CN104072582A

CN104072582A - 新型肽

Info

Publication number: CN104072582A
Application number: CN201410120069.8A
Authority: CN
Inventors: 熊泽益德; 池山芳史; 黑濑沙予; 中田温子; 本多裕之; 加藤竜司
Original assignee: SAATSU PHARMECEUTICAL Manufacturing Co Ltd
Current assignee: SAATSU PHARMECEUTICAL Manufacturing Co Ltd; Rohto Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2013-03-27
Filing date: 2014-03-27
Publication date: 2014-10-01
Anticipated expiration: 2034-03-27
Also published as: CN104072582B

Abstract

本发明涉及新型肽。本发明的目的在于提供一种具有在生物体内促进整联蛋白或胶原蛋白等的表达的效果的新型物质。所述新型物质为一种由下述的式(I)：Gly-Arg-Ile-Arg-Val-Leu(SEQ ID NO：1)所示的氨基酸序列构成的肽、或由在上述式(I)所示的氨基酸序列中具有1或多个氨基酸的添加、缺失和/或保守性置换的氨基酸序列构成的肽或者该肽的衍生物、或它们的盐。

Description

新型肽

技术领域

本发明的目的在于提供一种具有促进生物体内的整联蛋白或胶原蛋白等的表达的效果的新型物质。而且，本发明还涉及一种利用经由整联蛋白等细胞粘附因子的细胞粘附来提高生长因子或激素等功能肽的活性的方法等。

背景技术

在生物体的组织内，细胞和细胞外基质通过粘附而相互作用并在细胞内部传递信号，诱导或抑制基因或蛋白质等的各种因子，由此进行细胞的分化或增殖等的细胞质的控制及代谢产物的分泌等。另外，胶原蛋白等细胞外基质自身也通过与细胞粘附而使胶原蛋白纤维束的格子状的立体结构增强、稳定化，保持肌肤的张力及弹性。因此，根据紫外线等外部因子及年龄增加等原因，细胞和细胞外基质之间的粘附变弱时，不仅对细胞的信号传递没有成功且细胞的作用(各种因子的产生等)变弱，而且由基质结构的变化引起肌肤的张力及弹力的降低，招致皱纹及松弛等皮肤的老化症状等。而且，已知构成作为在皮肤组织中存在于表皮和真皮之间的细胞外基质的基膜的主要蛋白质的层粘连蛋白与位于细胞表面的整联蛋白相互作用，参与细胞粘附。而且，通过这种层粘连蛋白和整联蛋白之间的结合，基膜和细胞牢固地粘附，由此，作为基膜的重要作用的从真皮向表皮的营养因子及增殖因子的移动变得平滑(スムーズ)，能够关联到维持健康的皮肤状态。因此，基膜和细胞之间的粘附能力变弱时，皮肤整体的健康状态变得不良，有可能招致表皮的薄化等，此外，阻碍经由基膜的各种因子的移动招致代谢不良，与此同时也容易引起斑点(黑色素的蓄积)或暗淡等。因此，提高使细胞和细胞外基质粘附的因子的作用是非常重要的。

作为细胞和细胞外基质之间的粘附因子，存在于细胞膜上的整联蛋白是众所周知的。另外，在细胞外基质中参与和整联蛋白的粘附的纤连蛋白及层粘连蛋白等因子也广义地被称为细胞粘附因子。因此，得到使这些因子的表达量增加的物质是有用的。

但是，在使生长因子及激素、拮抗剂、激动剂之类的对于细胞具有生理活性的功能性因子对生物体起作用的情况下，认为细胞粘附促进因子的利用是有益的。即，通过同时使用意图作用于细胞的功能肽和细胞粘附促进因子，该功能性因子与细胞相互作用的概率提高，可以期待发挥高的效果。

从如上所述的观点出发，一直希望探索可以促进细胞粘附因子的表达并促进对细胞的粘附的物质。

迄今为止，作为促进细胞和胶原蛋白之间的粘附的物质，已知具有特定序列的肽(专利文献1、2)。另外，也提出了含有来自作为功能肽的TGF-β的特定氨基酸序列和细胞附着氨基酸序列的TGFP-CAP肽(专利文献3)。但是，一直在希望开发提高细胞粘附因子的表达量并能够促进对细胞的粘附的更有用的新型物质。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：美国专利申请公开第2004/0141939号说明书

专利文献2：国际公开第2012/144546号小册子

专利文献3：国际公开第2008/130082号小册子

发明内容

发明所要解决的课题

本发明是鉴于上述现有技术而完成的发明，其目的在于，提供一种可以使整联蛋白等细胞粘附因子的表达量增加、另外对促进胶原蛋白等的产生也有用的新型物质。

用于解决课题的方法

本发明人等为了解决上述课题而进行了潜心研究，结果发现，具有特定的氨基酸序列的短链肽可以使整联蛋白、纤连蛋白或层粘连蛋白之类的细胞粘附因子，及胶原蛋白、弹性蛋白微原纤维界面因子(EMILIN)、透明质酸合酶(hyaluronan synthase)、弹性蛋白、TIMP金属肽酶抑制剂之类的细胞外基质中存在的成分或参与其形成的成分的表达量增加，此外，通过使用该肽，实际上也能够发挥促进胶原蛋白、整联蛋白和/或纤连蛋白产生的活性。而且，本发明人等重复进行研究，结果发现：通过将该肽作为与对细胞起作用的功能肽融合的融合肽，可以用于容易发挥该功能肽对细胞的作用，直至完成了本发明。

即，本发明提供以下发明。

[1]一种由下述的式(I)：

Gly-Arg-Ile-Arg-Val-Leu(SEQ ID NO：1)

所示的氨基酸序列构成的肽、或由在上述式(I)所示的氨基酸序列中具有1或多个氨基酸的添加、缺失和/或保守性置换的氨基酸序列构成的肽或者该肽的衍生物、或它们的盐。

[2]如[1]的肽或者该肽的衍生物、或它们的盐，为Gly-Arg-Ile-Arg-Val-Leu(SEQ ID NO：1)、Gly-Arg-Ile-Arg-Val(SEQ ID NO：4)、Arg-Ile-Arg-Val-Leu(SEQ ID NO：5)、Gly-Arg-Ile-Arg(SEQ ID NO：6)、Gln-Tyr-Gly-Arg-Ile-Arg(SEQ ID NO：8)、Tyr-Gly-Arg-Ile-Arg-Val(SEQ IDNO：9)、Arg-Ile-Arg-Val-Leu-Gln(SEQ ID NO：10)、Ile-Arg-Val-Leu-Gln-Arg(SEQ ID NO：7)、Arg-Val-Leu-Gln-Arg-Phe(SEQ IDNO：11)、Tyr-Gly-Arg-Ile-Arg-Val-Leu(SEQ ID NO：3)、或Gly-Arg-Ile-Arg-Val-Leu-Gln(SEQ ID NO：2)。

[3]如[1]或[2]所述的肽或者该肽的衍生物、或它们的盐，具有4～8残基的氨基酸长度。

[4]一种组合物，所述组合物含有[1]～[3]中任一种肽或者该肽的衍生物、或它们的盐。

[5]如[4]的组合物，所述组合物用于美容。

[6]如[4]或[5]的组合物，所述组合物用于改善或预防皮肤的皱纹、松弛、张力降低、弹性降低、代谢不良、斑点、暗淡或表皮薄化。

[7]如[4]～[6]中任一种组合物，所述组合物用于使肌肤紧致。

[8]如[4]～[7]中任一种组合物，所述组合物用于促进选自由胶原蛋白、整联蛋白及纤连蛋白构成的组中的至少1种的产生。

[9]如[4]～[8]中任一种组合物，所述组合物使编码细胞粘附因子、细胞外基质中的蛋白质或参与细胞外基质中的蛋白质形成的蛋白质的基因的表达增加。

[10]一种融合肽或者该融合肽的衍生物、或它们的盐，由对细胞起作用的功能肽和[1]～[3]中任一种肽融合而成。

[11]如[10]的融合肽或者该融合肽的衍生物、或它们的盐，其中，功能肽选自由生长因子、激素、拮抗剂、激动剂及它们的部分构成的组中的1种以上。

[12]如[10]或[11]的融合肽或者该融合肽的衍生物、或它们的盐，其中，功能肽为来自转化生长因子(TGF)的片段肽或来自促黑素细胞激素(MSH)的片段肽。

[13]如[10]～[12]中任一种融合肽或者该融合肽的衍生物、或它们的盐，其中，功能肽和[1]～[3]中任一种肽通过接头融合。

[14]如[10]～[13]中任一项所述的融合肽或者该融合肽的衍生物、或它们的盐，其中，[1]～[3]中任一种肽与细胞粘附。

[15]一种组合物，所述组合物含有[10]～[14]中任一种融合肽或该融合肽的衍生物、或它们的盐。

本发明的肽或者其衍生物、或它们的盐具有使整联蛋白等细胞粘附因子及胶原蛋白等细胞外基质中的成分或参与其形成的成分的表达量增加的活性。因此，根据本发明，提供一种能够促进细胞和细胞外基质之间的粘附、另外促进胶原蛋白、整联蛋白和/或纤连蛋白的产生的新型物质。通过利用该新型物质，促进细胞和细胞外基质之间的粘附，进而可以对于有效地改善皮肤的皱纹及松弛、张力降低、弹性降低、代谢不良及与其相伴的斑点、暗淡、表皮薄化等，使肌肤紧致等有益，可以制备对美容有用的组合物。

而且，通过利用提高细胞粘附效果的上述新型物质，能够提高对细胞起作用的功能肽(例如生长因子、激素、拮抗剂、激动剂)对细胞的活性。

附图说明

图1是表示实施例3的胶原蛋白产生促进效果的评价结果的图。

图2是表示实施例4的细胞粘附试验的评价结果的图。

图3是表示利用实施例6的本发明的肽的促进整联蛋白α3的表达的图。

图4是表示利用实施例6的本发明的肽的促进纤连蛋白的表达的图。

具体实施方式

以下，对本发明详细地进行说明。在本说明书的整体范围内，单数形式的表现只要没有特别其它提及，则应理解为也包含其复数形式的概念。另外，在本说明书中所使用的术语只要没有特别其它提及，则应理解为以该领域中通常使用的含义进行使用的。另外，在本说明书中，有时用众所周知的三字符简写或单字符简写表示氨基酸。

＜能够促进整联蛋白或胶原蛋白等的表达的肽＞

本发明提供一种由下述的式(I)：

Gly-Arg-Ile-Arg-Val-Leu(单字符简写：GRIRVL，SEQ ID NO：1)表示的氨基酸序列构成的肽、或由在上述式(I)所示的氨基酸序列中具有1或多个氨基酸的添加、缺失和/或保守性置换的氨基酸序列构成的肽或者该肽的衍生物、或它们的盐。

用于本发明的肽可以为上述式(I)表示的GRIRVL肽，或可以为由在该氨基酸序列中具有1或多个氨基酸的添加、缺失、和/或保守性置换的氨基酸序列构成的肽(以下也称为肽变体)。优选为GRIRVL肽、GRIRV肽或RIRVL肽，更优选为GRIRVL肽。

在此，氨基酸的保守性置换是指：原来的氨基酸和被置换的氨基酸为具有共同的性质的氨基酸之间的置换。更具体而言，作为疏水性氨基酸，可以列举在色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、蛋氨酸(M)、脯氨酸(P)及丙氨酸(A)中的氨基酸间的置换；作为碱性氨基酸，可以列举在精氨酸(R)、赖氨酸(K)及组氨酸(H)中的氨基酸间的置换；作为小型氨基酸，可以列举在甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、蛋氨酸(M)、苏氨酸(T)中的氨基酸间的置换等。

用于本发明的肽变体只要能够发挥本发明的效果，可以为在式(I)表示的氨基酸序列中具有添加、缺失或保守性置换的任一种的变体，或者可以为在上述氨基酸序列中具有如添加及缺失、添加及保守性置换、或缺失及保守性置换等2个以上的改变的变体。为了更可靠地得到高的本发明的效果，优选使用在式(I)表示的氨基酸序列中具有添加和/或缺失的肽变体，更优选使用在式(I)表示的氨基酸序列的Ｎ末端和/或Ｃ末端上具有添加和/或缺失的肽变体。

而且，本发明的肽变体可以为由在式(I)表示的氨基酸序列中具有1或多个氨基酸的添加、缺失、和/或保守性置换的任意的氨基酸序列构成的肽变体，但优选为由具有1～3个、更优选为由具有1～2个、特别优选为由具有1个氨基酸的添加、缺失和/或保守性置换的氨基酸序列构成的肽变体。

另外，用于本发明的肽变体的氨基酸残基的长度只要可以产生本发明的效果，就没有特别限制，优选为4～8残基、更优选为5～7残基。

更具体而言，作为用于本发明的肽变体的实例，可以列举：在式(I)表示的氨基酸序列的Ｎ末端或Ｃ末端上具有添加的肽变体(例如GRIRVLQ(SEQ ID NO：2)、YGRIRVL(SEQ ID NO：3))、在式(I)表示的氨基酸序列的Ｎ末端或Ｃ末端上具有缺失的肽变体(例如GRIRV(SEQ IDNO：4)、RIRVL(SEQ ID NO：5)、GRIR(SEQ ID NO：6))、在式(I)表示的氨基酸序列的Ｎ末端及Ｃ末端上具有缺失及添加的肽变体(例如IRVLQR(SEQ ID NO：7)、QYGRIR(SEQ ID NO：8)、YGRIRV(SEQ ID NO：9)、RIRVLQ(SEQ ID NO：10)、RVLQRF(SEQ ID NO：11))等。从可以期待能够更可靠地发挥高的效果的观点出发，优选为GRIRVLQ(SEQ ID NO：2)、YGRIRVL(SEQ ID NO：3)、GRIRV(SEQ ID NO：4)、RIRVL(SEQ ID NO：5)、IRVLQR(SEQ ID NO：7)，更优选为GRIRVLQ(SEQ ID NO：2)、YGRIRVL(SEQ ID NO：3)、GRIRV(SEQ ID NO：4)、RIRVL(SEQ ID NO：5)。

在本说明书中，“肽的衍生物”是指例如将肽(含有肽变体及后述的融合肽)乙酰化、棕榈酰化、十四烷基化、酰胺化、丙烯酸化、丹酰化、生物素化、磷酸化、琥珀酰化、酰苯胺化、苄氧羰基化、甲酰化、硝基化、硫化、醛化、环状化、糖基化、单甲基化、二甲基化、三甲基化、胍基化、脒化、马来酰化、三氟乙酰化、氨基甲酰化、三硝基苯基化、硝基环庚三烯酮化或乙酰乙酰化而成的衍生物等。

在本说明书中，“盐”是指肽(含有肽变体及后述的融合肽)或其衍生物的药理学上可接受的任意的盐(含有无机盐及有机盐)，例如可列举：肽或其衍生物的钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐、盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、有机酸盐(乙酸盐、三氟乙酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、草酸盐、乳酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、丙酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、苦味酸盐、苯磺酸盐等)等，优选为铵盐、盐酸盐、硫酸盐、乙酸盐或三氟乙酸盐，更优选为铵盐、乙酸盐或三氟乙酸盐。

本发明的肽(含有肽变体及后述的融合肽)或者其衍生物、或它们的盐可以为水合物或非水合物。另外，本发明的肽或者其衍生物、或它们的盐可以为溶剂化物或非溶剂化物。

本发明的肽可以通过本领域中公知的方法来制备。例如，本发明的肽可以通过化学合成方法(例如，固相法(例如Fmoc法)、液相法等)来合成，另外，也可以通过基因重组表达等方法来制备。另外，构成本发明的肽的氨基酸可以为L-型，也可以为D-型，但优选为L-型。

进而，本发明的肽可以通过如下操作来制备：通过蛋白酶处理等公知的方法从含有目标氨基酸序列的蛋白质的氨基酸序列中切出由目标氨基酸序列构成的肽。

本领域技术人员考虑蛋白酶的序列特异性等，为了从含有目标氨基酸序列的蛋白质的氨基酸序列中切出由目标氨基酸序列构成的肽，可适宜选择适当的蛋白酶。另外，在用蛋白酶将蛋白质水解时使用的反应条件没有特别限制，可由本领域技术人员根据技术常识适宜选择而得到。利用蛋白酶的水解处理后，根据需要通过本领域中公知的方法进行精制，由此，可以精制目标肽。

如上所述，将天然的蛋白质用蛋白酶水解而得到的肽与用化学合成方法制备的情况相比，从成本方面考虑是有利的。进而，认为将天然的蛋白质用蛋白酶水解而得到的肽对生物体是更安全的。因此，如上得到的肽可优选用于针对向生物体的适用要求更高的安全性的内服剂、食品、敏感肌肤用化妆品、饲料等。其中，食品是指包含饮用品的全部的饮食物。

本发明的肽的衍生物可以通过本领域中公知的任意的方法由本领域技术人员容易地制备而得到。

本发明的肽的盐也可以通过本领域中公知的任意的方法由本领域技术人员容易地制备而得到。

本发明可使用具有上述的特定序列的肽或者其衍生物、或它们的盐中的任一种，但为了更可靠地得到高的本申请效果，可优选使用肽或其盐，特别优选使用肽。

本发明的肽或其变体或者该肽的衍生物、或它们的盐可以使编码整联蛋白等细胞粘附因子及胶原蛋白等细胞外基质中的蛋白质或参与细胞外基质中的蛋白质形成的蛋白质的基因的表达增加。以下，将本发明的肽或其变体或者该肽的衍生物、或它们的盐称为本发明的肽类。具体而言，作为利用本发明的肽类而表达增加的细胞粘附因子及细胞外基质中的蛋白质或参与细胞外基质中的蛋白质形成的蛋白质，可以列举：整联蛋白(integrin)、纤连蛋白(fibronectin)、层粘连蛋白(laminin)、胶原蛋白(collagen)、弹性蛋白(elastin)、TIMP金属肽酶抑制剂(TIMP metallopeptidase inhibitor)、弹性蛋白纤维关联蛋白质(elastin microfibril interfacer)(也称为弹性蛋白微原纤维界面因子)、透明质酸合酶(hyaluronan synthase)等。

整联蛋白为细胞表面蛋白质的一种，参与对细胞外基质的粘附、来自细胞外基质的信号传递。纤连蛋白为细胞外基质的一种，参与和整联蛋白的粘附。另外，纤连蛋白也与胶原蛋白等细胞外基质成分粘附，起到使细胞和细胞外基质粘附的作用。层粘连蛋白为基膜(细胞外基质的一种)的主要蛋白质，已知与整联蛋白相互作用，参与细胞粘附等。胶原蛋白为细胞外基质的主要蛋白质，在各种细胞的粘附、细胞的分化或增殖方面特异性地起作用，也具有作为细胞功能的调节因子的作用。胶原蛋白的减少有时引起角膜溃疡等角膜疾患，风湿病、关节炎、变形性关节炎、骨关节炎等关节疾患，炎症性疾病等各种疾病。另外，在皮肤真皮的细胞外基质中，通过胶原蛋白纤维形成网眼状的束而赋予适当的张力。在胶原蛋白中存在I～ＸIＸ型等各种类型的胶原蛋白，但本发明的肽类特别可以使I型胶原蛋白(胶原蛋白类型I)及IV型胶原蛋白(胶原蛋白类型IV)或XVIII型胶原蛋白(胶原蛋白类型XVIII)的表达增加。弹性蛋白为构成细胞外基质的弹性纤维的构成成分。TIMP金属肽酶抑制剂具有阻碍参与细胞外基质的分解的肽酶的活性的作用，其结果，TIMP抑制细胞外基质的过量的分解，在组织的动态平衡中担负重要的作用。弹性蛋白微原纤维界面因子为构成细胞外基质的多聚体糖蛋白（多量体糖タンパク質）的一种，存在于弹性蛋白和微小纤维之间，认为参与弹性纤维形成及其结构稳定化等。透明质酸合酶作为局部存在于细胞膜的酶进行作为细胞外基质的主要成分的一种的透明质酸的合成。已知透明质酸除支撑细胞外空间的结构并参与营养因子及废物的物质输送之外，具有强力的保水作用，因此，对皮肤的弹力及张力产生影响。

上述的各种蛋白质直接或间接地参与细胞外基质和细胞的粘附，因此，这些蛋白质的产生量增加，例如细胞粘附因子增加时，进而细胞外基质增加，因此，促进成纤维细胞及角化细胞等皮肤细胞和细胞外基质之间的粘附。

而且，本发明的肽类不直接地参与细胞和细胞外基质的粘附，但可以增加或减少编码能够对皮肤产生作用的蛋白质的基因的表达。其中，对皮肤产生作用是指：例如，可以有效地改善皮肤的皱纹及松弛、张力降低、弹性降低、代谢不良及与其相伴的斑点、暗淡、表皮薄化等，使肌肤紧致等有益的对于皮肤的良好作用，除此之外，产生诱导皮肤的炎症及黑色素产生等对于皮肤的不良作用。本发明的肽类使对皮肤产生良好作用的基因的表达增加，另外，可以使对皮肤产生不良作用的基因的表达减少。

作为为能够对皮肤产生良好作用的蛋白质、且利用本发明的肽类而基因表达增加的蛋白质，可以列举：过氧化氢酶(catalase)、双向调节蛋白(amphiregulin)、去乙酰化酶(sirtuin)、端粒酶(telomerase)等。

过氧化氢酶为过氧化氢分解酶，由于其将由紫外线照射等产生的对皮肤有害的过氧化氢进行分解，所以，其表达量增加可以期待对皮肤良好的效果。双向调节蛋白为EGF家族的基因的一种，控制细胞的增殖、分化，可以期待表皮的代谢促进及抗皱纹效果。去乙酰化酶也被称为抗老化基因。通过活化去乙酰化酶基因，可以期待细胞寿命延长效果。端粒酶为端粒伸长酶，其也可以期待细胞寿命延长效果。

例如，在本发明的肽类的存在下，例如在以0.5mg/ml或1mg/ml的浓度含有本发明的肽类的培养基中培养正常人真皮成纤维细胞的情况下，编码上述的整联蛋白等细胞粘附因子及胶原蛋白等细胞外基质中的蛋白质、或参与细胞外基质中的蛋白质形成的蛋白质、以及对皮肤能够产生良好作用的蛋白质的基因的mRNA产生量增加约10%以上、优选约15%以上、更优选约20%以上、进一步优选约25%以上、特别优选约30%以上。

另外，作为为对皮肤能够产生不良作用的蛋白质、且利用本发明的肽类而基因表达减少的蛋白质，可列举：前列腺素内过氧化物合酶(prostaglandin-endoperoxide synthase)(前列腺素合成酶)、白细胞介素-6(IL-6:interleukin6)等。

前列腺素内过氧化物合酶(前列腺素合成酶)及白细胞介素-6(IL-6)分别为在炎症体系中起作用的酶及细胞因子。通过使这些基因的表达量降低，期待对炎症的抑制有益。另外，这些基因表达产物直接或间接地促进黑色素产生，因此，通过使其表达量降低而抑制黑色素产生，可以期待美白效果。

例如，在本发明的肽类的存在下，例如在以0.5mg/ml或1mg/ml的浓度含有本发明的肽类的培养基中培养正常人真皮成纤维细胞的情况下，编码上述的对皮肤能够产生不良作用的蛋白质的基因的mRNA产生量减少约20%以上、优选约30%以上、更优选约40%以上、进一步优选约70%以上、特别优选约80%以上。

这些基因的表达是否增加及其增加量、或者是否减少及其减少量通过如下操作测定：例如，在本发明的肽类的存在下及非存在下培养正常人真皮成纤维细胞，从该细胞中提取RNA，使用固定有将认为对皮肤可以起作用的基因或其片段的DNA芯片测定RNA量，将在本发明的肽类的存在下进行培养的细胞中的RNA量和在非存在下进行培养的细胞中的RNA量进行比较即可。作为固定有将认为对皮肤可以起作用的基因或其片段的DNA芯片，可以使用例如人类版（ヒト版）皮肤芯片(SKNH-LX)Genopal（ジェノパール）(注册商标)(三菱Rayon(公司))。基因的表达是否增加及其增加量、或者是否减少及其减少量也可以通过例如与上述同样地进行处理对提取的RNA进行定量PCR(qPCR)来评价。

利用本发明的肽类，参与细胞和细胞外基质的粘附的蛋白质的产生量增加时，成纤维细胞及角化细胞等细胞在生物体的真皮或表皮内与细胞外基质粘附，增强细胞和细胞外基质的结合。特别是成纤维细胞表面的整联蛋白在生物体的真皮内与细胞外基质粘附，增强成纤维细胞和细胞外基质的结合。另外，成纤维细胞在生物体的真皮内与细胞外基质中的胶原蛋白粘附，胶原蛋白牢固地形成纤维束结构，由此增强成纤维细胞和细胞外基质的结合。其结果，使细胞和细胞外基质的拉伸强度增加且紧致真皮、保持肌肤的张力及弹性。因此，本发明的肽类可以用于改善起因于细胞和细胞外基质之间的粘附能力降低的皮肤的皱纹及松弛、或者用于恢复肌肤的张力及弹性。而且，表皮角化细胞与基膜的细胞外基质粘附，使表皮和基膜牢固地固着，由此抑制松弛(例如毛孔的松弛)及皱纹，还促进角化细胞的增殖，因此，也可以用于促进代谢、以及改善由其引起的斑点、暗淡。其中，代谢是指：在皮肤中，表皮的角化细胞在皮肤的基底层产生后形成角层，最终脱落。通过代谢，表皮的细胞替换为新的细胞。通过代谢促进，缩短了代谢所需要的时间。另外，通过促进真皮或表皮和基膜的粘附，向表皮的营养供给及转录因子的移动等变为平滑，可以接近于更健康的皮肤状态(例如没有产生表皮的薄化的状态)。因此，本发明的肽类也可以用于改善起因于成纤维细胞或角化细胞和细胞外基质(特别是基膜)之间的粘附能力降低的松弛及皱纹、代谢降低、斑点、暗淡、表皮的薄化。

而且，本发明的肽类使对皮肤能够产生良好作用的基因的表达增加，其另一方面，使对皮肤能够产生不良作用的基因的表达减少。其结果，可以使皮肤的状态成为更健康良好的状态。

本发明也包含含有上述的肽类作为有效成分的组合物。该组合物例如可优选用作药物组合物、化妆品组合物、食品组合物或饲料组合物，进而可优选用于阐明与细胞和细胞外基质之间的粘附性相关的生理状态、或用于阐明皮肤状态的研究试剂。优选为用于美容的药物组合物、化妆组合物、食品组合物或饲料组合物。在本发明中，用于美容的组合物(即美容组合物)是指：以美化面容及身体(例如对于皮肤的美化肌肤效果等的美容)为目的而使用的组合物。

作为药物组合物，可列举例如：起因于以人类为主的哺乳动物中的细胞和细胞外基质之间的粘附能力降低的疾病的预防剂和/或治疗剂等。具体而言，本发明的药物组合物，例如可以作为起因于由于年龄增加等而产生的成纤维细胞或角化细胞和细胞外基质之间的粘附能力降低的皮肤的皱纹或松弛的预防剂和/或治疗剂、作为对于起因于上述粘附能力降低的皮肤的张力或者弹性降低的预防剂和/或治疗剂、或者作为使肌肤紧致的剂、作为起因于上述粘附能力降低的皮肤的代谢不良及与其相伴的斑点或暗淡的预防剂和/或治疗剂、或者作为起因于上述粘附能力降低的表皮薄化的预防剂和/或治疗剂等使用。含有本发明的肽类的药物组合物对于预防和/或治疗如上所述的皱纹、松弛、张力及弹性的降低、使肌肤紧致等是有益的，其也由后述的实施例3或6中所示的胶原蛋白、整联蛋白和/或纤连蛋白产生促进效果的结果得知。

作为化妆品组合物，例如，也可作为用于预防和/或改善起因于以人类为主的哺乳动物中的细胞和细胞外基质之间的粘附能力降低的状态的化妆品。具体而言，本发明的化妆品组合物，例如可以作为用于预防和/或改善起因于由于年龄增加等产生的成纤维细胞或角化细胞和细胞外基质之间的粘附能力降低的皮肤的皱纹或松弛的化妆品、作为用于预防和/或改善对于起因于上述粘附能力降低的皮肤的张力或弹性的降低的化妆品、或者作为用于使肌肤紧致的化妆品、作为用于预防和/或改善起因于上述粘附能力降低的皮肤的代谢不良及与其相伴的斑点或暗淡的化妆品、或者作为用于预防和/或改善起因于上述粘附能力降低的表皮薄化的化妆品等使用。含有本发明的肽类的化妆品组合物对预防和/或改善如上所述的皱纹、松弛、张力及弹性的降低、使肌肤紧致等是有益的，其也由后述的实施例3或6中所示的胶原蛋白、整联蛋白和/或纤连蛋白产生促进效果的结果得知。

作为食品组合物，例如也可用于预防和/或改善起因于以人类为主的哺乳动物中的细胞和细胞外基质之间的粘附能力降低的状态的食品。具体而言，本发明的食品组合物，例如可以作为用于预防和/或改善起因于由于年龄增加等产生的成纤维细胞或角化细胞和细胞外基质之间的粘附能力降低的皮肤的皱纹或松弛的食品、作为用于预防和/或改善对于起因于上述粘附能力降低的皮肤的张力或弹性的降低的食品、或者作为用于使肌肤紧致的食品、作为用于预防和/或改善起因于上述粘附能力降低的皮肤的代谢不良及与其相伴的斑点或暗淡的食品、或者作为用于预防和/或改善起因于上述粘附能力降低的表皮薄化的食品等使用。含有本发明的肽类的食品组合物对预防和/或改善如上所述的皱纹、松弛、张力及弹性的降低、使肌肤紧致等是有益的，其也由后述的实施例3或6中所示的胶原蛋白、整联蛋白和/或纤连蛋白产生促进效果的结果得知。

本发明的食品组合物包括健康食品、特定保健用食品、营养功能食品、健康辅助食品等。这些组合物包括美容健康食品。特定保健用食品是指标有在饮食生活中以特定的保健的目的进行摄取、通过该摄取可以期待该保健目的的食品。这些食品在特定的实施方式中，可作为附有用于如上所述的用途的标识的食品来提供。即，可作为附有用于美容的标识、具有美化肌肤作用的标识、用于肌肤改善的标识、用于使皮肤的张力及弹性恢复的标识、用于预防或改善皮肤的皱纹及松弛的标识、用于使肌肤紧致的标识、用于预防或改善皮肤的代谢不良及与其相伴的斑点或暗淡的标识、用于附有预防或改善表皮薄化的标识的食品提供。

作为饲料，例如可以列举：起因于牛、猪、鸡、羊、马等家畜及狗、猫等宠物中的细胞和细胞外基质之间的粘附能力降低的状态的预防用和/或改善用的饲料，起因于生物体内的胶原蛋白、整联蛋白和/或纤连蛋白量的减少的状态的预防用和/或改善用的饲料等。

本组合物中的本发明的肽类的含量也根据组合物的剂型等而不同，一般而言，从得到高的细胞和细胞外基质之间的粘附促进效果、或胶原蛋白、整联蛋白和/或纤连蛋白产生促进效果的观点出发，优选为0.0001～100重量%，更优选为0.001～95重量%，进一步优选为0.01～90重量%，特别优选为0.1～80重量%。

本发明的组合物可以通过在实现本发明的目的的范围内适宜配制除本发明的肽类之外在制剂领域或食品领域等的领域中通常使用的载体、基剂、和/或添加剂等来制备。

作为载体，例如可组合使用1种或2种以上糖类、纤维素类、水不溶性橡胶类、交联乙烯基聚合物、脂质类等。作为基剂，例如可组合使用1种或2种以上水、油脂类、矿物油类、蜡类、脂肪酸类、硅酮油类、甾醇类、酯类、金属皂类、醇等。作为添加剂，例如可组合使用1种或2种以上表面活性剂、可溶化成分、乳化剂、油分、稳定化剂、增粘剂、防腐剂、粘合剂、润滑剂、分散剂、pH调节剂、保湿剂、紫外线吸收剂、螯合剂、经皮吸收促进剂、抗氧化剂、崩解剂、增塑剂、缓冲剂、维生素类、氨基酸类、着色剂、香料等。

进而，为了根据需要附加其它有用的作用，也可以在本发明的组合物中组合配合1种或2种以上美白成分、抗炎症成分、抗菌成分、细胞活化成分、收敛成分、抗氧化成分、粉刺改善成分、胶原蛋白等生物体成分合成促进成分、血液循环促进成分、保湿成分、抗老化成分等各种成分。

本发明的组合物可以为内服剂(包括食品及饲料)或外用剂(包括化妆品)等任意的剂型。作为内服剂(包括食品及饲料)，例如能够以片剂、丸剂、颗粒剂、细粒剂、散剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、干糖浆剂、液剂(包括清凉剂、悬浮剂、糖浆剂)、凝胶剂、脂质体剂、提取剂、酊剂、柠檬水剂、果冻剂等任意的形态使用。

另外，在制成食品的情况下，也可以作为面包、面、家常菜、肉类加工食品(例如火腿、香肠等)、水产加工食品、调味料(例如调味汁等)、乳制品、点心(例如饼干、糖果、果冻、冰激凌等)、汤、果汁等含有在任意的通常的食品中的食品形态来提供。在形成这种形态的情况下，上述的水解物可依赖于目标食品的性质等，由本领域技术人员利用公知的方法适宜配制。

作为外用剂，例如能够以液状、乳液状、霜状、化妆水状、膏状、奶油状、凝胶状、片状(携带基材)、气雾状、喷雾状等任意的形态使用。

作为化妆品，例如能够以化妆水、乳液、霜、油、润肤膏等基础化妆品、还有粉底霜、腮红、口红等化妆的化妆品、进而洗面奶、清洁卸妆膏、沐浴露等清洁剂、入浴剂等任意的形态使用。

作为饲料，由于能够以任意的形态使用，因此，没有特别限定。

本发明还包含一种促进细胞和细胞外基质之间的粘附的方法、及促进胶原蛋白、整联蛋白和/或纤连蛋白的产生的方法，其特征在于，使用上述肽类。在本发明的方法中，只要以可得到细胞和细胞外基质之间的粘附促进效果的有效量以上、或可得到胶原蛋白、整联蛋白和/或纤连蛋白的产生促进效果的有效量以上的量使用上述肽类即可。即，本发明的方法中的上述肽类的使用量通常在内服剂的情况下，优选对于成人每人体重约50kg为约0.001～10000mg/天，更优选为约1～1000mg/天，进一步优选为约1～100mg/天。外用剂的情况下该使用量通常优选对于成人每人体重约50kg为约0.1μg～2g/天。而且，用作外用剂的情况下，对上述肽类的皮肤的适用量优选为约1ng～500μg/cm²、更优选为约0.01～50μg/cm²、进一步优选为约0.1～10μg/cm2。

本发明还提供上述肽类用于制备用作促进细胞和细胞外基质之间的粘附的组合物的用途。而且，本发明还提供上述肽类用于制备促进胶原蛋白、整联蛋白和/或纤连蛋白的产生的组合物的用途。

就上述肽类的使用量而言，只要以成为上述组合物中的含量的方式使用即可。

＜功能肽与融合肽＞

如后述的实施例的结果所示，得知：由式(I)表示的氨基酸序列构成的肽或其肽变体可以使细胞中的整联蛋白的表达量增加。而且也可以确认：由式(I)表示的氨基酸序列构成的肽或其肽变体实际上可以与细胞粘附。因此，通过使用本发明的肽或其肽变体，期待能够增强意图对细胞起作用的功能肽的细胞的活性。

因此，进一步从其它的观点出发，本发明还提供一种包含(A)对细胞起作用的功能肽(以下，也称为(A)要素)、和(B)由式(I)表示的氨基酸序列构成的肽或由在该氨基酸序列中具有1或多个氨基酸的添加、缺失、和/或保守性置换的氨基酸序列构成的肽(以下，也称为(B)要素)的融合肽。这种融合肽促进(B)要素通过整联蛋白等的细胞粘附，能够发挥细胞粘附促进效果，因此，可以提高(A)要素与细胞接触的概率，进而有效地容易发挥(A)要素对细胞的作用。即，由本发明的式(I)表示的氨基酸序列构成的肽或其肽变体和功能肽的融合肽与细胞作用，当上述融合蛋白质存在于细胞的附近时，通过本发明的肽或肽变体的作用，整联蛋白在细胞中的表达增加。而且，由本发明的式(I)表示的氨基酸序列构成的肽或其肽变体直接与细胞粘附。其结果，上述融合蛋白质利用细胞粘附效果，与细胞接触的概率升高，其结果，功能肽摄入于细胞中，或者与细胞表面的受体结合，能够对细胞发挥其功能。

作为成为本发明的融合肽的构成要素的(A)功能肽，可以为意图对细胞发挥功能的任意的肽，具体而言，可以为生长因子、激素、拮抗剂、激动剂、或它们的一部分等。

生长因子(growth factor)也被称为增殖因子或细胞增殖因子，是对特定的细胞的增殖及分化产生影响的蛋白质的总称。具体而言，可以列举：转化生长因子(TGF)、上皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、肝细胞增殖因子(HGF)等。优选为转化生长因子、上皮生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、肝细胞增殖因子。在本发明的融合肽中可以使用作为上述生长因子的一部分的肽。作为这样的一部分肽，可以使用国际公开第2008/130082号小册子中所记载的源自TGF-β的片段肽(例如具有Ile-Trp-Ser-Leu-Asp-Thr-Gln-Tyr序列(SEQ ID NO：12)的肽)等。

激素是指作用于细胞并调节细胞的活性的生理活性物质。在本发明的融合蛋白质中用作功能性因子的激素优选为肽激素。作为肽激素，具体而言，可以列举：促黑素细胞激素(MSH)、心房性钠利尿肽(ANP)、心房性钠利尿因子(ANF)、促甲状腺激素(TSH)、黄体化激素(LH)、促卵泡激素(FSH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、催产素、血管加压素等。优选为促黑素细胞激素。在本发明的融合肽中可以使用作为上述肽激素的一部分的肽，作为这样的一部分肽，可以使用美国专利第6245342号、美国专利第7737119号中所记载的α-MSH的片段肽(例如具有Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly序列(SEQ ID NO：13)的肽)等。

拮抗剂是指具有与细胞的受体作用而阻碍配体向该受体的结合的作用的物质的总称。具体而言，可以列举RAGE拮抗剂等。RAGE拮抗剂是指对于由认为是老化现象之一的蛋白质的糖化产生的终末糖化产物(也被称为AGE)的受体(RAGE：Receptor for AGE)拮抗性地作用、阻碍配体的结合的物质。在本发明的融合肽中也可以使用RAGE拮抗剂的一部分，作为这样的一部分肽，可以使用美国专利申请公开第2010/0249038号中所记载的RAGE拮抗剂的一部分等。

激动剂是指与细胞的受体作用而发挥与作用于该受体的配体相同的作用的物质的总称。在本发明的融合肽中也可以使用作为这种激动剂的一部分的肽。

予以说明，在本发明的融合肽中，作为(A)要素的功能肽、和作为(B)要素的式(I)表示的肽或其肽变体的融合的顺序没有特别限定，可以为(A)要素在N末端侧且(B)要素在C末端侧，也可以为其相反。予以说明，在融合肽中，有时将N末端侧的肽称为头部肽，将C末端侧的肽称为尾部肽。

另外，本发明的融合肽可以为仅由(A)要素及(B)要素构成的融合肽，也可以为含有(A)要素及(B)要素以外的其他氨基酸序列的融合肽。而且，本发明的融合肽既可以为直接连接(A)要素和(B)要素的融合肽，也可以为在(A)要素和(B)要素之间含有作为接头的氨基酸序列的融合肽。通过接头融合(A)要素和(B)要素的情况下，(A)要素及(B)要素的各自的结构稳定性升高，可以期待容易发挥更高的效果。因此，本发明的融合肽优选在(A)要素和(B)要素之间含有接头。另外，本发明的融合肽含有多个功能肽作为(A)要素的情况下，优选以在各功能肽间也含有接头的方式构成。

本发明的融合肽中所含的接头只要对(A)要素和(B)要素的各自的功能发挥没有影响，就可以为任意的接头序列。作为接头的一个实例，可以列举由氨基酸构成的接头。其中，作为可用于接头的氨基酸，为在同一分子内具有氨基(-NH2基)和羧基(-COOH基)两者的有机化合物，既可以为氨基和羧基结合于同一碳的α-氨基酸(例如，甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸(α-丙氨酸)、苏氨酸、蛋氨酸)，也可以为β-丙氨酸、氨基丁酸(例如4-氨基丁酸)、氨基戊酸(例如5-氨基戊酸)、氨基己酸(例如6-氨基己酸)、氨基庚酸(例如7-氨基庚酸)、氨基辛酸(例如8-氨基辛酸)、氨基壬酸(9-氨基壬酸)、氨基癸酸(例如10-氨基癸酸)、氨基十一烷酸(例如11-氨基十一烷酸)、氨基月桂酸(例如12-氨基月桂酸)、氨基十三烷酸(例如13-氨基十三烷酸)、氨基十四烷酸(例如14-氨基十四烷酸)、氨基十五烷酸(例如15-氨基十五烷酸)、氨基棕榈酸(例如16-氨基棕榈酸)等碳数2～50左右、优选碳数2～30左右、更优选碳数2～20左右、进一步优选碳数2～15左右的氨基羧酸。优选可以列举由甘氨酸、丝氨酸、和/或碳数2～20的氨基羧酸构成的接头，更优选可以列举由甘氨酸和/或碳数2～15的氨基羧酸构成的接头，进一步优选可以列举仅由甘氨酸构成的接头。

接头的氨基酸长度没有特别限定，通常为1～20残基，优选为1～15残基，更优选为1～10残基，进一步优选为1～5残基，更进一步优选为1～3残基。

更简便而言，本发明的融合肽可以用本领域中公知的化学合成方法(例如固相法(例如Fmoc法)、液相法等)来制备。化学合成融合肽的情况下，可以个别地准备(A)要素、(B)要素及根据需要的接头等其它肽之后使它们融合，或者可以预先设计含有(A)要素及(B)要素、以及根据需要的接头等的融合肽的一系列的氨基酸序列，以从Ｎ末端或Ｃ末端逐个合成的形式制备这样设计的融合肽的氨基酸序列。

另外，本发明的融合肽以能够起作用的形式符合读框地连接编码作为(A)要素的功能肽的DNA和编码作为(B)要素的式(I)表示的肽或其肽变体的DNA，将该融合DNA导入到表达载体，通过在适当的宿主细胞中导入该载体而使其表达，由此，在基因工程方面可以作为重组肽进行制备。此时，可以以能够起作用的形式连接启动子及终止子等要素。另外，在配置仅由遗传性地被编码的氨基酸构成的接头的情况下，可以在编码作为(A)要素的功能肽的DNA和编码作为(B)要素的式(I)表示的肽或其肽变体的DNA之间插入编码上述的接头肽的DNA。

另外，也可以以与上述相同的目的使用将本发明的融合肽进行了衍生物化的物质、或使本发明的融合肽或其衍生物作为盐的形态的物质。融合肽的衍生物、或融合肽或其衍生物的盐可以为与前述的本发明的肽类相同的衍生物或盐的形态。

本发明也包含含有上述融合肽的组合物。该组合物可以作为用于使功能肽作用于细胞的组合物进行使用。该组合物中的融合肽类的配合量、及其它能够配合的成分(载体、基剂或添加剂等)的种类及配合量或组合物的形态等与含有前述的本发明的肽类的组合物是相同的。另外，该组合物的用途既可以与含有前述的本发明的肽类的组合物相同，也可以根据该功能肽的效果进一步用于其它的用途。例如，在与期待发挥对皮肤有良好作用(例如，皮肤的皱纹、松弛、张力降低、弹性降低、代谢不良、斑点、暗淡、或表皮薄化的预防和/或改善；使肌肤紧致和/或美白；皮肤中的炎症的预防和/或改善；皮肤中的蛋白质的糖化(AGE生成)等皮肤老化症状的预防和/或改善等)的功能肽融合的情况下，除利用本发明的肽类自身的作用之外，可以为了得到基于该功能肽产生的作用的效果而有益地使用。

【实施例】

以下，基于实施例，对本发明详细地进行说明，但本发明并不受这些实施例限制。

实施例1：GRIRVL(Gly-Arg-Ile-Arg-Val-Leu)肽的制备

(1)肽的合成：

使用肽自动合成装置(岛津制作所制:PSSM8)，通过利用Fmoc法的固相合成法合成GRIRVL肽。具体的步骤如下所述：首先，使Fmoc-Leu-OH的C末端与固相合成用树脂结合后，通过哌啶处理除去保护基(Fmoc)，接着，将该树脂中和、清洗后，将Fmoc-Val-OH导入Leu的N末端。接着，通过哌啶处理除去保护基(Fmoc)，再次将该树脂中和、清洗后，将Fmoc-Arg(Pmc)-OH导入Val的N末端。接着，通过哌啶处理除去保护基(Fmoc)，再次将该树脂中和、清洗后，将Fmoc-Ile-OH导入Arg的N末端。接着，通过哌啶处理除去保护基(Fmoc)，再次将该树脂中和、清洗后，将Fmoc-Arg(Pmc)-OH导入Ile的N末端。接着，通过哌啶处理除去保护基(Fmoc)，再次将该树脂中和、清洗后，将Fmoc-Gly-OH导入Arg的N末端。接着，通过哌啶处理除去保护基(Fmoc)，从该树脂中切出肽链。通过利用TFA(三氟乙酸)切断Arg的Pmc基来进行脱保护。最后，通过制备型HPLC除去未反应物来进行精制，由此得到GRIRVL。

(2)肽的纯度检定：

将得到的精制物附于分析用反相高效液相色谱法[柱：Inertsil ODS―3(内径：4.6mm、长度：250mm)，GL Sciences社制；移动相：溶剂A(0.05%三氟乙酸)及溶剂B(0.05%三氟乙酸、100%乙腈)的梯度(0分钟(溶剂B＝0%)～30分钟(溶剂B＝11%))；流速：1ml/分钟；检测法：波长220nm中的吸光度]，其结果，在5.5分钟显示单一的尖锐的峰，纯度为99.9%。

实施例2：利用微阵列测定基因表达

使用含10%胎牛血清(FBS)达尔伯克改良MEM(DMEM)(GIBCO)在12孔微孔板上以3.0×10⁴细胞/cm²的细胞密度接种正常人真皮成纤维细胞(KF-4009;仓敷（クラボウ）)。接种24小时后，以指定的浓度(0.5mg/ml或1mg/ml)与含有上述实施例1中制备的GRIRVL肽的DMEM进行交换，培养48小时。另外，作为对照(无处理组)，准备用不含有被验肽的DMEM进行了交换的孔，同样地培养48小时。接着，使用RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN制)和QIA shredder(QIAGEN制)，从GRIRVL肽处理组及无处理组的成纤维细胞中各自提取RNA。对提取的各RNA，使用人类版皮肤芯片(SKNH-LX)Genopal（ジェノパール）(注册商标)(三菱Rayon(公司)制)，比较GRIRVL肽处理组和无处理组的基因表达谱。在该人类版皮肤芯片上将与肌肤的形成及新陈代谢有关的基因及与炎症及毒性有关的有可能作用于皮肤的139个基因固定化。关于139个基因中的通过GRIRVL肽处理看到表达的增减的基因，作为将无处理组中的表达量设定为100时的GRIRVL肽处理组中的表达量之比算出的结果表示于下述的表1～4中。表1及表2所示的基因为可直接或间接地参与细胞和细胞外基质的粘附的基因，表3及表4所示的基因不直接参与细胞和细胞外基质的粘附，但为对皮肤能够产生良好作用或不良作用的基因。

【表1】

【表2】

【表3】

【表4】

如上述表1及2的结果所示，在用GRIRVL肽进行处理的成纤维细胞中，除整联蛋白或纤连蛋白、层粘连蛋白等细胞粘附因子之外，胶原蛋白或抑制其分解酶的TIMP金属肽酶抑制剂、弹性蛋白、弹性蛋白微原纤维界面因子、透明质酸合酶等存在于细胞外基质中的成分或参与其形成的成分的表达量增加。其中，关于I型胶原蛋白，确认了高的表达量。

由以上的结果得知：本发明的肽使整联蛋白等细胞粘附因子及细胞外基质中的成分或参与其形成的成分的表达量增加，使细胞和细胞外基质之间的相互作用作为良好作用，可以为了促进细胞粘附而有益地使用。

另外，如上述表3及4的结果所示，在用GRIRVL肽进行处理的成纤维细胞中，过氧化氢酶、双向调节蛋白、去乙酰化酶、端粒酶等对皮肤能够产生良好作用的基因的表达量增加。另一方面，前列腺素内过氧化物合酶(前列腺素合成酶)、白细胞介素-6(IL-6)等对皮肤能够产生不良作用的基因的表达量减少。

由以上的结果得知：本发明的肽使对皮肤能够产生良好作用的基因的表达量增加，同时，使对皮肤能够产生不良作用的基因的表达量减少，其结果，对皮肤产生良好作用，可以有益于皮肤的老化症状的改善等。

实施例3：胶原蛋白产生促进效果的评价

使用含10%胎牛血清(FBS)达尔伯克改良MEM(DMEM)(GIBCO)在96孔微孔板上以6.25×10⁴细胞/cm²的细胞密度接种正常人真皮成纤维细胞(KF-4009;Kurabo)。接种24小时后，与以指定的浓度含有实施例1中制备的GRIRVL肽的DMEM进行交换。另外，作为对照(无处理组)，也准备用不含有被验肽的DMEM进行了交换的孔。将含GRIRVL肽组及无处理组培养约48小时之后，回收培养基上清液，供于I型胶原蛋白ELISA。一次抗体反应使用抗I型胶原蛋白抗体(Rabbit)(ROCKLAND社制)，二次抗体反应使用Histofine simple stain MAX-PO(R)(Rabbit)(NICHIREI制)，测定培养基上清液的I型胶原蛋白浓度。细胞在0.5%Triton X-100溶液中进行溶解，使用BCA Protein Assay Reagent试剂盒(Thermo Scientific)定量总蛋白量，将每细胞蛋白量的I型胶原蛋白产生量与无处理组进行比较。

图1表示该结果。由图1的结果得知：在GRIRVL肽处理组中，类型I胶原蛋白产生增加，特别是在200μg/ml处理组中看到为无处理组的约1.5倍的显著的增加。由以上的结果得知：本发明的肽可以发挥高的胶原蛋白产生促进效果，可以为了对于皮肤的皱纹及松弛、张力及弹性的降低等的预防和/或改善而有益地使用。

另外，由该试验结果可以理解为：实施例2中被确认的基因表达量的增减实际上与蛋白质量的增减有关联。

实施例4：使用肽芯片的细胞粘附评价

为了对本发明的肽的细胞粘附效果进行评价，进行了以下的试验。

(1)肽芯片的制备：

使用肽自动合成装置(ASP222,IntavisAG,Koeln,Germaniy)，通过利用Fmoc固相合成法的常规方法进行肽芯片的制备。首先，使Fmoc-β-Ala-OH的C末端与纤维素薄膜酯结合后，通过哌啶处理除去保护基(Fmoc)，接着，将该树脂中和、清洗后，与Fmoc-11-氨基十一酸的C末端结合。接着，通过哌啶处理除去保护基(Fmoc)，将该树脂中和、清洗后，使Fmoc-Leu-OH的C末端结合。接着，通过哌啶处理除去保护基(Fmoc)，接着，将该树脂中和、清洗后，将Fmoc-Val-OH导入Leu的N末端。接着，通过哌啶处理除去保护基(Fmoc)，再次将该树脂中和、清洗后，将Fmoc-Arg(Pmc)-OH导入Val的N末端。接着，通过哌啶处理除去保护基(Fmoc)，再次将该树脂中和、清洗后，将Fmoc-Ile-OH导入Arg的N末端。接着，通过哌啶处理除去保护基(Fmoc)，再次将该树脂中和、清洗后，将Fmoc-Arg(Pmc)-OH导入Ile的N末端。接着，通过哌啶处理除去保护基(Fmoc)，再次将该树脂中和、清洗后，将Fmoc-Gly-OH导入Arg的N末端。接着，通过哌啶处理除去保护基(Fmoc)。进一步通过利用TFA(三氟乙酸)切断Arg的Pmc基来进行脱保护。作为在GRIRVL肽的氨基酸序列中具有1或多个氨基酸的添加和/或缺失的肽变体，对GRIRVLQ(SEQ ID NO：2)、YGRIRVL(SEQID NO：3)、GRIRV(SEQ ID NO：4)、RIRVL(SEQ ID NO：5)、GRIR(SEQID NO：6)、IRVLQR(SEQ ID NO：7)、QYGRIR(SEQ ID NO：8)、YGRIRV(SEQ ID NO：9)、RIRVLQ(SEQ ID NO：10)、RVLQRF(SEQ ID NO：11)的肽也用相同的步骤制备肽芯片。最后，利用甲醇进行简易杀菌处理，其后，用于细胞分析。

(2)细胞粘附评价：

将如上述那样制备的肽芯片使用BIOPSY PUNCH(KAI medical,岐阜,日本)穿孔，移至96孔微孔板上。在肽芯片上使用含10%胎牛血清(FBS)达尔伯克改良MEM(DMEM)(SIGMA)以2.0×10⁴细胞/孔的细胞密度接种正常人真皮成纤维细胞(KF-4009;Kurabo)，在37℃、5%CO₂的条件下培养3小时。其后，利用生理盐水进行清洗，由此除去非粘附细胞。使用荧光色素calcein AM(Molecular Probes,莱顿，荷兰)进行粘附细胞数的评价(Ex:485nm,Em:538nm)。具体而言，细胞接种后，测定纤维素薄膜的荧光强度，由标准曲线算出粘附细胞数。予以说明，将以2.0×10⁴细胞/孔的密度接种细胞的薄膜的荧光强度设定为100，求出粘附细胞数(残存细胞数)对其的比率。

图2表示结果。由图2的结果得知：在使用基于GRIRVL肽(SEQ IDNO：1)及SEQ ID NO：1的氨基酸序列使1或多个氨基酸添加和/或缺失的SEQ ID NO：2～11的肽变体的情况下，确认了高的细胞粘附效果。因此也得知：通过使用本发明的肽类，可以提高对细胞发挥效果的功能肽的细胞的活性。

实施例5：利用定量PCR的基因表达的测定

使用上述实施例1中制备的GRIRVL肽(SEQ ID NO：1)、以及用与实施例1同样的步骤通过Fmoc法的固相合成法制备的GRIRV(SEQ ID NO：4)肽及RIRVL肽(SEQ ID NO：5)，利用定量PCR(qPCR)法对使这些肽作用于正常人真皮成纤维细胞时的基因表达量的变化进行评价。

首先，使用含10%胎牛血清(FBS)达尔伯克改良MEM(DMEM)(GIBCO)在96孔微孔板上以1×10⁴细胞/孔的细胞密度接种正常人真皮成纤维细胞(KF-4009；Kurabo)，在37℃、5%CO₂的条件下培养约24小时，与含0.5%FBS DMEM(GIBCO)进行交换。4小时后，使用含0.5%FBS DMEM(GIBCO)与以指定的浓度(0.5mg/ml)溶解上述3种被验肽的溶液进行交换。另外，作为对照(无处理组)，也准备用不含有被验肽的含0.5%FBS DMEM进行交换的孔。24小时后，回收RNA样品，用于qRT-PCR。样品的回收及qRT-PCR用制备液使用Cells Direct One Step qRT-PCR试剂盒(LifeTechnologies)。在由各基因表达的mRNA的检测中分别使用以下的Taqman(注册商标)Gene Expression Assays(Life Technologies)的引物及探测组[Fn1基因：Hs00365058_m1，Timp2基因：Hs00234278_m1，Cat基因：Hs00156308_m1，18s rRNA(内参基因)：Hs99999901_s1]。qRT-PCR设备使用Applied Biosystems社的ABI PRISM7000序列检测系统，在50℃下进行15分钟(1循环)，在95℃下进行2分钟(1循环)，在95℃下进行15秒，在60℃下进行40秒(50循环)。使用利用交叉点（Crossing point）法得到的CT值，用⊿⊿CT法进行相对定量，将对照组和被验肽处理组进行比较。算出将对照组(无处理组)设定为100时的各被验肽处理组的细胞中的各基因表达量的比率，以下的表5表示其结果。

【表5】

上述表5所示的各目标基因均为在使用有上述实施例2的微阵列的评价中通过用本发明的GRIRVL肽进行处理而在成纤维细胞中确认表达量增加的基因。由本结果得知：在使用定量PCR法的本评价中，在不仅使用GRIRVL肽，而且使用作为其肽变体的GRIRV肽及RIRVL肽的情况下，确认这些基因表达量增加。

实施例6：整联蛋白及纤连蛋白产生促进效果的评价

使用含10%胎牛血清(DS Pharma)达尔伯克改良MEM(DMEM)(GIBCO)在8孔培养载玻片(Thermo)上以3.0×10⁴细胞/cm²的细胞密度接种正常人真皮成纤维细胞(Kurabo)。接种24小时后，与不含有血清的DMEM培养基进行交换，进而在24小时后，与以1mg/ml含有上述实施例1中制备的GRIRVL肽的DMEM进行交换，培养48小时。另外，作为对照(无处理组)，准备用不含有被验肽的DMEM进行了交换的孔，同样地培养48小时。用冷却至－20℃的甲醇处理20分钟并固定，用含有2%的BSA的PBS在室温下进行90分钟的封闭处理，使用抗整联蛋白α3抗体(AB1920:Millipore)或抗纤连蛋白抗体(ab23750:abcam)进行1次抗体反应。将各抗体使用含2%BSA的PBS稀释200倍，通过在4℃下静置一夜而进行反应。其后，添加使用alexa488标记的山羊抗兔抗体(Molecular Probe)进行2次抗体反应。将2次抗体使用含2%BSA的PBS稀释200倍，通过在室温下静置90分钟而使反应进行。其后，用1ug/ml的核染色色素(Hoechst33258)在室温下处理5分钟，用市售的密封剂(AquaPoly/Mount(Polysciences))密封，使用荧光显微镜进行观察。予以说明，在液体交换时分别使用PBS清洗2次之后，添加以下的反应液。

图3及图4表示该结果的免疫染色图像(荧光显微镜：100倍数)。图3是显现了整联蛋白α3的表达的免疫染色图像。由图3得知：在对照(图3A)中，看到用赫希斯特(Hoechst33258)染色为蓝色的细胞核，但几乎没有看到显色为绿色的整联蛋白α3的存在。另一方面，在用本发明的GRIRVL肽进行处理的情况下(图3B)，与显色为蓝色的细胞核同时，可以明确地确认显色为绿色的整联蛋白α3的像。即，得知：通过使用GRIRVL肽进行处理，促进整联蛋白α3蛋白质的表达。同样地确认：在确认纤连蛋白的表达的免疫染色图像中也看到显色为绿色的纤连蛋白的图像，通过使用本发明的肽，实际上促进纤连蛋白蛋白质的表达(图4)。

实施例7：与来自αMSH的片段肽的融合肽的评价

为了对使GRIRVL肽和功能肽融合而成的融合肽进行评价，作为功能肽，使用已知具有黑色素产生促进效果的来自αMSH的片段肽(Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly:EHFRWG，SEQ ID NO：13)进行试验。作为被验肽，准备与来自αMSH的片段肽没有任何融合的肽(EHFRWG)、与作为细胞粘附基元序列公知的RGD序列N末端融合而成的肽(RGD-EHFRWG)及与本发明的GRIRVL肽N末端融合而成的肽(GRIRVL-EHFRWG)的3种肽。

首先，将来自小鼠的B16黑色素瘤细胞在6孔培养板中进行培养。更详细而言，以7,000细胞/1cm²密度接种于板上，在37℃下、在5%二氧化碳及95％空气的环境下培养24小时。就培养液而言，各孔500μl分别使用在达尔伯克改良MEM(DMEM)中以10重量％的浓度含有胎牛血清(FBS)的培养基。在细胞达到汇合的时刻除去培养液，将每3ml的添加有1μg/ml浓度的上述3种被验肽的培养基添加到DMEM中。予以说明，将添加有3ml未添加肽的培养基的物质用作对照。培养48小时后，用PBS清洗2次，接着，每3ml添加用DMEM稀释成100倍的WST-8试剂，在37℃下、在5％二氧化碳及95％空气的环境下培养2小时。将各上清液移至96孔培养板上，在450nm下测定吸光度并测定细胞数。用PBS清洗2次残留于6孔培养板上的细胞之后，在含有20％NaOH的10％DMSO溶液280μl中溶解，移至1.5ml管中，用板式加热器在60℃下反应2小时，进行黑色素的提取。将其移至96孔培养板上，在475nm下测定吸光度并测定黑色素量。基于该测定值算出将对照中的黑色素量设定为100％时各被验肽处理组中的黑色素量之比。以下的表6表示该结果。

【表6】

被验肽	黑色素产生量(％)
		对照	100
EHFRWG	137
		RGD—EHFRWG	143
GRIRVL—EHFRWG	151

如上述表6所示，在来自0(MSH的片段肽自身(EHFRWG)中，与对照相比，黑色素产生量增加。而且得知：通过使用公知其中具有细胞粘附作用的使的基元序列(RGD)融合而成的肽(RGD-EHFRWG)，黑色素产生量进一步增加。而且，在与作为本发明的肽的GRIRVL在N末端融合而成的融合肽(GRIRVL-EHFRWG)中，与和RGD基元序列融合的情况相比，看到许多黑色素产生量。即，由本结果得知：本发明的肽融合而成的融合肽在提高功能肽对细胞的作用的效果方面优异。

实施例8：与来自TGF-β的片段肽的融合肽的评价

为了对GRIRVL肽和功能肽融合而成的融合肽进一步进行评价，作为功能肽，使用已知具有胶原蛋白产生促进效果的来自TGF-β的片段肽(Ile-Trp-Ser-Leu-Asp-T11r-Gln-Tyr：IWSLDTQY、SEQ ID NO：12)进行试验。作为被验肽，使用与来自TGF-β的片段肽没有任何融合的肽(IWSLDTQY)及插入接头(由甘氨酸构成的3残基的接头)并与本发明的GRIRVL肽C末端融合而成的肽(IWSLDTQY-GGG-GRIRVL)的2种肽。

首先，使用含10%胎牛血清(FBS)达尔伯克改良MEM(DMEM)(GIBCO)在96孔微孔板上以6.25×10⁴细胞/cm²的细胞密度接种正常人真皮成纤维细胞(KF-4009;Kurabo)。接种24小时后，与DMEM进行交换。进一步培养24小时后，与以4μM浓度含有上述2种被验肽的DMEM进行交换。另外，作为对照(无处理组)，也准备用不含有被验肽的DMEM进行交换的孔。将含被验肽组及无处理组培养约48小时后，回收培养基上清液，供于Procollagen type I C-peptide(PIP)EIA试剂盒(TakaRa)，测定培养基上清液中的人I型前胶原蛋白C末端肽(PIP)浓度。细胞在0.5%Triton X-100溶液中进行溶解，使用BCA Protein Assay Reagent试剂盒(Thermo Scientific)定量总蛋白量。接着，由这些定量结果算出每细胞蛋白量的PIP产生量。基于所算出的值求出将对照中的每细胞蛋白量的PIP量设定为100%时的各被验肽处理组中的每细胞蛋白量的PIP产生量之比。以下的表7表示该结果。

【表7】

如上述表7所示，在来自TGF-β的肽自身(IWSLDTQY)中，与对照相比，每细胞的PIP产生量增加。而且，在与作为本发明的肽的GRIRVL通过3残基的甘氨酸接头C末端融合而成的融合肽(IWSLDTQY-GGG-GRIRVL)中，确认到每细胞的PIP产生量进一步提高。由本结果得知：即使使用使功能肽和GRIRVL肽通过接头融合而成的融合肽，也可以提高该功能肽对细胞的作用。

工业上应用的可能性

本发明的肽或其衍生物、或它们的盐可以为了促进细胞的粘附、另外为了基于胶原蛋白、整联蛋白和/或纤连蛋白的产生促进效果等而发挥美容效果而使用。而且，利用本发明的肽类，可以提高对意图作用于细胞的功能肽的细胞的活性。

将本说明书中引用的全部出版物、专利及专利申请直接作为参考引入本说明书中。

序列表全文

SEQ ID NO：1～13合成的

Claims

1.一种由下述的式(I)：

Gly-Arg-Ile-Arg-Val-Leu(SEQ ID NO：1)

2.如权利要求1所述的肽或者该肽的衍生物、或它们的盐，为Gly-Arg-Ile-Arg-Val-Leu(SEQ ID NO：1)、Gly-Arg-Ile-Arg-Val(SEQ ID NO：4)、Arg-Ile-Arg-Val-Leu(SEQ ID NO：5)、Gly-Arg-Ile-Arg(SEQ ID NO：6)、Gln-Tyr-Gly-Arg-Ile-Arg(SEQ ID NO：8)、Tyr-Gly-Arg-Ile-Arg-Val(SEQ IDNO：9)、Arg-Ile-Arg-Val-Leu-Gln(SEQ ID NO：10)、Ile-Arg-Val-Leu-Gln-Arg(SEQ ID NO：7)、Arg-Val-Leu-Gln-Arg-Phe(SEQ IDNO：11)、Tyr-Gly-Arg-Ile-Arg-Val-Leu(SEQ ID NO：3)、或Gly-Arg-Ile-Arg-Val-Leu-Gln(SEQ ID NO：2)。

3.如权利要求1或2所述的肽或者该肽的衍生物、或它们的盐，具有4～8残基的氨基酸长度。

4.一种组合物，所述组合物含有权利要求1～3中任一项所述的肽或者该肽的衍生物、或它们的盐。

5.如权利要求4所述的组合物，所述组合物用于美容。

6.如权利要求4或5所述的组合物，所述组合物用于改善或预防皮肤的皱纹、松弛、张力降低、弹性降低、代谢不良、斑点、暗淡或表皮薄化。

7.如权利要求4～6中任一项所述的组合物，所述组合物用于使肌肤紧致。

8.如权利要求4～7中任一项所述的组合物，所述组合物用于促进选自由胶原蛋白、整联蛋白及纤连蛋白构成的组中的至少1种的产生。

9.如权利要求4～8中任一项所述的组合物，所述组合物用于使编码细胞粘附因子、细胞外基质中的蛋白质或参与细胞外基质中的蛋白质形成的蛋白质的基因的表达增加。

10.一种融合肽或者该融合肽的衍生物或它们的盐，由对细胞起作用的功能肽和权利要求1～3中任一项所述的肽融合而成。

11.如权利要求10所述的融合肽或者该融合肽的衍生物、或它们的盐，其中，功能肽选自由生长因子、激素、拮抗剂、激动剂及它们的一部分构成的组中的1种以上。

12.如权利要求10或11所述的融合肽或者该融合肽的衍生物、或它们的盐，其中，功能肽为来自转化生长因子(TGF)的片段肽或来自促黑素细胞激素(MSH)的片段肽。

13.如权利要求10～12中任一项所述的融合肽或者该融合肽的衍生物、或它们的盐，其中，功能肽和权利要求1～3中任一项所述的肽通过接头融合。

14.如权利要求10～13中任一项所述的融合肽或者该融合肽的衍生物、或它们的盐，其中，权利要求1～3中任一项所述的肽与细胞粘附。

15.一种组合物，所述组合物含有权利要求10～14中任一项所述的融合肽或该融合肽的衍生物、或它们的盐。