CN104083352A - 对于肺部病症的治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对于肺部病症的治疗。具体而言，本发明涉及治疗个体的诸如支气管肺发育不良或缺氧诱发的肺动脉高压的肺部病症的方法和组合物，其包括向所述个体给药有效量的一氧化氮前体，如瓜氨酸。

Description

对于肺部病症的治疗
本申请是2009年2月2日提交的发明名称为“对于肺部病症的治疗”的中国专利申请200980109150.3的分案申请。
相关申请信息
本专利申请基于2008年1月31日提交的美国临时专利申请第61/025,157号，并要求其优先权，该临时专利申请的全部内容援引加入本文。
技术领域
本发明涉及肺部病症，如例如婴儿的支气管肺发育不良(BPD)和慢性缺氧诱发的肺动脉高压的治疗。
发明背景
支气管肺发育不良(BPD)通常发生在婴儿，尤其是早产儿身上，其特征为氧气和/或机械通气对肺的急性损伤，这导致了对肺泡和血管发育的干扰或抑制(Jobe等人(2001)Am J Respir Crit Care Med163:1723-1729)。在动物模型中，吸入的NO促进气体交换和肺结构发育，但是对面临BPD风险的婴儿使用这一疗法是有争议的(Ballard等人(2006)N Engl J Med355:343-353)。
患有慢性肺病和紫绀型先天性心脏病的婴儿通常患有缺氧。由于慢性缺氧对存在和发育中的肺动脉的作用，其导致肺循环功能和结构的进行性改变。Shimoda L等人,Physiol Res(2000)49:549-560；Subhedar,N.V.,ActaPaediatr suppl(2004)444:29-32。最终，慢性缺氧导致严重的肺动脉高压，其最终引发右侧心力衰竭和死亡。
因此，治疗诸如BPD和慢性缺氧诱发的肺动脉高压的肺部病症，尤其是在例如婴儿中的上述病症的方法代表了本领域中长期和持续的需求。
发明概述
本发明提供了治疗个体的诸如支气管肺发育不良(BPD)和慢性缺氧诱发的肺动脉高压的肺部病症的方法和组合物。
在某些实施方案中，向患有BPD和/或相关并发症和/或面临患有BPD和/或与BPD有关的并发症的风险的个体给药有效量的一氧化氮前体。在某些实施方案中，所述一氧化氮前体包括瓜氨酸、在体内产生瓜氨酸的前体、其药学可接受的盐及其组合中的至少一种。在某些实施方案中，将诸如瓜氨酸的一氧化氮前体口服给药。在某些实施方案中，将诸如瓜氨酸的一氧化氮前体静脉内给药。
在某些实施方案中，向患有慢性缺氧诱发的肺动脉高压和/或相关并发症和/或面临患有慢性缺氧诱发的肺动脉高压和/或与慢性缺氧诱发的肺动脉高压有关的并发症的风险的个体给药有效量的一氧化氮前体。在某些实施方案中，所述一氧化氮前体包括瓜氨酸、在体内产生瓜氨酸的前体、其药学可接受的盐及其组合中的至少一种。在某些实施方案中，将诸如瓜氨酸的一氧化氮前体口服给药。在某些实施方案中，将诸如瓜氨酸的一氧化氮前体静脉内给药。
因此，本发明旨在提供对个体的肺部病症的治疗。
当与附图和下文详细描述的实施例相联系时，会随着说明书的进行而清楚本发明的上述目的、其它目的。
附图简述
图1为尿素循环的示意图。
图2为实施例中所采用的研究步骤的流程图。
图3为表示在对照小猪(n＝6)、慢性缺氧小猪(n＝11)和用L-瓜氨酸治疗的慢性缺氧小猪(n＝6)中的平均肺动脉压的测量结果的条形图。所有值均为平均值+SEM。*与对照不同；+与慢性缺氧不同；p<0.05，事后比较检验(post-hoc comparison test)的ANOVA。
图4为表示在对照小猪(n＝6)、慢性缺氧小猪(n＝11)和用L-瓜氨酸治疗的慢性缺氧小猪(n＝6)中计算的肺血管阻力的条形图。所有值均为平均值+SEM。*与对照不同；+与慢性缺氧不同；p<0.05，事后比较检验的ANOVA。
图5为表示在对照小猪(n＝6)、慢性缺氧小猪(n＝11)和用L-瓜氨酸治疗的慢性缺氧小猪(n＝5)中呼出的一氧化氮的条形图。所有值均为平均值+SEM。*与对照不同；+与慢性缺氧不同；p<0.05，事后比较检验的ANOVA。
图6为表示在对照小猪(n＝17)、慢性缺氧小猪(n＝9)和用L-瓜氨酸治疗的慢性缺氧小猪(n＝5)的肺灌注液中的亚硝酸盐/硝酸盐积累的条形图。所有值均为平均值+SEM。*与对照不同；+与慢性缺氧不同；p<0.05，事后比较检验的ANOVA。
图7A为对照小猪(n＝3)、慢性缺氧小猪(n＝3)和用L-瓜氨酸治疗的慢性缺氧小猪(n＝3)的肺组织的肌动蛋白再探测的eNOS蛋白的免疫印迹图像。
图7B为表示对照小猪(n＝3)、慢性缺氧小猪(n＝3)和用L-瓜氨酸治疗的慢性缺氧小猪(n＝3)的肺组织的归一化为肌动蛋白的eNOS的光密度测定的条形图。
发明详述
早产是产科学和新生儿学的主要挑战，其是新生儿中大部分的围产期死亡率和长期神经病变的原因。BPD是可以与早产有关的许多并发症之一。BPD可以与早产儿住院时间延长、在生命最初的几年中多次再住院和发育迟缓有关。幸运的是，BPD目前在出生体重超过1,200g或孕期超过30周的情况下并不常见(Jobe等人(2001)Am J Respir Crit Care Med163:1723-1729)。定义为在末次月经年龄36周时的氧需求的BPD的发病率对于出生体重<1,000g的婴儿为约30％(Jobe等人(2001)Am J Respir CritCare Med163:1723-1729)。这些婴儿中的一些患有严重的肺病，需要通气和/或补充氧气达数月或者甚至数年之久。
多种因素促成了BPD，并且可能进行累加或协同作用来促成损伤。传统的观点认为，BPD主要是由氧化剂介导的损伤和通气介导的损伤引起的(Jobe等人(2001)Am J Respir Crit Care Med163:1723-1729)。机械通气和氧气可以干扰早产儿的肺泡和血管发育，并且促成了BPD的产生(Jobe等人(2001)Am J Respir Crit Care Med163:1723-1729)。肺泡数目的减少可以导致表面积的大量减少，其与异形肺微血管系统(dysmorphic pulmonarymicrovasculature)的减少有关。这些解剖学变化与呼吸道样品中白细胞和细胞因子水平的持续增加有关(Jobe等人(2001)Am J Respir Crit Care Med163:1723-1729)。
炎症也可以在BPD的产生中起到作用。多种促炎症和趋化性因子存在于通气的早产儿的气腔中，并且在随后产生BPD的婴儿的气腔中发现了更高浓度的这些因子(Jobe等人(2001)Am J Respir Crit Care Med163:1723-1729)。被认为对BPD的产生具有重要性的其它因素包括：铃蟾肽样肽、高氧、缺氧、营养不良、糖皮质激素治疗以及肿瘤坏死因子-α、TGF-α、IL-6或IL-11等细胞因子的过表达(Jobe等人(2001)Am J Respir CritCare Med163:1723-1729)。
诊断BPD通常包括在生命的初始几周内监测婴儿的呼吸，以发现肺部发育延缓以及连续和/或增加的对辅助呼吸的依赖性的征兆。为了辅助BPD的诊断而进行的诊断测试可以包括：血氧测试、胸透和超声心动图。在月经后36周时，当婴儿需要补充供氧时，通常诊断为患有BPD。在BPD的诊断和定义中所用的较新的定义包括“轻微”、“中等”和“严重”BPD的具体标准(Ryan,R.M.(2006)J Perinatology26:207–209)。
治疗BPD可以包括多方面的治疗所述病症的症状并为婴儿的肺部提供发育机会的方法。目前可用的治疗可以包括：给药表面活性剂以改善肺通气、用机械呼吸机补偿呼吸衰竭、补充供氧以确保充足的血氧、用支气管扩张药物治疗改善肺部气流、用皮质类固醇减少呼吸道的肿胀和炎症、通过流体控制以避免肺水肿、治疗动脉导管未闭和适当的营养。
通过吸入给药一氧化氮对肺部发育的改善已在动物幼仔模型中得到证实(Ballard等人(2006)N Engl J Med355:343-353)。然而，通过吸入给药NO对人类个体是有争议的。因此，根据本发明的某些实施方案，向患有BPD的个体给药瓜氨酸或其他NO前体从而增加体内的NO合成可以为BPD治疗提供NO吸入的替代选择。
由于慢性缺氧对存在和发育中的肺动脉的作用，其导致肺循环功能和结构的进行性改变。Shimoda L等人,Physiol Res(2000)；49:549-560；Subhedar,N.V.,Acta Paediatr suppl(2004)；444:29-32。最终，慢性缺氧导致严重的肺动脉高压，其最终引发右侧心力衰竭和死亡。目前用于患有与持续性或间断性缺氧有关的慢性心肺病症的婴儿的肺动脉高压的疗法主要局限于改善根本的心肺病症并试图实现充分的氧合。Abman,S.H.；Arch DisChild Fetal Neonatal Ed(2002)87:F15-F18；Allen,J.and ATS subcommitteeAoP,Am J Respir Crit Care Med(2003)168:356-396；Mupanemunda,R.H.,Early Human Development(1997)47:247-262；Subhedar,N.V.,Acta Paediatrsuppl(2004)444:29-32。因此，根据本发明的某些实施方案，提供了新的治疗方法，其包括向患有慢性缺氧诱发的肺动脉高压的个体给药瓜氨酸。
瓜氨酸是尿素循环和产生一氧化氮(NO)的关键中间体。在尿素循环中，瓜氨酸是从头合成精氨酸的前体。可以通过精氨酸酶使精氨酸脱氨以产生尿素，其随后可以被排泄以清除身体的废氮，特别是氨。或者，精氨酸可以通过一氧化氮合酶产生NO。就这点而论，完整的尿素循环功能不仅对氨的排泄是重要的，而且对维持充分的精氨酸(NO前体)组织水平也是重要的。
一氧化氮是利用精氨酸作为底物通过一氧化氮合酶合成的。NO合成的限速因素是细胞精氨酸的利用率，并且用于NO合成的精氨酸的优选来源是从瓜氨酸从头合成。精氨酸的体内合成途径以鸟氨酸开始。鸟氨酸与氨甲酰磷酸结合产生瓜氨酸，其又在三磷酸腺苷的存在下与天冬氨酸结合产生精氨琥珀酸。在最终步骤中，延胡索酸从精氨琥珀酸断开产生精氨酸。精氨酸的降解途径是通过精氨酸酶的水解作用产生鸟氨酸和尿素。这些反应形成了尿素循环。还参见图1。
作为用于尿素合成的降解的替代选择，精氨酸可以通过一氧化氮合酶提供合成NO所需的底物。另外，外源瓜氨酸可以进入尿素循环并提供精氨酸的体内合成，其随后可以提供NO合成。因此，向个体给药瓜氨酸可以增加精氨酸合成，并且随后增加NO产生，从而预防和/或治疗BPD或慢性缺氧诱发的肺动脉高压，所述个体包括但不限于对BPD或慢性缺氧诱发的肺动脉高压敏感或者诊断为患有BPD或慢性缺氧诱发的肺动脉高压的个体。还可以提供在体内产生瓜氨酸的瓜氨酸前体。作为对瓜氨酸的替代选择，可以提供其它NO前体。例如，可以提供作为NO前体的精氨酸或在体内产生精氨酸的前体。
I.治疗方法
本发明提供了增加个体中的NO合成的方法和组合物。在某些实施方案中，向个体给药有效量的瓜氨酸或其它NO前体以增加NO合成。在某些实施方案中，所述NO前体选自包括但不限于瓜氨酸、在体内产生瓜氨酸的前体、精氨酸、在体内产生精氨酸的前体或其组合的组。在某些实施方案中，将瓜氨酸或其它NO前体口服给药。在某些实施方案中，将瓜氨酸或其它NO前体静脉内给药。
本发明还提供了治疗个体的BPD和/或相关并发症的方法和组合物。在某些实施方案中，向患有BPD和/或相关并发症和/或面临患有与BPD有关的并发症的风险的个体给药有效量的瓜氨酸或其它NO前体。在某些实施方案中，所述NO前体选自包括但不限于瓜氨酸、在体内产生瓜氨酸的前体、精氨酸、在体内产生精氨酸的前体或其组合的组。在某些实施方案中，将瓜氨酸或其它NO前体口服给药。在某些实施方案中，将瓜氨酸或其它NO前体静脉内给药。在某些实施方案中，待治疗个体为患有与BPD有关的急性病症的个体。上文中公开了这些病症的代表性实例。
本发明还提供了治疗个体的慢性缺氧诱发的肺动脉高压和/或相关并发症的方法和组合物。在某些实施方案中，向患有慢性缺氧诱发的肺动脉高压和/或相关并发症和/或面临患有与慢性缺氧诱发的肺动脉高压有关的并发症的风险的个体给药有效量的瓜氨酸或其它NO前体。在某些实施方案中，所述NO前体选自包括但不限于瓜氨酸、在体内产生瓜氨酸的前体、精氨酸、在体内产生精氨酸的前体或其组合的组。在某些实施方案中，将瓜氨酸或其它NO前体口服给药。在某些实施方案中，将瓜氨酸或其它NO前体静脉内给药。在某些实施方案中，待治疗个体为患有与慢性缺氧诱发的肺动脉高压有关的急性病症的个体。上文中公开了这些这样的病症的代表性实例。
在某些实施方案中，所述一氧化氮前体包括瓜氨酸、在体内产生瓜氨酸的前体、其药学可接受的盐及其组合的至少一种。参见图1。在某些实施方案中，所述一氧化氮前体选自包括但不限于瓜氨酸、精氨酸或其组合的组。在某些实施方案中，将诸如瓜氨酸的一氧化氮前体口服给药。在某些实施方案中，将诸如瓜氨酸的一氧化氮前体静脉内给药。
在某些实施方案中，所述个体患有低瓜氨酸血症。在某些实施方案中，所述低瓜氨酸血症的特征在于血浆瓜氨酸水平为≤37μmol/升，在某些实施方案中为≤25μmol/升，在某些实施方案中为≤20μmol/升，在某些实施方案中为≤10μmol/升，在某些实施方案中为≤5μmol/升。
在某些实施方案中，患有本文公开的病症的个体还患有相对低瓜氨酸血症(relative hypocitrullinemia)。术语“相对低瓜氨酸血症”指这样的状态，其中与未患有病症的个体相比，患有病症的个体具有降低的血浆瓜氨酸。
本文所用的短语“治疗”是指为改善个体的病症(例如，疾病过程开始后或者在损伤后)、为改善个体的与病症有关的并发症而设计的干预措施，以及为预防个体的病症发生而设计的干预措施。换言之，术语“治疗”及其语法变体旨在被广义地解释为涵盖意指减少病症的严重性和/或治愈病症的含义，以及意指预防的含义。在后一方面，“治疗”可以指在例如但不限于面临罹患病症的风险的个体中“预防”至任何程度；或者以其它方式增强个体抵抗病症过程的能力。
在本发明的许多实施方案中治疗的个体期望地为人类个体，但是应当理解本发明的原理表明本发明对于包括诸如哺乳动物和鸟类的温血脊椎动物在内所有脊椎动物物种是有效的，其意图被包括在术语“个体”中。在本文的语境中，哺乳动物被理解为包括期望治疗的任何哺乳动物物种，例如但不限于农业哺乳动物物种和饲养哺乳动物物种。
因此，本发明提供了对诸如人的哺乳动物的治疗，以及对以下哺乳动物的治疗，其由于濒临绝种而对人类具有重要性(例如西伯利亚虎)、对人类具有经济重要性(为人类食用而在农场饲养的动物)和/或对人类具有社会重要性(作为宠物或在动物园中饲养)，例如除人以外的食肉动物(如猫和狗)、猪(swine)(小猪(pig)、肉猪(hog)和野猪)、反刍动物(例如牛(cattle)、阉牛(oxen)、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛和骆驼)和马。本发明还提供了对鸟类的治疗，包括对濒临灭绝的鸟、饲养在动物园中的鸟，以及家禽(fowl)，更特别的是驯养家禽，即诸如火鸡、鸡、鸭、鹅、珍珠鸡等家禽(poultry)的治疗，因为它们也对人类具有经济重要性。因此，本发明提供了对家畜的治疗，所述家畜包括但不限于家猪(小猪和肉猪)、反刍动物、马、家禽等。II.药物组合物
将有效剂量的本发明的组合物向有此需要的个体给药。“有效量”是足以产生可测量的反应(例如正在接受治疗的个体中的生物或临床相关的反应)的组合物的量。可以改变本发明的组合物中的活性成分的实际剂量水平，从而以有效实现特定个体的期望治疗反应的量将活性化合物给药。所选的剂量水平取决于治疗组合物的活性、给药途径、与其它药物或疗法的组合、被治疗的病症的严重性以及被治疗的个体的病症和既往医疗史。以示例而非限制的方式，组合物的剂量可以以低于实现期望疗效所需的水平开始，并且逐渐地增加剂量直至实现期望的效果。组合物的效力可以变化，因此“有效量”可以变化。
阅读了本文所提供的本发明的公开内容之后，考虑到具体制剂、用所述组合物实施的给药方法以及治疗的具体疾病，本领域技术人员可以为单独的个体制定剂量。剂量的进一步计算可以考虑个体的身高和体重、性别、症状的严重性和阶段，以及其它有害身体病症的存在。
以其它实例的方式，可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量取决于待治疗个体和具体给药方式而变化。例如，意图向人类给药的制剂可以含有与合适且方便的量的载体材料混合的0.5mg至5g的活性剂，所述载体材料可以为全部组合物的约5％至约95％不等。例如，在成人中，每人每次给药的剂量通常为1mg至500mg，并且每天多达数次。因此，单位剂型通常含有约1mg至约500mg的活性成分，通常为25mg、50mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、800mg或1000mg的活性成分。
在某些实施方案中，以约0.01mg至约1,000mg的剂量将一氧化氮前体给药，在某些实施方案中，剂量为约0.5mg至约500mg，并且在某些实施方案中，剂量为约1.0mg至约250mg。在某些实施方案中，还可以以约100mg至约30,000mg的剂量将一氧化氮前体给药，并且在某些实施方案中，剂量为约250mg至约1,000mg。代表性剂量为3.8g/m2/天的精氨酸或瓜氨酸(摩尔当量，MW L-瓜氨酸175.2，MW L-精氨酸174.2)。
代表性的静脉内瓜氨酸溶液可以包括100mg/ml(10％)的溶液。代表性的静脉内瓜氨酸剂量可以包括200mg/kg、400mg/kg、600mg/kg和800mg/kg。在某些实施方案中，所述剂量例如但不限于600mg/kg或800mg/kg，可以将所述剂量减少50mg/kg至100mg/kg的量以缓和所观察到的对全身血压的不期望作用。在某些实施方案中，在诸如1天的给定时间内，可以给药一次或多次的剂量。
在某些实施方案中，药物组合物包含有效地升高血浆瓜氨酸水平以治疗个体的本文公开的病症的量的瓜氨酸。在某些实施方案中，所述水平是通过将待治疗个体的血浆瓜氨酸水平与在未患有所述病症的个体中所观察到的血浆瓜氨酸水平进行比较而测定的。在某些实施方案中，瓜氨酸的量将个体的血浆瓜氨酸水平有效升高到至少5μmol/升，任选至少10μmol/升，任选至少20μmol/升，任选至少25μmol/升，以及任选约37μmol/升。
在某些实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含一氧化氮前体和药学可接受的载体，如在人类中药学可接受的载体。在某些实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含上述剂量的瓜氨酸或精氨酸。
通常以单位剂量制剂(dosage unit formulation)将本发明的组合物口服或胃肠外给药，所述制剂视需要含有标准无毒的药学可接受的载体、佐剂和媒介物(vehicle)。本文所用的术语“胃肠外”包括静脉内、肌肉内、动脉内注射或输注技术。
根据已知技术，利用合适的分散剂或润湿剂及助悬剂配制诸如无菌注射水性或油性悬浮液的注射制剂。所述无菌注射制剂还可以为在无毒可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如，1,3-丁二醇中的溶液。
可用的可接受的媒介物和溶剂中包括水、林格溶液(Ringer’s solution)和等渗氯化钠溶液。另外，通常将无菌非挥发油用作溶剂或悬浮介质。为了该目的，可以使用包括合成甘油单酯或甘油二酯在内的任何温和的非挥发油。此外，诸如油酸的脂肪酸可用于注射剂的制备。示例性载体包括用磷酸盐、乳酸盐、Tris等缓冲的中性盐溶液。
在代表性实施方案中，可以在相关治疗期间向个体给药若干次的剂量，其包括但不限于1、2、3、4、5、6或更多次的剂量。
然而，应当理解，对于任何特定个体的具体剂量水平取决于多种因素，其包括年龄、体重、一般健康、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄速率、药物组合以及在治疗的特定疾病的严重性。
实施例
本发明包括以下实施例以示例本发明的代表性方式。根据本公开内容和本领域的一般技术水平，本领域技术人员应当理解，由于可以在不偏离本发明的精神和范围的情况下采用多种变化、修改和改变，以下实施例仅仅旨在示例。
实施例1-4
下列实施例评价在将新生小猪暴露于10天的慢性缺氧期间，口服补充L-瓜氨酸是否会预防肺动脉高压的产生和NO产生的随之减少。
实施例1-4所用的方法
动物护理
将总共17只缺氧小猪和17只对照小猪进行研究。参见图2。在从农场抵达的当天研究12天大的对照动物。将缺氧的猪(2天大)置于常压的缺氧室中达10天至11天。利用压缩空气和氮气提供常压缺氧以产生8-11％的吸入氧气(PO260-72Torr)，并且通过用碱石灰的吸收来将CO2保持在3-6Torr。监测动物的每日体重并且每日体检两次。用笼中饲喂装置的猪乳替代物随意地饲养它们。
L-瓜氨酸补充
将17只缺氧小猪中的6只在缺氧暴露的第一天开始口服补充L-瓜氨酸。参见图2。以0.13-gm/千克体重的剂量，利用注射器每日口服递送两次来提供L-瓜氨酸补充。如果研究人员觉得小猪没有摄入大部分的剂量，则重复该步骤。利用0.13克每升蒸馏水的浓度的制剂(Sigma Pharmaceuticals,St.Louis,Missouri,United States of America,纯度98％)来混合L-瓜氨酸，并且当完全溶解时，将该溶液通过0.20微米过滤器。
体内血流动力学
在对照小猪中的6只和全部缺氧小猪中测量体内血流动力学。参见图2。对于这些测量，将这些动物称重，然后用氯胺酮(15mg/kg)和乙酰丙嗪(2mg/kg)进行肌肉内预麻醉。然后利用用于镇静的静脉内戊巴比妥，如以前所描述进行气管造口术，置入静脉和动脉导管以及热敏电阻。Fike,C.D.等人,J Appl Physiol(2000)88:1797-1803。测量肺动脉压、左心室舒张末期压以及心输出量。通过热稀释技术(9520型热稀释法心输出量计算机，Edwards Laboratory,Irvine,California,United States of America)，利用主动脉弓中的热敏电阻以及作为注入孔的左心室导管来测量心输出量。在呼气末将心输出量测量为3ml普通盐水(0℃)的3次注射的平均值。如下所述测量呼出的NO。在体内测量期间，利用活塞型通气机以15-20cc/kg的潮气量、2mmHg的终末呼气压以及每分钟15-20次呼吸的呼吸速率，用室内空气将动物通气。
呼出的一氧化氮测量
对于被麻醉的动物中的呼出NO测量，如前所述，每3分钟时间段将呼出气体取样2至3次，并通过化学发光分析仪(270B型NOA；Sievers,Boulder,Colorado,United States of America)来测量NO浓度。Fike,C.D.等人,American Journal of Physiology(Lung,Cellular and Molecular Physiology18)(1998)274:L517-L526。利用每分钟通气量和所测量的呼出的NO浓度来计算呼出的NO产量(nmol/min)。
分离的肺灌注物
在37℃下，将肺分离，并用含有mol.wt.为70,000的5％葡聚糖的克雷布-林格碳酸氢盐(Krebs Ringer bicarbonate，KRB)溶液进行原位灌注，并且如前所述地用常氧气体混合物(21％O2和5％CO2)进行通气。Fike,C.D.等人,J Appl Physiol(2000)88:1797-1803。将肺灌注30-60min直至达到稳定的肺动脉压。然后在60分钟的时间段内，每10min从左心房插管中除去灌注液样品(1ml)。将灌注液样品离心，并且将上清液贮存在-80℃下以用于下述以后的亚硝酸盐/硝酸盐(NOx–)浓度分析。在灌注末尾，测量保留在回路和储气泡中的灌注液体积。在某些情况下，在灌注后立即收集肺组织，将其用液氮冷冻，然后贮存于-80度下以用于下述以后的eNOS含量测量。NOX –测量
在每次收集时间，使用前述化学发光分析来测定灌注液NOx–浓度(nmol/ml)。Fike,C.D.等人,J Appl Physiol(2000)88:1797-1803；Turley,J.E.等人,Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol(2003)284:L489-L500。将灌注液(20μl)注入化学发光NO分析仪(170B型NOA,Sievers)的反应室中。该反应室含有在1M HCl中的氯化钒(III)，其被加热到90℃以将亚硝酸盐和硝酸盐还原为NO气体。利用恒定的N2气流，通过含有用于除去HCl蒸汽的1M NaOH的除泡器(gas bubble trap)将NO气体带入分析仪中。通过向蒸馏水中添加已知量的NaNO3，并且如所述地测定灌注样品来生成标准曲线。
通过以下方法计算每次收集时间的灌注液NOx–浓度(nmol/ml)：将样品收集时间时的灌注液NOx–浓度乘以样品收集时间时的体系体积(灌注回路+储藏)，加上所有以前样品除去的NOx–的量。从与灌注液中NOx–的量比收集时间段的最初60分钟的时间拟合的线性回归线的斜率来测定NOx–的产生速率。
血浆氨基酸测量
在血流动力学测量和/或肺灌注研究的当天，对于对照动物与用L-瓜氨酸治疗和未治疗的慢性缺氧动物，在开始研究之前抽取血液，并将血浆在-80度下冷冻以用于以后的氨基酸水平测定。对于用L-瓜氨酸治疗的缺氧动物，获得血液样品的时间为L-瓜氨酸的最后给药后约12小时，因此其为低谷水平。在某些用L-瓜氨酸治疗的动物(n＝3)中，对低谷水平血液取样后，通过经鼻胃管给予一次剂量的L-瓜氨酸。在该次给药之后，在90分钟(体内研究的时间长度)的每30分钟抽取血液样品。将全部样品离心，收集血浆并在-80度下冷冻以用于氨基酸分析。
通过无蛋白提取物的氨基酸分析来测定血浆瓜氨酸和精氨酸的浓度。利用Hitachi L8800氨基酸分析仪(Hitachi USA,San Jose,California,UnitedStates of America)，通过阳离子交换色谱来分离氨基酸。在测试小猪样品前进行分析仪的校准。
肺组织中ENOS的蛋白质印迹
利用前述标准免疫印迹技术，我们分析了来自对照动物(n＝3)、未治疗的缺氧动物(n＝3)以及用L-瓜氨酸治疗的缺氧动物(n＝3)的全肺匀浆样品的eNOS。我们使用了10微克总蛋白、1:500的第一eNOS抗体稀释液(BD转导)和1:5000的与辣根过氧化物酶结合的第二抗小鼠抗体稀释液。Fike,C.D.等人,American Journal of Physiology(Lung,Cellular and MolecularPhysiology18)(1998)274:L517-L526。
计算和统计学
从体内血流动力学测量计算肺血管阻力：(肺动脉压–左心室舒张末期压)÷(心输出量/体重)。
将数据表示为平均值+SE。使用具有Fisher保护的最小显著差异(Fisher’s protected least significant difference)(PLSD)的单向ANOVA事后比较测试来比较对照动物、未治疗的缺氧动物和用L-瓜氨酸治疗的缺氧动物之间的数据。将小于0.05的p值视为显著。Meier,U.,Pharm Stat(2006)5:253-263。
实施例1
体内血流动力学测量
在12-13天大的动物的研究当天，与年龄相当的对照小猪相比，用L-瓜氨酸治疗的缺氧动物和未治疗的缺氧动物均具有较低的心输出量和重量以及较高的LVEDP测量值(表1)。组群中的主动脉压和血气指数的测量值类似(对照小猪中的paO2为74+5Torr，未治疗的缺氧小猪中的paO2为74+8Torr，用L-瓜氨酸治疗的缺氧小猪中的paO2为78+7Torr；对照小猪中的paCO2为39+2，未治疗的缺氧小猪中的paCO2为41+4，用L-瓜氨酸治疗的缺氧小猪中的paCO2为30+1.0)。明显地，如图3所示，与未治疗的缺氧动物相比，用L-瓜氨酸治疗的缺氧动物具有明显较低的肺动脉压(p值为0.01)。在常氧对照动物和用L-瓜氨酸治疗的缺氧动物之间的肺动脉压并无不同(p＝0.08)。
另外，如图4所示，在用L-瓜氨酸治疗的这些缺氧动物中计算的肺血管阻力(0.071±0.003)明显低于未治疗的缺氧动物的肺血管阻力(p值为0.001)。而且，用L-瓜氨酸治疗的缺氧动物与常氧对照动物的肺血管阻力类似(p值为0.07)。
实施例2
呼出的NO输出量和灌注液NOX –
如图5所示，对照动物与用L-瓜氨酸治疗的缺氧动物中的呼出的NO输出量高于未治疗的缺氧动物中的呼出的NO输出量(p值分别为0.001和0.032)。然而，对照动物与用L-瓜氨酸治疗的缺氧动物之间呼出的NO输出量并无差别(p＝0.124)。
如图6所示，与未治疗的缺氧动物的肺相比，对照动物(p＝0.02)和用L-瓜氨酸治疗的缺氧动物(p＝0.04)的肺具有明显更高的NOx–积累速率。而且，用L-瓜氨酸治疗的缺氧动物的肺与常氧对照动物的肺的NOx–积累速率并无差别。
实施例3
血浆氨基酸
如表2所示，尽管没有达到统计显著性(p＝0.05)，但是未治疗的缺氧小猪中的血浆L-瓜氨酸水平低于治疗过的缺氧小猪中的低谷L-瓜氨酸水平。而且，当在给药后90分钟抽取时，治疗过的缺氧动物的L-瓜氨酸水平几乎是未治疗的缺氧动物的2倍(p＝0.001)。然而，不管抽取样品的时间如何，当与未治疗的缺氧动物相比，用L-瓜氨酸治疗的慢性缺氧动物中的血浆精氨酸水平不会更高。
实施例4
肺ENOS蛋白的蛋白质印迹
如图7A和7B所示，存在于对照动物的肺组织中的eNOS蛋白的量明显高于存在于未治疗的缺氧动物的肺中的eNOS蛋白的量。而且，存在于用L-瓜氨酸治疗的缺氧小猪的肺组织中的eNOS蛋白的量与未治疗的缺氧动物的肺组织中的eNOS蛋白的量没有明显差异，并且明显低于对照动物中的eNOS蛋白水平。
表1对照小猪、慢性缺氧小猪和用L-瓜氨酸治疗的慢性缺氧小猪的数据
N＝动物数目，值为平均值±SEM，*p<0.05比对照，事后比较检验的ANOVA
表2对照小猪、慢性缺氧小猪和用L-瓜氨酸治疗的慢性缺氧小猪的血浆氨基酸水平
治疗组 瓜氨酸 精氨酸
对照动物N＝10 71±6 112±16
慢性缺氧动物N＝8 111±23 51±10*
用L-瓜氨酸治疗的缺氧动物：低谷N＝6 161±5* 39±10*
用L-瓜氨酸治疗的缺氧动物：90min.N＝3 219±36*？ 43±5*
N＝动物数目，值为平均值±SEM，*p<0.05比对照，p<0.05比未治
疗的慢性缺氧动物，事后比较检验的ANOVA，给药L-瓜氨酸后约12小时的瓜氨酸低谷血浆水平，给药L-瓜氨酸后90分钟的瓜氨酸90min血浆水平。
实施例讨论
在实施例1-4中发现，L-瓜氨酸补充改善了暴露于慢性缺氧10天的新生小猪中肺动脉高压的产生。该研究中的其它发现是，用L-瓜氨酸治疗的缺氧小猪的呼出的NO产生和肺血管NOx–积累速率均大于未治疗的缺氧小猪。因此，这些发现表明，L-瓜氨酸补充明显地增加了肺NO产生。治疗过的缺氧动物中的eNOS蛋白的量没有增加。
尽管不期望为任何具体操作理论所束缚，但是L-瓜氨酸介导NO产生的增加被认为是通过增加可用作eNOS底物的L-精氨酸的量的机制。在本发明的实施例中，用L-瓜氨酸治疗的动物的精氨酸的血浆水平与未治疗的缺氧动物相比没有明显增加。在本发明的实施例中，存在被称作“精氨酸悖论(arginine paradox)”的细胞内精氨酸与NO产生之间的不一致似乎是由于在补充L-瓜氨酸时所观察到的血浆精氨酸水平不变的情况下，NO产生的增加。L-瓜氨酸是尿素循环中间体，其通过两种酶，即精氨琥珀酸合酶(AS)与精氨琥珀酸裂合酶(AL)的再循环途径被代谢为精氨酸。据发现这两种酶，即AS与AL与eNOS共同位于肺内皮细胞。Boger,R.H.,Curr OpinClin Nutr and Met Care(2008)11:55-61。据认为这些酶共同产生专门用于NO合成的精氨酸的单独亚细胞库(subcellular pool)。组织与血浆精氨酸水平不能精确地测量该亚细胞库。
L-瓜氨酸还可以通过其它机制改进NO产生和eNOS功能。此外，尽管不期望为任何具体操作理论所束缚，但是本发明的实施例中L-瓜氨酸的另一潜在作用是通过保持eNOS的底物精氨酸的充足水平来防止eNOS的解偶联。
此外，尽管不期望为任何具体操作理论所束缚，但是L-瓜氨酸还可能通过补偿增加的NO降解来影响NO的生物利用度。在暴露于慢性缺氧期间，可能从除了eNOS以外的酶来源，如NADPH氧化酶，来增加超氧化物的产生。Liu等人,Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol(2006)290:L2-L10。这种过量的超氧化物产生可能直接与NO相互作用以减少其局部产生。在这种情况下，提供L-瓜氨酸可能使得NO产生能够足以补偿超氧化物介导的还原。
总之，本发明的实施例表明，L-瓜氨酸改善了新生小猪的慢性缺氧诱发的肺动脉高压。本发明还提供了瓜氨酸的有效性归因于增加的NO产生的证据。因此，L-瓜氨酸是面临产生由慢性或间歇性未吸收缺氧(unresolvedhypoxia)所导致的肺动脉高压风险的新生儿的有用疗法。
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美国专利第6,743,823号。
应当理解，可以在不偏离本发明的范围的情况下对本发明的各种细节做出改变。而且，前述说明仅用于示例的目的，而并非用于限制的目的。

Claims (19)

1.治疗支气管肺发育不良的方法，所述方法包括向有此需要的个体给药有效量的一氧化氮前体。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述一氧化氮前体选自瓜氨酸、在体内产生瓜氨酸的前体、精氨酸、在体内产生精氨酸的前体及其组合。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述给药包括口服给药、静脉内给药及其组合。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述个体为婴儿。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述婴儿为早产儿。
6.如权利要求1所述的方法，其中将所述一氧化氮前体以约100mg至约30,000mg的剂量给药。
7.如权利要求6所述的方法，其中将所述一氧化氮前体以约250mg至约1,000mg的剂量给药。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述个体患有低瓜氨酸血症，其特征在于血浆瓜氨酸水平为≤37μmol/升。
9.治疗慢性缺氧诱发的肺动脉高压的方法，所述方法包括向有此需要的个体给药有效量的一氧化氮前体。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述一氧化氮前体选自瓜氨酸、在体内产生瓜氨酸的前体、精氨酸、在体内产生精氨酸的前体及其组合。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述给药包括口服给药、静脉内给药及其组合。
12.如权利要求9所述的方法，其中所述个体为婴儿。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述婴儿为早产儿。
14.如权利要求9所述的方法，其中将所述一氧化氮前体以约100mg至约30,000mg的剂量给药。
15.如权利要求14所述的方法，其中将所述一氧化氮前体以约250mg至约1,000mg的剂量给药。
16.如权利要求9所述的方法，其中所述个体患有低瓜氨酸血症，其特征在于血浆瓜氨酸水平为≤37μmol/升。
17.药物组合物，其包含药学可接受的载体以及有效升高血浆瓜氨酸水平以治疗个体的支气管肺发育不良或缺氧诱发的肺动脉高压的量的瓜氨酸，其中所述水平是通过将待治疗个体的血浆瓜氨酸水平与在未患有支气管肺发育不良或缺氧诱发的肺动脉高压的个体中所观察到的血浆瓜氨酸水平进行比较而测定的。
18.如权利要求17所述的药物组合物，其中瓜氨酸的量将个体的血浆瓜氨酸水平有效升高到至少5μmol/升，任选至少10μmol/升，任选至少20μmol/升，任选至少25μmol/升，以及任选约37μmol/升。
19.如权利要求17所述的药物组合物，其中所述药物组合物适合于静脉内或口服给药。
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