的抑制剂,或者DEFB-1表达或DEFB-1活性的增强剂。在一实施方案中,所述个体被诊断患有乳腺上皮内瘤变(MIN)。
在某些方面,乳腺组织的PAX2在MIN之前被上调。因而,本申请还提供了治疗或预防个体中MIN的方法。所述方法包括给予个体组合物,所述组合物包含PAX2表达或PAX2活性的抑制剂,或者DEFB-1表达或DEFB-1活性的增强剂。
蛋白“活性”包括,例如转录、翻译、细胞内转位、分泌、通过激酶的磷酸化、通过蛋白酶的剪切、与其它蛋白的嗜同和嗜异结合、 泛素化作用。在某些方面,“PAX2活性”具体是指PAX2与DEFB-1启动子的结合。
乳腺癌
普遍用于乳腺癌筛选的方法包括自我和临床乳腺检查,x-射线乳腺摄影以及乳腺磁共振成像(MRI)。乳腺癌筛查的最新技术是超声计算机断层成像术,其利用声波形成三维图像并且乳腺癌在不用x-射线乳腺摄影中所用的危险放射线的情况下检测乳腺癌。还可以使用基因测试。用于乳腺癌的基因测试一般包括测试BRCA基因中的突变。这除了对那些有提高乳腺癌风险的患者,通常是不推荐的技术。
女性死亡的主要原因,乳腺癌的发生率,在美国过去这三十年逐渐增加。虽然乳腺癌的发病机理尚不清楚,但是正常乳腺上皮细胞转化成恶性表型可能是遗传因素的结果,尤其是30岁以下的女性。最近,BRCA1和BRCA2的发现和表征已扩大了我们对能促进家族乳腺癌的遗传因素的理解。这两个基因座内的生殖细胞系突变与50-85%的乳腺癌和/或卵巢癌的终身风险相关。然而,其它非遗传因素很可能对该疾病的病因也具有重大影响。无论其起因是什么,如果在其进程早期未被检测到,那么乳腺癌发病率和死亡率会显著增加。因而,大量工作已集中于乳腺组织的细胞转化和肿瘤形成的早期检测上。
目前,鉴定乳腺癌的主要方式是通过检测致密肿瘤组织的存在。这可以通过直接检查乳腺外部或通过乳腺摄影或其它X-射线成像方法来实现不同程度的效力。然而,后面的方法有相当大的代价。每当进行乳腺摄影时,患者承受测试过程中所使用的放射线的电离特性所诱导的较小的患有乳腺肿瘤的风险。此外,该方法昂贵并且技术员的主观解释可能导致不精确,例如,一项研究表明,对于由所调查的一组放射科医生单独解释的一组乳腺影像,大约三分之一存在主要临床分歧。此外,许多女性感到进行乳腺摄影是痛苦的经历。因此,国家癌症研究所并不推荐50岁以下的女性进行乳腺摄影,因为与年纪较大的女性相比,该群体发展成乳腺癌的可能性较低。然而,引人注意的是,虽然50岁以下的女性仅有约22%发生乳腺癌,但数据显示绝经前女性的乳腺癌更具侵袭性。
PAX2
PAX基因是编码核转录因子的九个发育调控基因家族。它们在胚胎发生中起重要作用,并且以非常有序的时空模式表达。它们全部包含编码DNA结合结构域的384个碱基对的“配对盒”区,所述“配对盒”区在整个进化过程中是高度保守的(Stuart,ET,et al.1994)。通过许多可直接归因于PAX基因的杂合不足的天然鼠和人类综合症已证实PAX基因对发育过程的影响。Dressier等(1990)已给出PAX2序列。人PAX2蛋白及其变体的氨基酸序列,以及编码这些蛋白的DNA序列列于SEQ ID NO:39-59(SEQ ID NO:39,由人PAX2基因的外显子1编码的氨基酸序列;SEQ ID NO:40,人PAX2基因启动子和外显子1;SEQ ID NO:41,人PAX2的氨基酸序列;SEQ ID NO:42,人PAX2基因;SEQ ID NO:43,人PAX2基因变体b的氨基酸序列;SEQ ID NO:44,人PAX2基因变体b;SEQ ID NO:45,人PAX2基因变体c的氨基酸序列;SEQ ID NO:46,人PAX2基因变体c;SEQ ID NO:47,人PAX2基因变体d的氨基酸序列;SEQ ID NO:48,人PAX2基因变体d;SEQ ID NO:49,人PAX2基因变体e的氨基酸序列;SEQ ID NO:50,人PAX2基因变体e)。据报道,PAX2通过与DEFB-1启动子(Bose SK et al.,MoI Immunol.2009,46:1140-8.)在紧邻DEFB1TATA盒的5’-CCTTG-3’(SEQ ID NO:1)识别位点处相结合而阻抑DEFB-1表达。在一些文献中,结合位点还称为3’-GTTCC-5’(SEQ ID NO:1)或5’-CAAGG-3’(SEQ ID NO:2)识别位点,5’-CAAGG-3’(SEQ ID NO:2)是相对链上的序列。两个序列都涉及DEFB1启动子上的PAX2结合位点。已检测PAX2表达的癌症的例子列于表1。
表1:表达PAX2的癌症
DEFB1
β-防御素是具有广谱抗微生物活性的阳离子肽,其是上皮细胞和白细胞的产物。有两个外显子的单基因产物表达于上皮表面并且在包括皮肤、角膜、舌、牙龈、唾腺、食道、肠、肾、泌尿生殖道、以及呼吸上皮的位置分泌。至今,已在人类中鉴定和表征了上皮来源的五种β-防御素基因:DEFB1(Bensch et al.,1995),DEFB2(Harder et al.,1997),DEFB3(Harder et al.,2001;Jia et al.,2001),DEFB4和HE2/EP2。人DEFB1的氨基酸序列和人DEFB1基因序列分别如SEQ ID NOS:63和64所示。
每种β-防御素基因产物的一级结构的特征为小型、六个半胱氨酸基序、高阳离子电荷以及这些特征之外的极度多样性。防御素蛋白最典型的特征是其形成三个二硫键网的六个半胱氨酸基序。β-防御素蛋白的三个二硫键位于C1-C5、C2-C4和C3-C6。相邻半胱氨酸残基之间最常见的间距是6、4、9、6、0。除了位于最接近羧基末端的C5和C6外,β-防御素蛋白的半胱氨酸之间的间距可以相差一个或两个氨基酸。在所有已知的脊椎动物β-防御素基因中,这两个半胱氨酸残基彼此相邻。
β-防御素蛋白的第二个特征是其小型。每种β-防御素基因编码的前蛋白原的大小范围为59至80个氨基酸(平均大小为65个氨基酸)。接着该基因产物通过未知机制剪切形成大小范围为36至47个氨基酸(平均大小为45个氨基酸)的成熟肽。这些范围的例外是包含β-防御素基序并且表达于附睾中的EP2/HE2基因产物。
β-防御素蛋白的第三个特征是高浓度的阳离子残基。成熟肽中带正电荷残基(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)的数量范围为6至14个(平均为9个)。
β-防御素基因产物的最后一个特征是其多样的一级结构但明显保守的三级结构。在该蛋白家族所有已知的成员中,除六个半胱氨酸之外,在给定位置没有一个氨基酸是保守的。然而,有保守的位置似乎对二级和三级结构以及功能是重要的。
尽管β-防御素蛋白的一级氨基酸序列差异很大,但有限的数据表明该蛋白家族的三级结构是保守的。结构核心是三链反向平行的β-折叠,以BNBD-12和DEFB2编码的蛋白作为实例。三条β-链通过β-转角和α-发卡环连接,并且第二β-链还含有β-凸起。当这些结构折叠成其特有的三级结构时,阳离子和疏水残基的随机序列明显聚集成球状蛋白的两个表面。一个表面是亲水的并且含有许多带正电荷的侧链,而另一个表面是疏水的。在溶液中,由DEFB2基因编码的HBD-2蛋白在N-末端附近显示α-螺旋区段,这以前没有被认为是α-防御素或β-防御素BNBD-12的溶液结构。β-防御素蛋白之间,其侧链指向蛋白表面的氨基酸更不保守,而核心β-折叠的三条β-链的氨基酸残基是更高度保守的。
β-防御素肽作为前肽原(pre-pro-peptides)产生,然后剪切以释放C-末端活性肽片段;然而,人β-防御素肽在气道上皮的细胞内加工、贮存和释放途径是未知的。
PAX2表达或PAX2活性的抑制剂
功能性核酸
所公开方法的抑制剂可以是能抑制PAX2表达的功能性核酸。功能性核酸是具有特定功能如结合靶分子或催化特定反应的核酸分子。功能性核酸分子可以分成以下种类,但是并不意图限制。例如,功能性核酸包括反义分子、适配子、核酶和形成三螺旋的分子、RNAi以及外部引导序列。功能性核酸分子可以充当靶分子所具有的特定活性的影响物、抑制剂、调节剂和刺激物,或者功能性核酸分子可以具有 不依赖于其它任何分子的全新活性。
功能性核酸分子可以与任何大分子如DNA、RNA、多肽或碳水化合物链相互作用。因而,功能性核酸可以与PAX2的mRNA或PAX2的基因组DNA相互作用,或者它们可以与多肽PAX2相互作用。基于靶分子和功能性核酸分子之间的序列同源性,通常将功能性核酸设计成与其它核酸相互作用。在其它情况下,功能性核酸分子与靶分子之间的特异性识别并不是基于功能性核酸分子与靶分子之间的序列同源性,而是基于允许发生特异性识别的四级结构的形成。
将反义分子设计成与靶核酸分子通过常规或非常规的碱基配对相互作用。将反义分子与靶分子的相互作用设计成促进靶分子通过例如RNAseH介导的RNA-DNA杂合体降解而破坏。可选择地,将反义分子设计成阻断通常发生于靶分子上的加工功能如转录或复制。反义分子可以基于靶分子的序列进行设计。存在通过寻找靶分子最易受影响的区域来优化反义效力的许多方法。示例性的方法是体外选择试验和利用DMS和DEPC的DNA修饰研究。优选的是反义分子与靶分子结合,所具有的解离常数(Kd)为小于或等于10-6、10-8、10-10或10-12。
适配子是优选以特异方式与靶分子相互作用的分子。通常,适配子是长度范围为15-50个碱基的小核酸,其能折叠成确定的二级和三级结构,如茎-环或G-四分体。适配子可以结合诸如ATP和茶碱的小分子,以及诸如逆转录酶和凝血酶的大分子。适配子可以与靶分子以Kd小于10-12M非常紧密地结合。优选的是,适配子与靶分子结合,所具有的Kd小于10-6、10-8、10-10或10-12。适配子可以非常高程度的特异性结合靶分子。例如,已分离在靶分子与仅有分子的一个位置不同的另一分子之间结合亲和力相差大于10,000倍的适配子。优选的是适配子与靶分子的Kd比其与背景结合分子的Kd低至少10、100、1000、10,000或100,000倍。例如,进行多肽比较时,背景分子优选是不同的多肽。
核酶是能够催化分子内或分子间化学反应的核酸分子。因而,核酶是具有催化活性的核酸。优选催化分子间反应的核酶。有许多不同种类的催化核酸酶或核酸聚合酶类型反应的核酶是基于天然系统中存 在的核酶,如锤头状核酶、发卡状核酶和四膜虫核酶。还有许多天然系统中不存在但是经改造能重新催化特异反应的核酶。优选的核酶剪切RNA或DNA底物,更优选剪切RNA底物。核酶通常通过识别并且结合靶底物并随后剪切来剪切核酸底物。该识别通常主要基于常规或非常规的碱基对相互作用。由于对靶底物的识别是基于靶底物的序列,这种特征使得核酶成为特别适合于核酸的靶向特异性剪切的候选者。
形成三螺旋的功能性核酸分子是可以与双链或单链核酸相互作用的分子。当三螺旋分子与靶区相互作用时,形成被称为三螺旋的结构,其中有三条DNA链依赖于Watson-Crick和Hoogsteen碱基配对形成复合物。三螺旋分子是优选的,因为它们能够以高的亲和力和特异性结合靶区。优选的是形成三螺旋的分子与靶分子结合,所具有的Kd为小于10-6、10-8、10-10或10-12。
外部引导序列(EGS)是与靶核酸分子结合形成复合物的分子,并且该复合物可被剪切靶分子的RNase P识别。EGS可以设计成特异地靶向选择的RNA分子。RNAse P辅助细胞内加工转移RNA(tRNA)。通过利用导致靶RNA:EGS复合物模拟天然tRNA底物的EGS,细菌RNAse P实际上可以补充剪切任何RNA序列。同样地,可以利用真核EGS/RNAse P-定向的RNA剪切来剪切真核细胞内期望的靶标。
还可以通过RNA干扰(RNAi)以高度特异的方式有效地沉默基因表达。最初通过添加双链RNA(dsRNA)观察到这种沉默。一旦进入细胞,dsRNA由RNase III-样酶Dicer剪切成长度为21-23个核苷酸的双链小干扰RNA(siRNA),所述双链小干扰RNA在3’端含有2个核苷酸的悬突。在ATP依赖的步骤中,siRNA适合整合入通常被称为RNAi诱导的沉默复合物(RISC)的多亚基蛋白复合物中,这种复合物引导siRNA至靶RNA序列。在一些点,siRNA双螺旋解开,并且反义链似乎保持与RISC结合且通过核酸内切酶和核酸外切酶的组合指导互补mRNA序列的降解。然而,iRNA或siRNA的作用或它们的应用并不限于任何类型的机制。
短干扰RNA(siRNA)是可以诱导序列特异的转录后基因沉默从而 降低甚至抑制基因表达的双链RNA。在一个例子中,siRNA在siRNA与靶RNA之间的序列同一性区域内触发同源RNA分子(如mRNA)的特异性降解。例如,WO02/44321公开了当用3’悬突端碱基配对时,siRNA能够序列特异地降解靶mRNA,本文通过引用并入制备这些siRNA的方法。利用合成的短双链RNA模拟由酶dicer产生的siRNA,可以在哺乳动物细胞内实现序列特异的基因沉默。siRNA可以用化学方法合成或在体外合成,或者可以是能在细胞内被加工成siRNA的短双链发卡样RNA(shRNA)的结果。合成的siRNA通常利用算法和常规DNA/RNA合成仪来设计。厂商包括Ambion(Austin,Texas)、ChemGenes(Ashland,Massachusetts)、Dharmacon(Lafayette,Colorado)、Glen Research(Sterling,Virginia)、MWB Biotech(Esbersberg,Germany)、Proligo(Boulder,Colorado)以及Qiagen(Vento,TheNetherlands)。siRNA还可以利用试剂盒如Ambion的siRNA构建试剂盒体外合成。本文公开的是基于PAX2的序列,如以上描述所设计的任何siRNA。
更常进行的是通过短发卡RNA(shRNA)的转录,由载体产生siRNA。用于产生含有shRNA的载体的试剂盒可获自例如,如Imgenex的GENESUPPRESSORTM构建试剂盒以及Invitrogen的BLOCK-ITTM诱导型RNAi质粒和慢病毒载体。本文公开的是基于本文所公开炎症介质的序列,如以上描述所设计的任何shRNA。
在某些实施方案中,功能性核酸序列包括能抑制PAX2(抗-PAX2siRNA)表达的siRNA。抗-PAX2siRNA的例子包括但不限于,具有以下序列的siRNA(5’至3’方向):
AUAGACUCGACUUGACUUCUU(SEQ ID NO:3),
AUCUUCAUCACGUUUCCUCUU(SEQ ID NO:4),
GUAUUCAGCAAUCUUGUCCUU(SEQ ID NO:5),
GAUUUGAUGUGCUCUGAUGUU(SEQ ID NO:6),
ACCCGACTATGTTCGCCTGG(SEQ ID NO:11),
AAGCTCTGGATCGAGTCTTTG(SEQ ID NO:12),
ATGTGTCAGGCACACAGACG(SEQ ID NO:13),
GUCGAGUCUAUCUGCAUCCUU(SEQ ID NO:14),
GGAUGCAGAUAGACUCGACUU(SEQ ID NO:15),以及
至少10个核酸片段及其保守变体;以及以上的组合。
在其他实施方案中,功能性核酸包括PAX2的反义RNA和干扰或抑制PAX2与DEFB1启动子结合的寡核苷酸。寡核苷酸可以与结合DEFB1启动子的PAX2的序列互补。可选择地,寡核苷酸可以抑制PAX2与DEFB1结合的方式与PAX2相互作用。该相互作用可以基于三维结构而非一级核苷酸序列。
PAX蛋白是进化过程中保守并且能够与特定DNA序列通过被称为“配对结构域”和“同源结构域”的结构域结合的转录因子家族。配对结构域(PD)是由某些PAX蛋白(如PAX2和PAX6)共享的共有序列。PD指导DNA与位于形成DNA-蛋白复合物的α3-螺旋内的氨基酸结合。对于PAX2,HD内的氨基酸识别CCTTG(SEQ ID NO:1)DNA核心序列并且与其特异地相互作用。预期包括该序列或其互补序列的寡核苷酸为抑制剂。用于PAX2蛋白结合的DEFB1启动子内的关键DNA区具有序列AAGTTCACCCTTGACTGTG(SEQ ID NO:16)。
在一实施方案中,寡核苷酸具有序列V-CCTTG-W(SEQ ID NO:17),其中V和W是1至35个核苷酸的核苷酸序列。在某些实施方案中,V或W或二者包含通常位于DEFB1启动子的PAX2结合位点侧翼的连续核苷酸序列。可选择地,V和/或W的核苷酸序列可与DEFB1启动子无关,并且随机选择以避免干扰PAX2识别序列。
抑制PAX2与DEFB1启动子结合的寡核苷酸的其它例子包括但不限于,具有以下序列的寡核苷酸(5’至3’方向):
CTCCCTTCAGTTCCGTCGAC(SEQ ID NO:18),
CTCCCTTCACCTTGGTCGAC(SEQ ID NO:19),
ACTGTGGCACCTCCCTTCAGTTCCGTCGACGAGGTTGTGC(SEQ ID NO:20),以及
ACTGTGGCACCTCCCTTCACCTTGGTCGACGAGGTTGTGC(SEQ ID NO:21)。
其它抑制剂
除功能性核苷酸外,PAX2表达或PAX2活性的抑制剂可以是能干扰或抑制PAX2与DEFB1启动子结合的任何小分子。PAX2表达或PAX2活性的抑制剂还可以是血管紧张素II的拮抗剂,或血管紧张素转化酶(ACE)的拮抗剂。例如,抑制剂可以是依那普利(enalapril)或/和血管紧张素II1型受体(ATlR)的拮抗剂。抑制剂可以是缬沙坦(valsartan)、奥美沙坦(olmesartan)或/和替米沙坦(telmisartan)。抑制剂可以是MEK的拮抗剂、ERK1,2的拮抗剂,或/和STAT3的拮抗剂。在某些方面,所公开的PAX2表达或活性抑制剂不是AT1R受体拮抗剂。术语“拮抗剂”是指抑制靶标活性的试剂。
MEK和/或ERK1,2的拮抗剂包括U0126和PD98059。U0126是化学合成的有机化合物,最初被认为是细胞AP-1拮抗剂,并且发现是通过抑制其直接的上游活化剂丝裂原活化蛋白激酶激酶1和2(还被称为MEKl和MEK2,IC50分别为70nM和60nM)而成为丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联的极具选择性和高度有效的抑制剂。U0126抑制活化和失活的MEKl,2,与仅抑制失活MEK的活化的PD98059不同。MEK活化的阻断会阻止下游许多因子包括p62TCF(EIk-1)的磷酸化,p62TCF是c-Fos和c-Jun的上游诱导剂,AP-1复合物的成分。由U0126抑制MEK/ERK通路还阻止了癌基因H-Ras和K-Ras的全部作用,抑制由生长因子触发的部分作用,以及阻断炎症细胞因子和基质金属蛋白酶的产生。
已表明,PD98059在体内作为MEKl活化和MAP激酶级联的高度选择性的抑制剂而起作用。PD98059与MEKl的失活形式结合并且通过上游活化剂如c-Raf阻止其活化。PD98059抑制MEKl与MEK2的活化,所具有的IC50值分别为4μM和50μM。
在某些实施方案中,PAX2的表达通过将RAS信号通路的阻断剂给予个体的乳腺癌组织或MIN组织来抑制。
在某些其它实施方案中,PAX2表达或PAX2活性的抑制剂与抗体、受体或配体缀合,以靶向肿瘤组织。
DEFB-1表达或DEFB-1活性的增强剂
DEFB-1表达或DEFB-1活性的增强剂可以是表达DEFB-1蛋白的载体。由于PAX2抑制DEFB-1表达,PAX2表达或PAX2活性的抑制剂也是DEFB-1表达的增强剂。
递送系统
有许多组合物和方法可以用于在体外或体内将核酸递送至细胞。这些方法和组合物主要可以分成两类:基于病毒的递送系统和基于非病毒的递送系统。例如,核酸可以通过许多直接递送系统,如电穿孔、脂质体转染、磷酸钙沉淀、质粒、病毒载体、病毒核酸、噬菌体核酸、噬菌体、粘粒被递送或通过在细胞或诸如阳离子脂质体的载体内转移遗传材料被递送。这样的方法是本领域内熟知的并且适用于本文所描述的组合物和方法。在某些情况下,所述方法将改进,从而对大DNA分子特异地起作用。此外,通过利用载体的靶向特征,这些方法可以用于靶向某些疾病和细胞群。
基于核酸的递送系统
利用基于核酸的递送系统如质粒和病毒载体可以将PAX2表达或PAX2活性的抑制剂和DEFB1表达或DEFB1活性的增强剂递送至靶细胞。如本文所使用的,质粒或病毒载体是将所公开的核酸如PAX2siRNA转运至细胞而不会降解的试剂,其包含在其所递送至的细胞中产生基因表达的启动子。在一些实施方案中,载体来源于病毒或逆转录病毒。病毒载体是,例如腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、AIDS病毒、神经元营养型病毒(neuronal trophic virus)、辛德毕斯(Sindbis)病毒以及其它RNA病毒,包括具有HIV骨架的这些病毒。还优选的是共享这些病毒的使得它们适合用作载体的特性的任何病毒家族。逆转录病毒包括莫洛尼氏鼠白血病病毒、MMLV以及作为载体表达MMLV的期望特性的逆转录病毒。逆转录病毒载体能够携带比其它病毒载体更大的遗传负荷,即转基因或标记基因,并且鉴于此原因是普遍使用的载体。然而,它们在非增殖细胞中并没有 用。腺病毒载体相对稳定并且易于操作,具有高滴度,以及可以在气雾剂制剂中递送,并且可以转染非分裂细胞。Pox病毒载体较大并且具有用于插入基因的几个位点,它们耐热并且可以于室温贮存。病毒载体比化学或物理方法具有更高的转导(引入基因的能力)能力,从而将基因引入细胞。通常,病毒载体包含非结构早期基因、结构晚期基因、RNA聚合酶III转录本、复制和包装所必需的反向末端重复以及控制病毒基因组转录和复制的启动子。当改造成为载体时,病毒通常去除了一个或多个早期基因并且将基因或基因/启动子盒插入至病毒基因组代替去除的病毒DNA。该类型的构建体可以转运高达约8kb的外源遗传材料。所去除的早期基因的必需功能通常由经改造能以反式表达早期基因的基因产物的细胞系补充。
递送至细胞的核酸一般包含表达控制系统。例如,病毒和逆转录病毒系统内的插入基因通常包含启动子和/或增强子以辅助控制所期望基因产物的表达。启动子通常是对于转录起始位点处于相对固定的位置时起作用的DNA序列。启动子包含RNA聚合酶与转录因子基本相互作用所需的核心元件,并且可以包含上游元件和响应元件。
在哺乳动物宿主细胞中控制载体转录的优选启动子可以获自多种来源,例如病毒基因组,如多瘤病毒、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、逆转录病毒、乙肝病毒,并且最优选巨细胞病毒,或者来自异源哺乳动物启动子,如β-肌动蛋白启动子。
增强子通常是指在距转录起始位点不固定的距离处起作用并且可以位于转录单元的5’或3’处的DNA序列。此外,增强子可以在内含子之内,也可以在编码序列之内。它们的长度通常为10至300bp,并且它们以顺式起作用。增强子起增加邻近启动子转录的作用。增强子通常还含有介导转录调控的响应元件。启动子还含有介导转录调控的响应元件。增强子通常决定基因表达的调控。虽然现在已知许多增强子序列来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、胎蛋白以及胰岛素),但是对于常规表达通常将使用来自真核细胞病毒的增强子。优选的例子是在复制起点下游(late side)(bp100-270)的SV40增强子,巨细胞病毒早期启动子增强子,在复制起点下游的多瘤病毒增强子, 以及腺病毒增强子。
启动子和/或增强子可以通过光或触发其功能的特定化学事件而被特异地活化。系统可以通过诸如四环素和地塞米松的试剂调控。还有通过暴露于辐射(如γ辐射)或烷基化化疗药物来增强病毒载体基因表达的方法。
在某些实施方案中,启动子和/或增强子区可以用作组成型启动子和/或增强子,以使待转录的转录单位区的表达最大化。在某些构建体中,即使仅于特定时间在特定类型的细胞中表达,启动子和/或增强子区在所有真核细胞类型中都是有活性的。该类型优选的启动子是CMV启动子(650个碱基)。其它优选的启动子是SV40启动子、巨细胞病毒(全长启动子)以及逆转录病毒载体LTR。
已表明所有特异的调控元件都可以被克隆并用于构建可在特定细胞类型如黑素瘤细胞中选择性表达的表达载体。已将神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子用于在神经胶质起源的细胞中选择性地表达基因。
用于在真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或有核细胞)中的表达载体还可含有能影响mRNA表达的转录终止所必需的序列。这些区域在编码组织因子蛋白的mRNA的非翻译部分作为多腺苷酸化片段转录。3’非翻译区还包含转录终止位点。优选的是转录单位还含有多腺苷酸化区。该区的一个益处,在于其增加转录单元如mRNA一样被加工和转运的可能性。已完善建立了多腺苷酸化信号在表达构建体中的鉴定和使用。优选的是将同源多腺苷酸化信号用于转基因构建体中。在某些转录单元中,多腺苷酸化区源自SV40早期多腺苷酸化信号,并且由约400个碱基组成。还优选的是转录单元含有其它标准序列,所述其它标准序列单独或与以上序列组合来提高构建体的表达或构建体的稳定性。
病毒载体可以包含编码标记产物的核酸序列。将该标记产物用于确定基因是否已递送至细胞,并且是否一递送就被表达。优选的标记基因是编码β-半乳糖苷酶的大肠杆菌lacZ基因,以及绿色荧光蛋白。
在一些实施方案中,标记可以是选择标记。用于哺乳动物细胞的 合适的选择标记的例子是二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶、新霉素、新霉素类似物G418、潮霉素以及嘌呤霉素。当这样的选择标记成功转移至哺乳动物宿主细胞时,若放置于选择性压力下,所转化的哺乳动物宿主细胞能存活。有两类广泛使用的不同类别的选择方式。第一类是基于细胞的代谢,并且使用不依赖于补充培养基就没有能力生长的突变细胞系。两个例子是:CHO DHFR-细胞和小鼠LTK-细胞。未添加诸如胸苷或次黄嘌呤这样的营养物时,这些细胞不能生长。因为这些细胞缺少完整核苷酸合成途径所必需的某些基因,所以如果不在补充培养基中提供缺少的核苷酸,它们就不能存活。补充培养基的备选方案是将完整DHFR或TK基因引入缺少各自基因的细胞,因而改变它们的生长需求。未转化DHFR或TK基因的个体细胞将不能在无补充的培养基中存活。
第二类是显性选择,其涉及任何细胞类型所使用的选择方案并且不需要使用突变细胞系。这些方案通常利用药物来阻止宿主细胞生长。那些具有新基因的细胞会表达传递药物抗性的蛋白,并且选择后会存活。这样的显性选择例子利用药物新霉素、霉酚酸或潮霉素。这三个例子于真核控制下使用细菌基因来分别传递对适当药物G418或新霉素(遗传霉素)、xgpt(霉酚酸)或潮霉素的抗性。其它包括新霉素类似物G418和嘌呤霉素。
基于非核酸的系统
PAX2表达或PAX2活性的抑制剂和DEFB1表达或DEFB1活性的增强剂还可以以多种方法递送至靶细胞。例如,可以通过电穿孔或通过脂质体转染或通过磷酸钙沉淀来递送组合物。递送方式的选择部分依赖于所靶向的细胞类型以及递送是否发生于例如体内或体外。
因而,所述组合物可以包含脂质如脂质体,例如阳离子脂质体(如DOTMA、DOPE、DC-胆固醇)或阴离子脂质体。如果需要,脂质体还可以包含利于靶向特定细胞的蛋白。包含化合物和阳离子脂质体的组合物的给药可以给予血液传入靶器官或吸入呼吸道至呼吸道的靶细胞。此外,化合物可以作为微胶囊的成分给予,所述微胶囊可以靶向 特定的细胞类型如巨噬细胞,或者其中化合物的扩散或化合物从微胶囊的递送被设计成特定的速率或剂量。
在以上所描述的包括将外源DNA给予和吸收至个体细胞的方法(即基因转导或转染)中,组合物可以通过多种方式递送至细胞。作为一个例子,递送可以通过脂质体,利用可商购获得的脂质体制剂如LIPOFECTIN,LIPOFECTAMINE(GIBCO-BRL,Inc.,Gaithersburg,MD),SUPERFECT(Qiagen,Inc.Hilden,Germany)和TRANSFECTAM(Promega Biotec,Inc.,Madison,WI),以及根据本领域程序标准开发的其它脂质体。此外,所公开的核酸或载体可以通过电穿孔(该技术可获自Genetronics,Inc.(San Diego,CA))以及通过SONOPORATION装置(ImaRx Pharmaceutical Corp.,Tucson,AZ)在体内递送。
所述材料可以在溶液、悬浮液(例如并入微粒、脂质体或细胞)中。这些材料可以通过抗体、受体或受体配体来靶向特定细胞类型。媒介如“stealth”和其它抗体偶联的脂质体(包括靶向结肠癌的脂质介导的药物),通过细胞特异的配体介导靶向DNA的受体,定向于肿瘤靶标的淋巴细胞,以及体内靶向于鼠神经胶质瘤细胞的高度特异的治疗性逆转录病毒。通常,组成型或配体诱导的受体参与细胞内吞途径。这些受体聚集于网格蛋白包被的小窝,通过网格蛋白包被的囊泡进入细胞,穿过酸化的内涵体(其中受体被分选),然后或者再循环到细胞表面,储存于细胞内,或者于溶酶体中降解。内在化途径提供多种功能,如营养物的摄取,活化蛋白的去除,大分子的清除,病毒和毒素的进入机会,配体的分离和降解,以及受体水平调控。许多受体遵循多于一种的细胞内途径,这取决于细胞类型、受体浓度、配体类型、配体效价以及配体浓度。
递送至细胞并整合入宿主细胞基因组的核酸,通常包含整合序列。这些序列通常是病毒相关序列,特别当使用基于病毒的系统时。这些病毒整合系统还可以利用基于非核酸的递送系统(如脂质体)并入待递送的核酸,使得递送系统中含有的核酸可以整合入宿主基因组。
其它整合入宿主基因组的常规技术包括,例如设计的能促进与宿主基因组同源重组的系统。这些系统通常依赖于与宿主细胞基因组内 的靶序列具有足够同源性的待表达核酸侧翼的序列,在所述宿主细胞基因组内,载体核酸和靶核酸之间发生重组,致使所递送的核酸整合入宿主基因组。这些系统和促进同源重组所需的方法是本领域技术人员所熟知的。
PAX2表达或PAX2活性的抑制剂和DEFB1表达或DEFB1活性的增强剂可以多种方法递送至靶细胞,可以于药学可接受的载体中给予,以及可以通过本领域内所熟知的各种方式在体内和/或离体递送至个体细胞(例如,裸DNA摄取、脂质体融合、通过基因枪肌内注射DNA、细胞内吞作用等)。
如果采用离体方法,可以根据本领域内所熟知的标准方案将细胞或组织移出并于体外维持。组合物可以通过任何基因转移方式引入细胞诸如,例如磷酸钙介导的基因递送、电穿孔、显微注射或蛋白脂质体。然后,可以按照细胞或组织类型的标准方法将所转导的细胞注入如于药学可接受的载体中)或正位移植回个体。用于将各种细胞移植或注射入个体中的标准方法是已知的。
组合物和试剂盒
本发明另一方面涉及用于治疗或预防癌症的组合物和试剂盒。所述组合物包含PAX2表达或PAX2活性的抑制剂和/或DEFB-1表达或DEFB-1活性的增强剂,以及药学可接受的载体。
“药学可接受的”意指不是生物学或其它不想要的材料,即材料可以与核酸或载体一起给予个体而不会引起不想要的生物学效应或与其中含有药物组合物的任何其它组分以有害方式相互作用。正如本领域技术人员所熟知的,应当合理选择载体,从而使任何活性成分的降解最小化并使个体中任何有害副作用最小化。
合适的载体及其制剂描述于Remington:The Science and Practice of Pharmacy(雷明顿:药学技术与实践,第19版)ed.A.R.Gennaro,Mack Publishing Company,Easton,PA1995。通常,适当量的药学可接受的盐用于制剂中,从而使制剂是等渗的。药学可接受的载体的例子包括但不限于,盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。溶液pH优选约5 至约8,并且更优选约7至约7.5。其它的载体包括持续释放的制剂,如含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质,该基质是特型制剂如膜、脂质体或微粒的形式。本领域技术人员显而易见的是可以更优选某些载体,这取决于例如给药途径和所给予组合物的浓度。
药物载体是本领域技术人员所熟知的。这些最典型的是用于给予人药物的标准载体,包括溶液如无菌水、盐水和生理pH的缓冲溶液。组合物可以经肌内或皮下给予。其它化合物将根据本领域技术人员所使用的标准程序给予。
药物组合物除了所选择的分子外,可以包含载体、增稠剂、稀释液、缓冲液、防腐剂、表面活性剂等。药物组合物还可以包含一种或多种活性成分,如抗菌剂、抗炎剂、麻醉剂等。
用于肠胃外给药的制剂包括无菌的水性或非水性溶液、悬浮液和乳剂。非水溶剂的例子是丙二醇,聚乙二醇,植物油如橄榄油,以及可注射有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、乙醇/水溶液、乳剂或悬浮液,包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介包括氯化钠溶液,林格氏右旋糖,右旋糖和氯化钠,乳酸林格氏液或非挥发性油。静脉内媒介包括流体和营养补充物,电解质补充物(如基于林格氏右旋糖液的那些)等。还可以存在防腐剂和其它添加剂如,例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
用于局部给药的制剂可以包括药膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。常规药物载体、水、粉末或油性基质、增稠剂等可以是必需或期望的。
用于口服给药的组合物包括粉末或颗粒、水或非水性介质中的悬浮液或溶液、胶囊、散剂或片剂。增稠剂、调味剂、稀释液、乳化剂、分散助剂或粘合剂可以是期望的。
一些组合物可能作为药学可接受的酸或碱加成盐给药,所述酸加成盐通过与以下发生反应形成:无机酸如盐酸、氢溴酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸、磷酸,和有机酸如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、丁二酸、顺丁烯二酸、反丁烯二酸反应;所述碱加成盐通过与以下发生反应形成:无机碱如氢氧 化钠、氢氧化铵、氢氧化钾,和有机碱如单烷基、双烷基、三烷基和芳胺及取代的乙醇胺。
所述材料可以在溶液、悬浮液(例如并入微粒、脂质体或细胞)中。这些材料可以通过抗体、受体或受体配体来靶向特定细胞类型。媒介如“stealth”和其它抗体偶联的脂质体(包括靶向结肠癌的脂质介导的药物),通过细胞特异的配体介导靶向DNA的受体,定向于肿瘤靶标的淋巴细胞,以及体内靶向于鼠神经胶质瘤细胞的高度特异的治疗性逆转录病毒。通常,组成型或配体诱导的受体参与细胞内吞途径。这些受体聚集于网格蛋白包被的小窝,通过网格蛋白包被的囊泡进入细胞,穿过酸化的内涵体(其中受体被分选),然后或者再循环到细胞表面,储存于细胞内,或者于溶酶体中降解。内在化途径提供多种功能,如营养物的摄取,活化蛋白的去除,大分子的清除,病毒和毒素的进入机会,配体的分离和降解,以及受体水平调控。许多受体遵循多于一种的细胞内途径,这取决于细胞类型、受体浓度、配体类型、配体效价以及配体浓度。
以上所描述的材料以及其它材料可以以任何合适的组合一起包装成试剂盒,用于进行或辅助实施所公开的方法。如果给定试剂盒中的试剂盒成分被设计并且适合于与所公开的方法一起使用,那么这是有益的。例如,公开了用于检测、治疗或预防前列腺癌、PIN、乳腺癌和MIN的试剂盒。所述试剂盒包含PAX2表达或PAX2活性的抑制剂和/或DEFB1表达或DEFB1活性的增强剂。在一实施方案中,所述试剂盒包含特异地结合PAX2或DEFB1的肽或抗体。
本文所公开的组合物可以以许多方式给药,这取决于是需要局部治疗还是全身治疗以及取决于待治疗的部位。例如,所述组合物可以口服给药、肠胃外(如静脉内、皮下、腹膜内或肌内注射)给药、通过吸入给药、体外、局部(包括经皮、眼部、阴道、直肠、鼻内)给药等。
本文所使用的“局部鼻内给药”意指将组合物通过一个或两个鼻孔递送至鼻子或鼻腔,并且可以包括由喷雾途径或滴液途径递送,或者通过核酸或载体的雾化递送。组合物通过吸入剂给药可以由喷雾或滴液方式递送通过鼻或口。还可以由插管法直接递送至呼吸系统的任 何区域(如肺)。
如果使用组合物的肠胃外给药,特征通常为注射。注射剂可以以常规形式制备,作为液体溶液或悬浮液、注射前为适合在液体中溶解成悬浮液的固体形式,或者作为乳剂。最近修订的肠胃外给药方法包括使用缓释或持续释放系统以便维持恒定剂量。
所需组合物的精确量将随个体不同而改变,这取决于物种、年龄、体重和个体的一般状况、待治疗的过敏病症的严重程度、所使用的具体核酸或载体、给药的方式等等。结合本文的教导仅利用常规试验,本领域普通技术人员就可以确定合适的量。因而,给予组合物的有效剂量和时间表可以根据经验确定,并且做出这样的决定在本领域技术人员范围之内。给予组合物的剂量范围应大到足以对受影响产生对症状失调病症作用的期望效果。剂量不应大到引起有害的副作用,如不需要的交叉反应、过敏反应等。通常,剂量将随患者的年龄、性别和疾病程度,给予途径,或治疗方案中是否包括其它药物而变化,并且可以由本领域技术人员确定。如果发生任何相反指征时,剂量可以由个别医师调整。剂量可以改变,并且可以每日一次或多次剂量给予一日或几日。可以在文献中找到对给定类别药物产品的适当剂量的指导。
例如,取决于以上所提及的因素,单独使用公开的组合物的典型日剂量范围可以是每日约1μg/kg体重至高达100mg/kg体重或更多。在某些实施方案中,治疗方法基于患病组织的PAX2-比-DEFB1的表达率(P/D比值)和雌激素受体(ER)/孕酮受体(PR)状态来调整。表2给出基于P/D比值和ER/PR状态的治疗选择。正常乳腺组织、MIN和低级别乳腺癌中PAX2状态和ER状态之间存在正相关。PAX2还通过雌激素受体调控ERBB2表达以及随后的Her2/neu表达。相反地,PAX2表达和高级别(或浸润性)乳腺癌之间存在反向关系。因此监测PAX2表达水平可以用于预测药物响应或抗性,以及鉴定可以作为DEFB1或抗-PAX2疗法候选者的患者。术语“抗-PAX2疗法”是指抑制PAX2表达或PAX2活性的方法。术语“DEFB1疗法”是指增加DEFB1表达的方法。术语“DEFB1疗法”不包括抑制PAX2表达或PAX2活性的方法,虽然这样的方法也导致DEFB1表达增加。
如表2所示,抗-PAX2疗法和/或DEFB1疗法可以与一种或多种其它乳腺癌治疗方法联合使用,所述其它乳腺癌治疗方法如抗-激素治疗(如他莫昔芬(Tamoxifen)),抗-ERBB2治疗(如赫赛汀(Herceptin)),抗-Her2治疗(如曲妥珠单抗(Trastuzumab)),以及抗-AIB-1/SRC-3治疗。
表2:利用PAX2-比-DEFB1比值治疗乳腺疾病
*与正常乳腺上皮中的PAX2/DEFB1比值相比
PAX2-比-DEFB1的表达率
以下所使用的术语“PAX2-比-DEFB1的表达率”是指给定细胞或组织中功能性PAX2蛋白或其变体的量与功能性DEFB1蛋白或其变体的量之间的比值。细胞或组织中PAX2和DEFB1表达的水平可以通过本领域内已知的任何方法测定。在某些实施方案中,通过测定直接获自乳腺组织的细胞中PAX2与DEFB1的水平,来测定乳腺组织中PAX2与DEFB1表达的水平。
“PAX2-比-DEFB1表达率”可以在蛋白水平直接测定,或在RNA水平间接测定。蛋白水平可以用蛋白阵列、免疫测定和酶测定来测量。 RNA水平可以例如用DNA阵列、RT-PCR和Northern印迹来测量。在某些实施方案中,通过测定相对于对照基因表达水平的PAX2基因表达水平,测定相对于同一对照基因表达水平的DEFB1基因表达水平,以及基于PAX2和DEFB1的表达水平计算PAX2-比-DEFB1表达率,来确定PAX2-比-DEFB1表达率。在一实施方案中,对照基因是甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因。
免疫测定
最简单且直接意义的免疫测定是涉及抗体与抗原结合的结合测试。已知许多类型和形式的免疫测定,并且全部都适用于检测所公开的生物标志物。免疫测试的例子是酶联免疫吸附测定ELISA)、放射免疫测定(RIA)、放射免疫沉淀测定(RIPA)、免疫微球捕获测定、Western印迹、斑点印迹、凝胶移位测定、流式细胞术、蛋白质阵列、多重微珠阵列、磁捕获法、体内成像、荧光共振能量转移(FRET)以及光褪色后荧光复现/定位(FRAP/FLAP)。
一般而言,免疫测定包括在允许形成免疫复合物的有效条件下,根据具体情况,将疑似含有目的分子(如所公开生物标志物)的样品与该目的分子的抗体接触,或者将目的分子的抗体(如所公开生物标志物的抗体)与能够与该抗体结合的分子接触。许多形式的免疫测定中,可以洗涤样品-抗体组合物如组织切片、ELISA平板、斑点印迹或Western印迹,以去除任何非特异结合的抗体物质,允许仅检测一级免疫复合物内特异结合的那些抗体。
放射免疫沉淀测定RIPA)是利用放射性标记的抗原来检测血清中特异抗体的灵敏测定。允许抗原与血清反应,然后利用专用试剂如,例如蛋白A琼脂糖珠来沉淀。接下来通过凝胶电泳常规分析所结合的放射性标记的免疫沉淀物。放射免疫沉淀测定RIPA)常常用作诊断HIV抗体存在的验证试验。本领域内RIPA还被称为Farr测定、沉淀素测定、放射免疫沉淀素测定以及放射免疫沉淀分析。
还考虑的是免疫测定,其中将蛋白或蛋白特异抗体结合至固相载体(如管、孔、珠或小室),与检测载体上蛋白或蛋白特异抗体的方法 相结合,从而从样品分别捕获目的抗体或蛋白。这样的免疫测定的例子包括放射性免疫测定(RIA),酶联免疫吸附测定(ELISA),流式细胞术,蛋白质阵列,多重微珠阵列以及磁捕获法。
蛋白质阵列是利用表面上固定蛋白的固相配体结合测定系统,所述表面包括玻璃、膜、微量滴定孔、质谱仪板以及微珠或其它物体。测定是高度平行的(多重)并且常常是小型化(微阵列,蛋白芯片)的。它们的优点包括快速和可自动化,能高灵敏度、节约试剂以及一次实验产生大量的数据。生物信息学支持是重要的,数据处理需要先进的软件和数据比较分析。然而,软件可以根据所用的DNA阵列改编,正如硬件和检测系统可以的那样。
捕获阵列形成用于表达谱的诊断芯片和阵列的基础。它们使用高亲和力捕获试剂如常规抗体,单结构域,改造的支架,肽或核酸适配子,以高通量方式结合和检测特异靶配体。抗体阵列可商购获得。除常规抗体之外,来自camelids或工程化人等同的单一V-结构域的Fab和scFv片段(Domantis,Waltham,MA)也可以用于阵列中。
非蛋白捕获分子,特别是以高特异性和亲和力与蛋白配体结合的单链核酸适配子也可以用于阵列中(SomaLogic,Boulder,CO)。适配子通过SelexTM程序选自寡核苷酸库,并且它们与蛋白的相互作用可以通过掺入溴脱氧尿苷和UV-活化的交联(光适配子,photoaptamer)由共价连接增强。与配体光交联由于特定空间需要而减少适配子的交叉反应。适配子具有通过自动化寡核苷酸合成而便于生产以及DNA稳定和健全的优点;在光适配子阵列上,通用荧光蛋白染色可以用于检测结合。
可选择的捕获分子阵列是通过“分子印刷”技术制备的阵列,其中肽(例如来自蛋白C-末端)用作模板,以在可聚合基质上产生结构互补的、序列-特异的孔;然后,孔可以特异地捕获具有适当一级氨基酸序列的(变性的)蛋白(ProteinPrintTM,Aspira Biosystems,Burlingame,CA)。
可以用于诊断和表达谱中的另一方法是阵列(Ciphergen,Fremont,CA),其中固相色谱表面结合具有与混合物如血浆或肿瘤提取物相似的电荷或疏水性特征的蛋白,并且SELDI-TOF 质谱分析用于检测残留的蛋白。
其它有用的方法包括通过于芯片上固定大量纯化的蛋白构建大型功能性芯片,以及多重微珠测定。
抗体
术语“抗体”在本文中以广泛意义使用,并且包括多克隆和单克隆抗体。除了完整的免疫球蛋白分子,术语“抗体”还包括那些免疫球蛋白分子的片段或聚合物,以及人或人源化形式的免疫球蛋白分子或其片段,只要它们有与例如PAX2或DEFB1相互作用,使得PAX2受到抑制而不能与DEFB1相互作用的能力就选择它们。还公开了与参与PAX2和DEFB1相互作用的PAX2或DEFB1的公开区域结合的抗体。利用本文所描述的体外测定或通过类似的方法可以检测抗体的期望活性,之后根据已知的临床检测方法测试它们的体内治疗和/或预防活性。
本文的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体,其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,而其余的链与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,以及这种抗体的片段,只要它们表现出期望的拮抗活性(参见美国专利号4,816,567和Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。
本文所使用的术语“抗体”还指人抗体和/或人源化抗体。许多非人抗体(例如源自小鼠、大鼠或兔的那些抗体)是人的天然抗原,因而给予人时能产生不想要的免疫应答。因此,在方法中使用人或人源化抗体用于减少给予人的抗体引起不想要的免疫应答的机会。非人抗体的人源化方法是本领域所熟知的。
DNA阵列
DNA或寡核苷酸微阵列由排列的一系列多个被称为“特征(feature)”的寡核苷酸微斑点组成,各斑点包含少量(一般是皮摩尔级别)特定寡核苷酸序列。特定寡核苷酸序列可以是基因或其它寡核苷酸 元件的一小部分,其在高严紧条件下可用作杂交cDNA或cRNA样品的探针。通常基于荧光检测荧光团标记的靶标来检测和定量探针靶标的杂交,以测定靶标中核酸序列的相对丰度。
探针一般通过与化学基质的共价键(通过环氧-硅烷、氨基-硅烷、赖氨酸、聚丙烯酰胺等)而连接至固体表面。固体表面可以是玻璃或硅片或微珠。寡核苷酸阵列与其它类型的微阵列的区别仅在于它们测量核苷酸或使用寡核苷酸作为其检测系统的一部分。
为利用寡核苷酸阵列检测靶组织或细胞中的基因表达,从靶组织或细胞纯化目的核酸。核苷酸可以是用于表达谱的全部RNA,用于比较杂交的DNA,或与用于表观遗传或调控研究的免疫沉淀(ChIP-on-chip)的特定蛋白结合的DNA/RNA。
在一实施方案中,通过异硫氰酸胍-酚-氯仿提取法(如Trizol)分离总RNA(称为总的,是因为其在细胞核和细胞质内)。纯化的RNA可以用于定性(如通过毛细管电泳)和定量(如通过利用nanodrop分光光度计)分析。将总RNA用polyT引物或随机引物逆转录成DNA。DNA产物可以通过PCR任意地进行扩增。在RT步骤或扩增后的其它步骤(如果有的话)中向扩增产物添加标记物。标记物可以是荧光标记物或放射性标记物。然后将标记的DNA产物与微阵列杂交。接着洗涤并扫描微阵列。利用本领域所熟知的方法,基于杂交结果测定目的基因的表达水平。
药物基因组学
在另一实施方案中,将PAX2和/或DEFB1表达谱用于确定乳腺癌的药物基因组学。药物基因组学是指个体的基因型与该个体对外来化合物或药物响应之间的关系。治疗的代谢差异可以通过改变药理活性药物的剂量和血液浓度之间的关系而导致严重的毒性或治疗失效。因而,内科医生或临床医生可考虑应用相关药物基因组学研究中获得的信息来确定是否给予抗癌药物,以及调整用抗癌药物治疗的剂量和/或治疗方案。
由于改变的药物处置和在受影响人体中的异常作用,药物基因组 学处理临床上响应于药物的显著的遗传变异。一般而言,可以区分出两种类型的药物基因组学状态。基因状态作为改变药物作用于身体方式(改变药物作用)的单因素传播,或者基因状态作为改变身体作用于药物方式(改变药物代谢)的单因素传播。这些药物基因组学状态能够作为罕见的基因缺失或天然存在的多态性而出现。例如,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷(G6PD)是常见的遗传酶病,其中主要的临床并发症是吸收氧化剂药物(抗-疟疾药、磺胺药物、止痛剂、硝基呋喃)和消耗蚕豆后的溶血。
一种鉴定预测药物响应的基因的药物基因组学方法(所谓“全基因组关联”)主要依赖于由已知基因相关位点(如由人基因组的60,000-100,000个多态或可变位点组成的“双等位基因”的基因标记物图谱,各自具有两种变体)组成的人基因组高分辨率图谱。这样的高分辨率基因图谱可以与统计学上大量的参与II/III期药物试验的个体的各基因组图谱进行比较,以鉴定与特别观察的药物响应或副作用相关的基因。可选择地,这样的高分辨率图谱可以由人基因组的一些千万已知单核苷酸多态性(SNP)的组合形成。本文所使用的术语“SNP”是发生于DNA区段的单核苷酸碱基的常见改变。例如,SNP可能于DNA的每1,000个碱基出现一次。SNP可能与疾病进程相关。然而,绝大多数SNP可能与疾病无关。鉴于基因图谱基于出现这样的SNP,可以将个体分为取决于它们个体基因组的SNP的特定模式的遗传类别。以这样的方式,考虑到遗传相似个体中可能共有的遗传特征,可以对这样的遗传相似的个体组调整治疗方案。因而,将PAX2和/或DEFB1绘制到乳腺患者的SNP图谱可以允许根据本文所描述的遗传方法更易于鉴定这些基因。
可选择地,可以利用被称为“备选基因方法”的方法来鉴定预测药物响应的基因。根据该方法,若编码药物靶标的基因是已知的,则可以相当容易地在人群中鉴定出该基因的全部共有变体,并且可以确定具有一种形式的基因相对另一基因是否与特定药物响应相关。
如示例性的实施方案,药物代谢酶的活性是药物作用强度和持续时间的主要决定因素。发现药物代谢酶(如N-乙酰基转移酶2(NAT2) 以及细胞色素P450酶CYP2D6和CYPZC19)的遗传多态性已提供解释为何一些个体未获得预期的药物效应,或者服用标准和安全剂量的药物后显示出过大的药物响应和严重中毒。这些多态性表达于两类表型的人群——广泛代谢者和不良代谢者。普遍的不良代谢者表型在不同人群中是不同的。例如,编码CYP2D6的基因是高度多态的,并且已在不良代谢者中鉴定出几种突变,所述突变全部导致功能性CYP2D6的缺失。CYP2D6和CYP2C19的不良代谢者接受标准剂量时,极其频繁地遭受过大的药物响应和副作用。如果代谢物是活性治疗剂部分,不良代谢者没有显示治疗响应,正如由可待因的CYP2D6-形成的代谢物吗啡介导的其止痛效果所证实。另一极端是对标准剂量无响应的所谓超快代谢者。最近,已鉴定出超快代谢的分子基础是由于CYP2D6基因增殖。
可选择地,可以利用被称为“基因表达谱”的方法来鉴定预测药物响应的基因。例如,给予药物的动物的基因表达可以给出与毒性相关的基因通路是否已开启的指征。
由多于一种以上药物基因组学方法所产生的信息可以用于确定预防性或治疗性治疗个体的适当剂量和治疗方案。当应用于剂量或药物选择时,该信息可以避免不利反应或治疗失效,因而增强治疗患乳腺疾病个体时的治疗或预防效力。
在一实施方案中,将个体的PAX2和/或DEFB1表达谱,以及ER/PR状态用于确定对患有乳腺疾病的个体适当的治疗方案。
在另一实施方案中,将PAX2表达水平(一般参照对照基因如肌动蛋白基因或GAPDH基因确定)用于患有三阴乳腺癌(即雌激素受体(ER)阴性,孕酮受体(PR)阴性,人表皮生长因子受体2(HER2)阴性)的患者中来测量癌症疗法的有效性,确定治疗进程或监测癌症复发。
本发明进一步通过以下实施例阐述,但所述实施例不应当解释为限制。本申请所引用的全部文献、专利和公开专利申请的内容,以及图和表都通过引用并入本文。
实施例1:人β-防御素-1对晚期前列腺癌有细胞毒性并且在前列腺癌肿瘤免疫中起作用
本实施例中,将DEFB1克隆到诱导型表达系统来检测其如何影响正常前列腺上皮细胞以及雄激素受体阳性(AR+)和雄激素受体阴性(AR-)前列腺癌细胞系。诱导DEFB1表达导致AR-细胞DU145和PC3的细胞生长降低,但是对AR+前列腺癌细胞LNCaP的生长没有影响。DEFB1还致使快速诱导半胱天冬酶-介导的凋亡。此处提出的数据首次提供了DEFB1在天然肿瘤免疫中起作用的证据,并且表明其受损将促进前列腺癌的肿瘤发展。
材料与方法
细胞系:于DMEM培养基中培养细胞系DU145,于F12培养基中培养PC3,以及于RPMI培养基中培养LNCaP(Life Technologies,Inc.,Grand Island,NY)。用于全部三种细胞系的生长培养基补充10%(v/v)的胎牛血清(Life Technologies)。于前列腺上皮细胞基础培养基(Cambrex Bio Science,Inc.,Walkersville,MD)中培养hPrEC细胞。所有细胞系均维持在37℃和5%CO2下。
组织样品和激光捕获显微切割:根据机构审查委员会(Institutional Review Board)批准的协议,通过Hollings癌症中心肿瘤库获得经过根治性前列腺切除术的知情同意患者的前列腺组织。这包括用于样品的处理、切片、组织学表征、RNA纯化和PCR扩增的指导原则。对冷冻组织切片进行病理检查之后,进行激光捕获显微切割(LCM)以确保所检测的组织样品由纯的良性前列腺细胞群组成。对于所分析的每个组织切片,在含有良性组织的三个不同区域进行LCM,然后合并所采集的细胞。
前列腺组织获自在进行根治性前列腺切除术之前已提供知情同意的患者。样品根据机构审查委员会批准的协议,通过Hollings癌症中心肿瘤库获得。这包括用于样品的处理、切片、组织学表征、RNA纯化和PCR扩增的指导原则。外科医生获得前列腺标本并且病理学者迅速于OCT化合物中冷冻。将各OCT块切割以产生待染色和检测的系列切片。鉴定含有良性细胞、前列腺上皮内瘤变(PIN)和癌症的区域,并用于指导我们利用Arcturus PixCell II系统(Sunnyvale,CA)选择来自未染色玻 片上的区域。使含有捕获材料的Caps暴露于来自Arcturus Pico Pure RNA分离试剂盒的20μl裂解液并立即处理。RNA定量和定性利用产生5’扩增子的引物组来评估。该引物组包括用于核糖体蛋白L32的引物(3’扩增子和5’扩增子相隔298个碱基),用于葡萄糖磷酸异构酶的引物(相隔391个碱基),以及用于葡萄糖磷酸异构酶的引物(相隔842个碱基)。使用来自多种制备组织的样品,这些引物组常规获得0.95至0.80的比值。其它肿瘤和正常样品由病理学者粗略切割,于液氮中速冻并且评估hBD-1和cMYC表达。
DEFB1基因的克隆:通过逆转录PCR从RNA产生DEFB1cDNA。所设计的PCR引物含有ClaI和KpnI限制性位点。DEFB1PCR产物用ClaI和KpnI消化并连接到TA克隆载体。然后使TA/DEFB1载体通过热激转染大肠杆菌,并选择和扩增单克隆。通过Cell Culture DNA Midiprep(Qiagen,Valencia,CA)分离质粒,并通过自动测序验证序列完整性。然后,将DEFB1基因片段连接入用ClaI和KpnI消化的pTRE2(用作定向目的的中间载体)。然后用ApaI和KpnI消化pTRE2/DEFBl构建体来切下DEFB1插入物,并将该插入物连接入同样用ApaI和KpnI双重消化的脱皮激素诱导型表达系统的pIND载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)。将所述构建体再次转染入大肠杆菌,并且选择和扩增单克隆。分离质粒并且通过自动测序再次验证pIND/DEFB1的序列完整性。
转染:将细胞(1x106)接种到100-mm皮氏培养皿并过夜生长。然后利用Lipofectamine2000(Invitrogen,Carlsbad,CA),用1μg的pVgRXR质粒(表达异源二聚体的蜕皮激素受体)和1μg的pIND/DEFB1载体构建体或空pIND对照载体于Opti-MEM培养基(Life Technologies,Inc.,Grand Island,NY)中共转染细胞。
RNA分离和定量RT-PCR:为了验证用DEFB1构建体所转染细胞中DEFB1蛋白的表达,用松甾酮A(Pon A)诱导24小时之后,收集RNA。简而言之,使用SV总RNA分离系统(Promega,Madison,WI)从通过胰蛋白酶消化收集的大约1x106细胞中分离总RNA。此时,将细胞裂解并且通过离心柱离心分离总RNA。为了通过LCM收集细胞,使用PicoPure RNA分离试剂盒(Arcturus Biosciences,Mt.View,CA)按照厂商手册分离 总RNA。利用随机引物(Promega)将两种来源的总RNA(每个反应0.5μg)逆转录成cDNA。按照厂商手册,将AMV逆转录酶II(每个反应500单位;Promega)用于第一链合成,而Tfl DNA聚合酶用于第二链合成(每个反应500单位;Promega)。在每种情况下,每次使用50pg的cDNA以确保PCR反应。利用来自TaqMan逆转录系统和PCR Master Mix(Applied Biosystems)的MultiScribe逆转录酶对所产生的cDNA进行两步QRT-PCR。
从已公开的DEFB1序列(GenBank登录号U50930)产生用于DEFB1的引物对。引物序列如下:
QRT-PCR引物序列
正义(5’-3’)
β-肌动蛋白 5’-CCTGGCACCCAGCACAAT-3’SEQ ID NO:51
DEFB1 5’-GTTGCCTGCCAGTCGCCATGAGAACTTCCTAC-3’SEQ ID NO:53
反义(5’-3’)
β-肌动蛋白 5’-GCCGATCCACACGGAGTACT-3‘SEQ ID NO:52
DEFB1 5’-TGGCCTTCCCTCTGTAACAGGTGCCTTGAATT-3’SEQ ID NO:54
在标准条件下,使用56℃的退火温度进行40个PCR循环。此外,扩增β-肌动蛋白(表2),作为管家基因来标准化总cDNA的初始含量。DEFB1表达计算为DEFB1与β-肌动蛋白之间的相对表达率,并且与诱导和未诱导DEFB1表达的细胞系,以及LCM良性前列腺组织进行比较。作为阴性对照,还进行了不含cDNA模板的QRT-PCR反应。所有反应均运行三次,一式三份。
MTT细胞活力测定:为检测DEFB1对细胞生长的影响,进行代谢物3-(4,5-二甲基噻唑-2基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)测定。将用pVgRXR质粒和pIND/DEFB1构建体或空pIND载体共转染的PC3、DU145和LNCaP细胞接种于96-孔板,每孔1-5x103细胞。接种之后24小时,每日添加含有10μM松甾酮A的新鲜生长培养基来诱导DEFB1表达24、48和72小时,之后根据厂商说明书(Promega)进行 MTT测定。反应进行三次,一式三份。
流式细胞术:将用DEFB1表达系统共转染的PC3和DU145细胞于60-mm培养皿中培养,并用10μM松甾酮A诱导12、24和48小时。各孵育期之后,从平板收集培养基(以保留任何分离的细胞)并且与用于洗涤平板的PBS混合。通过胰蛋白酶消化收集残存的附着细胞并且与分离的细胞和PBS混合。然后使细胞于4℃(500x g)离心5分钟使其结团,PBS洗涤两次,并且重新悬浮于含有5μl膜联蛋白V-FITC和5μl PI的l00ul1倍膜联蛋白结合缓冲液(0.1M Hepes/NaOH,pH7.4,1.4M NaCl,25mM CaCl2)中。将细胞在黑暗中于RT下孵育15分钟,然后用400μl1倍膜联蛋白结合缓冲液稀释,并且通FACscan(Becton Dickinson,San Jose,CA)分析。所有反应均进行三次。
显微镜分析:通过相差显微镜分析细胞形态。将不含载体,含有空质粒或DEFB1质粒的DU145、PC3和LNCaP细胞接种于96孔培养板(BD Falcon,USA)。第二天用含10μM松甾酮A的培养基诱导含质粒的细胞48小时,而对照细胞接受新鲜培养基。然后在倒置Zeiss IM35显微镜(Carl Zeiss,Germany)下观察细胞。利用SPOT Insight Mosaic4.2照相机(Diagnostic Instruments,USA)获得细胞视野的相差图。细胞通过32倍放大倍数的相差显微镜法检测,并且将数字图像保存为无压缩的TIFF文件并传输到Photoshop CS软件(Adobe Systems,San Jose,CA),用于图像处理和硬拷贝显示。
半胱天冬酶检测:利用APO LOGIXTM羧基荧光素半胱天冬酶检测试剂盒(Cell Technology,Mountain View,CA)进行前列腺癌细胞系中的半胱天冬酶活性检测。通过使用不可逆地与活性半胱天冬酶结合的FAM-VAD-FMK抑制剂检测活性半胱天冬酶。简而言之,将含有DEFB1表达系统的DU145和PC3细胞(1.5-3xl05)接种于35mm玻璃底微孔培养皿(Matek,Ashland,MA),并且如先前所描述仅用培养基或用含PonA的培养基处理24小时。接着,将10μl羧基荧光素标记的肽氟甲基酮(FAM-VAD-FMK)的30倍工作稀释液添加到300μl培养基,并添加至每个35mm培养皿。然后于37℃,5%CO2下孵育细胞1小时。接着,将培养基吸出,并用2ml1倍工作稀释洗涤缓冲液洗涤细 胞两次。在微分干涉相差DIC)或488nm激光激发下观察细胞。利用具有Vario2RGB激光扫描组件的共聚焦显微镜(Zeiss LSM5Pascal)和63倍DIC油镜分析荧光信号。
统计学分析:利用非配对值的学生t-检验评估统计学差异。通过双边计算确定P值,并且认为P值小于0.05是统计学显著的。
结果
前列腺组织和细胞系中的DEFB1表达:通过QRT-PCR测量良性和恶性前列腺组织,hPrEC前列腺上皮细胞,以及DU145、PC3和LNCaP前列腺癌细胞中的DEFB1表达水平。检测全部良性临床样品中的DEFB1表达。DEFB1相对表达的平均量为0.0073。此外,hPrEC细胞中DEFB1的相对表达为0.0089。所检测的良性前列腺组织样品和hPrEC中DEFB1表达没有统计学差异(图1A)。对前列腺癌细胞系中的相对DEFB1表达水平的分析显示DU145、PC3和LNCaP中的水平显著更低。作为进一步的参考点,测量来自患者#1215的前列腺组织的邻近恶性切片中相对DEFB1的表达。与来自患者#1215的恶性前列腺组织相比,所观测的三种前列腺癌细胞系中的DEFB1表达水平没有显著差异(图1B)。此外,全部四种样品中的表达水平接近不含模板的阴性对照(证实几乎没有内源性DEFB1表达,未给出数据)。还对用DEFB1表达系统转染的前列腺癌细胞系进行了QRT-PCR。24小时诱导期之后,相对表达水平:DU145为0.01360,PC3为0.01503,以及LNCaP为0.138。通过凝胶电泳验证扩增产物。
对含有良性、PIN和癌的LCM组织区域进行QRT-PCR。DEFB1相对表达:良性区域为0.0146,相比恶性区域为0.0009(图1C)。这表示降低了94%,这再次证实表达的显著下调。此外,分析PIN显示DEFB1表达水平为0.044,其降低了70%。将患者#1457中的表达与六名其他患者的良性区域所见的平均表达水平相比(图1A),显示1.997的比值,表示多表达了几乎两倍(图1D)。然而,与良性组织中的平均表达水平相比,表达率:PIN为0.0595,以及恶性组织为0.125。
DEFB1引起细胞膜透性和波动:对前列腺癌细胞系中DEFB1的 诱导导致DU145和PC3细胞数量的显著减少,但是对LNCaP的细胞增殖没有影响(图2)。作为阴性对照,监测含有空质粒的所有三种细胞系中的细胞增殖。添加PonA之后,在DU145、PC3或LNCaP细胞中没有观测到细胞形态的变化。此外,DEFB1诱导导致DU145和PC3的细胞形态变化。此时细胞似乎更圆并且显示指征细胞死亡的膜波动。两种细胞系中还出现凋亡小体。
DEFB1表达导致细胞活力降低:MTT测定显示,PC3和DU145细胞中的DEFB1导致细胞活力降低,但是对LNCaP细胞没有显著影响(图3)。24小时之后,相对细胞活力:DU145为72%,以及PC3为56%。诱导48小时之后分析显示DU145的细胞活力为49%,以及PC3的细胞活力为37%。DEFB1表达72小时之后,导致DU145和PC3细胞的相对细胞活力分别为44%和29%。
晚期前列腺癌细胞中DEFB1引起快速半胱天冬酶-介导的凋亡:为了确定DEFB1对PC3和DU145的作用是细胞抑制的的还是细胞毒性的,进行了FACS分析。正常生长条件下,多于90%的PC3和DU145培养物存活且无凋亡(左下象限),并且没有膜联蛋白V或PI染色。诱导PC3细胞中DEFB1表达之后,凋亡细胞的数量(右下和右上象限)总计:12小时为10%,24小时为20%,以及48小时为44%(图4B)。对于DU145细胞,凋亡细胞的数量总计:诱导之后12小时为12%,24小时为34%,以及48小时为59%(图4A)。含有空质粒的细胞用PonA诱导之后没有观测到凋亡增加(数据未给出)。
通过共聚焦激光显微镜分析测定半胱天冬酶活性(图5)。诱导DU145和PC3细胞中DEFB1的表达,并基于发绿色荧光的FAM-VAD-FMK与活跃发生凋亡的细胞中半胱天冬酶的结合来监测活性。对DIC下细胞的分析显示,0小时时存在存活对照DU145(图A),PC3(图E)和LNCaP(图I)细胞。通过共聚焦激光在488nm处的激发未产生可检测的绿色染色,表明DU145(图B),PC3(图F)或LNCaP(图J)中无半胱天冬酶活性。诱导24小时之后,在DIC下再次可见DU145(图C),PC3(图G)和LNCaP(图K)细胞。荧光下的共聚焦分析显示DU145(图D)和PC3(图H)细胞中的绿色染色,表明半胱天冬酶活性。 然而,LNCaP(图L)细胞没有绿色染色,表明没有DEFB1诱导的凋亡。
总之,本研究提供了DEFB1在前列腺癌中的功能作用。此外,这些发现表明DEFB1是参与肿瘤免疫的天然免疫系统的一部分。此处显示的数据证实生理水平表达的DEFB1对AR-激素难治性前列腺癌细胞是细胞毒性的,但是对AR+激素敏感的前列腺癌细胞和对正常前列腺上皮细胞没有细胞毒性。鉴于DEFB1在正常前列腺细胞中是组成型表达的,没有细胞毒性,可能是具有不同表型特征的晚期AR-前列腺癌细胞致使它们对DEFB1细胞毒性敏感。因而,DEFB1是用于晚期前列腺癌,还可能是用于其它癌症治疗的可行治疗剂。
实施例2:SiRNA介导的PAX2表达敲低导致不依赖于P53状态的前列腺癌细胞死亡
本实施例通过p53基因状态不同的前列腺癌细胞中的RNA干扰检测抑制PAX2表达的影响。结果证实抑制PAX2导致与p53状态无关的细胞死亡,表明在前列腺癌中存在受PAX2抑制的其它肿瘤阻抑基因或细胞死亡通路。
材料和方法
PAX2的siRNA沉默:为实现有效的基因沉默,合成靶向人PAX2mRNA(登录号NM_003989.1)的四种互补短干扰核糖核苷酸(siRNA)池(Dharmacon Research,Lafayette,CO,USA)。四种siRNA的第二池用作测试PAX2siRNA特异性的内参。所合成序列中的两条靶向GL2荧光素酶mRNA(登录号X65324),另两条是非序列特异的(表3)。对于siRNA的退火,在退火缓冲液(100mM乙酸钾,pH7.4的30mMHEPES-KOH,2mM乙酸镁)中,将35M单链于90℃孵育1分钟,之后于37℃孵育1小时。
表3PAX2siRNA序列
利用四种siRNA池来抑制PAX2蛋白表达
正义(5’-3’)
反义(5’-3’)
Western分析:简而言之,细胞通过胰蛋白酶消化收集并用PBS洗涤两次。按照厂商(Sigma)说明书配制裂解缓冲液,然后添加至细胞。在轨道摇床上于4℃孵育15分钟之后,收集细胞裂解物并于12000x g下离心10分钟使细胞碎片结团。收集并定量含蛋白的上清液。接着,将25μg蛋白提取物上样到8-16%梯度SDS-PAGE(Novex)。电泳之后,将蛋白转移到PVDF膜,然后用含5%脱脂奶粉的TTBS(0.05%Tween20和100mM Tris-Cl)封闭1小时。用以1:2000稀释的兔抗-PAX2一抗(Zymed,San Francisco,CA)探测印迹。洗涤之后,用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗-兔抗体(稀释度1:5000;Sigma)孵育膜,并且于Alpha Innotech Fluorchem8900上利用化学发光试剂(Pierce)显现信号检测。作为对照,将印迹清除并用小鼠抗-β-肌动蛋白一抗(1:5000;Sigma-Aldrich)和HRP-偶联的抗-小鼠二抗(1:5000;Sigma-Aldrich)重新探测,以及再次显现信号检测。
相差显微镜法:通过如实施例1所描述的相差显微镜法分析PAX2敲低对细胞生长的影响。
MTT细胞毒性测定:根据厂商手册(Promega),利用Codebreaker转染试剂用0.5μg PAX2siRNA池或对照siRNA池转染DU145、PC3和LNCaP细胞(1x105)。接着,将细胞悬浮液稀释并以每孔1-5xl03细胞接种于96-孔板,让其生长2、4或6日。培养之后,通过测量3-(4,5-二甲基噻唑-2基)-2,5-二苯基溴化四唑MTT(Promega)转化成的有色甲臢产物来测定细胞活力。在多孔扫描分光光度计上于540nm处读取吸 光度。
泛半胱天冬酶检测:如实施例1所描述进行前列腺癌细胞系中半胱天冬酶活性的检测。
定量实时RT-PCR:为验证PAX2siRNA处理PC3、DUl45和LNCaP细胞系之后的基因表达,如实施例1所描述进行定量实时RT-PCR。用于GAPDH(对照基因)、BAX、BID和BAD的引物对如下:
正义(5’-3’)
反义(5’-3’)
于MicroAmp Optical96-孔反应板(PE Biosystems)进行反应。在标准条件下,使用60℃的退火温度进行40个PCR循环。通过指数扩增开始的循环数(阈值)和获自三个重复的平均值来确定定量。信号水平与阈值之间存在反向关系。此外,GAPDH作为管家基因来标准化总cDNA的初始含量。基因表达计算为促凋亡基因与GAPDH之间的相对表达率。所有反应均进行一式三份。
结果
PAX2蛋白的siRNA抑制:为证实siRNA有效靶向PAX2mRNA,进行Western分析来监测6日处理期间的PAX2蛋白表达水平。使用用PAX2siRNA池转染一轮的细胞。通过显示第4日DU145(图6,图A)和第6日PC3(图6,图B)中的PAX2蛋白敲低的结果证实了特异靶向PAX2mRNA。
PAX2的敲低抑制前列腺癌细胞生长:分析用单独的培养基、阴性 对照非特异siRNA或PAX2siRNA处理6日之后的细胞(图7)。DU145(图A),PC3(图D)和LNCaP(图G)细胞在仅含培养基的培养皿中全部达到至少90%汇合。用阴性对照非特异siRNA对DU145(图B)、PC3(图E)和LNCaP(图H)的处理对细胞生长没有影响,并且6日之后细胞再次达到了汇合。然而,用PAX2siRNA处理导致细胞数量显著减少。DU145细胞大约15%汇合(图C),以及PC3细胞仅10%汇合(图F)。siRNA处理之后LNCaP细胞5%汇合。
细胞毒性测定:暴露2、4和6日之后,测量细胞活力并表示为处理细胞570-630nm处的吸光度除以未处理对照细胞的吸光度的比值(图8)。处理2日之后的相对细胞活力:LNCaP为77%,DU145为82%,以及PC3为78%。4日之后,相对细胞活力:LNCaP为46%,DU145为53%,以及PC3为63%。处理6日之后,相对细胞活力降低至:LNCaP为31%,PC3为37%,以及DU145为53%。作为阴性对照,用阴性对照非特异siRNA或单独的转染试剂处理6日之后,测量细胞活力。对于两种条件,与正常生长培养基相比,=细胞活力的改变在统计学上不显著。
泛半胱天冬酶检测:通过共聚焦激光显微镜分析检测半胱天冬酶活性。用PAX2siRNA处理DU145、PC3和LNCaP细胞,并基于FAM标记的肽与活跃发生凋亡的细胞中半胱天冬酶的结合(发绿色荧光)来监测活性。在DIC下分析仅用培养基处理的细胞显示,0小时时存在活的DU145(A),PC3(E)和LNCaP(I)细胞(图9)。通过共聚焦激光在488nm处的激发未产生可检测的绿色染色,表明未处理的DU145(B),PC3(F)或LNCaP(J)中没有半胱天冬酶活性。用PAX2siRNA处理4日之后,在DIC下再次显现DU145(C),PC3(G)和LNCaP(K)细胞。荧光下,处理的DU145(D),PC3(H)和LNCaP(L)细胞显示绿色染色,表明半胱天冬酶活性。
PAX2抑制对促凋亡因子的影响:用对抗PAX2的siRNA处理DU145,PC3和LNCaP细胞6日,并且测量依赖于和不依赖于p53转录调控的促凋亡基因表达以监测细胞死亡通路。对于BAX:LNCaP中增加1.81倍;DU145中增加2.73倍;以及PC3中增加1.87倍(图 10,图A)。BID的表达水平增加:LNCaP为1.38倍;以及DU145为1.77倍(图10,图B)。然而,处理之后,PC3中的BID表达水平降低1.44倍(图10,图C)。BAD分析显示表达增加:LNCaP为2.0倍;DU145为1.38倍,以及PC3位1.58倍。
这些结果证实前列腺癌细胞的存活依赖于PAX2表达。由于p53表达的细胞系LNCaP、p53突变的细胞系DU145以及p53缺失的细胞系PC3中PAX2敲低活化p53之后,检测全部三种细胞系中的半胱天冬酶活性,表明启动程序化细胞死亡。全部三种细胞系中BAX的表达不依赖于p53状态上调。PAX2抑制之后,全部三种细胞系中促凋亡因子BAD的表达也增加。用PAX2siRNA处理之后,LNCaP和DU145中BID表达增加,而在PC3中竟然降低。这些结果表明,前列腺癌中所观测的细胞死亡受影响但是不依赖于p53表达。通过与p53状态无关的不同细胞死亡通路启动前列腺癌细胞的凋亡表明PAX2抑制其它肿瘤阻抑物。
实施例3:PAX2癌基因的抑制导致前列腺癌细胞发生DEFB1-介导的死亡
鉴定用作开发新型癌症药物靶标的肿瘤-特异分子被认为是癌症研究的主要目标。实施例1证实前列腺癌中存在高频率的DEFB1表达受损,以及诱导DEFB1表达导致雄激素受体阴性-阶段的前列腺癌快速凋亡。这些数据表明DEFB1在前列腺肿瘤阻抑中起作用。此外,鉴于它是正常前列腺上皮细胞的免疫系统的天然存在的成分,预期DEFB1是具有很少至没有副作用的可行治疗剂。实施例2证实抑制PAX2表达导致不依赖于p53的前列腺癌细胞死亡。这些数据表明存在由PAX2抑制的其它促凋亡因子或肿瘤阻抑物。此外,数据表明在前列腺癌中过表达的癌基因因子PAX2是DEFB1的转录阻遏物。本研究的目的是确定DEFB1表达受损是否是由于PAX2癌基因的异常表达,以及抑制PAX2是否能导致DEFB1表达和DEFB1-介导的细胞死亡(图11)。
材料与方法
RNA分离和定量RT-PCR:如实施例1所描述进行DEFB1的RNA分离和定量RT-PCR。
DEFB1报告子构建体的产生:将pGL3荧光素酶报告子质粒用于监测DEFB1报告子活性。此处,DEFB1转录起始位点上游的160个碱基的区域并且包括DEFB1TATA盒。所述区域还包括PAX2结合所必需的CCTTG(SEQ ID NO:1)序列。设计包含Kpnl和Nhel限制位点的PCR引物。将DEFB1启动子PCR产物用Kpn1和Nhe1限制消化并连接到同样限制消化的pGL3质粒(图12)。将构建体转染至大肠杆菌,选择并扩增单克隆。分离质粒并通过自动测序验证DEFB1/pGL3构建体的序列完整性。
荧光素酶报告子测定:此时,将lμg DEFB1报告子构建体或对照pGL3质粒转染至1x106DU145细胞。接着,将0.5x103细胞接种于96-孔板的各孔,并让生长过夜。然后添加含有PAX2siRNA的新鲜培养基或仅添加培养基,并且孵育细胞48小时。通过BrightGlo试剂盒根据厂商手册(Promega)检测荧光素酶,并且用Veritas自动化96-孔发光检测仪读取平板。启动子活性表示为相对发光。
膜透性分析:进行吖啶橙(AO)/溴化乙锭(EtBr)双重染色来鉴定细胞膜完整性变化,以及通过染色浓缩的染色质鉴定凋亡细胞。AO染色活细胞以及早期凋亡细胞,而EtBr染色膜透性受损的晚期凋亡细胞。简而言之,将细胞接种于2-腔室培养玻片(BD Falcon,USA)。用含有10μM松甾酮A的培养基诱导用空pIND质粒/pvgRXR或pINDDEFB1/pvgRXR转染的细胞24或48小时。对照细胞于24和48小时时提供新鲜培养基。为了测定PAX2抑制对膜完整性的影响,用PAX2siRNA处理单独的含有DU145、PC3和LNCaP的培养玻片并孵育4日。在这之后,细胞用PBS洗涤一次并用2ml AO(Sigma,USA)和EtBr(Promega,USA)(5ug/ml)溶液的混合物(1:1)染色5分钟。染色之后,再次用PBS洗涤细胞。通过Zeiss LSM5Pascal Vario2激光扫描共聚焦显微镜(Carl Zeiss Jena,Germany)观测荧光。激发色轮含有BS505-530(绿色)和LP560(红色)滤光器组件,其允许从AO发射的绿 光分离至绿色通道,来自EtBr的红光分离至红色通道。对照和DEFB1诱导的细胞之间的各独立试验的激光功率输出和增益控制设置是相同的。由Kr/Ar混合气体激光器提供的激发波长为543nm(对于AO)和488nm(对于EtBr)。玻片于40倍放大倍数下分析,并且将数字图像保存为未压缩的TIFF文件并输出到Photoshop CS软件(Adobe Systems,San Jose,CA),用于图像处理和硬拷贝显示。
PAX2的ChIP分析:染色质免疫沉淀(ChIP)允许基于转录因子对启动子的体内占据和通过免疫沉淀富集与染色质结合的转录因子来鉴定DNA-结合蛋白的结合位点。使用由Farnham实验室所描述的改进方案;还有在线网址http://mcardle.oncology.wisc.edu/farnham/)。DU145和PC3细胞系过表达PAX2蛋白,但是不表达DEFB1。细胞用含1.0%甲醛的PBS孵育10分钟使蛋白和DNA交联。然后超声处理样品以产生平均长度为600bp的DNA。将用蛋白A Dynabead预清除的超声处理的染色质与PAX2-特异抗体或“无抗体”对照[同型匹配的对照抗体]一起孵育。然后收集所洗涤的免疫沉淀。交联逆转之后,通过PCR利用启动子-特异引物分析DNA来测定DEFB1是否存在于PAX2-免疫沉淀的样品中。设计引物来扩增DEFB1mRNA起始位点正上游的160bp的区域(其包含DEFB1TATA盒和功能性CCTTG(SEQ ID NO:1)PAX2识别位点)的。对于这些研究,阳性对照包括输入染色质的等分试样的PCR(免疫沉淀之前,但交联逆转)。所有步骤在蛋白酶抑制剂存在下进行。
结果
PAX2的siRNA抑制增加DEFB1表达:siRNA处理之前的DEFB1表达的QRT-PCR分析显示相对表达水平:DU145为0.00097,PC3为0.00001,以及LNCaP为0.00004(图13)。siRNA敲低PAX2之后,相对表达:DU145为0.03294(增加338倍),PC3为0.00020(增加22.2倍),以及LNCaP为0.00019(增加4.92倍)。作为阴性对照,PAX2缺失的人前列腺水平细胞系(hPrEC)显示表达水平:处理之前为0.00687,而siRNA处理之后为0.00661,这证实DEFB1表达没有统计学变化。
PAX2的siRNA抑制增强DEFB1启动子活性:图14给出PAX2的抑制导致DEFB1启动子活性增强。产生PC3启动子/pGL3和DUl45启动子/pGL3构建体,并分别转染至PC3和DUl45细胞。比较由siRNA处理抑制PAX2之前和之后的启动子活性。处理之后,DEFB1启动子活性增强:DU145为2.65倍,以及PC3为3.78倍。
DEFB1引起细胞膜透性:通过共聚焦分析监测膜完整性。如图15所示,完整的细胞由于能透过膜的AO染成绿色。此外,具有受损细胞质膜的细胞由不能透过膜的EtBr会染成红色。未诱导的DU145(A)和PC3(D)细胞被AO阳性染色并且发出绿色,但是无EtBr染色。然而,DU145(B)和PC3(E)中的DEFB1诱导在24小时时导致EtBr聚集于细胞质,如通过红色染色所指示的。48小时时,DU145(C)和PC3(F)具有浓缩的细胞核并且显示黄色,这是由于存在分别来自AO和EtBr聚集的绿色和红色染色。
PAX2的抑制导致膜透性:用PAX2siRNA处理细胞4日,再次通过共聚焦分析监测膜完整性。如图16所示,DU145和PC3具有浓缩的细胞核并且显示黄色。然而,siRNA处理之后,LNCaP细胞的细胞质和细胞核均保持绿色。细胞周围还是红色染色表明维持了细胞膜的完整性。这些发现表明,抑制PAX2导致DU145和PC3发生特异的DEFB1-介导的细胞死亡,但是没有介导LNCaP细胞死亡。LNCaP中观测到的死亡是由于PAX2抑制之后LNCaP中存在野生型p53的反式激活。
PAX2与DEFB1启动子的结合:对DUl45和PC3细胞进行ChIP分析以确定PAX2转录阻遏物是否与DEFB1启动子相结合(图17)。泳道1包含100bp的分子量标志物。泳道2是阳性对照,代表交联和免疫沉淀反应之前从DU145扩增的DEFB1启动子的160bp区。泳道3是阴性对照,代表无DNA进行的PCR。泳道4和5是阴性对照,分别代表用IgG从交联的DU145和PC3进行免疫沉淀反应的PCR。交联之后用抗-PAX2抗体免疫沉淀的25pg DNA(泳道6和8)和50pg DNA(泳道7和9)的PCR扩增分别显示DU145和PC3中160bp的启动子片段。
图18给出预测的PrdPD和PrdHD与DNA的结构。将PrdPD结合至DNA(Xu et al.,1995)和PrdHD结合至DNA(Wilson et al.,1995)的结构的协同用于构建两个结构域结合至PH0位点的模型。如图所示,各结合位点以特定的方向彼此邻接。RED结构域基于PrdPD晶体结构定向。
图19给出不同配对结构域共有序列的比较。在图顶部示出Prd-配对-结构域±DNA复合物晶体学分析中所描述的蛋白±DNA接触的示意图。空框指示α-螺旋,阴影框指示β-折叠,以及粗线指示β-转角。接触的氨基酸由单字母代码给出。仅给出直接接触的氨基酸±碱基。空圈指示大沟接触,而红箭头指示小沟接触。该示意图是配对结构域蛋白所有已知共有序列的比对(仅给出正义链)。共有序列之间的垂直线指示保守的碱基对。位置编号在图底部给出。
这些结果证实癌基因因子PAX2阻抑DEFB1表达。阻抑发生于转录水平。此外,对DEFB1启动子的计算分析显示,紧邻DEFB1TATA盒存在用于PAX2转录阻遏物的CCTTG(SEQ ID NO:1)DNA结合位点(图1)。防御素细胞毒性的一个特点是破坏膜完整性。这些结果表明前列腺癌细胞中DEFB1的异常表达由于损害细胞膜而导致膜电位受损。抑制PAX2蛋白表达之后观测到相同的现象。因此,阻抑PAX2表达或功能导致DEFB1表达的重新建立以及随后的DEFB1-介导的细胞死亡。同样地,本结果建立利用DEFB1通过天然免疫作为用于前列腺癌治疗,还可能是用于其它癌症治疗的定向疗法。
实施例4:DEFB1表达对植入肿瘤细胞的影响
通过将过表达DEFB1的肿瘤细胞注射入裸鼠来评估DEFB1的抗肿瘤能力。将DEFB1克隆至pBI-EGFP载体(其具有双向四环素响应的启动子)。通过将pTet-Off转染至DU145、PC3和LNCaP细胞并且用G418选择来产生Tet-Off细胞系。pBI-EGFP-DEFB1质粒与pTK-Hyg共转染至Tet-off细胞系并且用潮霉素选择。仅使用活力>90%的单细胞悬浮液。每只动物接受大约500,000个细胞,经皮下给予雌性裸鼠的右侧腹部。有两组,对照组用仅有载体的克隆注射,而一组用过表达DEFB1的克隆注射。由统计学家确定每组35只小鼠。动物每周称 重两次,肿瘤生长由卡尺监测,而肿瘤体积利用以下公式计算确定:体积=0.5x(宽)2x长。当肿瘤大小达到2mm3或植入之后六个月时,所有动物通过过量CO2处死;将肿瘤切除、称重并保存于中性缓冲的福尔马林,用于病理检查。两组之间肿瘤生长的差异通过汇总统计表和图形显示描述表征。用t-检验或非参数等同方法评估统计学显著性。
实施例5:PAX2siRNA对植入肿瘤细胞的影响
将体外研究中利用的发卡PAX2siRNA模板寡核苷酸用于检测对体内DEFB1表达上调的影响。使正义和反义链(参见表3)退火并克隆至人U6RNA pol III启动子控制下的pSilencer2.1U6hygro siRNA表达载体(Ambion)。将所克隆的质粒测序、验证并转染至PC3、DU145和LNCap细胞系。将乱序shRNA克隆并用作本研究的阴性对照。选择抗潮霉素的克隆。将细胞经皮下引入小鼠,并如以上所描述监测肿瘤生长。
实施例6:结合PAX2的小分子抑制剂对植入肿瘤细胞的影响
PAX2结合的DNA识别序列位于DEFB1启动子的核苷酸-75和-71(+1是指转录起始位点)之间。提供了与PAX2DNA-结合结构域互补的短寡核苷酸。这样的寡核苷酸例子包括含有以下提供的CCTTG(SEQ ID NO:1)识别序列的20-mer和40-mer寡核苷酸。这些长度是随机选择的,并且预期其它长度作为结合的阻断剂是有效的。作为阴性对照,设计具有乱序序列(CTCTG)(SEQ ID NO:22)的寡核苷酸来验证特异性。用lipofectamine试剂或Codebreaker转染试剂(Promega,Inc)将寡核苷酸转染至前列腺癌细胞和HPrEC细胞。为了证实DNA-蛋白相互作用,双链寡核苷酸用[32P]dCTP标记并进行电泳迁移率测定。此外,通过QRT-PCR和Western分析监测用寡核苷酸处理之后的DEFB1表达。最后,通过如先前所描述的MTT测定和流式细胞术检测细胞死亡。
识别序列#1:CTCCCTTCAGTTCCGTCGAC(SEQ ID NO:18)
识别序列#2:CTCCCTTCACCTTGGTCGAC(SEQ ID NO:19)
乱序序列#1:CTCCCTTCACTCTGGTCGAC(SEQ ID NO:23)
识别序列#3:
ACTGTGGCACCTCCCTTCAGTTCCGTCGACGAGGTTGTGC(SEQ ID NO:20)
识别序列#4:
ACTGTGGCACCTCCCTTCACCTTGGTCGACGAGGTTGTGC(SEQ ID NO:21)
乱序序列#2:
ACTGTGGCACCTCCCTTCACTCTGGTCGACGAGGTTGTGC(SEQ ID NO:24)
本发明的寡核苷酸的其它例子包括:
识别序列#1:5’-AGAAGTTCACCCTTGACTGT-3’(SEQ ID NO:25)
识别序列#2:5’-AGAAGTTCACGTTCCACTGT-3’(SEQ ID NO:26)乱序序列#1:5’-AGAAGTTCACGCTCTACTGT-3’(SEQ ID NO:27)
识别序列#3:
5’-TTAGCGATTAGAAGTTCACCCTTGACTGTGGCACCTCCC-3’(SEQ ID NO:28)
识别序列#4:
5’-GTTAGCGATTAGAAGTTCACGTTCCACTGTGGCACCTCCC-3’(SEQ ID NO:29)
乱序序列#2:
5’-GTTAGCGATTAGAAGTTCACGCTCTACTGTGGCACCTCCC-3’(SEQ ID NO:30)
该组可选择的抑制性寡核苷酸代表PAX2结合结构域和同源框的识别序列。这些包括来自DEFB1启动子的实际序列。
PAX2基因是各种癌细胞(包括前列腺)生长和存活所必需的。此外,抑制PAX2表达导致由天然免疫成分DEFB1介导的细胞死亡。阻抑DEFB1表达和活性通过PAX2蛋白与DEFB1启动子的CCTTG(SEQID NO:1)识别位点的结合来实现。因此,该通路提供用于前列腺癌治疗的可行治疗靶标。在本方法中,序列结合至PAX2DNA结合位点并阻断PAX2与DEFB1启动子的结合,从而允许DEFB1表达和活性。 以上所描述的寡核苷酸序列和实验是其它PAX2抑制剂药物的例子,并且证实用于其它PAX2抑制剂药物设计的模型。
鉴于CCTTG(SEQ ID NO:1)序列存在于白细胞介素-3、白细胞介素-4、胰岛素受体等。PAX2也调控它们的表达和活性。因此,本文所公开的PAX2抑制剂在许多其它的疾病,包括与炎症直接相关的那些疾病包括前列腺炎和良性前列腺增生(BPH)中是有用的。
实施例7:DEFB1表达受损导致肿瘤发生提高
功能受损的小鼠的产生:Cre/loxP系统在阐明前列腺癌发生的潜在分子机制中是有用的。此时,DEFB1Cre条件性KO用于前列腺内的诱导型破坏。DEFB1Cre条件性KO包括产生含有位于DEFB1编码外显子侧翼的loxP位点的靶向载体,用该载体靶向ES细胞,并且由这些靶向的ES细胞产生生殖系嵌合小鼠。使杂合体交配成前列腺-特异的Cre转基因,并且将杂合杂交用于产生前列腺-特异的DEFB1KO小鼠。已发现四种能诱导啮齿动物前列腺癌的基因毒性化合物:N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)、N-亚硝基双2-氧丙基胺(BOP)、3,2X-二甲基-4-氨基-联苯(MAB)和2-氨基-l-甲基-6-苯基咪唑并-4,5-联吡啶(PhIP)。用这些致癌化合物通过胃内给予或静脉注射处理DEFB1转基因小鼠,用于前列腺腺瘤和腺癌诱导研究。通过组织学、免疫组织学、mRNA和蛋白分析研究前列腺样品中肿瘤生长的差异和基因表达的变化。
GOF小鼠的产生:对于PAX2诱导的GOF小鼠,给予5周龄的PAX2GOF(双转基因)和野生型(单转基因)同窝小鼠多西环素(Dox)来诱导前列腺-特异的PAX2表达。简而言之,PROBASIN-rtTA单转基因小鼠(四环素-依赖性rtTA诱导剂的前列腺细胞-特异性表达)与我们的PAX2转基因感应系(responder line)杂交。为了诱导,双转基因小鼠通过饮水喂给Dox(500mg/L,新鲜制备,一周两次)。最初的实验利用双转基因小鼠中的转基因建立系(founder line),验证低背景水平、良好可诱导性和PAX2和EGFP报告子的细胞类型特异性表达。关于实验组大小,每组(野生型和GOF)中5-7只年龄和性别相匹配的个体,具有统计学意义。对于本研究中的全部动物,最初每隔一周采集前列 腺组织,用于分析和比较,以确定致癌的时间参数。
PCR基因分型,RT-PCR和qPCR:利用以下PCR引物和条件对PROBASIN-rtTA转基因小鼠进行基因分型:
PROBASIN5(正向)5’-ACTGCCCATTGCCCAAACAC-3’
(SEQ ID NO:31);
RTTA3(反向)5’-AAAATCTTGCCAGCTTTCCCC-3’
(SEQ ED NO:32);
95℃变性5分钟;之后于95℃、30秒,57℃、30秒,72℃、30秒,进行30个循环;之后于72℃延伸5分钟,产生600bp的产物。利用以下PCR引物和条件对PAX2诱导型转基因小鼠进行基因分型:
PAX2For5’-GTCGGTTACGGAGCGGACCGGAG-3’(SEQ ID NO:33);
Rev5’IRES5’-TAACATATAGACAAACGCACACCG-3’(SEQ ID NO:34);
95℃变性5分钟;之后于95℃、30秒,63℃、30秒,72℃、30秒,进行34个循环;之后于72℃延伸5分钟,产生460bp的产物。
利用以下PCR引物和条件对永生化小鼠半合子进行基因分型:
Immol1,5’-GCGCTTGTGTC GCCATTGTATTC-3’(SEQ ID NO:35);
Immol2,5’-GTCACACCACAGAAGTAAGGTTCC-3’(SEQ ID NO:36);于94℃、30秒,58℃、1分钟,72℃、1分30秒,进行30个循环,产生~lkb的转基因条带。对于PAX2敲除小鼠的基因分型,使用以下PCR引物和条件:
PAX2For5’-GTCGGTTACGGAGCGGACCGGAG-3’(SEQ ID NO:37);
PAX2Rev5’-C AC AGAGC ATTGGCG ATCTCG ATGC-3’(SEQ ID NO:38);
于94℃、1分钟,65℃、1分钟,72℃、30秒,进行36个循环,产生~280bp的条带。
DEFB1肽动物研究:用106活PC3细胞经肩胛骨皮下注射六周龄雄性无胸腺(裸)鼠(购自Charles River Laboratories)。注射后一周,将动物随机分配到以下三组中的一组:组I—对照;组II—经腹膜内注射 DEFB1,100μg/日,一周5日,持续2-14周;组III—经腹膜内注射DEFB1,100mg/日,一周5日,持续8-14周。将动物饲养于无菌室,四只一笼,并且每日观察。每间隔10日,通过利用卡尺测量肿瘤,并且通过下式计算肿瘤体积:V=(L x W2)/2。
实施例8:靶向PAX2表达用于上皮内瘤变和癌症的化学预防
癌症化学预防定义为预防癌症或于癌前状态或更早时期进行治疗。浸润性癌症的长期进程是主要的科学机会,但也是显示备选化学预防性药物的临床益处的经济障碍。因此,近年来化学预防性药剂开发研究的重要组成部分,是鉴定(比癌症)更早期的准确预测药剂的临床益处或降低癌症发病率效应的终点或生物标志物。许多癌症中,IEN是诸如前列腺癌的早期终点。鉴于PAX2/DEFB1通路在IEN过程中,以及或许在更早的组织病理学状态会失控,这使得其成为癌症化学预防的有力的预测性生物标志物和极好的靶标。给出许多阻抑PAX2和增加DEFB1表达的化合物,其可能具有作为前列腺癌化学预防剂的效用。
如表1所示,PAX2基因表达于许多癌症中。此外,已表明几种癌症具有异常的PAX2表达(图20)。血管紧张素II(AngII)是血压和心血管动态平衡的主要调控因子,并且被认为是有效的丝裂原。AngII通过与两种亚型的受体的结合来介导其生物学效应,所述两种亚型是血管紧张素I型受体(AT1R)和血管紧张素II型受体(AT2R),它们属于G-蛋白偶联受体超家族,但是具有不同的组织分布和细胞内信号转导通路。除了其对血压的影响外,还显示AngII在包括组织重建如创伤愈合、心肌肥厚和发育的各种病理状况中起作用。事实上,最近研究已显示各种癌细胞或组织(包括前列腺)中的肾素-血管紧张素系统(RAS)的几种成分的局部表达。AT1R的上调为已学会躲避凋亡和生长调控元件的癌细胞提供诸多优势。至今大量癌症已显示异常表达PAX2。通过靶向PAX2表达的化学预防对癌症相关的死亡可能具有重要影响。
材料与方法
细胞培养:如实施例1所描述培养细胞系DU145、LnCap和PC3。于前列腺上皮细胞基础培养基(Cambrex Bio Science,Inc.,Walkersville,MD)中培养hPrEC细胞并保持于37℃和5%CO2下。
试剂和处理:用5或l0uM AngII,5uM ATRl拮抗剂Los,5uMATR2拮抗剂PD123319,25uM MEK抑制剂U0126,20uM MEK/ERK抑制剂PD98059或者250μM AMP激酶诱导剂AICAR处理细胞。
Western分析:如实施例2所描述进行Western印迹。用以1:1000-2000稀释的(抗-PAX2,抗-磷酸化-PAX2,抗-JNK,抗-磷酸化-JNK,抗-ERK1/2或抗-磷酸化-ERKl/2)(Zymed,San Francisco,CA)一抗探测印迹。洗涤之后,膜用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗-兔抗体(稀释度1:5000;Sigma)孵育,于Alpha Innotech Fluorchem8900上利用化学发光试剂(Pierce)显现信号检测。作为对照,将印迹清除并用小鼠抗-β-肌动蛋白一抗(1:5000;Sigma-Aldrich)和HRP-偶联的抗-小鼠二抗(1:5000;Sigma-Aldrich)重新探测,以及再次显现信号检测。
QRT-PCR分析:为验证PC3和DU145前列腺癌细胞系和hPrEC正常前列腺上皮细胞中PAX2敲低之后的基因表达变化,如实施例1所描述进行定量实时RT-PCR。在标准条件下,使用60℃的退火温度进行40个PCR循环。通过指数扩增开始的循环数(阈值)和获自三个重复的平均值来确定定量。信号水平与阈值之间存在反向关系。此外,将GAPDH用作管家基因来标准化总cDNA的初始含量。相对表达计算为每种基因与GAPDH之间的比值。所有反应均进行一式三份。
胸苷掺入法:通过将[3H]胸苷核苷酸([3H]TdR)掺入DNA来测定细胞的增殖。将0.5x106细胞/孔的DU145细胞悬浮液接种至其合适的培养基。细胞于所示浓度的AngII存在或不存在的条件下孵育72小时。细胞暴露于相同培养基中的37kBq/ml[甲基-3H]胸苷6小时。贴壁细胞通过5%三氯乙酸固定,并于SDS/NaOH裂解缓冲液中裂解过夜。通过Beckman LS3801液闪计数器(Canada)测量放射性。通过细胞收集器(Packard instrument Co.,Meriden,CT)收集悬浮细胞培养物,并且通过1450microbeta液闪计数器(PerkinElmer Life Sciences)测量放射性。
结果
为研究AngII对DU145前列腺癌细胞中PAX2表达的影响,用AngII处理30分钟至48小时之后,检测PAX2表达。如图21所示,AngII处理之后PAX2表达随着时间逐渐增加。通过用Los处理DU145阻断RAS信号转导显著降低了PAX2表达。此时,与未处理的对照DU145细胞相比,Los处理之后PAX2表达:48小时为37%,以及72小时为50%(图22A)。已知AT2R受体对抗AT1R的作用。因此,检测阻断AT2R受体对PAX2表达的影响。用AT2R阻断剂PD123319处理DU145之后导致PAX2表达增加:48小时为7倍,以及96小时为8倍(图22B)。总的来说,这些发现证实PAX2表达由ATR1受体调控。
已知AngII通过AT1R-介导的MAPK和STAT3磷酸化活化直接影响前列腺癌细胞的增殖。用AngII处理DU145导致增殖率增加2至3倍(图23)。然而,用Los处理使增殖率降低50%。此外,通过用Los预先处理30分钟阻断AT1R受体阻抑AngII对增殖的影响。
为进一步检测AT1R信号转导在调控PAX2表达和活化中的作用,检测阻断MAP激酶信号转导通路的多种成分对PAX2表达的影响。此时,DU145细胞用MEK抑制剂U0126处理导致PAX2表达显著降低(图24)。此外,用MEK/ERK抑制剂PD98059处理同样导致PAX2降低。用Los处理DU145细胞对ERK蛋白水平没有影响,但是降低磷酸化-ERK的量(图25A)。然而,用Los处理DU145导致PAX2表达显著降低。用U0126和PD98059观测到相似的结果(图25B)。还已知PAX2表达受STAT3调控,STAT3是ERK的下游靶标。用Los,U0126和PD98059处理DU145降低磷酸化-STAT3蛋白的水平(图25C)。这些结果证实,前列腺癌细胞中PAX2通过AT1R调控。
此外,检测AT1R信号转导通过JNK对PAX2活化的影响。用Los,U0126和PD98059处理DU145全部导致磷酸化-PAX2蛋白水平的显著降低或阻抑(图26A)。然而,Los和U0126并不降低磷酸化-JNK蛋白的水平(图26B)。因此,磷酸化-PAX2的降低似乎是由于PAX2水平降低,但并不减少磷酸化。
5-氨基咪唑-4-羧胺-l-β-4-呋喃核糖苷(AICAR)作为AMP-激酶活化剂广泛使用,其调控能量平衡并且响应代谢应激。最近报道显示,利用药理试剂或AMPK过表达来活化AMPK的抗-增殖和促凋亡作用。已表明AMPK活化诱导人胃癌细胞、肺癌细胞、前列腺癌、胰腺细胞和肝癌细胞的凋亡,并且通过各种机制包括抑制脂肪酸合成途径和诱导应激激酶和半胱天冬酶3来增强小鼠成神经瘤细胞中氧化应激诱导的凋亡。此外,处理PC3前列腺癌细胞增加p21、p27和p53蛋白表达,并且抑制PDK-Akt通路。所有这些通路由PAX2直接或间接调控。用AICAR处理前列腺癌细胞导致PAX2表达(图25B)以及其活化形式磷酸化-PAX2的阻抑(图26A)。此外,还阻抑调控PAX2表达的磷酸化-STAT3(图25C)。
最后,推测导致PAX2上调和过表达的异常RAS信号转导阻抑DEFB1肿瘤阻抑基因的表达。为研究此点,用AngII处理正常前列腺上皮原代培养物hPrEC,并检测PAX2和DEFB1表达水平。发现正常前列腺细胞相对于前列腺癌细胞中,DEFB1和PAX2表达之间的反向关系。如图27所示,相比PC3前列腺癌细胞中的表达,未处理的hPrEC显示10%的相对PAX2表达。相反地,相比hPrEC中的表达,未处理的PAX2仅显示2%的相对DEFB1表达。用l0uM AngII处理72小时之后,相比未处理的hPrEC,DEFB1表达降低35%,以及96小时时,相比未处理的hPrEC细胞,DEFB1表达降低50%。然而,在72小时时,相比未处理的hPrEC细胞,PAX2表达增加66%,以及96小时时PAX2表达增加79%。此外72小时之后,hPrEC中PAX2表达的增加是PC3前列腺癌细胞所观测PAX2水平的77%。AngII处理96小时之后,PAX2表达为PC3中PAX2表达的89%。这些结果证实,失控的RAS信号转导通过前列腺细胞中PAX2表达的上调,阻抑DEFB1表达。
抑制凋亡是关键的病理生理因素,有助于癌症发展。尽管癌症治疗取得重大发展,但在治疗晚期疾病中很少有进展。鉴于癌发生是多年、多级、多通路疾病的进程,通过使用药物或其它药剂来抑制、延缓或逆转该过程的化学预防已被认为是癌症研究中非常有前景的领 域。用于前列腺癌化学预防的成功药物治疗,需要在阻抑癌症发展的总目标下使用对靶细胞具有特异效应而对宿主保持最低限度的临床影响的治疗。因此,理解早期癌发生的机制是确定具体治疗效力的关键。异常PAX2表达及其消除凋亡(随后利于肿瘤形成)的重要性,提示其可能是用于前列腺癌治疗的合适靶标。前列腺癌中PAX2由AT1R调控(图28)。其中,失控的RAS信号转导调控导致PAX2癌基因的表达增加和DEFB1肿瘤阻抑物的表达降低。因此,使用AT1R拮抗剂降低PAX2表达并通过DEFB1的重新表达而导致前列腺癌细胞死亡增加(图29)。这些结果提供新的发现,通过肾素-血管紧张素信号转导通路,AMP激酶通路或涉及PAX2蛋白失活的其它方法(即抗-PAX2抗体免疫)靶向PAX2表达可能是用于癌症预防的可行靶标(表4)。
表4用于化学预防抑制PAX2表达所用的化合物
本研究证实,前列腺癌中PAX2癌基因的上调是由于RAS信号转导失控。PAX2表达由通过血管紧张素1型受体介导的ERK1/2信号转导通路调控。此外,用洛沙坦(Los)阻断AT1R阻抑PAX2表达。此外,已表明AMPK活化剂AICAR可能作为潜在的PAX2抑制剂。总的来说,这些研究强有力地暗示这些类别的药物作为PAX2表达的潜在阻抑物,并且可以最终用作新的化学预防剂。
实施例9:PAX2-DEFB1表达水平作为前列腺组织的分级工具和前列腺癌发展的预测物
材料和方法
QRT-PCR分析:从经过根治性前列腺切除术的患者采集前列腺切片。病理检查之后,进行激光捕获显微切割来分离正常、增殖性上皮内瘤变(PIN)和癌组织区域。如先前所描述进行QRT-PCR来估计表达。各区域中的DEFB1和PAX2表达,并且GAPDH用作内参。
血液采集和RNA分离:对于QRT-PCR,按照厂商手册,将来自每个个体的血液(2.5ml)收集至PAX geneTMBlood RNA管(QIAGEN)。全血与PAX基因稳定试剂彻底混合,并在RNA提取之前于室温下保存6小时。然后根据厂商说明书,利用PAXgeneTMBlood RNA试剂盒(QIAGEN)提取总RNA。为了去除污染基因组DNA,用DNase I(QIAGEN)于25℃下孵育吸附至PAXgeneTMBlood RNA系统离心柱的总RNA样品20分钟,以去除基因组DNA。如先前所述洗脱、定量总RNA并进行QRT-PCR,以比较PAX2和DEFB1表达比值。
结果
LCM正常组织的QRT-PCR分析证实,与相对DEFB1表达水平小于0.005的那些患者相比,相对DEFB1表达水平大于0.005的患者具有更低的Gleason评分(图30)。因而,DEFB1表达与Gleason评分之间存在反向关系。相反地,恶性前列腺组织和PIN中PAX2表达与Gleason评分之间存在正相关(图30,图B)。
计算和比较来自各患者的正常、PIN和癌组织中的PAX2和DEFB1表达水平(图31A和31B)。总体而言,PAX2相对于GAPDH内参的表达水平范围:正常(良性)组织为0至0.2,PIN为0.2至0.3,以及癌(恶性)组织为0.3至0.5(图32)。对于DEFB1,与PAX2相比存在反向关系。此时,DEFB1相对于GAPDH内参的表达水平范围:正常(良性)组织为0.06至0.005,PIN为0.005至0.003,以及癌(恶性)组织为0.003至0.001。因此,公开了预测量表,命名为Donald预测因子(DPF),其 利用PAX2-DEFB1表达比值作为良性、癌前期(PIN)和恶性前列腺组织的预测物。基于DPF,PAX2-DEFB1比值为0至39的组织代表正常(病理良性)。基于DPF量表,PAX2-DEFB1比值为40至99的组织代表PIN(癌前)。最后,PAX2–DEFB1比值为100至500的组织代表恶性(低级别至高级别癌症)。
目前迫切需要用于前列腺癌发展的预测性生物标志物。已知前列腺癌在能通过目前的筛选方法如PSA测试或数字直肠检查进行检测之前,该疾病就已经发作很长时间了。认为能够监测前列腺癌进程及早期发作的可靠的测试应能通过更有效的疾病管理,极大地降低死亡率。本文公开了允许医生提前了解前列腺病理状态的预测指标。DPF评估与前列腺疾病进程相关的PAX2-DEFB1表达率的减小。这种有力的评估不仅能预测患者发展前列腺癌的可能性,而且还可以确认癌恶化前的早期发作。最后,该工具可以允许医生将患有更严重疾病的患者与不严重的那些患者隔离。
鉴定出的癌症-特异性标志物已用于辅助鉴定循环肿瘤细胞(CTC)。还有新的证据证实,为了早期评估辅助疗法的效力,检测外周血中散布的肿瘤细胞可以为肿瘤分期、预测和替代标志物的鉴定提供重要的临床数据。此外,通过比较所有循环细胞的基因表达谱,可以检测分别在“免疫监视”和“癌症存活”中发挥作用的DEFB1和PAX2基因的表达,这两种基因作为早期检测前列腺癌的预测物。
实施例10:宿主防御肽人β-防御素-1的功能性分析:其在癌症中潜在作用的新认识
材料与方法
细胞培养:如实施例1所描述培养前列腺癌细胞系。hPrEC原代培养物获自Cambrex Bio Science,Inc.(Walkersville,MD),并且细胞于前列腺上皮细胞基础培养基中生长。
组织样品和激光捕获显微切割:前列腺组织获自在进行根治性前列腺切除术之前已提供知情同意的患者。根据机构审查委员会批准的协议,通过Hollings癌症中心肿瘤库获得样品。这包括用于样品的处理、 切片、组织学表征、RNA纯化和PCR扩增的指导原则。从外科医生接收前列腺标本并且病理学者迅速于OCT化合物中冷冻。将各OCT块切割以产生待染色和检测的系列切片。鉴定含有良性细胞、前列腺上皮内瘤变(PIN)和癌症的区域,并用于指导我们利用Arcturus PixCell II系统(Sunnyvale,CA)选择来自未染色玻片上的区域。使含有捕获材料的Caps暴露于来自Arcturus Pico Pure RNA分离试剂盒的20μl裂解液并立即处理。RNA定量和定性利用产生5’扩增子的引物组来评估。该引物组包括用于核糖体蛋白L32的引物(3’扩增子和5’扩增子相隔298个碱基),用于葡萄糖磷酸异构酶的引物(相隔391个碱基),以及用于葡萄糖磷酸异构酶的引物(相隔842个碱基)。使用来自多种制备组织的样品,这些引物组常规获得0.95至0.80的比值。其它肿瘤和正常样品由病理学者粗略切割,于液氮中速冻并且评估hBD-1和cMYC表达。
hBD-1基因的克隆:利用从已公开的hBD-1序列(登录号U50930)(Ganz,2004)产生的引物,通过逆转录PCR产生hBD-l cDNA。所设计的PCR引物含有ClaI和KpnI限制性位点。hBD-l PCR产物用ClaI和KpnI消化并连接到TA克隆载体。然后使TA/hBD-l载体通过热激转染到大肠杆菌XL-I Blue菌株,并选择和扩增单克隆。通过Cell Culture DNA Midiprep(Qiagen,Valencia,CA)分离质粒,并通过自动测序验证序列完整性。然后,将hBD-l基因片段连接入用ClaI和KpnI消化的pTRE2(用作定向目的的中间载体)。用ApaI和KpnI消化pTRE2/hBD-l构建体来切下hBD-l插入物。将插入物连接入同样用ApaI和KpnI双重消化的脱皮激素诱导型表达系统的pIND载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)。使所述构建体转染大肠杆菌,并选择和扩增单克隆。分离质粒并通过自动测序再次验证pIND/hBD-l的序列完整性。
转染:将细胞(1x106)接种到100-mm皮氏培养皿并且过夜培养。接着,利用Lipofectamine2000(Invitrogen,Carlsbad,CA),用1μg pVgRXR质粒(表达异源二聚体的蜕皮激素受体)和1μg pIND/hBD-l载体构建体或pIND/β-半乳糖苷酶(β-gal)对照载体于Opti-MEM培养基(Life Technologies,Inc.)中共转染细胞。通过用松甾酮A(PonA)诱导β-gal表达和用β-半乳糖苷酶检测试剂盒(Invitrogen)染色细胞来测定转染率。通 过计数阳性染色(蓝色)克隆的转染率评估证实,细胞系中60-85%的细胞表达β-半乳糖苷酶。
免疫细胞化学:为了验证hBD-1蛋白表达,将DU145和hPrEC细胞以每个腔室1.5-2x104细胞接种于2-腔室培养玻片(BD Falcon,USA)。用含10μM Pon A的培养基诱导仅用pvgRXR(对照)或用hBD-1质粒转染的DU145细胞18小时,而未转染的细胞接受新鲜的生长培养基。诱导之后,细胞用1倍PBS洗涤并于室温下用4%多聚甲醛固定。然后细胞用1倍PBS洗涤六次并在补充有2%BSA、0.8%正常羊血清(Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,CA)和0.4%Triton-X100的1倍PBS中于室温下封闭1小时。接着,细胞于以1:1000稀释于封闭溶液的一级兔抗-人BD-1多克隆抗体(PeproTech Inc.,Rocky Hill,NJ)中过夜孵育。在这之后,细胞用封闭溶液洗涤六次,并于室温下在以1:1000稀释于封闭溶液的Alexa Fluor488山羊抗-兔IgG(H+L)二抗中孵育1小时。用封闭溶液洗涤细胞六次之后,用Gel Mount(Biomeda,Foster City,CA)密封盖玻片。最后,于微分干涉相差(DIC)和448nm激光激发下观测细胞。通过具有Vario2RGB激光扫描组件的共聚焦显微镜(Zeiss LSM5Pascal),利用63倍DIC油镜分析荧光信号。将数字图像传输到Photoshop CS软件(Adobe Systems),用于图像处理和硬拷贝显示。
RNA分离和定量RT-PCR:如先前所描述进行QRT-PCR(Gibson et al.,2007)。简而言之,利用随机引物(Promega)将来自组织切片的总RNA(每个反应0.5μg)逆转录成cDNA。利用来自TaqMan逆转录系统的MultiScribe逆转录酶和PCR Master Mix(Applied Biosystems)对所产生的cDNA进行两步QRT-PCR。用于hBD-1和c-MYC的引物对由公开序列产生(表5)。于标准条件下,使用56.4℃(用于hBD-1和c-MYC)和55℃(用于PAX2)的退火温度进行40个PCR循环。此外,扩增β-肌动蛋白(表5),作为管家基因来标准化总cDNA的初始含量。良性前列腺组织样品中的基因表达计算为与β-肌动蛋白相比的表达率。恶性前列腺组织、hPrEC前列腺原代培养物和前列腺癌细胞系在诱导之前和之后的hBD-1表达水平计算为相对于hPrEC细胞中 hBD-1表达的平均水平。作为阴性对照,还进行了不含cDNA模板的QRT-PCR反应。所有反应均最少进行三次。
表5QRT-PCR引物的序列
MTT细胞活力测定:为检测hBD-1对细胞生长的影响,进行代谢物3-(4,5-二甲基噻唑-2基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)测定。将用pVgRXR质粒和pIND/hBD-1构建体或对照pvgRXR质粒共转染的DU145、LNCaP、PC3和PC3/AR+细胞接种于96-孔板,每孔1-5x103细胞。接种之后24小时,每日添加含有10μM Pon A的新鲜生长培养基来诱导hBD-1表达24、48和72小时,之后根据厂商说明书(Promega)进行MTT测定。反应进行三次,一式三份。
膜完整性分析:进行吖啶橙(AO)/溴化乙锭(EtBr)双重染色来鉴定细胞膜完整性变化,以及通过染色浓缩的染色质鉴定凋亡细胞。AO染色活细胞以及早期凋亡细胞,而EtBr染色膜受损的晚期凋亡细胞。简而言之,将PC3、DU145和LNCaP细胞接种于2-腔室培养玻片(BD Falcon)。用含有10μM Pon A的培养基诱导用空质粒或hBD-1质粒转染的细胞24或48小时,而对照细胞在每个时间点接受新鲜的生长培养基。诱导之后,细胞用PBS洗涤一次,并用2ml AO(Sigma,St.Louis,MO)和EtBr(Promega)(5μg/ml)溶液的混合物(1:1)染色5分钟,再次用PBS洗涤细胞。
通过Zeiss LSM5Pascal Vario2激光扫描共聚焦显微镜(Carl Zeiss)观测荧光。激发色轮含有BS505-530(绿色)和LP560(红色)滤光器组件,其允许从AO发射的绿光分离至绿色通道,来自EtBr的红光分离至红色通道。对照和hBD-1诱导的细胞之间的各独立试验的激光功率输出和增益控制设置是相同的。由Kr/Ar混合气体激光器提供的激发 波长为543nm(对于AO)和488nm(对于EtBr)。玻片于40倍放大倍数下分析,并且将数字图像保存为未压缩的TIFF文件并输出到Photoshop CS软件(Adobe Systems),用于图像处理和硬拷贝显示。
流式细胞术:于60-mm培养皿中培养用hBD-1表达系统转染的PC3和DU145细胞,并且用10μM Pon A诱导12、24和48小时。如实施例1所描述收集并通过流式细胞术分析。
半胱天冬酶检测:如实施例1所描述进行前列腺癌细胞系中半胱天冬酶活性的检测。
PAX2的siRNA沉默:如实施例2所描述进行SiRNA敲低并验证。
结果
前列腺组织中的hBD-1表达:所分析的前列腺癌冷冻组织切片分析的82%表现出很少或没有hBD-1表达(Donald et al.,2003)。为比较hBD-1表达水平,对通过粗略切割或随机选择的恶性区域附近的正常前列腺组织的LCM所获得的正常前列腺组织进行QRTPCR分析。此时,检测全部粗略切割的正常临床样品中的hBD-1,所述正常临床样品具有代表表达水平相差大约6.6倍的一系列表达(图33A)。LCM捕获的正常组织样品以代表表达相差32倍的范围水平表达hBD-1(图33B)。样品编号与相应的患者特征的匹配显示,在大多数情况下,Gleason评分为6的患者样品中的hBD-1表达水平高于Gleason评分为7的患者样品中的水平。此外,比较通过粗略切割和LCM从同一患者#1343获得的组织中的hBD-1表达水平,证实两种分离技术之间表达相差854倍。因此,这些结果表明LCM为评估前列腺组织中的hBD-1表达提供更敏感的技术。
前列腺细胞系中的hBD-1表达:为验证用hBD-1表达系统转染之后前列腺癌细胞系中hBD-1的上调,进行QRTPCR。此外,还进行不含模板的阴性对照,并通过凝胶电泳验证扩增产物。此时,与hPrEC细胞相比,前列腺癌细胞系中的hBD-1表达显著更低。诱导24小时之后,与hBD-1诱导之前的细胞系相比,DU145、PC3和LNCaP中hBD-1的相对表达水平显著增加(图34A)。
接着,用Pon A诱导后,通过免疫细胞化学技术验证用hBD-1表达系统转染的DU145细胞中hBD-1的蛋白表达。作为阳性对照,还检测表达hBD-1的hPrEC前列腺上皮细胞。用抗hBD-1的一抗对细胞染色,并基于二抗的绿色荧光监测蛋白表达(图34B)。在DIC下的细胞染色验证hPrEC细胞和DU145细胞的存在在18小时时诱导hBD-1表达。通过共聚焦激光在488nm处产生的激发显示绿色荧光,这表明作为阳性对照的hPrEC中存在hBD-1蛋白。然而,对照DU145细胞和空质粒诱导的DU145细胞没有检测到绿色荧光,这表明没有hBD-1表达。对诱导hBD-1表达的DU145细胞的共聚焦分析显示绿色荧光,这表明用Pon A诱导之后存在hBD-1蛋白。
hBD-1表达导致细胞活力降低:进行MTT测定来评估hBD-1表达对DU145、PC3、PC3/AR+和LNCaP前列腺癌细胞系的相对细胞活力的影响。用空载体的MTT分析在细胞活力上没有表现出统计学显著的变化。hBD-1诱导之后24小时,相对细胞活力:DU145细胞为72%,以及PC3细胞为56%,而48小时之后,细胞活力降低至:DU145细胞为49%,以及PC3细胞为37%(图35)。hBD-1诱导72小时之后,相对细胞活力进一步降低至:DU145细胞为44%,以及PC3细胞为29%。相反地,对LNCaP细胞的活力没有显著影响。为评估LNCaP中所观测到的对hBD-1细胞毒性的抗性是否是由于雄激素受体(AR)的存在,检测具有异常AR表达的PC3细胞(PC3/AR+)中的hBD-1细胞毒性。此时,PC3/AR+与PC3细胞之间没有差异。因此,数据表明hBD-1特异地对晚期前列腺癌细胞是细胞毒性的。
为了测定hBD-1对PC3和DU145的影响是细胞抑制的还是细胞毒性的,进行FACS分析来测量细胞死亡。在正常生长条件下,多于90%的PC3和DU145培养物存活且不凋亡(左下象限),并且用膜联蛋白V或PI不染色。诱导PC3细胞的hBD-1表达之后,发生早期凋亡和晚期凋亡/坏死的细胞数量(分别为右下和右上象限)总计:12小时为10%,24小时为20%,以及48小时为44%(图4B)。对于DU145细胞,发生早期凋亡和晚期凋亡/坏死的细胞数量总计:诱导12小时之后为12%,24小时为34%,以及48小时为59%(图4A)。用Pon A诱导之 后,含有空质粒的细胞中未观测到凋亡增加。膜联蛋白V和碘化丙啶吸收研究已证实,hBD-1对DU145和PC3前列腺癌细胞具有细胞毒活性,并且结果表明凋亡为细胞死亡的机制。
hBD-1致使膜完整性和半胱天冬酶活性变化:研究hBD-1诱导之后所观测的前列腺癌细胞的细胞死亡是否是半胱天冬酶-介导的凋亡。为更好地理解参与hBD-1表达的细胞机制,对诱导hBD-1表达的DU145和LNCaP细胞进行共聚焦激光显微镜分析(图5)。基于发绿色荧光的FAM-VAD-FMK与活跃发生凋亡的细胞中半胱天冬酶的结合和分离来监测泛半胱天冬酶活化。在DIC下的细胞分析表明,0小时时存在活的对照DU145(图A)和LNCaP(图E)细胞。通过共聚焦激光在488nm处的激发未产生可检测的绿色染色,表明DU145(图B)或LNCaP(图F)对照细胞中没有半胱天冬酶活性。诱导24小时之后,在DIC下再次可见DU145(图C)和LNCaP(图G)细胞。荧光下的共聚焦分析显示DU145(图D)细胞中的绿色染色,表明诱导hBD-1表达之后的泛半胱天冬酶活性。然而,诱导hBD-1表达的LNCaP(图H)细胞中没有绿色染色。因此,诱导hBD-1之后所观测的细胞死亡是半胱天冬酶-介导的凋亡。
所提出的防御素肽抗菌活性的机制是由于孔形成破坏微生物膜(Papo and Shai,2005)。为了确定hBD-1表达是否改变膜完整性,通过共聚焦分析检测EtBr吸收。完整细胞由于膜透过AO被染成绿色,而只有细胞质膜受损的细胞由于并入膜不可透过的EtBr而染成红色。对照DU145和PC3细胞用AO呈阳性染色并且发出绿色,但不被EtBr染色。然而,如通过红色染色所指示的,hBD-1诱导24小时的DU145和PC3导致EtBr聚集于细胞质。48小时时,DU145和PC3具有浓缩的细胞核,并且由于分别来自AO和EtBr的绿色和红色的共定位而出现黄色。相反地,诱导48小时之后,通过用AO呈阳性绿色荧光但没有红色EtBr荧光所指示的,LNCaP细胞的膜完整性没有可观测的改变。该发现表明早期和晚期前列腺癌细胞之间响应于hBD-1表达不同而改变膜完整性和透性。
hBD-1和cMYC表达水平的比较:对来自三名患者的LCM前列腺 组织进行QRT-PCR分析(图34)。患者#1457中,hBD-1表达显示:由正常至PIN降低2.7倍,由PIN至肿瘤降低3.5倍,以及由正常至肿瘤降低9.3倍(图36A)。同样地,患者#1457的cMYC表达遵循相似的表达模式,其中:由正常至PIN表达降低1.7倍,由PIN至肿瘤降低1.7倍,以及由正常至肿瘤降低2.8倍(图36B)。此外,另外两名患者中的cMYC表达呈现统计学显著的降低。患者#1569由正常至PIN降低2.3倍,而患者#1586由正常至PIN降低1.8倍,由PIN至肿瘤降低4.3倍,以及由正常至肿瘤降低7.9倍。
PAX2抑制之后hBD-1表达的诱导:为进一步检测PAX2调控hBD-1表达的作用,利用siRNA敲低PAX2表达并进行QRT-PCR监测hBD-1表达。用PAX2siRNA处理的hPrEC细胞显示对hBD-1表达没有影响(图37)。然而,与未处理细胞相比,PAX2敲低导致hBD-1的表达增加:LNCaP为42倍,PC3为37倍,以及DU145为1026倍。作为阴性对照,用非特异siRNA处理的细胞对hBD-1表达没有显著影响。
实施例11:PAX2表达的抑制导致交替的P53状态不同的前列腺癌细胞的细胞死亡通路
材料与方法
细胞系:如实施例1所描述培养p53突变状态不同(表6)的癌细胞系PC3、DU145和LNCaP。前列腺上皮细胞系HPrEC获自Cambrex Bio Science,Inc.,(Walkersville,MD),并培养于前列腺上皮细胞基础培养基中。细胞保持于37℃,5%CO2下。
表6前列腺癌细胞系种的p53基因突变
PAX2的siRNA沉默:如实施例2所描述进行PAX2的siRNA沉默。
Western分析:如实施例2所描述进行Western印迹。用以1∶1000稀释的兔抗-PAX2一抗(Zymed,San Francisco,CA)探测印迹。洗涤之后,用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗-兔抗体(稀释度1∶5000;Sigma)孵育膜,并于Alpha Irmotech Fluorchem 8900上利用化学发光试剂(Pierce)显现信号检测。作为对照,将印迹清除并用小鼠抗-β-肌动蛋白一抗(1∶5000;Sigma-Aldrich)和HRP-偶联的抗-小鼠二抗(1∶5000;Sigma-Aldrich)重新探测,并再次显现信号检测。
相差显微镜法:通过实施例1所描述的相差显微镜法分析PAX2敲低对细胞数量的影响。
MTT细胞毒性测定:如实施例1所描述进行MTT细胞毒性测定。
泛半胱天冬酶测定:如实施例1所描述进行前列喙癌细胞系中半胱天冬酶活性的检测。
定量实时RT-PCR:为验证PAX2敲低之后,PC3、DU145和LNCaP细胞系中基因表达的变化,如实施例1所描述进行定量实时RT-PCR。从公开序列产生用于BAX、BID、BCL-2、AKT和BAD的引物对(表7)。于Micro Amp Optical 96-孔反应板(PE Biosystems)进行反应。在标准条件下,使用60℃的退火温度进行40个PCR循环。通过指数扩增开始的循环数(阈值)和获自三个重复的平均值来确定定量。信号水平与阈值之间存在反向关系。此外,将GAPDH用作管家基因来标准化总cDNA的初始含量。相对表达计算为各基因与GAPDH之间的比值。所有反应均进行一式三份。
表10定量RT-PCR引物
膜透性测定:如实施例3所描述进行膜透性测定。
结果
前列腺细胞中PAX2蛋白表达的分析:通过在HPrEC前列腺原代培养物以及LNCaP、DU145和PC3前列腺癌细胞系中的Western分析检测PAX2蛋白表达。此时,检测所有前列腺癌细胞系中的PAX2蛋白(图38A)。然而,HPrEC未检测出PAX2蛋白。将印迹清除并用作为内参的β-肌动蛋白重新探测以确保上样相等。通过DU145、PC3和LNCaP前列腺癌细胞系中PAX2特异siRNA选择性靶向和抑制之后,同样监测PAX2蛋白表达。用PAX2siRNA池在6日处理期间转染细胞一轮。PAX2蛋白表达于仅用培养基处理的对照细胞。通过观测所有三种细胞系中PAX2蛋白的敲低证实了特异靶向PAX2mRNA(图38B)。
PAX2敲低对前列腺癌细胞生长的影响:利用光学显微镜法和MTT测定分析PAX2siRNA对细胞数量和细胞活力的影响。为检测PAX2siRNA对细胞数量的影响,仅用培养基、用非特异siRNA或PAX2siRNA于6日期间转染PC3、DU145和LNCaP细胞系。每种细胞系在仅含有培养基的60mm培养皿中达到80-90%汇合。与仅用培养基处理的细胞相比,用非特异siRNA对HprEC、DU145、PC3和LNCaP细胞的处理似乎对细胞生长少有至没有影响(图39,分别为图A、C和E)。用PAX2siRNA对PAX2-缺失细胞系HprEC的处理似乎对细胞生 长没有显著影响(图39,图B)。然而,用PAX2siRNA对前列腺癌细胞系DU145、PC3和LNCaP的处理导致细胞数量显著减少(图39,分别为图D、F和H)。
PAX2敲低对前列腺癌细胞活力的影响:暴露2日、4日和6日之后,测量细胞活力。百分比活力计算为用PAX2siRNA处理的细胞的570-630nm处的吸光度除以未处理对照细胞的570-630nm处的吸光度的比值。作为阴性对照,在用阴性对照非特异siRNA或仅用试剂转染的每次处理之后,测量细胞活力。通过PAX2siRNA处理之后的百分比活力除以用非特异siRNA处理之后的百分比活力计算相对细胞活力(图40)。处理2日之后,相对细胞活力:DU145为116%,PC3为81%,以及LNCaP为98%。处理4日之后,相对细胞活力降低至:DU145为69%,PC3为79%,以及LNCaP为80%。最后,到6日时,相对细胞活力:DU145为63%,PC3为43%以及LNCaP为44%。此外,还测量仅用试剂转染处理之后的细胞活力。此时,各细胞系在细胞活力上未表现出显著降低。
泛活性的检测:通过共聚焦激光显微镜分析检测半胱天冬酶活性。用PAX2siRNA处理LNCaP、DU145和PC3细胞,并且基于FAM-标记的肽与活跃发生凋亡的细胞中半胱天冬酶的结合(发绿色荧光)来监测活性。仅用培养基处理的细胞分析分别显示活LNCaP、DU145和PC3细胞的存在。通过共聚焦激光在488nm处的激发未产生可检测的绿色染色,表明未处理的细胞中没有半胱天冬酶活性(图41,分别为图A、C和E)。用PAX2siRNA处理4日之后,荧光下呈现绿色染色的LNCaP、DU145和PC3细胞表明半胱天冬酶活性(图41,分别为图B、D和F)。
PAX2抑制对凋亡因子的影响:用针对PAX2的siRNA处理LNCaP、DU145和PC3细胞4日,并且通过QRTPCR测量促凋亡因子和抗凋亡因子的表达。PAX2敲低之后,BAD分析显示:LNCaP为2倍,DU145为1.58倍,以及PC3为1.375倍(图42A)。BID的表达水平:LNCaP增加1.38倍,以及DU145增加1.78倍,但是阻抑PAX2表达之后观测PC3中的BID没有统计学显著差异(图42B)。处理之后,抗-凋亡因 子AKT的分析显示:LNCaP表达下降1.25倍,以及DU145表达下降1.28倍,而观测PC3无变化(图42C)。
膜完整性和坏死分析:通过共聚焦分析监测LNCaP,DU145和PC3细胞的膜完整性。此时,完整细胞由于能透过膜的AO而染成绿色;而由于在细胞质内并入不能透过膜的EtBr,具有受损细胞质膜的细胞会染成红色;以及由于AO和EtBr在细胞核中的共定位,呈现为黄色。未处理的LNCaP、DU145和PC3细胞用AO呈阳性染色并且发出绿色,但是用EtBr未染色。PAX2敲低之后,如通过用AO呈阳性绿色荧光而没有红色EtBr荧光所指示的,LNCaP细胞的膜完整性没有可观测到的变化。这些发现进一步表明,PAX2敲低之后,LNCaP细胞可发生凋亡,但不是坏死性细胞死亡。相反地,DU145和PC3中的PAX2敲低导致EtBr聚集于细胞质,如通过红色染色所指示的。此外,由于分别来自AO和EtBr的绿色和红色的共定位,DU145和PC3具有呈现黄色的浓缩细胞核。这些结果表明,相比LNCaP,DU145和PC3正在发生包括坏死性细胞死亡的交替的细胞死亡通路。
实施例12:乳腺癌细胞系和具有导管或小叶上皮内瘤变的乳腺组织中的PAX2和DEFB-1表达
测定导管或小叶上皮内瘤变的乳腺活检样品以及以下乳腺癌细胞系中的PAX2和DEFB-1表达:
BT-20:从原发性浸润性导管癌分离;细胞表达E-钙粘附素、ER、EGFR和uPA。
BT-474:从原发性浸润性导管癌分离;细胞表达E-钙粘附素、ER、PR,并且具有增加的HER2/neu。
Hs578T:从原发性浸润性导管癌分离;同样由正常邻近组织建立的细胞系,称为Hs578Bst。
MCF-7:由胸腔积液建立。细胞表达ER,并且是雌激素-响应性乳腺癌细胞的最常见例子。
MDA-MB-231:由胸腔积液建立。细胞为ER-阴性,E-钙粘附素阴性,并且体外测定是高度浸润的。
MDA-MB-361:由脑转移瘤建立。细胞表达ER、PR、EGFR和HER2/neu。
MDA-MB-435:由胸腔积液建立。细胞为ER-阴性,E-钙粘附素阴性,并且在免疫缺陷小鼠中是高度浸润和转移性的。
MDA-MB-468:由胸腔积液建立。细胞具有增加的EGFR,并且是ER-阴性。
SK-BR-3:由胸腔积液建立。细胞具有增加的HER/2neu,表达EGFR以及是ER-阴性。
T-47D:由胸腔积液建立。细胞保持表达E-钙粘附素、ER和PR。
ZR-75-1:由腹水建立。细胞表达ER、E-钙粘附素、HER2/neu和VEGF。
利用实施例9所描述的方法确定PAX2-比-DEFB表达率。
实施例13:乳腺癌细胞中的DEFB1表达
利用实施例1所描述的方法将DEFB1表达于乳腺癌细胞中。如实施例1所描述测定细胞活力和半胱天冬酶活性。
实施例14:对乳腺癌细胞中PAX2表达的抑制乳腺癌
利用实施例2所描述的siRNA抑制乳腺癌细胞中的PAX2表达。如实施例2所描述测定促凋亡基因如BAX、BID和BAD的表达水平,细胞活力和半胱天冬酶活性。
实施例15:DEFB1表达对体内肿瘤生长的影响
通过将过表达DEFB1的乳腺癌细胞注射至裸鼠来评估DEFB1的抗肿瘤能力。用携带DEFB1基因的表达载体转染乳腺癌细胞。选择并克隆表达外源DEFB1基因的细胞。仅使用活力>90%的单细胞悬浮液。每只动物接受大约500,000个细胞,经皮下给予雌性裸鼠右侧腹部。有两组,对照组用仅有载体的克隆注射,而一组用过表达DEFB1的克隆注射。由统计学家确定每组35只小鼠。动物每周称重两次,肿瘤生长由卡尺监测,而肿瘤体积利用以下公式计算确定:体积=0.5x(宽)2 x长。肿瘤大小达到2mm3或植入之后六个月时,通过过量CO2处死所有动物;将肿瘤切除、称重并保存于中性缓冲的福尔马林,用于病理检查。两组之间肿瘤生长的差异通过汇总统计表和图形显示描述表征。用t-检验或非参数等同方法评估统计学显著性。
实施例16:PAX2siRNA对体内肿瘤生长的影响
将体外研究中利用的发卡PAX2siRNA模板寡核苷酸用于检测体内DEFB1表达上调的作用。使正义和反义链(参见表3)退火并克隆入人U6RNA pol III启动子控制下的pSilencer2.1U6hygro siRNA表达载体(Ambion)。将所克隆的质粒测序、验证并转染至乳腺癌细胞系。克隆乱序shRNA并用作本研究的阴性对照。选择抗潮霉素的克隆,将细胞经皮下引入小鼠,并且如以上所描述监测肿瘤生长。
实施例17:PAX2结合的小分子抑制剂对乳腺癌细胞的影响
用lipofectamine试剂或Codebreaker转染试剂(Promega,Inc)使实施例6中所描述的可选的抑制性寡核苷酸转染入乳腺癌细胞。为了证实DNA-蛋白相互作用,用[32P]dCTP标记双链寡核苷酸,并进行电泳迁移率测定。用寡核苷酸处理之后,通过QRT-PCR和Western分析监测DEFB1表达。最后,通过如先前所描述的MTT测定和流式细胞术检测细胞死亡。
以上描述仅是为了教导本领域普通技术人员如何实施本发明,并不意欲详述本领域技术人员通过阅读说明书就能显而易见的那些明显的修改和变化。然而,其目的是所有这些明显修改和变化都包括于由以下权利要求书所限定的本发明的范围内。权利要求书意欲涵盖所要求保护的成分和可有效满足预期目的的任何顺序的步骤,除非上下文特别指明相反。
Claims (18)
1.一种组合物在制备用于治疗个体中乳腺疾病的药物中的用途,
其中所述组合物抑制PAX2表达或PAX2活性,并且
所述组合物包含选自编码PAX2siRNA的多核苷酸和阻断PAX2与DEFB1启动子结合的多核苷酸的一种或多种成分,
其中所述药物用于治疗这样的乳腺上皮内瘤变(MIN)或低级别乳腺癌,其中所述个体的乳腺组织的PAX2-比-DEFB1的表达率升高且所述乳腺组织的雌激素受体/孕酮受体状态(ER/PR)是ER+/PR+或ER+/PR-。
2.如权利要求1所述的用途,其中所述组合物包含编码siRNA的多核苷酸,所述siRNA包含选自以下的序列:SEQ ID NO:3-6和11-15。
3.如权利要求1所述的用途,其中所述阻断PAX2与DEFB1启动子结合的多核苷酸包含V-CCTTG-W序列及其互补序列,其中V和W由DEFB1启动子对应于SEQ ID NO:64的核苷酸512-585的PAX2结合位点中的1至35个连续侧翼核苷酸组成。
4.如权利要求3所述的用途,其中所述多核苷酸包含选自以下的序列:SEQ ID NO:16、18-21,25,26,28和29。
5.如权利要求1所述的用途,其中所述组合物还包含抗激素剂。
6.如权利要求5所述的用途,其中所述抗激素剂是他莫昔芬。
7.如权利要求1所述的用途,其中所述组合物还包含抗ERBB-2/抗-Her-2剂。
8.如权利要求7所述的用途,其中所述抗ERBB-2/抗-Her-2剂是曲妥珠单抗。
9.如权利要求1所述的用途,其中所述组合物还包含抗-AIB-1/SRC-3剂。
10.用于治疗个体乳腺疾病的方法的试剂盒,其包含选自编码PAX2siRNA的多核苷酸和阻断PAX2与DEFB1启动子结合的多核苷酸的一种或多种成分,以及选自抗激素剂、抗ERBB-2/抗-Her-2剂和抗-AIB-1/SRC-3剂的一种或多种化合物,其中所述乳腺疾病是乳腺上皮内瘤变(MIN)或低级别乳腺癌,其中所述方法包括:
(a)测定来自所述个体的患病乳腺组织中PAX2-比-DEFB1的表达率;
(b)测定来自所述个体的所述患病乳腺组织的ER/PR状态;以及
(c)基于(a)和(b)的结果,当所述个体的乳腺组织中PAX2-比-DEFB1的表达率升高且所述乳腺组织的雌激素受体/孕酮受体状态是ER+/PR+或ER+/PR-时,给予所述个体所述试剂盒的一种或多种成分。
11.如权利要求10所述的试剂盒,其中所述试剂盒包含编码siRNA的多核苷酸,所述siRNA包含选自以下的序列:SEQ ID NO:3-6和11-15。
12.如权利要求10所述的试剂盒,其中所述试剂盒包含多核苷酸,所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1及其互补序列。
13.如权利要求110所述的试剂盒,其中所述阻断PAX2与DEFB1启动子结合的多核苷酸包含V-CCTTG-W序列及其互补序列,其中V和W由DEFB1启动子对应于SEQ ID NO:64的核苷酸512-585的PAX2结合位点中的1至35个连续侧翼核苷酸组成。
14.如权利要求13所述的试剂盒,其中所述多核苷酸包含选自以下的序列:SEQ ID NO:16,18-21,25,26,28和29。
15.如权利要求10所述的试剂盒,其中所述试剂盒包含与抗体、受体或配体缀合以靶向所述个体肿瘤组织的抗-PAX2剂。
16.如权利要求10所述的试剂盒,其中所述抗激素剂是他莫昔芬。
17.如权利要求10所述的试剂盒,其中所述抗ERBB-2/抗-Her-2剂是曲妥珠单抗。
18.一种寡核苷酸在制备用于治疗个体乳腺上皮内瘤变(MIN)或低级别乳腺癌的药物中的用途,
其中所述寡核苷酸阻断PAX2与DEFB1启动子的结合,其中所述寡核苷酸由SEQ ID NO:16及其互补序列组成,其中所述药物用于治疗这样的乳腺上皮内瘤变(MIN)或低级别乳腺癌,其中所述个体的乳腺组织的PAX2-比-DEFB1的表达率升高且所述乳腺组织的雌激素受体/孕酮受体状态(ER/PR)是ER+/PR+或ER+/PR-。
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