CN104059985A - 口腔鳞状癌诊断试剂盒及myh7基因在其制备中的用途 - Google Patents

口腔鳞状癌诊断试剂盒及myh7基因在其制备中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了MYH7基因在制备诊断口腔鳞状癌的试剂盒中的用途。本发明利用高通量测序技术筛选出MYH7基因在口腔鳞状癌组织中表达下调，并使用荧光实时定量PCR方法验证了上述结论，据此，本发明还公开了一种诊断口腔鳞状癌的试剂盒以及利用该试剂盒诊断口腔鳞状癌的方法。本发明一方面为研究口腔鳞状癌的分子机理提供新的思路，另一方面为早期诊断口腔鳞状癌提供了更为灵敏的诊断试剂盒。

Description

口腔鳞状癌诊断试剂盒及MYH7基因在其制备中的用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种口腔鳞状癌诊断试剂盒及MYH7基因在制备口腔鳞状癌诊断试剂盒中的应用。
背景技术
在我国，口腔颌面部的恶性肿瘤以癌为最常见，肉瘤较少。在癌瘤中又以鳞状细胞癌为最多见，一般占80％以上。口腔鳞状细胞癌(Oral Cancer)的发生是个多因素、多步骤、多阶段的复杂过程，在这些过程中，涉及众多基因表达的改变，导致细胞正常生理过程及大分子代谢紊乱，信号转导受阻，细胞结构改变及免疫调节紊乱等，结果导致细胞异常增殖，最终形成癌。与口腔鳞状细胞癌发病相关的因素既包括各种理化刺激、致瘤性病毒等外源性因素，又包括机体的免疫状态、遗传易感性以及DNA损伤修复能力等内源性因素。在口腔鳞状细胞癌的发生过程中最重要的机制是细胞中原癌基因激活和抑癌基因失活，最终导致细胞增殖和(或)凋亡调节失控。
高通量转录组测序(RNA-sep)是在转录组水平上进行深度测序的一项技术，测序技术在转录组分析中的应用主要集中在基因表达谱的构建、新基因的发现、小分子非编码RNA表达谱的构建和新小分子RNA基因的发现、蛋白质编码基因注释、以及如fusion transcript等转录组研究上。数据在最初的处理上是大体是相似的，接下来针对不同的研究目的可以选用不同的生物信息学软件进行计算。
利用大规模测序技术直接对由mRNA反转录成的cDNA序列进行测序，产生数以千万计的reads数量，从而使得一段特殊的基因组区域的转录水平可以直接通过比对到该基因组区域的reads数来衡量。该技术常用来构建某一特定组织或细胞的基因表达谱，通过对正常组织和病变组织进行基因表达谱的分析，得到在两种组织中差异表达的基因，一方面为研究疾病的发生和发展的分子机制提供新的思路，另一方面为疾病的诊断和治疗提供新的诊断标记物或新的药物靶点。
利用高通量转录组测序筛选与口腔鳞状细胞癌密切相关的基因，不仅有利于研究口腔鳞状细胞癌的发生和发展的病理机制，而且为诊断和治疗口腔鳞状细胞癌提供新的诊断标志物或新的药物靶点。
发明内容
本发明利用高通量测序技术发现MYH7基因在口腔鳞状癌组织中的表达与在正常组织中的表达存在差异，与正常组织相比，MYH7基因在口腔鳞状癌组织中表达下调，通过检测MYH7基因转录水平的表达情况，可以判断受试者是否患有口腔鳞状癌。
本发明的目的在于提供MYH7基因在制备诊断口腔鳞状癌的试剂盒中的用途。所述诊断试剂盒包含SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增MYH7基因和管家基因的引物对。SYBR Green聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。
上述技术方案中，PCR缓冲液为本领域技术人员公知的现有技术，优选地，PCR缓冲液包含：25mM KCl，2.5mM MgCl2，200mM(NH4)2SO4。
引物对是本领域技术人员可以根据引物设计的常规设计原则设计；优选的实施方案中，扩增MYH7基因的正向引物序列为5’-ATGGACCTGGAGAATGAC-3’，反向引物序列为5’-CAATCCTTGCGTTGAGAG-3’；管家基因优选GAPDH，扩增该基因的正向引物序列为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’，反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。
在本发明的一个具体的实施方案中，本发明的诊断试剂盒还包含M-MLV逆转录体系，该逆转录体系包含：T重复寡核苷酸Oligo(dT)、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs。
优选逆转录反应液包含：250mM PH8.3的Tris-HCL，375mM的KCL，15mM的MgCl2，50mM的DTT。
RNA酶抑制剂可选用本领域常用的RNA酶抑制剂，优选为大肠杆菌表达的非竞争性抑制RNA酶的重组蛋白酶。
在本发明的一个具体的实施方案中，本发明的诊断试剂盒还包含RNA提取试剂，RNA酶提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。
本发明的诊断试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。
本发明的又一个目的在于提供一种诊断口腔鳞状癌的试剂盒。所述诊断试剂盒包含SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增MYH7基因和管家基因的引物对。所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、dNTPs、SYBRGreen荧光染料。
上述技术方案中，PCR缓冲液为本领域技术人员公知的现有技术，优选地，PCR缓冲液包含：25mM KCl，2.5mM MgCl2，200mM(NH4)2SO4。
引物对是本领域技术人员可以根据引物设计的常规设计原则设计；优选的实施方案中，扩增MYH7基因的正向引物序列为5’-ATGGACCTGGAGAATGAC-3’，反向引物序列为5’-CAATCCTTGCGTTGAGAG-3’；管家基因优选GAPDH，扩增该基因的正向引物序列为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’，反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。
在本发明的一个具体的实施方案中，本发明的诊断试剂盒还包含M-MLV逆转录体系，该逆转录体系包含：T重复寡核苷酸Oligo(dT)、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs。
优选逆转录反应液包含：250mM PH8.3的Tris-HCL，375mM的KCL，15mM的MgCl2，50mM的DTT。
RNA酶抑制剂可选用本领域常用的RNA酶抑制剂，优选为大肠杆菌表达的非竞争性抑制RNA酶的重组蛋白酶。
在本发明的一个具体的实施方案中，本发明的诊断试剂盒还包含RNA提取试剂，RNA酶提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。
本发明还提供了诊断口腔鳞状癌的方法，所述方法包括：
(1)利用RNA提取试剂提取样本总RNA；
(2)将步骤(1)获得的RNA逆转录成cDNA；
(3)在荧光实时定量PCR仪上将MYH7基因和管家基因进行扩增检测；
(4)通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量；
(5)MYH7基因表达下调，表明研究对象为口腔鳞状癌患者。
步骤(1)的具体实施方法为：收集样本后冻存于液氮，取出后把组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：
①加入Trizol，室温保存5min；
②加氯仿0.2ml，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5min-10min；
③12000rpm高速离心15min后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10min；
④12000rpm高速离15min后小心弃掉上清液，按1ml/ml Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗涤沉淀(4℃保存)，洗涤沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5min；
⑤弃去乙醇液体，室温下放置5min以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；
⑥用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-70℃。
步骤(2)的具体实施方法为：用逆转录缓冲液对1μg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mmol/L dNTP，0.1mmol/l DTT，30μmmol/l Oligo dT，200U/μl M-MLV RT，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。
步骤(3)的具体实施方法为：采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μM/μl)1μl，反向引物(5μM/μl)1μl，模板cDNA2.0μl，无酶水8.5μl；扩增MYH7基因的正向引物序列为5’-ATGGACCTGGAGAATGAC-3’，反向引物序列为5’-CAATCCTTGCGTTGAGAG-3’；扩增GAPDH基因的正向引物序列为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’，反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’，各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)*45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
本发明的优点和有益效果在于：(1)本发明首次公开了MYH7基因与口腔鳞状癌相关，MYH7基因有望成为诊断口腔鳞状癌的分子标志物，并为研究口腔鳞状癌的分子机理提供新的思路。(2)利用检测基因表达的方式诊断口腔鳞状癌的存在与否的方法更加灵敏，有利于疾病早期的诊断。
附图说明：
图1表示口腔癌RNA样品琼脂糖凝胶电泳，其中C代表癌变组织、P代表癌旁组织、N代表正常组织；
图2表示利用Agilent Technologies2100Bioanalyzer检测RNA样品的质量，其中图2a代表癌变组织、图2b代表癌旁组织、图2c代表正常组织；
图3表示总体基因表达普遍与Pearson关联系数高度相关(癌变与癌旁0.93图3a，癌变与正常0.93图3b)；
图4表示荧光实时定量PCR测定在正常组织和口腔鳞状癌中MYH7基因mRNA的相对表达量。
具体的实施方式：
下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。
实施例1筛选与口腔鳞状癌相关的基因
1.1样品收集
本项目共收集8例口腔鳞状癌及正常组织，分为三组(如表1所示)：
表1 研究对象分组
1.2RNA样品的制备及质量分析
1.2.1RNA样品的制备
三组样品包括癌变组织、癌旁组织、正常组织，经过RNA抽提后琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。从电泳结果初步认为提取的RNA样品质量合格，可以用于进一步的转录组分析。
1.2.2RNA样品的质量分析(NanoDrop1000分光光度计)
NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的结果如表2所示。每个样品体积均为100μl。RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。从表1可以看出，本研究的样品均达到转录组测序的要求。
表2 RNA样品的分光光度检测
1.2.3RNA样品的质量分析(Agilent Technologies2100Bioanalyzer)
Agilent Technologies2100Bioanalyzer检测RNA样品质量结果如图2所示，其中RIN(RNAintegrity number)指的是RNA完整性指数，是RNA质量的重要指标。从图中可以看出28S rRNA和18S rRNA主带明显，无降解，RIN合格，浓度达到要求，符合RNA-seq测序cDNA文库构建的要求，可以用于文库构建及测序。
1.3高通量转录组测序
1.3.1RNA-seq读段定位
首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHat v1.3.1将清洁片段与UCSC H.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，H.sapiens UCSC hg19版的预先构建的索引从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用TopHat方法的系统默认参数。
1.3.2转录丰度评估
匹配上的读段文件通过Cufflinks v1.0.3处理，Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。
1.3.3差异表达基因的检测
将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在Cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。
1.4结果
1.4.1转录组测序和匹配结果
我们进行分析的癌变、癌旁及正常组织三组样品来自于8例口腔鳞状癌患者。将这三组样品进行高通量cDNA测序。从这三个组织中我们分别得到4.85×107、4.91×107、4.46×107个读段对。我们利用TopHat将读段匹配到UCSC参考人基因组(hg19)，唯一匹配的读段对范围在4.04×107到4.49×107之间，匹配到Ensembl参考基因的读段比例在81％到89％之间。我们测序深度的平均覆盖度大概为人类基因组的130倍(按照Ensembl数据库唯一注释的外显子区域的总长度，大概为1.13×108)，另外只有1％的读段定位到rRNA，表明我们的数据库构建合理，较可靠地表现带有ployA尾巴的RNA的表达。
1.4.2差异表达基因的分析
为了计算基因的表达从而鉴定出不同样品间的差异表达基因，我们利用Cuffdiff方法估计基因的表达，从而鉴定表达失调的基因。每个基因的标准化的表达水平按照每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目(FPKM)计算。将FPKM设计定为＞1，分别在癌变、癌旁及正常组织，我们检测到14854-15168个表达基因，其中包括大部分注释的人类参考基因。我们进一步分析不同样品之间基因表达的相关性。总体基因表达普遍与Pearson关联系数高度相关。(癌变与癌旁0.93图3A，癌变与正常0.93图3B)
我们检测到癌变与癌旁组织之间有252个差异表达基因，癌变与正常组织之间有234个差异表达基因。值得注意的是癌变组织比其他两种组织产生更多表达失调的基因(癌变与癌旁252个基因，癌变与正常234个基因)。
实施例2QPCR验证候选基因与口腔鳞状癌的关系
基于前期高通量转录组深度测序的结果，根据p valu的大小，我们选择MYH7基因(与正常组织和癌旁组织相比，其表达在口腔鳞状癌组织中下调)进行验证。收集5对口腔鳞状癌组织样本和口腔鳞状癌旁组织样本，同时收集5个正常组织样本，采用荧光实时定量PCR进行经典的分子生物学实验验证(qRT-PCR)，具体操作步骤如下所示：
(1)RNA提取
收集样本后冻存于液氮，取出后把组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：
①加入Trizol，室温保存5min；
②加氯仿0.2ml，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5min-10min；
③12000rpm高速离心15min后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10min；
④12000rpm高速离15min后小心弃掉上清液，按1ml/ml Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗涤沉淀(4℃保存)，洗涤沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5min；
⑤弃去乙醇液体，室温下放置5min以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；
⑥用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-70℃。
(2)逆转录
用逆转录缓冲液对1μg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mmol/L dNTP，0.1mmol/l DTT，30μmmol/l Oligo dT，200U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。
(3)QPCR扩增检验
采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μM/μl)1μl，反向引物(5μM/μl)1μl，模板cDNA2.0μl，无酶水8.5μl；扩增MYH7基因的正向引物序列为5’-ATGGACCTGGAGAATGAC-3’，反向引物序列为5’-CAATCCTTGCGTTGAGAG-3’；，扩增GAPDH基因的正向引物序列为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’，反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’，各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)*45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量，结果如图1所示，与正常组织和癌旁组织相比，MYH7基因在口腔鳞状癌组织中的表达下调，同RNA-sep结果一致。
实施例3口腔鳞状癌诊断试剂盒的制备
根据MYH7基因与口腔鳞状癌的相关性，可以通过检测MYH7基因的表达情况来诊断口腔鳞状癌是否发生，据此本发明提供了一种基于检测MYH7基因表达来诊断口腔鳞状癌的试剂盒，该诊断试剂盒中的组分如下：SYBR Green聚合酶链式反应体系；扩增MYH7基因和GAPDH基因的引物对。扩增MYH7基因的正向引物序列为5’-CTGTAAGGCTTCTGGATA-3’，反向引物序列为5’-TACTTGGTATAAGAGTCACT-3’；扩增GAPDH的正向引物序列为5’-AACTCTGGTAAAGTGGATATTG-3’，反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。SYBR Green聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。PCR缓冲液成分为：25mM KCL，2.5mM MgCL2、200mM(NH4)2SO4。
实施例4口腔鳞状癌诊断试剂盒的制备
根据MYH7基因与口腔鳞状癌的相关性，可以通过检测MYH7基因的表达情况来诊断口腔鳞状癌是否发生，据此本发明提供了一种基于检测MYH7基因表达来诊断口腔鳞状癌的试剂盒，该诊断试剂盒中的组分如下：SYBR Green聚合酶链式反应体系、扩增MYH7基因和GAPDH基因的引物对、M-MLV逆转录体系。扩增MYH7基因的正向引物序列为5’-CTGTAAGGCTTCTGGATA-3’，反向引物序列为5’-TACTTGGTATAAGAGTCACT-3’；扩增GAPDH的正向引物序列为5’-AACTCTGGTAAAGTGGATATTG-3’，反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。SYBR Green聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。PCR缓冲液组分为：25mM KCL、2.5mMMgCL2、200mM(NH4)2SO4。M-MLV逆转录体系组分为：T重复寡核苷酸Oligo(dT)、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs。逆转录反应液组分为：250mM Tris-HCL(PH8.3)、375mM KCL、15mM MgCL2、50mM的DTT。RNA酶抑制剂为大肠杆菌表达的非竞争性抑制RNA酶的重组蛋白酶。
实施例5口腔鳞状癌诊断试剂盒的制备
根据MYH7基因与口腔鳞状癌的相关性，可以通过检测MYH7基因的表达情况来诊断口腔鳞状癌是否发生，据此本发明提供了一种基于检测MYH7基因表达来诊断口腔鳞状癌的试剂盒，试剂盒中的组分如下：SYBR Green聚合酶链式反应体系、扩增MYH7基因和GAPDH基因的引物对、RNA提取试剂。扩增MYH7基因的正向引物序列为5’-CTGTAAGGCTTCTGGATA-3’，反向引物序列为5’-TACTTGGTATAAGAGTCACT-3’；扩增GAPDH的正向引物序列为5’-AACTCTGGTAAAGTGGATATTG-3’，反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。SYBR Green聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。PCR缓冲液组分为：25mM KCL、2.5mM MgCL2、200mM(NH4)2SO4。RNA提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。
实施例6口腔鳞状癌诊断试剂盒的制备
根据MYH7基因与口腔鳞状癌的相关性，可以通过检测MYH7基因的表达情况来诊断口腔鳞状癌是否发生，据此本发明提供了一种基于检测MYH7基因表达来诊断口腔鳞状癌的试剂盒，试剂盒组分如下：SYBR Green聚合酶链式反应体系、扩增MYH7基因和GAPDH基因的引物对、M-MLV逆转录体系、RNA提取试剂。扩增MYH7基因的正向引物序列为5’-CTGTAAGGCTTCTGGATA-3’，反向引物序列为5’-TACTTGGTATAAGAGTCACT-3’；扩增GAPDH的正向引物序列为5’-AACTCTGGTAAAGTGGATATTG-3’，反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。SYBR Green聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。PCR缓冲液组分为：25mM KCL、2.5mM MgCL2、200mM(NH4)2SO4。M-MLV逆转录体系组分为：T重复寡核苷酸Oligo(dT)、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs。逆转录反应液组分为：250mM的Tris-HCL(PH8.3)、375mM的KCL、15mM的MgCL2，50mM的DTT。RNA酶抑制剂为大肠杆菌表达的非竞争性抑制RNA酶的重组蛋白酶。RNA提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.MYH7基因在制备诊断口腔鳞状癌的试剂盒中的用途，其特征在于，所述诊断试剂盒包含SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增MYH7基因和管家基因的引物对；所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包含：PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述扩增MYH7基因的引物对的序列如下：正向引物序列为5’-ATGGACCTGGAGAATGAC-3’，反向引物序列为5’-CAATCCTTGCGTTGAGAG-3’；所述管家基因是GAPDH，扩增GAPDH基因的正向引物序列为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’，反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述PCR缓冲液包含：25mMKCL、2.5mM MgCL2、200mM(NH4)2SO4。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其特征在于，所述诊断试剂盒还包含M-MLV逆转录体系和/或RNA提取试剂；所述逆转录体系包含：T重复寡核苷酸Oligo dT、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs；所述RNA提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述逆转录反应液包含：250mM PH8.3的Tris-HCL、375mM的KCL、15mM的MgCL2、50mM的DTT。
6.一种口腔鳞状癌的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒包含SYBRGreen聚合酶链式反应体系、用于扩增MYH7基因和管家基因的引物对；所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包含：PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。
7.根据权利要求6所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述扩增MYH7基因的引物对的序列如下：正向引物序列为5’-ATGGACCTGGAGAATGAC-3’，反向引物序列为5’-CAATCCTTGCGTTGAGAG-3’；所述管家基因是GAPDH，扩增GAPDH基因的正向引物序列为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’，反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。
8.根据权利要求6所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液包含：25mM KCL、2.5mM MgCL2、200mM(NH4)2SO4。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒还包含M-MLV逆转录体系和/或RNA提取试剂；所述逆转录体系包含：T重复寡核苷酸Oligo dT、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs；所述RNA提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。
10.根据权利要求9所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述逆转录反应液包含：250mM PH8.3的Tris-HCL、375mM的KCL、15mM的MgCL2、50mM的DTT。
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