CN104059154A - 一种新的具有抗心力衰竭作用的钠尿肽嵌合体cnaac - Google Patents
一种新的具有抗心力衰竭作用的钠尿肽嵌合体cnaac Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有舒张血管、利尿、保护心肌作用新的钠尿肽嵌合体-CNAAc。CNAAc是由CNP的氨基端加上ANP的环状结构和羧基端构成的新型钠尿肽分子(附图)。该钠尿肽嵌合体具有非内皮依赖性舒张血管的作用和较强的利尿作用，其舒张作用远高于天然钠尿肽ANP或CNP，并可能是通过NPR/cGMP/PKG信号通路发挥作用的。CNAAc可以显著抑制大鼠心力衰竭发生过程中心肌肥厚的产生，改善大鼠的心肌酶学指标和心脏功能，显著减轻心力衰竭大鼠的心肌梗死程度和心肌纤维化程度。这种具有心肌保护和抗心力衰竭作用的新型钠尿肽嵌合体可用于学术研究，也可为临床应用防治心力衰竭提供可能的新药，因而具有良好的科学研究价值和临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及应用新型钠尿肽类药物防治心力衰竭的基础研究和临床研究领域。
背景技术
心脑血管疾病是世界公认的人类健康的“第一杀手”，其中心力衰竭是众多器质性心脏病如心肌梗死、肺源性心脏病、肥厚型心肌病等几乎不可避免的结局，严重威胁人类健康。钠尿肽家族因其具有显著的利钠、利尿、舒血管和抑制增殖等多样化作用，目前已被广泛应用于心力衰竭的基础和临床研究。
钠尿肽家族是一组结构相似的内源性肽的家族，其成员包括心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)、脑钠尿肽(brain natriuretic peptide，BNP)、C-型钠尿肽(C-type natriuretic peptide，CNP)及D型钠尿肽(D-type natriuretic peptide，DNP)等，是由氨基端、环状结构和羧基端组成的多肽结构。人工合成的ANP和BNP类似物已经在HF治疗中得到了广泛应用，但由于化学合成效率低、成本昂贵、易被机体降解等问题，其应用受到了一定限制。新出现的NPs嵌合体分子有望为以上问题提供新的解决途径。
研究发现，ANP的羧基端的5个氨基酸残基在利尿方面起到重要作用，而环状结构可能与受体结合及产生舒血管等作用有关。因此我们对ANP分子进行改造：保留ANP分子的环状结构和羧基端，与CNP的氨基端进行组合，获得一种新型钠尿肽嵌合体CNAAc。改造后的钠尿肽嵌合体具有显著地舒张血管、利尿、保护心肌作用。这种新型钠尿肽嵌合体可用于学术研究，也可为临床应用钠尿肽嵌合体防治心力衰竭提供可能的新药，因此具有良好的科学研究价值和应用前景。
发明内容
CNAAc的命名以其结构组成而来：即CNP的氨基端(CN)加ANP的环状结构(A)和ANP的羧基端(Ac)。CNAAc理论分子量为2837.1g/mol，氨基酸序列为GLSKG CFGGRMDRIGAQSGLGC NSFRY，两个半胱氨酸残基之间以二硫键相连(图1)。我们委托上海吉尔生化有限公司进行CNAAc的合成，合成产物呈白色粉末状。通过高效液相色谱-质谱联用检测纯度在95％以上，所测分子量与理论值相一致。
为了检测CNAAc的作用，我们做了以下几方面的实验研究。详细的实验方法、步骤见具体实施方式。
一、CNAAc舒血管作用的研究
CNAAc舒血管效应的研究是通过分离大鼠腹主动脉后，应用离体血管环灌流实验来实现的。
(一)CNAAc与ANP、CNP舒血管作用的比较
首先将灌流浴槽中血管的基础张力定为1g，将去甲肾上腺素加入10ml的浴槽中，使其终浓度为10-6M，其可引起显著的血管收缩作用。将CNAAc按浓度梯度加入浴槽，使浴槽中CNAAc的终浓度依次为10-10、10-9、10-8、10-7、10-6M。实验结果表明：CNAAc可以剂量依赖性地舒张大鼠的离体腹主动脉(图2A)，且其最大舒张效应远高于其“母体”CNP或ANP (图2B)，在保留内皮和去内皮组其舒张效应没有显著性差异(图2C)。
(二)CNAAc舒血管机制的研究
应用钠尿肽受体A阻断剂ab14356(1∶1000)、鸟苷酸环化酶(guanylate cyclase，GC)抑制剂镁蓝(methylene blue，MB，10-5M)可以部分阻断CNAAc的舒张作用(图3A，3B)，应用cGMP依赖性蛋白激酶G(PKG)抑制剂KT5823(10-6M)可将CNAAc的舒张作用完全阻断(图3C)，说明CNAAc可能通过NPR/cGMP/PKG信号通路发挥舒张血管的作用。
上述结果表明：新合成的钠尿肽嵌合体CNAAc具有显著地不依赖于内皮的舒张动脉的作用，且可能是通过NPR/cGMP/PKG信号通路发挥作用的。
二、CNAAc利尿作用的研究
按照图4所述步骤，Sham组大鼠在经颈静脉给予CNAAc后，尿量较基础期增加了约10倍，与Sham+NS组相比有非常显著性差异(P<0.01)；HF组给予CNAAc后，尿量较基础期增加了约5倍，与HF组给予生理盐水后尿量的增加有非常显著性差异(P<0.01)(图5)。
三、CNAAc对心力衰竭大鼠心脏的保护作用
CNAAc对心力衰竭大鼠心脏的保护作用的实验研究，是通过结扎大鼠的冠状动脉左前降支建立大鼠心力衰竭模型来实现的。
(一)CNAAc对大鼠心肌肥厚的影响
心肌肥厚是多种心血管病的共同病理过程，也是心力衰竭发生的结果。
HF及HF+CNAAc组在术后4周时BW均显著性降低(P<0.01)，HF组的HW/BW、LVW/BW与对照组相比均显著增加，表明心肌肥厚的发生，经过4周的给药后，HF+CNAAc组的HW/BW、LVW/BW与HF组相比显著降低(P<0.01)(表1)。
表1CNAAc对大鼠心肌肥厚指数的影响
BW：体重；HW：心脏重量；LVW：左心室重量
**P<0.01vs.Sham；#P<0.05，##P<0.01vs.HF.
(二)CNAAc对大鼠心脏功能的影响
心脏超声心动图显示HF组的左室前壁搏动幅度减弱，心室容积增大(图6A)；与对照组相比，HF组的各项指标均有非常显著性改变(P<0.01)(图6B，6C，6D，6E，6F，6G)；与HF组相比，HF+CNAAc组大鼠的EF、FS显著增加(P<0.01)、LVEDd显著降低(P<0.05)、LVESd、LVEDV和LVESV非常显著性降低(P<0.01)。
(三)CNAAc对大鼠血流动力学指标的影响
与对照组相比，HF组的各项指标即LVSP、±dp/dtmax与对照组相比显著降低(P<0.01)， LVEDP显著增高(P<0.01)；在HF+CNAAc组，LVSP和±dp/dtmax与HF组相比显著性增加，而LVEDP显著性减少(P<0.01，表2)。
表2CNAAc对大鼠血流动力学指标的影响(n＝6，)
HR：心率；LVSP：左室收缩压；LVEDP：左室舒张末压；±dp/dtmax：左室内压最大变化速率
**P<0.01vs.Sham；#P<0.05，##P<0.01vs.HF.
(四)CNAAc对心力衰竭大鼠血清心肌酶学指标的影响
按照测试试剂盒说明书所述方法步骤，我们分别对各实验组大鼠血清中的乳酸脱氢酶(LDH)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)的水平进行了测定。LDH和cTnI存在于正常心肌细胞胞浆中，只有在心肌细胞受到损伤或者坏死时，它们会大量的释放到血液中。因此，检测血清中这些物质的含量可以反映心肌受损程度。
实验结果显示，与Sham组相比，HF组的LDH、cTnI的水平均有非常显著地升高(P<0.01)，说明HF组大鼠心肌严重受损；与HF组相比，HF+CNAAc组的LDH、cTnI的水平明显降低(P<0.01)(图7)。
(五)CNAAc对HF大鼠心肌梗死面积和胶原容积分数的影响
Masson染色显示HF组和HF+CNAAC组左室壁发白、变薄，呈现明显的心肌梗死(图8A)。光镜下显示，心肌梗死边缘区的心肌细胞呈现为暗红色，胶原纤维呈蓝色，细胞核为蓝褐色(图8B，400×)。经过4周腹腔注射CNAAC后，HF+CNAAC组的梗死面积与HF组相比显著减少(P＜0.01)(图8C)。如图8D所示，HF组的心肌胶原容积分数CVF为21.5±2.20％，经过4周腹腔注射CNAAC后，HF+CNAAC组的CVF为12.0±0.68％，与HF组相比显著减少(P＜0.01)。
上述结果表明CNAAc可以显著抑制大鼠心力衰竭发生过程中心肌肥厚的产生，改善大鼠的心肌酶学指标和心脏功能，显著减轻HF大鼠的心肌梗死程度和心肌纤维化程度。
总之，本研究表明，新设计合成的钠尿肽嵌合体CNAAc具有显著地舒张血管、利尿、心肌保护和抗心力衰竭作用，这一结果可为临床应用CNAAc防治心力衰竭提供重要的理论和实验基础，因此具有良好的科学研究价值和应用前景。
附图说明
图1 CNAAC的结构示意图
图2 CNAAC舒张大鼠腹主动脉的研究
A：CNAAC剂量依赖性舒张大鼠的腹主动脉；B：CNAAC与天然钠尿肽舒张作用的比较(各钠尿肽的终浓度为10-6M)；C：CNAAC对保留内皮和去内皮大鼠腹主动脉的舒张作用
**P＜0.01vs.Control，##P＜0.01vs.CNP，&&P＜0.01vs.ANP.n＝6
图3 ab14356、MB、KT5823对CNAAC舒张大鼠腹主动脉作用的影响
**P＜0.01vs.CNAAC.n＝6
图4 CNAAC对尿量的影响实验设计图
图5 CNAAC对正常和心力衰竭大鼠尿量的影响
将各组基础期的尿量设为1，各组给予生理盐水或CNAAC后的尿量则记为各基础期尿量的倍数.**P＜0.01vs.Sham+NS，##P＜0.01vs.HF+NS.n＝6
图6 超声心动图检测CNAAC对大鼠心脏功能的影响
A：各组大鼠超声心动图；B、C、D、E、F、G：CNAAC对各组大鼠心脏功能的影响；
EF：射血分数，FS：左室缩短率，LVEDd：左室舒张末期内径，LVESd：左室收缩末期内径，LVEDV：左室舒张末期容积，LVESV：左室收缩末期容积.
**P＜0.01vs.Sham；#P＜0.05，##P＜0.01vs.HF.n＝6
图7 CNAAC对心力衰竭大鼠血清心肌酶学指标的影响
**P＜0.01vs.Sham，#P＜0.05，##P＜0.01vs.HF.n＝6
图8 心脏马松染色结果
A：心脏横截面马松染色结果(体视镜，虚线箭头所指部分为梗死区)，B：马松染色结果显示各组胶原含量(光镜，400×，实线箭头所指部分为染成蓝色的胶原纤维)，C：CNAAC对大鼠心肌梗死面积的影响，D：CNAAC对大鼠心肌胶原容积分数的影响.
**P＜0.01vs.Sham.##P＜0.01vs.HF.n＝6
图9 CNAAC的设计理念
具体实施方式
一、CNAAC的设计理念(图9)
二、大鼠离体血管环灌流实验
(一)CNAAc舒血管效应的研究及血管内皮对舒张作用的影响
成年健康雄性SD大鼠经戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉后，迅速分离并剪取腹主动脉，放入预冷氧饱和的K-H液中，用显微镊仔细去除血管周围的结缔组织，制备成长约3mm的环形标本。将血管环悬挂于37℃的持续通入95％O2和5％CO2的混合气体的Kreb’s液浴槽中。连接张力换能器，记录血管环张力的变化，腹主动脉血管环的前负荷(基础张力)设为1g。平衡1h后加入NE(10-6M)引起血管收缩作为预刺激(收缩幅度小于300mg者弃去)，然后反复冲洗洗去药物。稳定30min后再次给予NE(10-6M)引起血管收缩，待张力稳定后，分别给予生理盐水(对照)、NPs及嵌合体(10-10～10-6M)，制作累积浓度-舒张反应曲线，若血管张力可恢复至加NE之前的水平，则认为是100％的舒张，计算出最大舒张反应值＝药物引起的舒张反应值/NE引起的收缩反应值。血管内皮对NPs嵌合体舒张作用的影响实验中血管环制备方法同上操作，其中一半血管环用浸有K-H液的拭子轻轻在血管内皮表面转动以去除内皮，之后操作与上述相同。
(二)CNAAc舒血管机制的研究
动物的处理和血管环的制作、平衡按照2.1步骤操作，平衡1h后加入NE(10-6M)进行预收缩检查血管活性，将收缩幅度小于300mg者弃去，反复冲洗使血管的张力恢复至基线水平。接着稳定30min后重新加入NE(10-6M)使血管收缩，待收缩达到稳定后，分别加入抗 NPR-A抗体ab14356(1∶1000)、鸟苷酸环化酶(guanylate cyclase，GC)抑制剂镁蓝(methylene blue，MB)(10-5M)或cGMP依赖性蛋白激酶(PKG)的抑制剂KT5823(10-6M)，稳定15min后按顺序加入CNAAc，使其在浴槽中的终浓度依次从10-10至10-6M，观察其舒张作用是否受到影响。
三、大鼠心力衰竭模型的建立和实验分组
成年健康SD雄性大鼠腹腔内注射戊巴比妥钠40mg/kg进行麻醉，固定。常规记录肢体II导联心电图。左胸备皮消毒，用小型动物呼吸机及大鼠呼吸面罩(国家发明专利：ZL200810150927.8)给予正压呼吸，于大鼠胸骨左缘第3～5肋间进行开胸，暴露心脏并打开心包膜，于在左心耳和肺动脉圆锥之间、冠状动脉左前降支进行穿线(5/0丝线)结扎。观察心电图ST段明显抬高、左室前壁和心尖部位颜色变暗，搏动减弱作为结扎成功的标志。挤压胸腔排气后逐层缝合关闭胸腔，撤离呼吸机及呼吸面罩，待大鼠呼吸平稳时放笼饲养。
(一)CNAAc对正常及心力衰竭大鼠尿量的影响
本实验分为2组，(1)Sham组，该组大鼠开胸后，对左冠状动脉只穿线，不结扎。(2)HF组，该组大鼠按前文所述方法进行冠脉结扎。Sham组和HF组大鼠手术后均正常喂养4周后进行下一步实验。
造模4周后，将Sham和HF组再各自分为两个组，分别为Sham+NS组、Sham+CNAAc组、HF+NS组和HF+CNAAc组，每组各6只。每组大鼠麻醉后进行颈静脉插管建立给药途径，采用去膀胱导尿法收集大鼠尿量。大鼠经颈静脉按1ml/100g/h0.9％的NaCl溶液。手术稳定30min后，经过15min的基础期(Baseline period)，之后紧接着是15min的给药期(Bolus period)，每组分别经颈静脉推注0.1ml的CNAAc(Sham+CNAAc组和HF+CNAAc组，剂量50μg/kg)或0.9％的NaCl溶液(Sham+NS组和HF+NS组)，(具体操作如图4所示)，收集整个基础期和给药期的尿液并分别测量记录尿量。
(二)CNAAc对心力衰竭大鼠心脏的保护作用
将实验动物分为三组，分别为假手术组(Sham)、心力衰竭组(HF)、给药组(HF+CNAAc)造模方法如前文所述，HF组结扎冠状动脉左前降支4周以建立HF模型，HF+CNAAc组结扎冠状动脉左前降支术后当天开始，连续腹腔注射CNAAc4周(50μtg/kg/2d)，每组各保证存活12只以便进行下步实验。
术后4周每组大鼠均作超声心动图检查。测量LVEDd、LVESd、LVEDV、LVESV、EF、FS。超声心动图检查完毕第二日，每组各取6只大鼠，经40mg/kg戊巴比妥钠麻醉大鼠，常规记录肢体II导联心电图。行气管插管术给予大鼠正压呼吸，分离大鼠右侧颈动脉并进行左心室插管，利用多道生理记录仪连续同步记录记录大鼠血流动力学指标HR、LVSP、LVEDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax。大鼠心功能检测完毕之后通过右侧颈动脉取血，加入含有EDTA的抗凝 管中，3000rpm、4℃离心20min后取血清分装存入-20℃冰箱待用。之后立即开胸，取出心脏置于冷的生理盐水中冲洗去血液，用滤纸吸干水分并称重，测得心脏重量(HW)和左心室重量(LVW)。
采用马松染色(Masson’s trichrome stain)法进行心肌梗死面积和胶原容积分数的检测。造模4周后，对照组、HF组及HF+CNAAc组大鼠各取6只进行心肌梗死面积的测定。采用40mg/kg戊巴比妥钠麻醉大鼠后，快速摘取大鼠心脏并用冰的生理盐水冲洗干净，用10％的多聚甲醛固定48h后进行石蜡包埋，之后切片并分别进行Masson染色。Masson染色中胶原纤维为蓝色，肌纤维、细胞质和红细胞为红色，细胞核为蓝褐色。心肌梗死面积(％)＝心肌梗死区弧长/(心室内周长+心室外周长)/2×100％。每张Masson染色切片在400×镜下随机选取6张心肌梗死边缘区进行照相，用Image-Pro Plus6.0图像分析软件计算每张图像上的胶原面积，心肌胶原容积分数(collagen volume fraction，CVF)(％)＝胶原面积/心肌总面积×100％。
Claims (2)
1.对心房钠尿肽和C-型钠尿肽进行改构重组，首次获得了新型钠尿肽嵌合体CNAAc。
2.CNAAc的特征在于：它可通过钠尿肽A受体介导了剂量依赖性的舒张血管作用，且这种舒张作用具非内皮依赖性；它可以显著地增加正常及心力衰竭大鼠的尿量；CNAAc可以显著抑制大鼠心力衰竭发生过程中心肌肥厚的产生，改善大鼠的心肌酶学指标和心脏功能，显著减轻心力衰竭大鼠的心肌梗死程度和心肌纤维化程度。这种具有扩血管、利尿、心肌保护作用的新型钠尿肽嵌合体可用于学术研究，也可为临床应用钠尿肽嵌合体防治心力衰竭提供新的理论和实验依据。
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