CN104055787A - 药用水溶性抗真菌大分子化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及治疗感染疾病的药用水溶性抗真菌大分子化合物。具体地说，本发明涉及一种多聚结合物，其包括活性药物和大分子聚合物，所述活性药物与所述大分子聚合物通过化学键结合。所述活性药物是多烯大环内酯类化合物例如两性霉素B。本发明还提供了制备所述多聚结合物的方法，提高活性药物的溶解度的方法，以及治疗真菌感染的疾病的方法，所述真菌感染的疾病是任何与真菌有关的疾病，例如败血症、心内膜炎、脑膜炎(隐球菌及其他真菌)、腹腔感染(包括与透析相关者)、肺部感染、尿路感染等。本发明多聚结合物在生物学和/或物理学和/或化学性能方面显示优良的性质。

Description

药用水溶性抗真菌大分子化合物
技术领域
本发明涉及医用抗真菌感染药物，特别涉及可用于治疗感染性疾病的多烯大环内酯类抗生素例如两性霉素B与聚合型大分子肽类或多糖化合而形成的多聚结合物(polyconjunctions)，更具体地涉及聚合型大分子肽类、多糖或糖肽类与多烯大环内酯类化合物例如两性霉素B经化合反应形成的多烯大环内酯类化合物多聚结合物例如两性霉素B多聚结合物。
背景技术
多烯类化合物(亦可称为多烯类抗生素、多烯大环内酯类抗生素、多烯类、多烯类抗真菌药等)，是一类含有共轭多烯和羟基的大环内酯类化合物，其典型实例有两性霉素B、制霉菌素、那他霉素、曲古霉素、美帕曲星、克念菌素、菲律平、金色制霉素、意北霉素、汉霉素、表霉素等。多烯类抗生素是临床上应用最早的抗真菌药，其作用机制是通过与敏感真菌细胞膜上的甾醇相结合，损伤细胞膜的通透性，导致细胞内重要物质如钾离子、核苷酸和氨基酸等外泄，破坏细胞的正常代谢从而抑制其生长。
两性霉素B(Amphotericin B，在本发明中亦可简称为AB)，其例如已收载于2010年版中国药典，具有如下结构式、分子式和分子量：
两性霉素B是临床上的抗真菌感染药物。它通过影响真菌细胞膜的通透性从而发挥抑制真菌生长的作用。多用于治疗严重的深部真菌引起的内脏或全身感染。两性霉素B是从链霉菌(Streptomycesnodosus)的培养液中分离而得的多烯类化合物。它在化学上为多烯大环内酯类物质(polyene macrolide substances)，在其38元内酯环内有7个均为反式构型的共轭双键，而该内酯环又通过O-糖苷键与氨基糖D-海藻糖胺键接。它在二甲亚砜中溶解，在二甲基甲酰胺中微溶，在甲醇中极微溶解，在水、无水乙醇、氯仿或乙醚中不溶。在中性或酸性介质中可形成盐，其水溶性增高但抗菌活性会下降。两性霉素B是兼具两性的，在分子内具有亲脂区和亲水区，这使得它能够与存在于真菌细胞质膜内的甾醇形成复合物，从而导致细胞通透性受损。由于细菌细胞膜不含甾醇，所以两性霉素B的抗生素作用选择性地针对真菌。
由于两性霉素B具有广谱的作用，该作用包括实际上所有致人疾病的真菌，所以它是用于全身性治疗人的真菌感染的首选药物。特别是在免疫系统受损的患者如HIV或癌症患者中，相关侵入性真菌感染的治疗近年来急剧增加。
另一方面，使用两性霉素B伴随有副作用，并且这种负作用有时相对严重。在全身性真菌病和器官真菌病中，通常以0.5-0.7mg/kg体重的日剂量静脉给予两性霉素B。然而，由于不同患者对两性霉素B的耐受性不同，所以必须对剂量进行个体调整或改变。此外，免疫系统受损的患者一般要求的剂量高于常规量，例如1mg/kg体重的日剂量，这一剂量在重型疾症中(如果耐受性好)可以提高到1.5mg/kg。在这一点上肠胃外给药的持继时间可以从数周延长至数月。
在肠胃外治疗的过程中，通常会发生典型的输液反应，例如发热、呕吐和颤抖的发作，对这些反应通常只是做对症治疗，不必中断输液治疗。但更为严重的是常常发生的肝功能障碍，特别是肾功能障碍。因此，例如，在治疗开始时，肾小球滤过率总是下降40%左右。所治疗的多数患者在整个治疗过程中都维持这种低肾小球滤过率。因此血清中的肌酸酐和血液中的脲升高。偶尔甚至可在治疗期过后现察到不可逆损伤。治疗二至三周后，还常出现贫血，这会使血细胞比容水平降至25-30%。但血细胞计数的变化一般在治疗结束后完全可以逆转。
由于两性霉素B具有毒性和副作用，因此应当只在有生命危险的情况下给药。另一方面，在由免疫系统失调(如艾滋病或器官移植后)引起的真菌病中，它又经常是唯一有效的药物。
尽管两性霉素B在分子内有亲水域，但在整体上仍呈现出显著的疏水性质，因此在生理pH下几乎不溶于水，即便在有机溶剂中也只是微溶。因此，现有的市售制剂是结构较为复杂的药物形式，被一些额外的缺点所阻碍。用适宜的增溶剂如脱氧胆酸钠能提高水溶性。因此，例如，由BRISTOL-MYERSSQUIBB生产的用于输注的原研制剂(在德国可以以商品名“Amphotericin B”得到)是以冻干粉剂的形式存在的，其必须在水中复溶而呈两性霉素B和脱氧胆酸钠在水中的胶束分散体形式。为获得立即可用的输注溶液，可以仅用无电解质载体溶液如5%葡萄糖溶液将所获得的原液稀释至所需的终浓度。
此外，该制剂仅显示出很有限的治疗指数，即有效剂量和有毒剂量之间的间隔很窄。此外，尽管两性霉素B具有较为广谱的作用，该制剂在某些临床情况下仍然效果较差，因为活性物质不能到达真菌感染部位或到达真菌感染部位的浓度不够，致使两性霉素B在该部位不能呈现其特有的抗真菌作用或作用不足。
为克服此原初制剂的这些缺点，已研制出了一系列属于脂类制剂的两性霉素B制剂，例如类脂与两性霉素B的脂类复合物、胆固醇硫酸酯与两性霉素B的胶体分散体、以及包裹在脂质体中的两性霉素B。所用这些药物形式都具有较大的治疗指数和较高的耐受性，特别是相对于常规两性霉素B脱氧胆酸盐制剂具有较低的肾毒性，因此这些药物形式也可以以较高的剂量给药，但是在高剂量下上述副作用仍不能完全避免。
另外，这些两性霉素B脂类制剂的一个严重不足是生产成本很高，因此售价也很高。此外，这些复杂药物形式仍必须费事地进行复溶以得到其可直接给药的形式。尽管两性霉素B脂类制剂的治疗范围得到了改善，但由于有上述不足和其他不足，这些制剂在市场上并没有被广泛接受。
目前临床上两性霉素B的药效是非常肯定的，但主要存在的问题是：1.药物水溶性差，没有很好的静脉给药剂型；2.毒、副作用太大，给药剂量受限；3.由于给药剂量受限，给药剂量只能逐渐增加，因此、临床疗效打折扣，同时临床上容易产生耐药性。
目前临床上使用的两性霉素B制剂主要有：
注射用两性霉素B，其是最早应用于临床的两性霉素B制剂，以脱氧胆酸钠为其增溶辅料以在复溶后形成胶体分散液，例如华北制药股份有限公司产(国药准字H13020283)，临床适应症为：适用于敏感真菌所致的深部真菌感染且病情呈进行性发展者，如败血症、心内膜炎、脑膜炎(隐球菌及其他真菌)、腹腔感染(包括与透析相关者)、肺部感染、尿路感染和眼内炎等；
注射用两性霉素B脂质体，其是以例如胆固醇硫酸钠、氨丁三醇、EDTA二钠、单水乳糖、盐酸制成的脂质体制剂，例如Three Rivers Pharmaceuticals.LLC的进口产品(商品名：安浮特克，Amphotec，批准文号H20090964)，这些脂质体制剂的适应症为：适用于患有深部真菌感染的患者；因肾损伤或药物毒性而不能使用有效剂量的两性霉素B的患者，或已经接受过两性霉素B治疗无效的患者均可使用；
两性霉素B脂质复合物注射液，其例如是Sigma-tau制药公司生产的商品名为的产品，其是以二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(L-α-dimyristoylphosphatidylcholine，DMPC)和二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(L-α-dimyristoylphosphatidyl glycerol，DMPG)二者以7:3摩尔比为脂质成分，药物与两种脂质成分以1:1摩尔比复合形成的无菌无热源的混悬型静脉注射液，该注射液的适应症为：适用于治疗侵袭性真菌感染患者，该患者对常规的两性霉素B治疗无效或者不耐受。
注射用两性霉素B脂质体，为供静脉注射用的无菌无热源冻干品，每瓶含有插入于脂质膜中的50mg两性霉素B，该脂质膜组成为213mg氢化大豆卵磷酯、52mg胆固醇、84mg二硬脂酰磷脂酰甘油、0.64mg的α生育酚，还包括900mg蔗糖和27mg六水合琥珀酸二钠；该适用于发热、中性白细胞减少症患者推测为真菌感染的经验性治疗，HIV感染患者隐球菌性脑膜炎，对两性霉素B脱氧胆酸钠无效的曲霉、念珠菌和/或隐球菌感染，或者对两性霉素B脱氧胆酸钠有肾损伤或不能接受的毒性的患者等的治疗；——可见以脂质体为载体为克服两性霉素B的某些缺陷例如副作用的方法（剂型）已得到了临床治疗的认可。
但是在上述两性霉素B脂质复合物注射液和的产品说明书中明确记载了如下黑体注意事项：与未囊化或未与脂质组合的药物相比，脂质体微囊化或者掺入脂质复合物中总体上可以影响药物的功能特征；此外，具有相同活性成分的不同的脂质体或脂质复合物产品可能会因化学组成以及脂质成分的物理形态而改变；这类差异可影响这些药的产品的功能特征(例如参见http://www.rxlist.com/abelcet-drug.htm)。可见，本领域公知的是，即对于同一活性药物例如两性霉素B，其存在于不同的给药载体可能会赋予药物完全不同的、不可预见的物理化学性质甚至是生物学性质。
鉴于已经发现两性霉素B存在诸多使用上的不足，本领域技术人员仍然期待提供一种治疗感染性疾病例如因真菌感染引发的疾病的方法，例如期待提供一种以两性霉素B为活性物质来治疗上述疾病的方法；并且期待这种方法，包括由该方法提供的治疗剂具有一个或多个方面的优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗感染性疾病例如因真菌感染引发的疾病的方法，例如期待提供一种以两性霉素B为活性物质来治疗上述疾病的方法；并且期待这种方法，包括由该方法提供的治疗剂具有一个或多个方面的优点。在本发明中，已经出人意料地发现，通过聚合型大分子与两性霉素B化合形成的两性霉素B多聚结合物显示至少一种完全出人意料的性质，例如理化性质和/或生物学性质。本发明还已经出人意料地发现，其它一些多烯大环内酯类抗生素亦显示有与上述赋予两性霉素B相似的优良性质。本发明基于此发现而得以完成。
为此，本发明第一方面提供了一种供药用的多聚结合物，其包括活性药物和大分子聚合物，所述活性药物与所述大分子聚合物通过化学键结合。
根据本发明第一方面任一实施方案的多聚结合物，其中所述活性药物是多烯大环内酯类抗生素。
根据本发明第一方面任一实施方案的多聚结合物，其中所述活性药物是选自下列的多烯大环内酯类抗生素：两性霉素B、制霉菌素(nystatin)、那他霉素(Natamycin)、曲古霉素(Trichomycin)、美帕曲星(mepartricin)、克念菌素(Cannitracin，CAS No.84930-92-7，例如得自浙江海正药业产品，国药准字H33021810)、菲律平(Filipin III，CAS No.480-49-9)、金色制霉素(aureofungin)、意北霉素(etruscomycin)、汉霉素(hamycin，CAS No.1403-71-0)、表霉素(Perimycin A，CAS No.62327-61-1)等。在一个实施方案中，所述活性药物是选自下列的多烯大环内酯类抗生素：两性霉素B、制霉菌素(nystatin)、那他霉素(Natamycin)、曲古霉素(Trichomycin)。
根据本发明第一方面任一实施方案的多聚结合物，其中所述大分子聚合物选自：由氨基酸聚合形成的聚氨基酸、由氨基六碳糖聚合形成的聚氨基六碳糖。
根据本发明第一方面任一实施方案的多聚结合物，其中所述大分子聚合物是由氨基酸聚合形成的聚氨基酸，所述氨基酸选自：羧酸型氨基酸、氨基型氨基酸、或其组合。从而形成羧酸型聚氨基酸、或氨基型聚氨基酸等聚氨基酸。
根据本发明第一方面任一实施方案的多聚结合物，其中所述羧酸型氨基酸选自：天门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、或它们以任意比率的组合。
根据本发明第一方面任一实施方案的多聚结合物，其中所述氨基型氨基酸选自：鸟氨酸(Orn)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、羟赖氨酸(Hyl)、或它们以任意比率的组合。
根据本发明第一方面任一实施方案的多聚结合物，其中形成所述聚氨基酸的氨基酸包括其D型氨基酸、L型氨基酸、DL混合型氨基酸。
根据本发明第一方面任一实施方案的多聚结合物，其中所述氨基六碳糖选自：氨基葡萄糖、氨基半乳糖、乙酰氨基葡萄糖、乙酰氨基半乳糖、或其组合。从而形成聚氨基葡萄糖、聚氨基半乳糖、聚乙酰氨基葡萄糖、聚乙酰氨基半乳糖等聚氨基六碳糖。
根据本发明第一方面任一实施方案的多聚结合物，其中所述聚氨基酸的平均分子量为5000～100000道尔顿，例如10000～80000道尔顿，例如10000～50000道尔顿，例如10000～40000道尔顿。
根据本发明第一方面任一实施方案的多聚结合物，其中所述聚氨基六碳糖的平均分子量为10000～200000道尔顿，例如20000～180000道尔顿，例如20000～150000道尔顿，例如30000～120000道尔顿，例如40000～100000道尔顿。
根据本发明第一方面任一实施方案的多聚结合物，其中所述活性药物重量是该多聚结合物重量的5～60%，即在该多聚结合物中包含5～60%的活性药物以及余量的大分子聚合物。例如，所述活性药物重量是该多聚结合物重量的10～50%，例如10～40%，例如10～35%。
根据本发明第一方面任一实施方案的多聚结合物，其可使用注射用水、0.9%氯化钠注射液、5%葡萄糖注射液作为给药时的注射用溶媒。
进一步地，本发明第二方面提供了制备本发明第一方面任一项所述多聚结合物的方法，其中包括以下步骤：
i)提供大分子聚合物，使其溶解于溶剂中以形成溶液；
ii)向步骤i)所得溶液中加入活性药物并使其溶解；
iii)向步骤ii)所得溶液中加入催化剂和缩合剂，使大分子聚合物和活性药物进行缩合反应，以形成大分子聚合物与活性药物二者通过化学键结合的多聚结合物；
iv)分离提取所得多聚结合物。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤i)中所述溶剂是有机溶剂，例如但不限于二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤iii)中所述催化剂是4-(二甲氨基)吡啶(其可简写为DMAP)。其用量通常可以是活性药物摩尔量的0.2～4倍，例如0.5～2倍，例如0.8～1.5倍，例如1.0～1.2倍。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤iii)中所述缩合剂是二环己基碳二亚胺(Dicyclohexylcarbodiimide，其可简写为DCC)。其用量通常可以是活性药物摩尔量的0.5～2倍，例如0.8～1.5倍，例如1.0～1.2倍。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤iv)中所述分离提取是通过透析的方法进行的，此方法可以容易地除去未结合的游离活性药物。这种透析分离提取的方法是本领域技术人员公知的。
在本发明方法中，使用缩合剂DCC和催化剂DMAP反应条件可以使羧酸型聚氨基酸例如聚天门冬氨酸的游离羧基与活性药物分子结构中的羟基缩合，从而形成多烯类抗生素与该类聚氨基酸经化学键结合的多聚结合物；另外，使用上述缩合剂DCC和催化剂DMAP反应条件还可以使氨基型聚氨基酸例如聚鸟氨酸的游离氨基与活性药物(特别是含有羧基基团的活性药物)分子结构中的羧基缩合，从而形成多烯类抗生素与该类聚氨基酸经化学键结合的多聚结合物；另外，使用上述缩合剂DCC和催化剂DMAP反应条件还可以使聚氨基六碳糖例如聚氨基葡萄糖的羟基与活性药物(特别是含有羧基基团的活性药物)分子结构中的羧基缩合，从而形成多烯类抗生素与该类聚氨基六碳糖经化学键结合的多聚结合物。本领域技术人员已知的可以使本发明活性药物与所述大分子聚合物通过化学键结合的其它方法亦可用于本发明。
已经发现，通过本发明方法，至少赋予本发明多聚结合物具有比之于其相应的活性药物在溶解度方面显著更高的溶解性的优点。例如，通过本发明方法，使得本发明所得两性霉素B多聚结合物的溶解度(折算成两性霉素B计)比之于两性霉素B原药具有显著更高的溶解性。
因此，进一步地，本发明三方面提供了提高活性药物的溶解度的方法，该方法包括使所述活性药物与大分子聚合物通过化学键结合而形成多聚结合物的步骤。
根据本发明第三方面任一实施方案的方法，其中所述活性药物是多烯大环内酯类抗生素。
根据本发明第三方面任一实施方案的方法，其中所述活性药物是选自下列的多烯大环内酯类抗生素：两性霉素B、制霉菌素(nystatin)、那他霉素(Natamycin)、曲古霉素(Trichomycin)、美帕曲星(mepartricin)、克念菌素(Cannitracin，CAS No.84930-92-7，例如得自浙江海正药业产品，国药准字H33021810)、菲律平(Filipin III，CAS No.480-49-9)、金色制霉素(aureofungin)、意北霉素(etruscomycin)、汉霉素(hamycin，CAS No.1403-71-0)、表霉素(Perimycin A，CAS No.62327-61-1)等。在一个实施方案中，所述活性药物是选自下列的多烯大环内酯类抗生素：两性霉素B、制霉菌素(nystatin)、那他霉素(Natamycin)、曲古霉素(Trichomycin)。
根据本发明第三方面任一实施方案的方法，其中所述大分子聚合物选自：由氨基酸聚合形成的聚氨基酸、由氨基六碳糖聚合形成的聚氨基六碳糖。
根据本发明第三方面任一实施方案的方法，其中所述大分子聚合物是由氨基酸聚合形成的聚氨基酸，所述氨基酸选自：羧酸型氨基酸、氨基型氨基酸、或其组合。从而形成羧酸型聚氨基酸、或氨基型聚氨基酸等聚氨基酸。
根据本发明第三方面任一实施方案的方法，其中所述羧酸型氨基酸选自：天门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、或它们以任意比率的组合。
根据本发明第三方面任一实施方案的方法，其中所述氨基型氨基酸选自：鸟氨酸(Orn)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、羟赖氨酸(Hyl)、或它们以任意比率的组合。
根据本发明第三方面任一实施方案的方法，其中形成所述聚氨基酸的氨基酸包括其D型氨基酸、L型氨基酸、DL混合型氨基酸。
根据本发明第三方面任一实施方案的方法，其中所述氨基六碳糖选自：氨基葡萄糖、氨基半乳糖、乙酰氨基葡萄糖、乙酰氨基半乳糖、或其组合。从而形成聚氨基葡萄糖、聚氨基半乳糖、聚乙酰氨基葡萄糖、聚乙酰氨基半乳糖等聚氨基六碳糖。
根据本发明第三方面任一实施方案的方法，其中所述聚氨基酸的平均分子量为5000～100000道尔顿，例如10000～80000道尔顿，例如10000～50000道尔顿，例如10000～40000道尔顿。
根据本发明第三方面任一实施方案的方法，其中所述聚氨基六碳糖的平均分子量为10000～200000道尔顿，例如20000～180000道尔顿，例如20000～150000道尔顿，例如30000～120000道尔顿，例如40000～100000道尔顿。
根据本发明第三方面任一实施方案的方法，其中所述活性药物重量是该多聚结合物重量的5～60%，即在该多聚结合物中包含5～60%的活性药物以及余量的大分子聚合物。例如，所述活性药物重量是该多聚结合物重量的10～50%，例如10～40%，例如10～35%。
根据本发明第三方面任一实施方案的方法，其中所述多聚结合物可使用注射用水、0.9%氯化钠注射液、5%葡萄糖注射液作为给药时的注射用溶媒。
根据本发明第三方面任一实施方案的方法，其中所述活性药物与大分子聚合物通过化学键结合而制备多聚结合物的步骤可以照本发明第二方面任一实施方案的方法进行。
已经发现，在获得本发明第三方面所述方法的出人意料的效果基础上，本发明人还发现这种提高活性药物溶解性的方法所获得的多聚结合物具有其它一种或多种现有技术完全无法预期的优良效果。
进一步地，本发明第四方面提供了一种药物组合物，其中包含本发明第一方面任一实施方案所述的多聚结合物，以及任选的药学可接受的辅料。
根据本发明第四方面的药物组合物，其可以是制药工业中任意的药物制剂形式，例如但不限于，口服制剂例如片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服溶液剂、口服混悬液剂等，注射制剂例如小容量注射液、大容量注射液、无菌粉末制剂(例如冷冻干燥粉针剂等)，吸入制剂例如经鼻吸入制剂(例如吸入用粉末剂或吸入用溶液剂)等。
所述辅料的选择取决于该药物组合物呈现的具体制剂形式。例如，当该药物组合物为片剂、胶囊剂、颗粒剂等时，其中可以任选地包括稀释剂(例如淀粉、乳糖、微晶纤维素等)、崩解剂(例如羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素等)、粘合剂(例如羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等)、润滑剂或助流剂(例如硬脂酸镁、滑石粉、硬脂酸、胶体二氧化硅等)。还可以任选地包括矫味剂、着色剂、包衣剂等。
又例如，当该药物组合物为口服溶液剂、口服混悬液剂等时，其中可以包含溶媒例如水、乙醇、甘油、丙二醇、分子量为200～600的聚乙二醇等。还可以任选地包括矫味剂、着色剂等。
又例如，当该药物组合物为小容量注射液、大容量注射液等时，其中可以包含溶媒例如水、乙醇、甘油、丙二醇、分子量为200～600的聚乙二醇等，还可以任选地包含渗透压调节剂例如氯化钠、葡萄糖等。
又例如，当该药物组合物为无菌粉末制剂等时，其中可以包含赋形剂例如甘露醇、葡萄糖、右旋糖苷、氯化钠、蔗糖等。
这些呈药物制剂形式的本发明药物组合物的配方和制法可以通过本领域技术人员公知的方法和经验实现。例如对于片剂，可以通过湿法制粒压片、干法制粒压片、粉末直接压片等方法制备。又例如对于冷冻干燥粉针剂，可以根据制剂需求加入适量甘露醇并用注射用水溶解，接着经冷冻干燥而获得。
根据本发明第四方面任一实施方案的药物组合物，其为注射用药物组合物，并且其可使用注射用水、0.9%氯化钠注射液、5%葡萄糖注射液作为给药时的注射用溶媒。
进一步地，本发明第五方面提供了治疗真菌感染的疾病的方法，该方法包括给有需要的哺乳动物施用有效量的本发明第一方面任一实施方案的多聚结合物或者本发明第四方面任一实施方案的药物组合物的步骤。
根据本发明第五方面的方法，其中所述真菌感染的疾病是任何与真菌有关的疾病，例如是现有的任何一种两性霉素B制剂所适用的疾病，例如是诊断明确的敏感真菌所致的深部真菌感染，和/或病情呈进行性发展的情形，例如败血症、心内膜炎、脑膜炎(隐球菌及其他真菌)、腹腔感染(包括与透析相关者)、肺部感染、尿路感染等。
本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。
本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
在本发明中，术语“多聚结合物”或者亦可称为“结合物”、“多聚物”等，是指一种化学物质，其中包括活性药物和大分子聚合物两部分，所述活性药物部分与所述大分子聚合物部分通过化学键结合，例如通过酯键或者酰胺键结合，因此，本发明多聚结合物本质上讲亦是一种化合物，即，本发明多聚结合物亦可称为化合物。术语“多聚”具有本领域技术人员熟知的含义，例如其可理解为聚合物、多聚物、高分子物质、高分子化合物、聚合型大分子等，例如本发明涉及的聚氨基酸(即多肽)以及聚氨基六碳糖(多糖、多聚糖)等。
所述活性药物是多烯大环内酯类抗生素，亦可称为多烯大环内酯类物质、多烯类等类似术语，例如两性霉素B、制霉菌素(nystatin)、那他霉素(Natamycin)、曲古霉素(Trichomycin)、美帕曲星(mepartricin)、克念菌素(Cannitracin)、菲律平(Filipin III)、金色制霉素(aureofungin)、意北霉素(etruscomycin)、汉霉素(hamycin，CAS No.1403-71-0)、表霉素(Perimycin A)等。
众所周知，两性霉素B已载入诸多国家的药品标准并且可以容易地从市场购得，其具有如下结构式、分子式和分子量：
例如在2010年版中国药典中记载其为[1R-
(1R*,3S*,5R*,6R*,9R*,11R*,15S*,16R*,17R*,18S*,19E,21E,23E,25E,27E,29E,31E,33R*,35S*,36R*,37S*)]-33-[(3-氨基-3,6-二脱氧-β-D-吡喃甘露糖基)氧]-1,3,5,6,9,11,17,37-八羟基-15,16,18-三甲基-13-氧代-14,39-二氧双环[33.3.1]三十九烷-19,21,23,25,27,29,31-七烯-36-羧酸。典型地，两性霉素B包括多个羟基以及羧基，特别是37位羟基在缩合反应中是具有优势的，从而，羟基和羧基这两类活性基团赋予两性霉素B能够与具有羧基、氨基或羟基的本发明所述大分子聚合物通过化学键缩合而形成多聚结合物。当然，本领域技术人员公知，理论上讲两性霉素B中除37位之外其它位置的羟基亦具有与大分子聚合物的羧基通过化学键缩合而形成多聚结合物的可能，本发明在此亦不排除这种可能，并且包括这种可能。
另外，已知制霉菌素(nystatin，CAS No.1400-61-9)已收载于2010年版英国药典，并且其具有如下结构式：
典型地，制霉菌素亦包括类似于两性霉素B特征的羟基和羧基，这两类活性基团赋予制霉菌素能够与具有羧基、氨基和/或羟基的本发明所述大分子聚合物通过化学键缩合而形成多聚结合物。
另外，已知那他霉素(Natamycin，CAS No.7681-93-8)已收载于美国药典USP35-NF30中，并且其具有如下结构式：
典型地，那他霉素亦包括类似于两性霉素B特征的羟基和羧基，这两类活性基团赋予那他霉素能够与具有羧基、氨基和/或羟基的本发明所述大分子聚合物通过化学键缩合而形成多聚结合物。
另外，已知曲古霉素(Trichomycin，CAS No.1394-02-1)已收载于日本药局方第XVI版(JP16)中，并且其具有如下结构式：
典型地，曲古霉素亦包括类似于两性霉素B特征的羟基和羧基，这两类活性基团赋予曲古霉素能够与具有羧基、氨基和/或羟基的本发明所述大分子聚合物通过化学键缩合而形成多聚结合物。
另外，美帕曲星(mepartricin，CAS No.11121-32-7，例如参见US3780173)具有如下结构式：
美帕曲星包括类似于两性霉素B特征的羟基和已成甲酯的羧基，这些羟基以及在一定条件下成酯的羧基这两类基团可以赋予美帕曲星能够与具有羧基、氨基和/或羟基的本发明所述大分子聚合物通过化学键缩合而形成多聚结合物。
另外，菲律平(Filipin III，CAS No.480-49-9)具有如下结构式：
菲律平包括类似于两性霉素B特征的羟基，这些羟基可以赋予美帕曲星能够与具有羧基的本发明所述大分子聚合物通过化学键缩合而形成多聚结合物。
另外，表霉素(Perimycin A，CAS No.62327-61-1)具有如下结构式：
表霉素包括类似于两性霉素B特征的羟基，这些羟基可以赋予表霉素能够与具有羧基的本发明所述大分子聚合物通过化学键缩合而形成多聚结合物。
其它的多烯大环内酯类化合物例如克念菌素(Cannitracin，CAS No.84930-92-7，其例如可购自浙江海正药业，国药准字H33021810)、金色制霉素(aureofungin)、意北霉素(etruscomycin)、汉霉素(hamycin，CASNo.1403-71-0)等，它们均至少包含类似于两性霉素B特征的羟基和/或羧基，这些活性基团可以赋予这些多烯大环内酯类化合物能够与具有羧基、氨基和/或羟基的本发明所述大分子聚合物通过化学键缩合而形成多聚结合物。
在本发明中，大分子聚合物部分可以是由氨基酸聚合形成的聚氨基酸，也可以是由氨基六碳糖聚合形成的聚氨基六碳糖。
对于聚氨基酸而言，所述氨基酸可以选自：羧酸型氨基酸、氨基型氨基酸、或其组合，从而可以形成羧酸型聚氨基酸、或氨基型聚氨基酸等聚氨基酸。羧酸型氨基酸选自：天门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、或它们以任意比率的组合；氨基型氨基酸可以选自：鸟氨酸(Orn)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、羟赖氨酸(Hyl)、或它们以任意比率的组合。这些氨基酸可以包括它们的D型、L型、DL混合型。聚氨基酸的制备方法是本领域技术人员公知的，例如US5610264公开了聚天门冬氨酸的合成方法，S.Roweton等(Journal of Environmental Polymer Degradation,Vol.5,No.3,1997:175)亦公开了一种聚天门冬氨酸的合成方法。类似地，其它聚氨基酸也有诸多文献公开了它们的合成方法，并且通过控制这些合成方法的条件，可以有利地获得具有期望的聚合度的聚氨基酸，即可以有利地获得具有期望分子量或分子量范围的聚氨基酸。另外，还可以使用这些聚氨基酸的药学可接受的盐例如钠盐(例如聚天门冬氨酸)、盐酸盐(例如聚鸟氨酸)等。此外，这些聚氨基酸还可从市场购得，例如可以从Sigma-Aldrich公司容易地购得具有期望的聚合度或者分子量或分子量范围的聚氨基酸，例如可以从Sigma-Aldrich公司购得产品货号为P6762的分子量在15000～50000道尔顿的聚-L-天门冬氨酸。在本发明中，如未另外说明，所用的聚氨基酸是从市场购得的。
对于聚氨基六碳糖而言，所述氨基六碳糖可以选自：氨基葡萄糖、氨基半乳糖、乙酰氨基葡萄糖、乙酰氨基半乳糖、或其组合，从而形成聚氨基葡萄糖、聚氨基半乳糖、聚乙酰氨基葡萄糖、聚乙酰氨基半乳糖等聚氨基六碳糖。这些聚氨基六碳糖的制备方法是本领域技术人员公知的，例如邵健等(中国医药工业杂志，1999，30(11)：481)公开了具有特定分子量的聚氨基葡萄糖，本领域技术人员可以参考该文献方法并且通过控制这些合成方法的条件，可以有利地获得具有期望的聚合度的聚氨基葡萄糖，即可以有利地获得具有期望分子量或分子量范围的聚氨基葡萄糖。此外，这些聚氨基葡萄糖还可从市场购得，例如可以从Sigma-Aldrich公司容易地购得具有期望的聚合度或者分子量或分子量范围的聚氨基葡萄糖，还可以从一些国内公司例如从台州复大海洋生物或者石家庄拓冶公司购得具有期望的聚合度或者分子量或分子量范围的聚氨基葡萄糖。在本发明中，如未另外说明，所用的聚氨基葡萄糖是从市场购得的。
在本发明的一个实施方案中，本发明克服了多烯大环内酯类物质例如两性霉素B的缺陷，研究设计新型的聚合型大分子与多烯大环内酯类物质例如两性霉素B化合形成的多聚多烯大环内酯类物质例如多聚两性霉素B多聚结合物。
在本发明多聚结合物的一个实施方案中，一个聚合型大分子上可以结合多个多烯大环内酯类物质例如两性霉素B。
本发明多烯大环内酯类物质以两性霉素B为例，本发明提供的多聚结合物可以理解为是两性霉素B的前体药物，多聚两性霉素B在体内可通过酯水解酶或氨基酸水解酶的作用逐渐水解并释放出两性霉素B，聚合型大分子也逐渐水解成小分子，从体内排谢出去。本发明聚合型大分子与两性霉素B化合形成新型的两性霉素B多聚结合物，亦可称为多聚两性霉素B或类似术语。多聚两性霉素B是由聚合型大分子与两性霉素B以化学键(酯键或酰胺键)结合形成的大分子-两性霉素B多聚结合物。该多聚结合物中一个大分子载体上结合多个两性霉素B分子。本发明多聚两性霉素B具有良好的水溶、低毒副作用和缓慢释放两性霉素B等新特点，属于新一代的两性霉素B。多聚两性霉素B克服了经典两性霉素B水溶性差和毒副作用大的缺点。聚合型大分子载体是无毒，无过敏性，并具有良好生物相融性和生物降解性。多聚两性霉素B在体内由酯水解酶和氨基酸水解酶的作用逐渐从分子上水解、释放出两性霉素B，可维持较久的血药浓度，从而达到更好的抗真菌的治疗目的。聚合型大分子载体在体内也逐渐水解成小分子，从体内排谢出去。
在本发明的一个实施方案中，本发明的多聚结合物是由羧酸型聚氨基酸与多烯大环内酯类物质例如两性霉素B化合而得。例如，其是由聚氨基酸分子上羧酸与两性霉素B分子上羟基经化合形成酯键连接构成。例如，以聚天门冬氨酸与两性霉素B形成的多聚结合物为例，一种示例性的化学键合模式是：
其中两性霉素B可以在以DCC为缩合剂的化学缩合反应中以其优势反应活性的37位羟基(活跃羟基)与聚天门冬氨酸的羧基反应,两分子间脱去H2O分子形成酯键(-COO-)，聚天门冬氨酸肽链上的多个游离羧基可以根据缩合反应的具体条件(例如投料量、反应温度、反应时间等)而键合期望量的两性霉素B，例如在得到的由聚氨基酸与两性霉素B两分部构成的多聚结合物中，两性霉素B的重量可以占该多聚结合物重量的5～60%(例如10～50%，例如10～40%，例如10～35%)，接着可以使所得多聚结合物与碱性物质反应形成药学可接受的盐，例如形成钠盐。如前文所述的，根据具体需求，理论上讲还可以调节缩合反应的条件从而使两性霉素B其它羟基与聚天门冬氨酸缩合而形成多聚结合物。在本发明下文中已经通过紫外法和HPLC法证实了以化学键合而非物理键合(例如氢键)形成的多聚结合物，而该多聚结合物的化学键合位点无需作特别的限定。上述羧酸型聚氨基酸的典型实例包括但不限于D-天门冬氨酸(Aspartic acid，Asp)、L-天门冬氨酸、DL-天门冬氨酸、D-谷氨酸(Glutamic acid，Glu)、L-谷氨酸、DL-谷氨酸、及其组合例如任意构型的天门冬氨酸与任意构型的谷氨酸以任意比例例如以0-99%混合比例聚合的羧酸型聚氨基酸。
在本发明的一个实施方案中，本发明的多聚结合物是由氨基型聚氨基酸与多烯大环内酯类物质例如两性霉素B化合而得。例如，其是由聚氨基酸分子上的游离氨基(-NH2)与两性霉素B分子上的游离羧基(-COOH)在催化剂的作用下两分子间脱去H2O分子形成酰胺键(-CONH-)，两分子化合成聚氨基酸-两性霉素B。例如，以聚鸟氨酸与两性霉素B形成的多聚结合物为例，一种示例性的化学键合模式是：
与上文关于聚天门冬氨酸-两性霉素B多聚结合物类似，聚鸟氨酸肽链上的多个游离氨基可以根据缩合反应的具体条件(例如投料量、反应温度、反应时间等)而键合期望量的两性霉素B，接着可以使所得多聚结合物与酸性物质反应形成药学可接受的盐，例如形成盐酸盐。类似地，在本发明下文中已经通过紫外法和HPLC法证实了以化学键合而非物理键合(例如氢键)形成的多聚结合物，而该多聚结合物的化学键合位点无需作特别的限定。上述氨基型聚氨基酸的典型实例包括但不限于D-鸟氨酸(Ornithine，Orn)、L-鸟氨酸、DL-鸟氨酸、D-赖氨酸(Lysine，Lys)、L-赖氨酸、DL-赖氨酸、D-精氨酸(Arg)、L-精氨酸、DL-精氨酸、D-羟赖氨酸(Hyl)、L-羟赖氨酸、DL-羟赖氨酸、及其组合，例如任意构型的鸟氨酸与任意构型的赖氨酸以任意比例例如以1-99%混合比例聚合的羧酸型聚氨基酸。
在本发明的一个实施方案中，本发明的多聚结合物是由聚氨基六碳糖与多烯大环内酯类物质例如两性霉素B化合而得。例如，其是由聚氨基六碳糖(聚氨基葡萄糖)分子上的游离羟基(-OH)与两性霉素B分子上的游离羧基(-COOH)在催化剂的作用下两分子间脱去H2O分子形成酯键(-COO-)，两分子化合成聚氨基葡萄糖-两性霉素B。例如，以聚氨基葡萄糖与两性霉素B形成的多聚结合物为例，一种示例性的化学键合模式是：
与上文关于聚天门冬氨酸-两性霉素B多聚结合物类似，聚氨基葡萄糖链上的多个游离羟基可以根据缩合反应的具体条件(例如投料量、反应温度、反应时间等)而键合期望量的两性霉素B。类似地，在本发明下文中已经通过紫外法和HPLC法证实了以化学键合而非物理键合(例如氢键)形成的多聚结合物，而该多聚结合物的化学键合位点无需作特别的限定。聚氨基六碳糖的典型实例包括但不限于：聚氨基葡萄糖、聚氨基半乳糖、聚乙酰氨基葡萄糖、聚乙酰氨基半乳糖等聚氨基六碳糖。
在制备本发明物质的方法中，反应所用的各种原材料是本领域技术人员根据已有知识可以制备得到的，或者是可以通过文献公知的方法制得的，或者是可以通过商业购得的。本发明反应方案中所用的中间体、原材料、试剂、反应条件等均可以根据本领域技术人员已有知识可以作适当改变的。
本发明多聚结合物可以与其它活性成分组合使用，只要它不产生其他不利作用，例如不产生过敏反应。
本发明多聚结合物可作为唯一的药物使用，或者可以与一种或多种其他生理活性上与本发明物质具有协同和/或增效作用的药物联合使用。联合治疗可通过将各个治疗组分同时、顺序或隔开给药来实现。
本文所用的术语“药物组合物”意指包括包含指定量的各指定成分的产品，以及直接或间接从指定量的各指定成分的组合产生的任何产品。在本发明中，术语“药物组合物”可以与“组合物”互换使用。
可改变本发明药物组合物中各活性成分的实际剂量水平，以便所得的活性物质量能有效针对具体患者、化合物和给药方式得到所需的治疗反应。剂量水平须根据具体活性物质的活性、给药途径、所治疗病况的严重程度以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。但是，本领域的做法是，活性物质的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。
当用于上述本发明治疗和/或预防或其他治疗和/或预防时，治疗和/或预防有效量的一种本发明多聚结合物可以以纯形式应用。或者，所述多聚结合物可以以含有该目的多聚结合物与一种或多种药物可接受赋形剂的药物组合物给药。词语“治疗和/或预防有效量”的本发明多聚结合物指以适用于任何医学治疗和/或预防的合理效果/风险比治疗障碍的足够量的多聚结合物。但应认识到，本发明多聚结合物和药物组合物的总日用量须由主诊医师在可靠的医学判断范围内作出决定。对于任何具体的患者，具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度；所采用的具体多聚结合物的活性；所采用的具体药物组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体药物组合物的给药时间、给药途径和排泄率；治疗持续时间；与所采用的药物组合物组合使用或同时使用的其它药物；及医疗领域公知的类似因素。例如，本领域的做法是，药物组合物的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。一般说来，本发明多聚结合物用于哺乳动物特别是人的剂量以所述多烯大环内酯类化合物的量计可以介于0.0001～1000mg/kg体重/天，例如介于0.001～500mg/kg体重/天，例如介于0.001～100mg/kg体重/天。
运用本领域技术人员熟悉的药物载体可以制备成含有效剂量的本发明多聚结合物的药物组合物。因此本发明还提供包含与一种或多种无毒药物可接受载体配制在一起的本发明多聚结合物的药物组合物。所述药物组合物可特别专门配制成以固体或液体形式供口服给药、供胃肠外注射或供直肠给药。
所述的药物组合物可配制成许多剂型，便于给药，例如，口服制剂(如片剂、胶囊剂、溶液或混悬液)；可注射的制剂(如可注射的溶液或混悬液，或者是可注射的干燥粉末，在注射前加入注射水可立即使用)。所述的药物组合物中载体包括：口服制剂使用的粘合剂(如淀粉，通常是玉米、小麦或米淀粉、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮)，稀释剂，润滑剂(如二氧化硅、滑石、硬脂酸或其盐，通常是硬脂酸镁或硬脂酸钙，和/或聚乙二醇)，以及如果需要，还含有崩解剂，如淀粉、琼脂、海藻酸或其盐，通常是藻酸钠，和/或泡腾混合物，助溶剂、稳定剂、悬浮剂、着色剂、矫味剂等，可注射的制剂使用的防腐剂、增溶剂、稳定剂等；局部制剂用的基质、稀释剂、润滑剂等。药物制剂可以经口服或胃肠外方式(例如静脉内、皮下、腹膜内或局部)给药，如果某些药物在胃部条件下是不稳定的，可以将其配制成肠衣片剂。
更具体地说，本发明的药物组合物可通过口服、直肠、胃肠外、池内、阴道内、腹膜内、局部(如通过散剂、软膏剂或滴剂)、口颊给予人类和其他哺乳动物，或者作为口腔喷雾剂或鼻腔喷雾剂给予。本文所用术语“胃肠外”指包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和输液的给药方式。
适合于胃肠外注射的药物组合物可包括生理上可接受的无菌含水或非水溶液剂、分散剂、混悬剂或乳剂，及供重构成无菌可注射溶液剂或分散剂的无菌散剂。合适的含水或非水载体、稀释剂、溶剂或媒介物的实例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)、植物油(如橄榄油)、可注射有机酯如油酸乙酯及它们的合适混合物。
这些药物组合物也可含有辅料，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如尼泊金酯类、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等，可确保防止微生物的作用。还期望包括等渗剂，例如糖类、氯化钠等。通过使用能延迟吸收的物质，例如单硬脂酸铝和明胶，可达到可注射药物形式的延长吸收。
混悬剂中除活性化合物外还可含有悬浮剂，例如乙氧基化异十八醇、聚氧乙烯山梨醇和聚氧乙烯失水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶或者这些物质的混合物等。
在一些情况下，为延长药物的作用，期望减慢皮下或肌内注射药物的吸收。这可通过使用水溶性差的晶体或无定形物质的液体混悬剂来实现。这样，药物的吸收速度取决于其溶解速度，而溶解速度又可取决于晶体大小和晶型。或者，胃肠外给药的药物形式的延迟吸收通过将该药物溶解于或悬浮于油媒介物中来实现。
可注射贮库制剂形式可通过在生物可降解聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯中形成药物的微胶囊基质来制备。可根据药物与聚合物之比和所采用的具体聚合物的性质，对药物释放速度加以控制。其他生物可降解聚合物的实例包括聚原酸酯类和聚酐类。可注射贮库制剂也可通过将药物包埋于能与身体组织相容的脂质体或微乳中来制备。
可注射制剂可例如通过用滤菌器过滤或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌，所述固体组合物可在临用前溶解或分散于无菌水或其他无菌可注射介质。
本发明化合物或其药物组合物可用口服方法或非胃肠道给药方式。口服给药可以是片剂、胶囊剂、包衣剂，肠道外用药制剂有注射剂和栓剂等。这些制剂是按照本领域的技术人员所熟悉的方法制备的。为了制造片剂、胶囊剂、包衣剂所用的辅料是常规用的辅料，例如淀粉、明胶、阿拉伯胶，硅石，聚乙二醇，液体剂型所用的溶剂如水、乙醇、丙二醇、植物油(如玉米油、花生油、橄榄油等)。含有本发明化合物的制剂中还有其它辅料，例如表面活性剂，润滑剂，崩解剂，防腐剂，矫味剂和色素等。在片剂、胶囊剂、包衣剂、注射剂和栓剂中含有本发明多聚结合物的剂量是以单元剂型中存在的多烯大环类酯类化合物量计算的。在单元剂型中本发明多烯大环类酯类化合物一般含量为0.01-5000mg，优选的单元剂型含有0.1-500mg，更优选的单元剂型含有1-500mg。具体地说，本发明可以提供的供口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在此类固体剂型中，活性化合物可与至少一种惰性的药物可接受赋形剂或载体如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或以下物质混合：a)填充剂或增量剂；b)粘合剂如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶；c)保湿剂如甘油；d)崩解剂如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；e)溶液阻滞剂如石蜡；f)吸收加速剂如季铵化合物；g)湿润剂如鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯；h)吸附剂如高岭土和膨润土；以及i)润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠和它们的混合物。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，所述剂型中也可包含缓冲剂。
相似类型的固体组合物使用赋形剂例如乳糖及高分子量聚乙二醇等，也可用作软胶囊和硬胶囊中的填充物。
片剂、糖衣丸剂(dragees)、胶囊剂、丸剂和颗粒剂的固体剂型可与包衣和壳料如肠溶衣材和医药制剂领域公知的其他衣材一起制备。这些固体剂型可任选含有遮光剂，且其组成还可使其只是或优先地在肠道的某个部位任选以延迟方式释放活性成分。可以使用的包埋组合物的实例包括高分子物质和蜡类。如果适合，活性物质也可与一种或多种上述赋形剂配成微囊形式。
供口服给药的液体剂型包括药学可接受的乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。液体剂型除含有活性物质外还可含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂，增溶剂和乳化剂例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及它们的混合物。口服组合物除包含惰性稀释剂外还可包含辅料，例如湿润剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香味剂。
供直肠或阴道给药的组合物优选是栓剂。栓剂可通过将本发明多聚结合物与合适的非刺激性赋形剂或载体例如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡混合来制备，它们在室温下为固体，但在体温下则为液体，因此可在直肠腔或阴道腔内熔化而释放出活性化合物。
本发明多聚结合物及其药物组合物还考虑用于局部给药。供局部给予本发明多聚结合物的剂量形式包括散剂、喷雾剂、软膏剂和吸入剂。在无菌条件下将活性物质与药学可接受的载体和任何所需的防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。眼用制剂、眼软膏剂、散剂和溶液剂也被考虑在本发明范围内。
本发明多聚结合物也可以脂质体形式给药。如本领域所公知，脂质体通常用磷脂或其他脂类物质制得。脂质体由分散于含水介质中的单层或多层水化液晶所形成。任何能够形成脂质体的无毒、生理上可接受和可代谢的脂质均可使用。脂质体形式的本发明化合物除含有本发明化合物外，还可含有稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选的脂类是天然和合成的磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)，它们可单独或者一起使用。形成脂质体的方法是本领域公知的。参见例如Prescott,Ed.,Methods in Cell Biology,Volume XIV,AcademicPress,New York,N.Y.(1976),p.33。
本发明人惊奇地发现，本发明多聚结合物在生物和/或物理和/或化学方面显示出令人鼓舞的有益效果。
附图说明
图1：两性霉素B紫外-可见光的光谱扫描图。
图2：聚天门冬氨酸的紫外-可见光的光谱扫描图。
图3：聚天门冬氨酸—两性霉素B多聚结合物(PA-AB)紫外-可见光的光谱扫描图。
图4：两性霉素B(AB，28μg/ml)的高效液相色谱图。
图5：聚天门冬氨酸(制备例1所用，PA，80μg/ml)的高效液相色谱图。
图6：聚天门冬氨酸-两性霉素B多聚结合物的高效液相色谱图。
图7：聚天门冬氨酸-两性霉素B多聚结合物与游离两性霉素B的物理混合物的高效液相色谱图。
图8：聚天门冬氨酸—两性霉素B(PA-AB)的氢核磁共振(1H-NMR)图谱。
图9：聚天门冬氨酸—两性霉素B(PA-AB)的碳核磁共振(13C-NMR)图谱。
图10：聚天门冬氨酸—两性霉素B(PA-AB)的高效液相(HPLC)紫外检测(UV)图谱。
图11：聚天门冬氨酸—两性霉素B(PA-AB)的高效液相(HPLC)质谱检测(MS)图谱。
图12：两性霉素B(AB)的高效液相(HPLC)紫外检测(UV)图谱。
图13：两性霉素B(AB)的高效液相(HPLC)质谱检测(MS)图谱。
具体实施方式
下面通过具体的制备实例和试验例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些例子仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
A、测试多聚结合物的方法
测试方法1：紫外-可见分光光度法
对两性霉素B(25μg/ml，以DMSO为溶剂，并作为空白对照)进行紫外-可见分光光度法光谱扫描，结果如图1。图中显示在小于300nm以及大于500nm的波长范围内基本无吸收，而在波长350～450nm范围内有吸收，并且在371nm、391nm、415nm处显示有典型的吸收峰。
对聚天门冬氨酸(制备例1所用，100μg/ml，以水为溶剂)进行紫外-可见分光光度法光谱扫描，结果如图2。图中显示在大于250nm的波长范围内无吸收，而在小于250nm的波长范围内有典型的末端吸收，表明在大于250nm的波长范围内聚天门冬氨酸不会对多聚结合物或两性霉素B的吸光度有贡献。
对聚天门冬氨酸—两性霉素B多聚结合物(PA-AB)(制备例1所制得，100μg/ml，以水为溶剂)进行紫外-可见分光光度法光谱扫描，结果如图3。图中显示在大于500nm的波长范围内无吸收；在小于250nm的波长范围内有典型的末端吸收(聚天门冬氨酸贡献)；而在波长300～450nm范围内有吸收(主要由两性霉素B贡献)，并且在366nm、385nm、409nm处显示有典型的吸收峰。三个典型吸收峰与图1所示两性霉素B的对应三个吸收峰的波长稍有偏移，可能是由于形成化学键合的多聚结合物造成的，但总体上呈现出两性霉素B的典型吸收光谱。
以上图1～3分析了聚天门冬氨酸、两性霉素B、二者形成的多聚结合物的紫外-可见分光光度法光谱扫描图谱特征，表明三种物质在分光光度法下具有各自独特的光谱行为和光谱贡献，使得通过HPLC法定性和定量分析三种物质成为可能。
另外，本发明人在进一步的试验中还发现，对于其它种类的聚氨基酸和聚氨基六碳糖，对于其它类的多烯大环类酯类抗生素，以及对于其它种类的聚氨基酸或聚氨基六碳糖-多烯大环类酯类抗生素多聚结合物，它们均具有与上述聚天门冬氨酸、两性霉素B及其多聚结合物类似的紫外-可见分光光度法光谱扫描图谱特征，三类物质在分光光度法下具有各自独特的光谱行为和光谱贡献，使得通过HPLC法定性和定量分析三类物质成为可能。例如聚鸟氨酸、聚氨基葡萄糖、聚谷氨酸等与上述聚天门冬氨酸相似，对两性霉素B的光谱扫描图谱特征不会有影响/干扰。又例如聚天门冬氨酸、聚鸟氨酸、聚谷氨酸、聚氨基葡萄糖、聚氨基半乳糖等对那他霉素的光谱扫描图谱特征不会有影响/干扰。
测试方法2：高效液相色谱法(HPLC法)
参考中国药典2010年版二部328页两性霉素B有关物质检测项下的方法，色谱条件为：C18色谱柱(4.6*30mm，5μm)，流动相：乙腈-甲醇-含0.073%乙二胺四乙酸的0.05mol/L醋酸铵溶液(用冰醋酸调节pH值至5.0)(260：450：320)，流速1.0ml/min；检测波长为405nm。图4是两性霉素B(AB，28μg/ml)的高效液相色谱图，其中显示两性霉素B在约12min处出峰。
按照以上HPLC法，测试聚天门冬氨酸(PA，80μg/ml)的高效液相色谱图。如图5所示，在约3min处显示小色谱峰，色谱峰小的原因在于在检测波长405nm处PA吸收弱。
按照以上HPLC法，测试聚天门冬氨酸-两性霉素B多聚结合物(PA-AB，制备例1产物，105μg/ml，其中包含的两性霉素B浓度与图4样品溶液中两性霉素B浓度相当)的高效液相色谱图。如图6所示，在约12min处出基本未检测到色谱峰(无游离的AB)，但是在约3min处显示一个峰面积与图4相当的色谱峰。这表明，该PA-AB多聚结合物中基本无游离的AB(面积归一化法计算得其峰面积百分数小于1%)，本发明方法可以获得高纯度的PA-AB多聚结合物(以AB计的纯度大于99%)；而PA-AB以化学键结合成稳定的化合物，在色谱条件下不能分离开，并且由于聚氨基酸的强大极性使得该PA-AB多聚结合物的色谱保留行为与PA接近，在PA处出峰。另外还可以通过该HPLC法结合图4测定结果计算出该多聚结合物中AB的百分含量，即活性药物含量，制备例1的活性药物含量结果为23.4%(w/w)。
按照以上HPLC法，聚天门冬氨酸-两性霉素B多聚结合物与游离两性霉素B的物理混合物(PA-AB，100μg/ml；AB，26μg/ml)的高效液相色谱图。如图7所示，在约12min处检测到与AB添加量相符的AB色谱峰，且在约3min处检测到与PA-AB添加量相符的PA-AB谱峰。这表明，该PA-AB多聚结合物与游离的AB二者具有独立的色谱行为，二者互不干扰。
以上HPLC法同样可以延用于两性霉素B与其它大分子聚合物形成的多聚结合物，甚至基本不用对HPLC条件作显著的改变即可实现对这些多聚结合物的定性定量分析。
以上HPLC法同样可以延用于其它多烯大环内酯类化合物与大分子聚合物形成的多聚结合物，特别是通适当改变HPLC条件例如流动相等即可实现对这些多聚结合物的定性定量分析，例如可参考其它药品标准或文献中记载的其它多烯大环内酯类化合物的HPLC分析方法或分析条件。例如曲古霉素可参考JP16中同品种项下记载的HPLC分析方法或分析条件进行。
B、多聚结合物的制备例部分
制备例1.聚天门冬氨酸—两性霉素B多聚结合物的化学合成
示意性的合成路线如下：
——二环己基碳二亚胺，4-(二甲氨基)吡啶——>
合成步骤：取聚-L-天门冬氨酸800.0mg(分子量28000Da)，溶于5ml二甲基甲酰胺中。再取两性霉素B280.0mg(0.30mol)加入上述二甲基甲酰胺溶液中，搅拌使两性霉素B溶解。另取二环己基碳二亚胺62.5mg(0.30mol)和4-(二甲氨基)吡啶37.0mg(0.30mol)，均加入上述二甲基甲酰胺溶液中，在室温(23-25℃)条件下，磁力搅拌12小时。将100ml的1M NaHCO3溶液加入到上述反应溶液中，磁力搅拌1小时，将上述碱性溶液倒入透析袋中，用去离子水透析5小时后，溶液通过0.2μ过滤膜，冷冻和干燥，得聚天门冬氨酸-两性霉素B多聚结合物1033.4mg。
图8是本制备例获得的聚天门冬氨酸-两性霉素B多聚结合物的氢核磁共振(1H-NMR)图谱，显示有与该多聚结合物相符的谱线。
图9是本制备例获得的聚天门冬氨酸-两性霉素B多聚结合物的碳核磁共振(13C-NMR)图谱，显示有与该多聚结合物相符的谱线。
图10是本制备例获得的聚天门冬氨酸-两性霉素B多聚结合物的高效液相(HPLC)紫外检测(UV)图谱。
图11是在图10的HPLC条件下，本制备例获得的聚天门冬氨酸-两性霉素B多聚结合物的高效液相(HPLC)质谱检测(MS)图谱图中显示了一些由两性霉素B形成的碎片。这表明两性霉素B存在于该多聚结合物中，并且随大分子聚合物部分一起在HPLC系统中洗脱出来。
图12是在另一种测试条件下，本制备例获得的聚天门冬氨酸-两性霉素B多聚结合物的高效液相(HPLC)紫外检测(UV)图谱。
图13是在图12的HPLC条件下，本制备例获得的聚天门冬氨酸-两性霉素B多聚结合物的高效液相(HPLC)质谱检测(MS)图谱图中显示了一些由两性霉素B形成的碎片。表明两性霉素B存在于该多聚结合物中，并且随大分子聚合物部分一起在HPLC系统中洗脱出来。
经测定，活性药物含量=23.4%(w/w)，游离活性药物含量<0.2%(图6中AB峰的峰面积除以PA-AB峰的峰面积乘以100%所得百分数)。
制备例2.聚鸟氨酸—两性霉素B多聚结合物的化学合成
示意性的合成路线如下：
——二环己基碳二亚胺，4-(二甲氨基)吡啶——>
合成步骤：取聚-D-鸟氨酸250.0mg(分子量34000Da)，溶于3ml二甲基甲酰胺。再取两性霉素B75.0mg(0.08mmol)加入上述二甲基甲酰胺溶液，使两性霉素B溶解。另取二环己基碳二亚胺16.7mg(0.08mmol)，和4-(二甲氨基)吡啶10.0mg(0.08mmol)，均加入上述二甲基甲酰胺溶液中，在室温(23-25℃)条件下，磁力搅拌12小时。加入50ml水到上述反应溶液中，将上述溶液倒入透析袋中，用去离子水透析5小时后，溶液通过0.2μ过滤膜，冷冻和干燥，得聚鸟氨酸-两性霉素B多聚结合物323.0mg。
使用与对制备例1所得产物进行检测的紫外-可见分光光度法、HPLC法、氢核磁共振(1H-NMR)法、碳核磁共振(13C-NMR)法、HPLC-UV法、HPLC-MS法检测，显示形成了以化学键结合的多聚结合物。
经测定，活性药物含量=20.8%(w/w)，游离活性药物含量0%(未检测到)。
制备例3.聚氨基葡萄糖—两性霉素B多聚结合物的化学合成
示意性的合成路线如下：
——二环己基碳二亚胺，4-(二甲氨基)吡啶——>
合成步骤：取聚氨基葡萄糖532.0mg(分子量85000Da)，溶于6ml二甲基亚砜。再取两性霉素B305.0mg(0.33mmol)加入上述二甲基亚砜溶液，使两性霉素B溶解。另取二环己基碳二亚胺68.1mg(0.33mmol)，和4-(二甲氨基)吡啶40.3mg(0.33mmol)，均加入上述二甲基亚砜溶液中，在室温(23-25℃)条件下，磁力搅拌12小时。将80ml的0.1M HCl加入到上述反应溶液中，将上述酸性溶液倒入透析袋中，用去离子水透析5小时后，溶液通过0.2μ过滤膜，冷冻和干燥，得聚氨基葡萄糖-两性霉素B多聚结合物803.5mg。
使用与对制备例1所得产物进行检测的紫外-可见分光光度法、HPLC法、氢核磁共振(1H-NMR)法、碳核磁共振(13C-NMR)法、HPLC-UV法、HPLC-MS法检测，显示形成了以化学键结合的多聚结合物。
所得产物经测定，活性药物含量=33.6%(w/w)，游离活性药物含量<0.4%。
制备例4.大分子聚合物—两性霉素B多聚结合物的化学合成
参考制备例1的方法，但是大分子聚合物改用聚-DL-天门冬氨酸1400.0mg(分子量15000Da)进行，得多聚结合物1511.5mg。所得产物经测定，活性药物含量=15.7%(w/w)，游离活性药物含量<0.8%。
制备例5.大分子聚合物—两性霉素B多聚结合物的化学合成
参考制备例1的方法，但是大分子聚合物改用聚(L-鸟氨酸/L-精氨酸(克分子比1:1))1000mg(分子量25000Da)进行，得多聚结合物1191mg。所得产物经测定，活性药物含量=19.8%(w/w)，游离活性药物含量0%(未检测到)。
制备例6.大分子聚合物—两性霉素B多聚结合物的化学合成
参考制备例3的方法，但是大分子聚合物改用聚氨基半乳糖(分子量150000Da)进行，得多聚结合物811mg。所得产物经测定，活性药物含量=23.5%(w/w)，游离活性药物含量<0.3%。
制备例6.大分子聚合物—两性霉素B多聚结合物的化学合成
参考制备例3的方法，但是大分子聚合物改用聚乙酰氨基葡萄糖(分子量25000Da)进行，活性药物用量为90mg，得多聚结合物602mg。所得产物经测定，活性药物含量=11.2%(w/w)，游离活性药物含量0.2%。
制备例7.大分子聚合物—活性药物多聚结合物的化学合成
参考制备例1的方法，但是活性药物改用制霉菌素。所得产物经测定，活性药物含量=27.1%(w/w)，游离活性药物含量<0.3%。
制备例8.大分子聚合物—活性药物多聚结合物的化学合成
参考制备例2的方法，但是活性药物改用那他霉素。所得产物经测定，活性药物含量=18.7%(w/w)，游离活性药物含量<0.2%。
制备例9.大分子聚合物—活性药物多聚结合物的化学合成
参考制备例3的方法，但是活性药物改用曲古霉素。所得产物经测定，活性药物含量=20.4%(w/w)，游离活性药物含量<0.2%。
制备例10.大分子聚合物—活性药物多聚结合物的化学合成
参考制备例1的方法，但是活性药物分别改用：美帕曲星、克念菌素、菲律平、金色制霉素、意北霉素、汉霉素、表霉素，分别得到7种大分子聚合物—活性药物多聚结合物，它们的活性药物含量均在10～35%范围内，且游离活性药物含量均<1.0%。
制备例21.多聚结合物的化学合成(001056255，CN1310025A，Ex4)
聚(谷氨酸/天门冬氨酸，分子量28000Da)与紫杉醇的聚合物：药物比例为4：1(摩尔比)，将两者溶于N,N-DMF中，DCC作为联合剂。383毫克的聚二肽被溶于8毫升的DMF中，将8.5毫克的N,N-二甲胺嘧啶和209.4毫克的紫杉醇再加入152.2毫克的DCC。之后再加入上述混合液体之中。反应在室温下搅拌22小时。滤去尿素，产生的溶剂加入氯仿。产物过滤，再重新溶入碳酸氢钠溶液，用蒸溜水透析(以10000道尔顿为界)后，产物冷冻干燥并称重为611毫克。所得产物经测定，活性药物含量=23.8%(w/w)，游离活性药物含量3.6%。
制备例22.多聚结合物的化学合成(028121953，CN1596129A，Ex1-Ex2)
羟乙基淀粉(HES)130kD的氧化：将10g羟乙基淀粉(130kD)置于反应容器中，并使其在尽可能少量的水中溶解。在该溶液中加入2ml0.1N碘溶液和约3ml0.1N NaOH溶液，同时加以搅拌(磁力搅拌器)。将该混合物搅拌至无色，表明I2已反应。反复加入碘溶液和/或NaOH溶液若干次，直至总共加入10ml0.1N碘溶液和20ml0.1N NaOH溶液。然后将所得溶液加载通过H、离子交换柱(Amberlite IR120)，然后在排阻限为4-6kD的透析管中相对于蒸馏水进行透析20小时。将透析产物冻干，用SOMOGYI方法测定氧化程度。氧化程度的测定：为测定所生成的氧化HES(ox-HES)，采用SOMOGYI方法(Meth.CarbohydrateChem.，I，384-386，1962)。该方法的基础是通过将Cu2+、还原为Cu+测定游离醛基。借助由碘化物和碘酸盐形成的碘将Cu+、再氧化为Cu2+。然后利用硫代硫酸盐滴定过量的碘。
两性霉素B-羟乙基淀粉结合物的合成：在反应容器中，在室温和氮气氛下，将650mg(1.5x10-5摩尔)干燥的ox-HES(130kD，氧化程度约力100%)和2.8mg(3.0x10-6摩尔)两性霉素B溶解于约4ml无水DMSO中，同时加以搅拌。在70℃下使混合物避光反应24小时。加入10倍体积的水后，通过在4℃下以水避光透析48小时对反应产物进行处理，其间更换水四次。然后对产物进行冷冻干燥，得到微黄色粉末。所得产物经测定，活性药物含量=0.58%(w/w)，游离活性药物含量4.8%。
C、试验例部分
试验例1：测试本发明多聚结合物的溶解性
以水为溶剂，在室温(22～25℃)下测定各制备例所得大分子聚合物-活性药物的多聚结合物的溶解度，并以其中可溶解的活性药物的量表征溶解度，例如当100ml水可溶解10g多聚结合物并且该多聚结合物中活性药物含量为25%时，则以活性药物表征的溶解度为2.5%。
经测定，制备例1～制备例9的全部多聚结合物，其溶解度均大于1.4%，均在1.4～2.8%范围内，例如制备例1溶解度约1.95%。但是令人遗憾的是，制备例10获得的7种多聚结合物的溶解度均小于0.5%，均在0.13～0.47%范围内，例如聚天门冬氨酸-美帕曲星多聚结合物的溶解度为0.27%。
另外，制备例21所得产物中活性药物的溶解度0.53%；制备例22所得产物中活性药物两性霉素B的溶解度0.026%。
试验例2：测试本发明多聚结合物的溶血性
参照CN1596129A(费森尤斯卡比)说明书第12～14页实施例3的方法进行溶血性试验。并以出现溶血时多烯大环内酯类物质的浓度(mg/ml)表征测试物的溶解性。该文献方法中市售制剂在两性霉素B浓度为0.1mg/ml时即有明显溶血，而两性霉素B-HES多聚结合物在两性霉素B浓度为0.4mg/ml时出现溶血。
经测定，本发明制备例1～制备例9的全部多聚结合物，以及制备例10中的美帕曲星多聚结合物、克念菌素多聚结合物，这11个多聚结合物的溶血浓度均大于2.2mg/ml，均在2.2～4.6mg/ml，例如制备例2的溶血浓度为3.56mg/ml，显示本发明多聚结合物具有良好的安全性。但是制备例10中的其它多聚结合物，以及制备例21、制备例22所得多聚结合物，它们的溶血浓度均低于0.7mg/ml，例如制备例10的菲律平多聚结合物、制备例21多聚结合物、制备例22多聚结合物的溶血浓度分别为0.45mg/ml、0.6mg/ml、0.4mg/ml。
试验例3：测试本发明多聚结合物的体内行为
参考赵荣生等的文献(两性霉素B脂质体注射剂与市售注射剂家兔体内药代动力学行为的比较，北京大学学报(医学版)，2001，33(3):243)记载的方法进行，
测试样品：制备例1、2、3所得三种两性霉素B多聚结合物；参比制剂为注射用两性霉素B脂质体(商品名：Amphotec，产品注册证号：H20090963，100mg两性霉素B/瓶，Three Rivers公司)；它们在临用时用5%葡萄糖注射液配制无菌溶液。(本发明多聚结合物可用0.9%氯化钠注射液或者5%葡萄糖注射液溶解后注射给药，与这两种溶剂均有良好的相容性，但是市售注射用两性霉素B脂质体例如Amphotec不能与0.9%氯化钠注射液混合使用)。
家兔，雌雄各半，体重2.7～3.2kg，每组5只。将家兔禁食过夜后，随机分组，分别交叉从耳缘静脉注射上述四种测试样品，给药剂量为1mg/kg体重。于给药后即刻及0(给药前30min)、0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、15、18、21、24、28、32、36小时从耳缘静脉采取血样2ml，置肝素抗凝管中，3000rpm离心10min后分离血浆。其余操作同该文献。
结果，制备例1、2、3三种多聚结合物的AUC分别是参比制剂AUC的1.62、1.84、1.77倍。另外，对各样品绘制血药浓度曲线，对于每一试样，计算它们的血药浓度大于0.5mg/L的持续时间(赵荣生等的文献中记载两性霉素B市售注射剂在给药后约3小时血药浓度即降到了0.5mg/L，我们在此假定以该0.5mg/L为最低有效治疗血药浓度)，制备例1、2、3三种多聚结合物分别为18.4hr(从给药后起0.82h～19.2h期间)、21.8hr、17.41hr，而参比制剂的持续时间为11.7hr(从给药后起1h～11.7h期间)。假定以超过0.5mg/L为最低起效血药浓度，则在同剂量下本发明多聚结合物可以维持显著更长的有效治疗时间。并且已经出人意料地发现，本发明多聚结合物在血液中的游离药物浓度呈现类似于口服给药的血药浓度曲线(例如制备例1多聚结合物的血药浓度达峰时间为7.2h)，而不是呈现经典的注射给药的血药浓度曲线(例如参比制剂的血药浓度达峰时间为0h)，这样可以避免经典注射给药血药浓度曲线在给药初始阶段极高的血药浓度，从而可以避免或减少因极高血药浓度给本身毒性较大的两性霉素B引发的毒副作用。
试验例4：相容性试验
测试品：本发明制备例1～制备例10所得多聚结合物，市售注射用两性霉素B脂质体(商品名：Amphotec)。
测试1：使上述各测试品适量(相当于含活性成分100mg)分别与20ml、50ml、或100ml的注射用水溶解，观察药液溶解情况，特别是观察是否有不溶颗粒物；接着使溶解的药液置于4℃冰箱中放置6小时，观察药液溶解情况，特别是观察是否有不溶颗粒物；接着使溶解的药液置于30℃中放置6小时，观察药液溶解情况，特别是观察是否有不溶颗粒物。结果显示，在上述三种状态下观察，制备例1～制备例10所得全部多聚结合物均未出现不溶性颗粒物，但是Amphotec在30℃-6小时后显示有不溶性颗粒物。
测试2：使上述各测试品适量(相当于含活性成分100mg)分别与20ml、50ml、或100ml的0.9%氯化钠注射液溶解，参照上述“测试1”方法观察三种状态下的药液溶解情况。结果显示，在上述三种状态下观察，制备例1～制备例10所得全部多聚结合物均未出现不溶性颗粒物，但是Amphotec在30℃-6小时后显示有不溶性颗粒物。
测试3：使上述各测试品适量(相当于含活性成分100mg)分别与20ml、50ml、或100ml的5%葡萄糖注射液溶解，参照上述“测试1”方法观察三种状态下的药液溶解情况。结果显示，在上述三种状态下观察，制备例1～制备例10所得全部多聚结合物以及Amphotec均未出现不溶性颗粒物。
试验例5：药物安全性试验
已知两性霉素B大鼠静脉给药LD50值为1.6mg/kg(www.pfizer.com/.../Amphotericin%20B%20INJECTION.pdf,MATERIAL SAFETY DATA SHEET,Revision date:20-Dec-2007,Version:1.1,Page3)；另外，也有文献资料记载两性霉素B在小鼠和大鼠中的LD50分别为2.3mg/kg和1.6mg/kg(R T Proffitt,A Satorius,S M Chiang,L Sullivan,J P Adler-Moore,JAntimicrobChemother.1991Oct;28Suppl B:49-611778892Cit:108)。
本试验中测试了本发明制备例1所得聚天门冬氨酸-两性霉素B多聚结合物(可缩写为PA-AB，活性药物含量23.4%)对动物的安全性。
试药配制：将PA-AB用无菌生理盐水溶解制成浓度5mg/ml(每1ml溶液中含有的药物以原型药物两性霉素B计为5mg)的溶液，备用。
将大鼠(雌性)随机分成6组，每组3只；对照组给予无菌生理盐水(与15mg/kg剂量组的注射体积相同)，另外7组分别静脉注射给予5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、18mg/kg、30mg/kg，将各组动物分别于0天(给药前)，以及给药后第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天对动物称体重，计算每组动物的平均体重以及该组动物体重相对于其在0天时的体重增加百分数。结果见下表：
注：*以PA-AB形式给药，剂量是以两性霉素B形式计算的。#18mg/kg剂量组在第3天和第4天各观察到1只动物死亡；30mg/kg剂量组在第2天观察到有2只动物死亡，第3天有1只动物死亡；其它组别未见有动物死亡，并且在试验结束时各动物体重恢复至初始水平。
另外，同上法测定本发明制备例2～制备例10所得的各批多聚结合物，剂量均为15mg/kg，结果显示全部试药在第8天时均未见有动物死亡，并且在试验结束时各动物体重恢复至初始水平。本试验结果显示本发明多聚结合物在剂量高达15mg/kg时仍未见有动物死亡，而文献报道两性霉素B的LD50为1.6mg/kg，显示本发明多聚结合物的安全性远远高于原型药物。
试验例6：药效学实验：
试验方法：使用常规方法使小白鼠进行免疫力破坏(血液中白细胞计数≤100)，造模成功的小鼠用白念球菌进行感染；接着随机将动物分成8组，每组动物20只；使各组动物根据其分组经尾静脉注射给药，分组和剂量(各组剂量均折算成以两性霉素B的量计)见下表。此后每天观察小鼠生存情况，持续7天，于第7天统计每组小鼠死亡数，结果见下表：
组别 试药 剂量
A 生理盐水 0 死亡20只
B1 两性霉素B 2mg/kg 死亡3只
B2 两性霉素B 1mg/kg 死亡10只
C1 制备例1多聚结合物 2mg/kg 没有死亡
C2 制备例1多聚结合物 1mg/kg 没有死亡
C3 制备例1多聚结合物 0.5mg/kg 没有死亡
C4 制备例1多聚结合物 0.25mg/kg 死亡5只
C5 制备例1多聚结合物 0.125mg/kg 死亡14只
以上试验结果显示：对照组(给予两性霉素B原型药物的动物)的半数有效量约为1mg/kg；受试组(给予多聚结合物的动物)的半数有效量在0.25mg/kg～0.125mg/kg范围内，表明本发明形成多聚结合物的两性霉素B比之于其原型药物具有显著更高的药效。

Claims (16)

1.一种多聚结合物，其包括活性药物和大分子聚合物，所述活性药物与所述大分子聚合物通过化学键结合。
2.根据权利要求1的多聚结合物，其中：
所述活性药物是多烯大环内酯类抗生素；和/或
所述活性药物是选自下列的多烯大环内酯类抗生素：两性霉素B、制霉菌素、那他霉素、曲古霉素、美帕曲星、克念菌素、菲律平、金色制霉素、意北霉素、汉霉素、表霉素。
3.根据权利要求1-2的多聚结合物，其中所述大分子聚合物选自：由氨基酸聚合形成的聚氨基酸、由氨基六碳糖聚合形成的聚氨基六碳糖。
4.根据权利要求3的多聚结合物，其中所述大分子聚合物是由氨基酸聚合形成的聚氨基酸，所述氨基酸选自：羧酸型氨基酸、氨基型氨基酸、或其组合；或者进一步地，所述羧酸型氨基酸选自：天门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、或它们以任意比率的组合；或者进一步地，所述氨基型氨基酸选自：鸟氨酸(Orn)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、羟赖氨酸(Hyl)、或它们以任意比率的组合；或者进一步地，形成所述聚氨基酸的氨基酸包括其D型氨基酸、L型氨基酸、DL混合型氨基酸；或者进一步地，所述聚氨基酸的平均分子量为5000～100000道尔顿。
5.根据权利要求3的多聚结合物，其中所述大分子聚合物是由氨基六碳糖聚合形成的聚氨基六碳糖，所述氨基六碳糖选自：氨基葡萄糖、氨基半乳糖、乙酰氨基葡萄糖、乙酰氨基半乳糖、或其组合；或者进一步地，所述聚氨基六碳糖的平均分子量为10000～200000道尔顿。
6.根据权利要求1-5的多聚结合物，其中所述活性药物重量是该多聚结合物重量的5～60%。
7.制备权利要求1-6任一项所述多聚结合物的方法，其中包括以下步骤：
i)提供大分子聚合物，使其溶解于溶剂中以形成溶液；
ii)向步骤i)所得溶液中加入活性药物并使其溶解；
iii)向步骤ii)所得溶液中加入催化剂和缩合剂，使大分子聚合物和活性药物进行缩合反应，以形成大分子聚合物与活性药物二者通过化学键结合的多聚结合物；
iv)分离提取所得多聚结合物。
8.根据权利要求7的方法，其特征在于：
步骤i)中所述溶剂是有机溶剂，例如二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等；
步骤iii)中所述催化剂是4-(二甲氨基)吡啶；和/或
步骤iii)中所述缩合剂是二环己基碳二亚胺。
9.提高活性药物的溶解度的方法，该方法包括使所述活性药物与大分子聚合物通过化学键结合而形成多聚结合物的步骤。
10.根据权利要求9的方法，其中：
所述活性药物是多烯大环内酯类抗生素；和/或
所述活性药物是选自下列的多烯大环内酯类抗生素：两性霉素B、制霉菌素、那他霉素、曲古霉素、美帕曲星、克念菌素、菲律平、金色制霉素、意北霉素、汉霉素、表霉素。
11.根据权利要求9-10的方法，其中所述大分子聚合物选自：由氨基酸聚合形成的聚氨基酸、由氨基六碳糖聚合形成的聚氨基六碳糖。
12.根据权利要求11的方法，其中所述大分子聚合物是由氨基酸聚合形成的聚氨基酸，所述氨基酸选自：羧酸型氨基酸、氨基型氨基酸、或其组合；或者进一步地，所述羧酸型氨基酸选自：天门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、或它们以任意比率的组合；或者进一步地，所述氨基型氨基酸选自：鸟氨酸(Orn)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、羟赖氨酸(Hyl)、或它们以任意比率的组合；或者进一步地，形成所述聚氨基酸的氨基酸包括其D型氨基酸、L型氨基酸、DL混合型氨基酸；或者进一步地，所述聚氨基酸的平均分子量为5000～100000道尔顿。
13.根据权利要求11的方法，其中所述大分子聚合物是由氨基六碳糖聚合形成的聚氨基六碳糖，所述氨基六碳糖选自：氨基葡萄糖、氨基半乳糖、乙酰氨基葡萄糖、乙酰氨基半乳糖、或其组合；或者进一步地，所述聚氨基六碳糖的平均分子量为10000～200000道尔顿。
14.根据权利要求9-13的方法，其中所述活性药物重量是该多聚结合物重量的5～60%。
15.根据权利要求9-14的方法，其中所述活性药物与大分子聚合物通过化学键结合而制备多聚结合物的步骤是照权利要求7-8的方法进行。
16.药物组合物，其中包含权利要求1-6任一项的多聚结合物，以及任选的药学可接受的辅料。
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