KR101749004B1 - 약학적 수용성 항진균 거대분자 화합물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 감염성 질병의 치료를 위해 사용되는 의약용 수용성 항진균 거대분자 화합물, 특히 화학적 결합을 통해 서로 결합된 활성 약물 물질과 거대분자 중합체를 포함하는 다중접합체에 관한 것이다. 활성 약물 물질은 암포테리신 B와 같은 폴리엔 마크롤라이드 화합물이다. 상기 다중접합체의 제조방법, 활성 약물 물질의 용해도를 증가시키는 방법 및 진균과 관련된 임의의 질병인 진균성 감염, 예컨대 패혈증, 심내막염, 수막염(크립토코쿠스 및 기타 진균에 의해 발생), 복부 감염(투석과 관련이 있는 것 포함), 폐 감염, 요로 감염 등의 치료방법이 또한 제공된다. 다중복합체는 생물학적 성능 및/또는 물리적 성능 및/또는 화학적 성능 측면에서 우수한 성질을 가진다.
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Description

약학적 수용성 항진균 거대분자 화합물{PHARMACEUTICAL, WATER-SOLUBLE AND ANTIFUNGAL MACROMOLECULAR COMPOUND}
본 발명은 진균 감염 치료용 의약, 특히 감염성 질병 치료 목적의 폴리엔 마크롤라이드 항생제, 예컨대 암포테리신 B 및 중합성 마크로펩티드 또는 다당류로 구성된 다중접합체, 보다 구체적으로 중합성 마크로펩티드, 다당류 또는 글리코펩티드와 폴리엔 마크롤라이드 화합물, 예컨대 암포테리신 B 간의 결합 반응으로부터 유도된 폴리엔 마크롤라이드 다중접합체, 예컨대 암포테리신 B 다중접합체에 관한 것이다.
폴리엔 화합물(본원에서는 폴리엔 항생제, 폴리엔 마크롤라이드 항생제, 폴리엔, 폴리엔 항진균성 약물로도 칭해짐)은 접합된 폴리엔과 하이드록실을 가지는 마크롤라이드 화합물의 부류이다. 폴리엔 화합물의 대표적인 예는 암포테리신 B, 나이스타틴, 나타마이신, 하치마이신, 메파트리신, 칸니트라신, 필리핀, 아우레오펀긴, 에트루스코마이신, 하마이신, 페리마이신 등이다. 폴리엔 항생제는 임상적으로 사용된 최초의 항진균성 약물이었다. 이들의 항진균 작용 메커니즘은 감수성 진균의 세포막 상에 있는 스테롤과 결합하여 세포막 투과성을 손상시키고, 칼륨 이온, 뉴클레오티드 및 아미노산 등과 같은 중요한 세포 내 물질의 누설을 일으키고, 세포 대사를 방해함으로써 세포 성장을 저해하는 것을 포함한다.
암포테리신 B(본원에서 AB로 약칭되기도 함)는 중국 약전 2010에 수록되어 있으며, 다음과 같은 구조식, 분자식 및 분자량을 가진다:
Figure 112016007439486-pct00001
암포테리신 B는 진균 감염을 치료하기 위해 임상적으로 사용된다. 이는 진균 세포막의 투과성에 영향을 미쳐 진균 증식을 억제하고, 가장 흔하게는 심각한 장기 또는 전신성 심부 진균 감염을 치료하기 위해 사용된다. 암포테리신 B는 스트렙토마이세스 노도수스(Streptomyces nodosus)의 배양 배지로부터 단리된 폴리엔 화합물이다. 화학적으로, 이는 폴리엔 마크롤라이드 물질에 속하며, 그의 38-원 락톤 고리 내에는, 모두 트랜스 배열인 7개의 공액 이중 결합이 있고, 락톤 고리는 O-글리코시드 결합에 의해 아미노당 D-트레할로사민에 추가로 연결되어 있다. 암포테리신 B는 디메틸 설폭사이드에 가용성이고, 디메틸포름아미드에 약간 가용성이며, 메탄올에 난용성이고, 물, 무수 에탄올, 클로로포름 또는 에테르에 불용성이다. 이는 중성 또는 산성 매질에서 염을 형성하여 용해도가 증가할 수 있지만, 항진균 활성이 감소할 수 있다. 암포테리신 B는 친유성 및 친수성 영역을 둘 다 가지는 양쪽성으로, 진균 세포막 내 스테롤과 복합체를 형성하여 세포막 투과성에 손상을 일으킬 수 있다. 세균의 세포막에는 스테롤이 존재하지 않기 때문에, 암포테리신 B의 항생 작용은 진균에 대해 선택적으로 유도된다.
암포테리신 B는 실질적으로 모든 병원성 진균에 대해 광범위한 항진균 스펙트럼을 나타내기 때문에 인간의 전신성 진균 감염을 치료하기 위한 제1 선택 약물이다. 최근 침습성 진균 감염 사례가 특히 면역 체계가 손상된 환자, 예컨대 HIV 또는 암 환자에서 급증했다.
한편, 암포테리신 B로의 치료는 때때로 중증의 부작용을 동반한다. 전신 및 장기 진균 감염을 치료하기 위한 암포테리신 B의 일반적인 용량은 0.5 내지 0.7 ㎎/체중 ㎏이다(i.v.). 그러나, 환자마다 서로 다른 약물 관용성을 나타내기 때문에, 이 용량은 개인마다 조정되거나 변경되어야 한다. 또한, 면역 체계가 손상된 환자들은 종종 더 높은 용량, 예컨대 1 ㎎/체중 ㎏/일이 필요하며, 잘 견디기만 한다면 심한 경우 필요한 용량은 1.5 mg/kg 까지 증가시킬 수 있다. 관용성 및 감염의 심각도에 따라 비경구 암포테리신 B로의 치료는 수 주에서 수 개월 동안 지속될 수 있다.
비경구 치료 동안 전형적인 주입 반응, 예컨대 발열, 오한 및 구토가 통상적인데, 이는 치료 중단이 필요한 것이 아니라 단지 증상 치료 만을 필요로 한다. 그러나, 간 및 특히 신장 기능 장애는 더 심각한 주입 반응이고 자주 발생한다. 예를 들어, 치료 초에, 사구체 여과율은 항상 약 40% 정도 감소한다. 대부분의 환자들은 전체 치료 기간 동안 낮은 사구체 여과율을 유지할 것이다. 따라서, 혈청 크레아티닌 및 혈중 요소의 수준이 증가한다. 때때로, 치료 후/치료를 마친 후 돌이킬 수 없는 손상이 관찰되기도 한다. 치료 개시 후 2 내지 3 주째에 헤마토크릿이 25-30%로 감소한 빈혈이 보통 나타난다. 하지만, 치료 완료 후 혈구수 변화는 완전히 가역성이다.
암포테리신 B는 그의 독성 및 부작용 때문에, 생명을 위협하는 진균 감염의 경우에만 사용되어야 한다. 그렇지만, 암포테리신 B는 일반적으로 면역이 저하된 환자(예를 들어, AIDS 또는 장기 이식 후)에서 진균 질병에 효과가 있는 유일한 약물이다.
암포테리신 B는 분자 구조 내에 친수성 영역을 보유하지만 전체적으로 상당한 소수성을 갖기 때문에, 생리 pH 하에서 물에 거의 불용성이고 유기 용매에 난용성이다. 따라서, 현재의 시판 제품들은 추가적인 단점으로 제약이 따르는 복잡한 구조를 갖는 약물 형태이다. 수용해도는 적합한 가용화제, 예컨대 소듐 데옥시콜레이트를 사용하여 개선될 수 있다. 예를 들어, BRISTOL-MYERS SQUIBB에서 판매하는 오리지널 주입 제제(독일에서 상품명 "암포테리신 B"로 입수가능)는 동결 건조된 분말의 형태이지만, 암포테리신 B 및 소듐 데옥시콜레이트의 미셀 분산액 형성을 위해 물에 재용해되어야 한다. 즉시 사용 가능한 주입 용액을 얻기 위해, 원액은 예를 들면 5% 포도당 용액과 같은 무전해질 액체로 원하는 최종 농도로 희석될 수 있다.
상기 제제는 매우 제한적인 치료 지수가 추가 특징이며, 즉 유효 용량과 독성 용량 사이의 범위가 매우 좁다. 또, 특정 임상의 경우, 이와 같은 암포테리신 B의 제제는 제제가 활성 물질을 감염 부위로 전달하지 못하고/거나, 진균 감염 부위에서 활성 물질이 충분한 농도로 존재하지 않기 때문에, 암포테리신 B 자체의 광범위 작용 스펙트럼에도 불구하고 효과가 좋지 않고, 진균 감염 부위에서 암포테리신 B의 적절한 항진균 효과는 부족하거나 불충분하다.
오리지널 제제의 단점을 극복하기 위해 암포테리신 B의 일련의 지질 기반 제제, 예를 들어, 지질과 암포테리신 B의 지질 복합체, 콜레스테롤 설페이트와 암포테리신 B의 콜로이드 분산액, 및 리포솜에 함유된 암포테리신 B가 개발되었다. 이러한 약물 형태는 모두 개선된 치료 지수 및 관용성을 가지는데, 특히 암포테리신 B의 기존의 소듐 데옥시콜레이트 제제에 비해 신독성이 낮아서 이 약물 형태는 더 높은 용량으로 투여될 수 있지만 부작용을 완전히 방지할 수는 없었다.
높은 생산 비용으로 고가 제품으로 될 수 밖에 없다는 것이 암포테리신 B 제제의 또 다른 주요 단점이다. 또, 이들은 즉시 사용 가능한 형태를 얻기 위해 재용해되어야 하기 때문에, 이들의 복잡한 약물 형태는 불편하다. 이들 치료 지수의 일부 개선에도 불구하고, 암포테리신 B의 지질 기반 제제는 전술한 단점 및 다른 문제 때문에 시장에서 널리 받아들여지지 않고 있다.
암포테리신 B의 임상 효능이 장기간 확립되었다. 그러나 그의 임상 사용은 다음으로 인해 제한된다: 1. 낮은 수용해도, 정맥 투여에 적합한 제형 부족; 2. 높은 독성 및 부작용, 제한된 용량 범위; 3. 제한된 용량 범위 때문에, 용량은 서서히 증가되어야 하고, 이는 임상적 내성 발생 빈도를 증가시키는 동시에 치료 효과를 저하시킬 수 있다.
현재 임상적으로 사용가능한 암포테리신 B 제제는 주로 다음을 포함한다:
재용해 후 콜로이드 분산액을 형성하기 위해 가용화제로서 소듐 데옥시콜레이트를 사용하는 주사용 암포테리신 B로서, 병원에서 사용되는 1차 암포테리신 B 제제, 예컨대 NORTH CHINA PHARMACEUTICAL COMPANY. LTD의 제품(국립 의약품 허가 번호 H13020283). 징후는 다음을 포함한다: 감수성 진균에 의해 유발되는 점진적으로 악화되는 진균성 감염, 예컨대 패혈증, 심내막염, 수막염(Cryptococcus sp. 및 기타 진균류에 의해 발생), 복부 감염(투석을 받고 있는 경우 포함), 폐 감염, 요로 감염 및 내안구염 등;
주사용 암포테리신 B 리포솜으로서 콜레스테릴 소듐 설페이트, 트로메타민, 디소듐 EDTA, 락토스 일수화물 및 염산으로 만들어진 리포솜 제제, 예컨대 Three Rivers Pharmaceuticals. LLC로부터 수입한 제품(상품명: 암포텍, 허가 번호 H20090964). 리포솜 제제의 징후는 다음을 포함한다: 심부 진균 감염을 가진 환자, 신장애 또는 약물 독성으로 유효 용량의 기존 암포테리신 B의 사용이 배제된 환자, 기존의 암포테리신 B 치료에 실패한 환자;
암포테리신 B 지질 복합체 주사액, 예를 들면, 시그마-타우 제약 회사(Sigma-tau pharmaceutic company) 제인 ABELCET?(상품명) 제품으로서, 정맥 내 주입용 멸균 무발열성 현탁액. 이는 2종의 지질 성분이 1:1 약물-대지질 몰비로 복합체를 이룬 암포테리신 B로 구성되어 있다. 2종의 지질 성분, L-α-디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC) 및 L-α-디미리스토일포스파티딜글리세롤(DMPG)은 7:3의 몰비로 존재한다. 이 주입액은 기존 암포테리신 B 요법으로 다루기 힘들거나 듣지 않는 환자에서 침습성 진균 감염의 치료를 위해 처방된다.
주사용 암포테리신 B 리포솜, AmBisome?은 정맥 주입을 위한 멸균 비발열성 동결건조 제품이다. 각 바이알은 900 mg의 수크로스 및 27 mg의 디소듐 숙시네이트 육수화물과 함께 213 mg의 수소화 대두 포스파티딜콜린, 52 mg의 콜레스테롤, 84 mg의 디스테아로일 포스파티딜 글리세롤, 0.64 mg의 알파토코페롤로 이루어진 리포솜 막으로 삽입되는 50 mg 암포테리신 B를 함유한다. AmBisome?은 열성 호중구 감소증 환자에서 추정 진균성 감염의 실험적 치료, HIV 감염 환자에서 크립토코쿠스 뇌막염(Cryptococcal Meningitis) 치료, 암포테리신 B 데옥시콜레이트가 듣지 않는 아스페르길루스 종, 칸디다 종 및/또는 크립토코쿠스 종 감염 환자의 치료 또는 신장애 또는 허용되지 않는 독성으로 암포테리신 B 데옥시콜레이트의 사용이 배제된 환자의 치료를 위해 처방된다. 따라서, 암포테리신 B의 일부 단점을 극복하기 위한 매개체로서 리포솜을 이용하는 방법(제형)은 임상적으로 널리 인정되고 있다.
그러나, 상기 암포테리신 B 지질 복합체 주사액 ABELCET? 및 AmBisome?의 제품 설명서에는 다음과 같은 주의사항이 명시적으로 (굵게) 기입되어 있다: 리포솜 캡슐화 또는 지질 복합체 내 도입은 비캡슐화 또는 비지질-관련 약물에 비해 실질적으로 약물의 기능성에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 일반적인 활성 성분을 가지는 다른 리포솜 또는 지질 복합체 제품은 지질 성분의 화학적 조성과 물리적 형태가 서로 다를 수 있다. 이러한 차이는 이들 약품의 성질에 영향을 미칠 수 있다(http://www.rxlist.com/abelcet-drug.htm 참조). 따라서, 당 분야에서는 암포테리신 B와 같은 동일한 활성 약물 물질에 대해서 상이한 약물 담체는 약물에 완전히 다른 예기치않은 물리화학적 또는 심지어 생물학적 성질을 초래할 수 있다는 것은 주지이다.
암포테리신 B의 임상적 사용과 관련된 다수의 결점들을 고려하여, 당업자가 진균 감염에 의한 것과 같은 감염성 질병의 치료 방법을 제공하기를 여전히 기대하고 있다. 예를 들어, 활성 물질로 암포테리신 B를 사용하여 이러한 질병을 치료하기 위한 방법을 제공하기를 기대하며, 이 방법뿐만 아니라 상기 방법에 의해 제공된 치료제들은 하나 이상의 측면에서 이점이 있을 것으로 기대한다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 감염성 질병, 예컨대 진균 감염에 의해 발생하는 것을 치료하는 방법을 제공하는 것이다. 예를 들어, 활성 물질로 암포테리신 B를 사용하여 이러한 질병을 치료하기 위한 방법이 제공될 것으로 기대되며, 이 방법뿐만 아니라 상기 방법에 의해 제공된 치료제들은 하나 이상의 측면에서 이점이 있을 것으로 기대된다. 본 발명에 의해, 놀랍게도, 중합성 거대분자를 암포테리신 B와 결합하여 수득된 암포테리신 B 다중접합체가 적어도 하나의 예기치 않은 성질, 예컨대 물리화학적 성질 및/또는 생물학적 성질을 나타내는 것으로 발견되었다. 또한 놀랍게도, 다른 폴리엔 마크롤라이드 항생제를 중합성 거대분자와 결합하면, 예기치 않게 암포테리신 B에 부여되는 것과 유사한 성질을 나타내는 것으로 발견되었다. 본 발명은 이러한 발견에 기초하여 완성되었다.
따라서, 본 발명의 제1 양태는 활성 약물 물질과 거대분자 중합체를 포함하고, 여기서 활성 약물 물질은 화학 결합에 의해 거대분자 중합체와 접합되어 있는, 약학적으로 허용되는 다중접합체를 제공한다.
제1 양태의 일 구체예에 따라, 본 발명은 활성 약물 물질이 폴리엔 마크롤라이드 항생제인 다중접합체를 제공한다.
제1 양태의 일 구체예에 따라, 본 발명은 활성 약물 물질이 다음의 폴리엔 마크롤라이드 항생제로부터 선택되는, 다중접합체를 제공한다: 암포테리신 B, 나이스타틴, 나타마이신, 트리코마이신, 메파트리신, 칸니트라신(CAS No. 84930-92-7, 예를 들어, ZHEJIANG HAIZHENG PHARM CO LTD에서 입수한 제품, 국립 의약품 허가 번호 H33021810, 필리핀 III(CAS No. 480-49-9), 아우레오펀긴, 에트루스코마이신, 하마이신(CAS No. 1403-71-0), 페리마이신(CAS No. 62327-61-1) 등. 일 구체예에서, 활성 약물 물질은 다음의 폴리엔 마크롤라이드 항생제로부터 선택된다: 암포테리신 B, 나이스타틴, 나타마이신, 트리코마이신.
제1 양태의 일 구체예에 따라, 본 발명은 거대분자 중합체가 아미노산의 중합에 의해 형성된 폴리아미노산 및 아미노헥소스의 중합에 의해 형성된 폴리아미노헥소스로부터 선택되는, 다중접합체를 제공한다.
제1 양태의 일 구체예에 따라, 본 발명은 거대분자 중합체가 아미노산의 중합에 의해 형성된 폴리아미노산인, 다중접합체를 제공한다. 아미노산은 카복실산형 아미노산, 아미노형 아미노산 또는 이들의 조합으로부터 선택되고, 따라서 카복실산형 폴리아미노산 또는 아미노형 폴리아미노산을 형성한다.
제1 양태의 일 구체예에 따라, 본 발명은 카복실산형 아미노산이 아스파르트산(Asp), 글루타메이트(Glu), 또는 임의 비율의 이들의 조합으로부터 선택되는, 다중접합체를 제공한다.
제1 양태의 일 구체예에 따라, 본 발명은 아미노형 아미노산이 오르니틴(Orn), 리신(Lys), 아르기닌(Arg), 하이드록시리신(Hyl), 또는 임의 비율의 이들의 조합으로부터 선택되는, 다중접합체를 제공한다.
제1 양태의 일 구체예에 따라, 본 발명은 폴리아미노산 내 아미노산이 D-아미노산, L-아미노산 및 DL-아미노산을 포함하는, 다중접합체를 제공한다.
제1 양태의 일 구체예에 따라, 본 발명은 아미노헥소스가 글루코사민, 갈락토사민, 아세틸 글루코사민, 아세틸 갈락토사민, 또는 이들의 조합으로부터 선택되고, 따라서 폴리-글루코사민, 폴리-갈락토사민, 폴리-아세틸글루코사민, 폴리-아세틸갈락토사민 등을 형성하는, 다중접합체를 제공한다.
제1 양태의 일 구체예에 따라, 본 발명은 폴리아미노산의 평균 분자량이5000-100000 달톤, 예를 들어, 10000-80000 달톤, 10000-50000 달톤, 10000-40000 달톤인, 다중접합체를 제공한다.
제1 양태의 일 구체예에 따라, 본 발명은 폴리-아미노헥소스의 평균 분자량이 10000-200000 달톤, 예를 들어, 20000-180000 달톤, 20000-150000 달톤, 30000-120000 달톤, 40000-100000 달톤인, 다중접합체를 제공한다.
제1 양태의 일 구체예에 따라, 본 발명은 활성 약물 물질의 중량이 다중접합체 총 중량의 5~60%를 차지하는, 다중접합체를 제공하며, 즉, 다중접합체는 5-60 중량%의 활성 약물 물질을 포함하고 잔량은 거대분자 중합체이다. 예를 들어, 활성 약물 물질은 다중접합체 총 중량의 10-50%, 10-40%, 10-35%를 차지한다.
제1 양태의 일 구체예에 따라, 본 발명은 투여 시에 주사 용매로서 주사용수, 염화나트륨 주사액, 포도당 주사액을 사용할 수 있는, 다중접합체를 제공한다.
또한, 본 발명의 제2 측면은 다음의 단계를 포함하는, 본 발명의 제1 양태의 일 구체예에 따른 다중접합체의 제조방법을 제공한다:
i) 거대분자 중합체를 제공하고 이를 용매에 용해시켜 용액을 형성하는 단계;
ii) 상기 단계 (i)에서 얻은 용액에 활성 약물 물질을 첨가하여 용해시키는 단계;
iii) 상기 단계 (ii)에서 얻은 용액에 촉매 및 축합제를 첨가하고, 거대분자 중합체와 활성 약물 물질을 축합하여 그의 다중접합체를 형성하는 단계로서, 여기서 거대분자 중합체와 활성 약물 물질은 화학 결합에 의해 서로 결합되어 있는 것인 단계; 및
(iv) 상기에서 얻은 다중접합체를 분리 및 추출하는 단계.
제2 양태의 일 구체예에 따라, 본 발명은 (i) 단계에 사용되는 용매가 디메틸포름아미드, 디메틸 설폭사이드 등을 예로 들 수 있으나 이에 한정되지 않는 유기 용매인, 방법을 제공한다.
제2 양태의 일 구체예에 따라, 본 발명은 (iii) 단계에서 사용되는 촉매가 4-디메틸아미노피리딘(DMAP로 약칭)인, 방법을 제공한다. 촉매의 양은 일반적으로 활성 약물 물질 몰량의 0.2 내지 4배, 예컨대 0.5-2, 0.8-1.5 또는 1.0-1.2배일 수 있다.
제2 양태의 일 구체예에 따라, 본 발명은, (iii) 단계에서 사용되는 축합제가 디사이클로헥실 카보디이미드(DCC로 약칭)인, 방법을 제공한다. 축합제의 양은 일반적으로 활성 약물 물질 몰량의 0.5 내지 2배, 예컨대 0.8-1.5 또는 1.0-1.2배일 수 있다.
제2 양태의 일 구체예에 따라, 본 발명은 단계 (iv)의 분리 및 추출이 결합되지 않은 자유 활성 약물 물질을 용이하게 제거할 수 있는 투석 기반의 방법에 의해 수행되는, 방법을 제공한다. 이는 당업자에게 주지이다.
본 발명의 방법에서, 카복실산형 폴리아미노산(예컨대 폴리아스파르트산) 내 자유 카복실 그룹은 축합제 DCC 및 촉매 DMAP를 사용하는 반응 조건 하에서 활성 약물 분자 중의 하이드록실 그룹과 축합하여 화학적 결합을 통해 서로 결합되어 있는 폴리엔 항생제 및 폴리아미노산으로 구성된 다중접합체를 형성할 수 있다. 또, 축합제 DCC 및 촉매 DMAP를 사용하는 상기 반응 조건은 또한 아미노형 폴리아미노산, 예컨대 폴리오르니틴 내 자유 아미노 그룹을 활성 약물 분자(특히 카복실 그룹을 함유하는 것) 내에 카복실 그룹와 축합시켜 화학 결합을 통해 서로 결합되어 있는 폴리엔 항생제 및 폴리아미노산으로 구성된 다중접합체를 형성하도록 할 수 있다. 또, 축합제 DCC 및 촉매 DMAP를 사용하는 상기 반응 조건은 또한 폴리아미노헥소스, 예컨대 폴리글루코사민 내 카복실 그룹을 활성 약물 분자(특히 카복실 그룹을 함유하는 것) 내에 카복실 그룹와 축합시켜 화학 결합을 통해 서로 결합되어 있는 폴리엔 항생제 및 폴리아미노헥소스로 구성된 다중접합체를 형성하도록 할 수 있다. 화학 결합을 통해 거대분자 중합체와 활성 약물 물질을 결합시킬 수 있는 당업자에 공지된 다른 방법도 또한 본 발명에 사용될 수 있다.
놀랍게도, 본원에 개시된 방법에 의해, 본 발명의 암포테리신 B 다중접합체는 적어도 상응하는 활성 약물 물질에 비해 훨씬 더 높은 수용성을 부여하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 이 방법에 의해 수득된 암포테리신 B 다중접합체는 (등가의 암포테리신 B로 환산하여 계산되었을 때) 원형의 암포테리신 B에 비해 예상외로 훨씬 더 높은 용해도를 가진다.
본 발명의 제3 양태는 또한 활성 약물 물질을 화학 결합에 의해 거대분자 중합체와 결합시켜 다중접합체를 형성하는 단계를 포함하는, 활성 약물 물질의 용해도를 증가시키는 방법을 제공한다.
제3 양태의 일 구체예에 따라, 본 발명은 활성 약물 물질이 폴리엔 마크롤라이드 항생제인, 방법을 제공한다.
제3 양태의 일 구체예에 따라, 본 발명은 활성 약물 물질이 다음의 폴리엔 마크롤라이드 항생제로부터 선택되는, 방법을 제공한다: 암포테리신 B, 나이스타틴, 나타마이신, 트리코마이신, 메파트리신, 칸니트라신(CAS No. 84930-92-7, 예를 들어, ZHEJIANG HAIZHENG PHARM CO LTD에서 입수한 제품, 국립 의약품 허가 번호 H33021810, 필리핀 III(CAS No. 480-49-9), 아우레오펀긴, 에트루스코마이신, 하마이신(CAS No. 1403-71-0), 페리마이신(CAS No. 62327-61-1) 등. 일 구체예에서, 활성 약물 물질은 다음의 폴리엔 마크롤라이드 항생제로부터 선택된다: 암포테리신 B, 나이스타틴, 나타마이신, 트리코마이신.
제3 양태의 일 구체예에 따라, 본 발명은 거대분자 중합체가 아미노산의 중합에 의해 형성된 폴리아미노산 및 아미노헥소스의 중합에 의해 형성된 폴리아미노헥소스로부터 선택되는, 방법을 제공한다.
제3 양태의 일 구체예에 따라, 본 발명은 거대분자 중합체가 아미노산의 중합에 의해 형성된 폴리아미노산인, 방법을 제공한다. 아미노산은 카복실산형 아미노산, 아미노형 아미노산 또는 이들의 조합으로부터 선택되고, 따라서 카복실산형 폴리아미노산 또는 아미노형 폴리아미노산을 형성한다.
제3 양태의 일 구체예에 따라, 본 발명은 카복실산형 아미노산이 아스파르트산(Asp), 글루타메이트(Glu), 또는 임의 비율의 이들의 조합으로부터 선택되는, 방법을 제공한다.
제3 양태의 일 구체예에 따라, 본 발명은 아미노형 아미노산이 오르니틴(Orn), 리신(Lys), 아르기닌(Arg), 하이드록시리신(Hyl), 또는 임의 비율의 이들의 조합으로부터 선택되는, 방법을 제공한다.
제3 양태의 일 구체예에 따라, 본 발명은 폴리아미노산 내 아미노산이 D-아미노산, L-아미노산 및 DL-아미노산을 포함하는, 방법을 제공한다.
제3 양태의 일 구체예에 따라, 본 발명은 아미노헥소스가 글루코사민, 갈락토사민, 아세틸 글루코사민, 아세틸 갈락토사민, 또는 이들의 조합으로부터 선택되고, 따라서 폴리-글루코사민, 폴리-갈락토사민, 폴리-아세틸글루코사민, 폴리-아세틸갈락토사민 등을 형성하는, 방법을 제공한다.
제3 양태의 일 구체예에 따라, 본 발명은 폴리아미노산의 평균 분자량이5000-100000 달톤, 예를 들어, 10000-80000 달톤, 10000-50000 달톤, 10000-40000 달톤인, 방법을 제공한다.
제3 양태의 일 구체예에 따라, 본 발명은 폴리-아미노헥소스의 평균 분자량이 10000-200000 달톤, 예를 들어, 20000-180000 달톤, 20000-150000 달톤, 30000-120000 달톤, 40000-100000 달톤인, 방법을 제공한다.
제3 양태의 일 구체예에 따라, 본 발명은 활성 약물 물질의 중량이 다중접합체 총 중량의 5~60%를 차지하는, 방법을 제공하며, 즉, 다중접합체는 5-60 중량%의 활성 약물 물질을 포함하고 잔량은 거대분자 중합체이다. 예를 들어, 활성 약물 물질은 다중접합체 총 중량의 10-50%, 10-40%, 10-35%를 차지한다.
제3 양태의 일 구체예에 따라, 본 발명은 투여 시에 주사 용매로서 주사용수, 염화나트륨 주사액, 포도당 주사액을 사용할 수 있는, 방법을 제공한다.
제3 양태의 임의 구체예에 따라, 본 발명은 화학 결합에 의해 거대분자 중합체와 활성 약물 물질을 결합하여 다중접합체를 형성하는 단계가 본 발명의 제2 양태의 임의 구체예에 따른 방법에 따라 수행될 수 있는, 방법을 제공한다.
본 발명의 제3 양태에 따른 방법의 예기치 않은 효과에 기초해, 본 발명자들은 또한 활성 약물 물질의 용해도를 향상시키는 방법에 의해 얻은 다중접합체가 당업계에 현재 알려져 있는 하나 이상의 기술에 의해 전혀 예측할 수 없는 추가의 예기치 못한 우수한 특성을 갖는다는 것을 발견하였다.
또한, 본 발명의 제4 양태는 본 발명의 제1 양태의 임의의 구체예의 다중접합체 및 임의로 약학적으로 허용되는 보조 물질을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
제4 양태의 일 구체예에 따라, 본 발명은 정제, 캡슐, 과립제, 경구 용액, 경구 현탁액 등과 같은 경구형, 소용량 주사, 대용량 주사 및 멸균 분말(예컨대 주사용 동결 건조 분말 등)과 같은 주사형, 비강 흡입제(예컨대 흡입가능한 분말 또는 흡입가능한 용액 등)와 같은 흡입제 등을 예로 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는, 제약 산업에서의 임의 형태의 약물 제제로 약학 조성물을 제공한다.
보조 물질의 선택은 약학 조성물의 특정 형태에 좌우된다. 예를 들어, 약학 조성물이 정제, 캡슐, 과립제 등의 형태인 경우, 이는 임의로 희석제(예컨대, 전분, 락토스, 미정질 셀룰로스 등), 붕해제(예컨대, 소듐 카복시메틸 셀룰로스, 소듐 카복시메틸 전분, 저치환 하이드록시프로필 셀룰로스 등), 점착제(예를 들면, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜 등), 윤활제 또는 활택제(예컨대, 스테아르산마그네슘, 활석 분말, 스테아르산, 실리카겔 등)를 포함할 수 있다. 임의로, 약학 조성물은 향미제, 착색제, 코팅제 등을 추가로 포함할 수 있다.
예를 들어, 약학 조성물은 경구 용액 또는 경구 현탁액 등의 형태인 경우, 용매, 예컨대 물, 에탄올, 글리세린, 프로판디올, 폴리에틸렌 글리콜(분자량 200-600) 등을 포함할 수 있다. 임의로 약학 조성물은 향미제, 착색제 등을 추가로 포함할 수 있다.
예를 들어, 약학 조성물은 소용량 주사제, 대용량 주사제 등의 형태인 경우 용매, 예컨대 물, 에탄올, 글리세린, 프로판디올, 폴리에틸렌 글리콜(분자량 200-600) 등을 포함할 수 있다. 임의로, 약학 조성물은 침투 압력 조절제, 예컨대 염화나트륨, 글루코스 등을 추가로 포함할 수 있다.
예를 들어, 약학 조성물은 멸균 분말의 형태인 경우, 부형제, 예컨대 만니톨, 글루코스, 덱스트란, 염화나트륨, 수크로스 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 대한 의약 형태의 제제는 공지의 조제 및 제조방법을 사용하여 당업자에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 정제는 습식 제립 타정 공정, 건식 제립 타정 공정, 직접 분말 타정 공정 등을 통해 제조될 수 있다. 예를 들어, 동결 건조 분말 주사제는 필요에 따라 적당량의 만니톨을 첨가하여 주사용수에 용해시키고, 동결 건조하여 제조할 수 있다.
제4 양태의 임의 구체예에 따라, 본 발명은 주사용이고, 투여 시에 주사용수, 0.9% 염화나트륨 주사액, 또는 5% 포도당 주사액을 주사 용매로 사용하는, 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 제5 양태는 본 발명의 제1 양태의 임의 구체예에 따른 다중접합체 또는 본 발명의 제4 양태의 임의 구체예에 따른 약학 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 영장류에 전달하는 단계를 포함하는, 진균 감염과 관련된 질병의 치료 방법을 제공한다.
제5 양태의 일 구체예에 따라, 본 발명은 진균 감염과 관련된 질병이 진균과 관련된 임의 질병, 예컨대 암포테리신 B 제제로 치료하기에 적합한 임의의 공지 질병, 예를 들면 감수성 진균에 의한 확인된 심부 및/또는 악화되는 진균성 감염, 예컨대 패혈증, 심내막염, 수막염(Cryptococcus sp. 및 기타 진균류에 의해 발생), 복부 감염(투석과 관련된 것 포함), 폐 감염, 요로 감염 등일 수 있는, 방법을 제공한다.
본 발명의 임의의 양태의 임의의 구체예는 서로 상충되지 않는 한 다른 구체예와 조합될 수 있다. 또한, 본 발명의 임의의 양태의 임의의 구체예의 기술적 특징은 서로 상충되지 않는 한 다른 구체예의 기술적 특징에 적용될 수 있다.
본 발명의 임의의 양태 또는 이 양태의 임의의 구체예의 임의의 기술적 특징은 서로 상충되지 않는 한 임의의 다른 양태 또는 이러한 다른 양태의 임의의 구체예에 적용될 수 있다. 물론, 상호 적용시, 필요하다면, 상응하는 기술적 특징은 적절히 변경될 수 있다. 본 발명의 각 양태 및 특징은 또한 다음과 같이 설명된다.
본 명세서에 인용되는 모든 참조의 개시는 그 전체가 참고로 본원에 원용되고, 이들 문헌에 표현된 의미가 본 발명에서 정의된 것과 상이하면, 본 발명에서의 표현이 우선한다. 또한, 본 명세서에 모든 용어 및 구문은 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 그럼에도 불구하고, 본 발명에서는 이들 용어 및 구문을 더욱 상세히 나타내고 설명하고자 한다. 언급된 용어 및 구문이 그의 일반적인 의미와 다른 의미를 가지는 경우, 본 발명에서 표현된 의미들이 우선할 것이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "다중접합체"(또한 "접합체", "중합체" 등이라고도 함)는 2개의 부분, 활성 약물 물질 및 거대분자 중합체를 포함하고, 여기서 활성 약물 부분은 에스테르 결합 또는 아미드 결합과 같은 화학적 결합에 의해 거대분자 중합체와 접합된 화학물질을 가리킨다. 따라서 사실상, 본 발명에 개시된 다중접합체는 화합물이며, 이는 "화합물"로 지칭될 수 있다. 용어 "폴리"는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖고, 예를 들어, 이는, 다량체, 중합체, 고분자 물질, 고분자 화합물, 중합성 거대분자 등, 예컨대 개시된 폴리아미노산(즉, 폴리펩티드) 및 폴리아미노헥소스(다당류) 등으로 이해될 수 있다.
활성 약물 물질은 폴리엔 마크롤라이드 항생제이며, 폴리엔 마크롤라이드 물질, 폴리엔 등으로 칭해지기도 한다. 예를 들어, 암포테리신 B, 나이스타틴, 나타마이신, 트리코마이신, 메파트리신, 칸니트라신, 필리핀, 아우레오펀긴, 에트루스코마이신, 하마이신(CAS No. 1403-71-0), 페리마이신 등이 있다.
암포테리신 B가 많은 국가의 약물 표준에 포함되고, 시장에서 용이하게 입수할 수 있다는 것은 주지이다. 암포테리신 B는 하기 구조식, 분자식 및 분자량을 가진다:
Figure 112016007439486-pct00002
예를 들어 중국 약전 2010에서 암포테리신 B는 [(1R-1R*,3S*,5R*,6R*,9R*,11R*,15S*,16R*,17R*,18S*,19E,21E,23E,25E,27E,29E,31E,33R*,35S*,36R*,37S*)]-33-[(3-아미노-3,6-디데옥시-β-D-만노피라노실)옥시]-1,3,5,6,9,11,17,37-옥타하이드록시-15,16,18-트리메틸-13-옥소-14,39-디옥사바이사이클로-[33.3.1]노나트리아콘타-19,21,23,25,27,29,31-헵타엔-36-카복실산으로서 표기되어 있다. 암포테리신 B는 일반적으로 다수의 하이드록실 그룹 및 카복실 그룹을 포함하고; 37번째 위치의 하이드록실 그룹이 축합 반응에 특히 유리하다. 하이드록실 그룹 및 카복실 그룹 모두 암포테리신 B를 카복실 그룹, 아미노 그룹 또는 하이드록실 그룹을 갖는 개시된 거대분자 중합체와 결합시켜 다중접합체의 형성을 가능케 한다. 물론, 37번째 위치 이외의 위치에서의 다른 하이드록실 그룹도 또한 거대분자 내 카복실 그룹과 결합하여 본 발명의 다중접합체를 형성할 가능성을 가진다는 것을 당업자는 알고 있다. 이러한 가능성도 본원에서 제외되지 않고 포함된다.
또한, 나이스타틴(CAS No. 1400-61-9)은 영국 약전 2010년에 포함된 것으로 알려져 있고, 하기 구조식을 가진다:
Figure 112016007439486-pct00003
전형적으로, 나이스타틴은 암포테리신 B의 것과 유사한 특성을 갖는 하이드록실 및 카복실 그룹을 포함하여, 나이스타틴이 카복실, 아미노 및/또는 하이드록실 그룹을 갖는 개시된 거대분자와 결합하여 본 발명의 다중접합체의 형성을 가능케 한다.
또한 나타마이신(CAS No. 7681-93-8)은 미국 약전 USP35-NF30에 포함된 것으로 알려져 있고, 하기 구조식을 가진다:
Figure 112016007439486-pct00004
전형적으로, 나타마이신은 또한 암포테리신 B의 것과 유사한 특성을 갖는 하이드록실 및 카복실 그룹을 포함하여, 나타마이신이 카복실, 아미노 및/또는 하이드록실 그룹을 갖는 개시된 거대분자와 결합하여 본 발명의 다중접합체의 형성을 가능케 한다.
또한, 트리코마이신(CAS No. 1394-02-1)은 일본 약전 USP35-NF30, 버전 XVI(JP16)에 포함된 것으로 알려져 있고, 하기 구조식을 가진다:
Figure 112016007439486-pct00005
전형적으로, 트리코마이신은 또한 암포테리신 B의 것과 유사한 특성을 갖는 하이드록실 및 카복실 그룹을 포함하여, 트리코마이신이 카복실, 아미노 및/또는 하이드록실 그룹을 갖는 개시된 거대분자와 결합하여 본 발명의 다중접합체의 형성을 가능케 한다.
또한 메파트리신(CAS No. 11121-32-7, 미국특허 제3,780,173호 참조)은 하기 구조식을 가진다:
Figure 112016007439486-pct00006
메파트리신은 암포테리신 B의 것과 유사한 특성을 갖는 하이드록실 그룹 및 메틸-에스테르화 카복실 그룹을 포함한다. 이들 하이드록실 그룹 및 카복실 그룹은 특정 조건 하에서 에스테르화하여 메파트리신이 카복실, 아미노 및/또는 하이드록실 그룹을 갖는 개시된 거대분자와 결합하여 본 발명의 다중접합체의 형성을 가능케 한다.
또한 필리핀 III(CAS No. 480-49-9)은 하기 구조식을 가진다:
Figure 112016007439486-pct00007
필리핀은 암포테리신 B의 것과 유사한 특성을 갖는 하이드록실 그룹을 포함한다. 이들 하이드록실 그룹은 필리핀이 카복실 그룹을 갖는 개시된 거대분자와 결합하여 본 발명의 다중접합체의 형성을 가능케 한다.
또한, 페리마이신 A(CAS No. 62327-61-1)는 하기 구조식을 가진다:
Figure 112016007439486-pct00008
페리마이신은 암포테리신 B의 것과 유사한 특성을 갖는 하이드록실 그룹을 포함한다. 이들 하이드록실 그룹은 페리마이신이 카복실 그룹을 갖는 개시된 거대분자와 결합하여 본 발명의 다중접합체의 형성을 가능케 한다.
기타 폴리엔 마크롤라이드 화합물, 예컨대 칸니트라신(CAS No. 84930-92-7, 예를 들어, ZHEJIANG HAIZHENG PHARM CO LTD에서 얻은 제품, 국립 의약품 허가 번호 H33021810) 아우레오펀긴, 에트루스코마이신, 하마이신(CAS No. 1403-71-0) 등은 모두, 적어도 암포테리신 B의 것과 유사한 특성을 갖는 하이드록실 및/또는 카복실 그룹을 포함한다. 이들 활성 그룹은 폴리엔 마크롤라이드 화합물이 카복실, 아미노 및/또는 하이드록실 그룹을 갖는 개시된 거대분자와 결합하여 본 발명의 다중접합체의 형성을 가능케 한다.
본 발명에서, 거대분자 부분은 아미노산의 중합에 의해 형성된 폴리아미노산 또는 아미노헥소스의 중합에 의해 형성된 폴리아미노헥소스일 수 있다.
폴리아미노산을 위해, 아미노산은 카복실산형 아미노산, 아미노형 아미노산, 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있고, 따라서 카복실산형 폴리아미노산 또는 아미노형 폴리아미노산을 형성할 수 있다. 카복실산형 아미노산은 아스파르트산(Asp), 글루타메이트(Glu), 또는 임의의 비율의 이들의 조합으로부터 선택되고; 아미노형 아미노산은 오르니틴(Orn), 리신(Lys), 아르기닌(Arg), 하이드록시 리신(Hyl) 또는 임의의 비율의 이들의 조합으로부터 선택된다. 아미노산은 D-아미노산, L-아미노산 및 DL-아미노산을 포함할 수 있다. 폴리아미노산의 제조방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들면 US5610264호에 폴리아스파르트산의 합성방법이 개시되었고, S. Roweton 등에 의한 (Journal of Environmental Polymer Degradation, Vol. 5, No.3, 1997:175)에는 폴리아스파르트산의 또 다른 합성방법이 개시되었다. 유사하게, 다른 폴리아미노산의 합성 방법이 많은 참조에 개시되었으며, 원하는 중합도뿐만 아니라 원하는 분자량 또는 분자량 범위를 가지는 폴리아미노산은 유리하게는 이들 합성 방법의 조건을 조절하여 얻을 수 있다. 또한, 예를 들어 나트륨 염(예를 들어, 폴리아스파르트산 나트륨) 또는 하이드로클로라이드 염(예를 들면 폴리오르니틴) 등과 같은 이들 폴리아미노산의 약학적으로 허용가능한 염이 사용될 수도 있다. 또한, 폴리아미노산을 시장에서 구입할 수도 있으며, 예를 들면, 원하는 중합도뿐만 아니라 원하는 분자량 또는 분자량 범위를 가지는 폴리아미노산은 Sigma-Aldrich로부터 용이하게 구입할 수 있고, 예를 들어, 15,000-50,000 달톤의 분자량을 가지는 폴리-L-아스파르트산을 Sigma-Aldrich로부터 Cat. No. P6762 하에 구입할 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 본 발명에서 폴리아미노산은 시장에서 구입한 것이다.
폴리아미노헥소스를 위해, 아미노헥소스는 글루코사민, 갈락토사민, 아세틸 글루코사민, 아세틸 갈락토사민, 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있으며, 따라서 폴리글루코사민, 폴리갈락토사민, 폴리아세틸글루코사민, 폴리아세틸갈락토사민 등을 형성할 수 있다. 폴리아미노헥소스의 제조방법은 당업자들에게 주지이며, 예를 들어 SHAO, Jian 등에 의한 (Chinese Journal of Pharmaceuticals, 1999, 30(11): 481)에 특정 분자량을 가지는 폴리글루코사민이 개시되었다. 당업자는 이 문헌의 방법을 참조하여, 유리하게는 합성 조건을 조절하여 원하는 중합도뿐만 아니라 원하는 분자량 또는 분자량 범위를 가지는 폴리글루코사민을 얻을 수 있다. 또한, 폴리글루코사민은 시장에서 구입할 수도 있으며, 예를 들면, 원하는 중합도뿐만 아니라 원하는 분자량 또는 분자량 범위를 가지는 폴리글루코사민을 Sigma-Aldrich 또는 특정 국내 업체, 예컨대 ZHEJIANG FREEMEN SHINFUDA Co., Ltd., 또는 SHIJIAZHUANG TUOYE Co., Ltd.로부터 용이하게 구입할 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 본 발명에서, 폴리글루코사민은 시장에서 구입한 것이다.
본 발명의 일 구체예에서, 새로이 설계된 중합성 거대분자와 암포테리신 B와 같은 폴리엔 마크롤라이드 물질 간 다중접합체, 예를 들어 암포테리신 B 다중접합체를 형성함으로써 암포테리신 B와 같은 폴리엔 마크롤라이드 물질과 연관된 특정의 단점을 극복할 수 있었다.
본 발명의 다중접합체의 일 구체예에서, 하나의 중합성 거대분자를 여러 폴리엔 마크롤라이드 물질, 예컨대 암포테리신 B에 결합시킬 수 있다.
본 발명의 폴리엔 마크롤라이드 물질의 일례로서 암포테리신 B를 고려하여 제공된 다중접합체는 암포테리신 B의 전구약물로서 간주될 수 있다. 접합된 암포테리신 B는 에스테라제 또는 아미노아실라제에 의해 서서히 가수분해하여 자유 암포테리신 B를 방출할 수 있으며, 이 동안 중합성 거대분자는 또한 소분자로 분해되어 체외로 배출될 수 있다. 본 발명의 중합성 거대분자와 암포테리신 B를 축합시켜 형성된 암포테리신 B의 신규 다중접합체는 또한 폴리-암포테리신 B 등으로도 지칭될 수 있다. 폴리-암포테리신 B는 화학 결합(에스테르 결합 또는 아미드 결합)을 통해 중합성 거대분자 및 암포테리신 B에 의해 형성되는 거대분자이다. 다중접합체에서, 하나의 거대분자 담체가 다수의 암포테리신 B 분자에 결합할 수 있다. 본 발명의 폴리-암포테리신 B는 높은 수용성, 낮은 독성/부작용, 및 암포테리신 B의 서방출과 같은 새로운 특성을 가지며, 따라서 새로운 세대의 암포테리신 B이다. 폴리-암포테리신 B는 기존 암포테리신 B의 좋지 않은 수용해도 및 높은 독성/부작용의 단점을 극복하였다. 이 중합성 거대분자 담체는 비독성 및 비알레르겐성이면서 우수한 생체적합성 및 생분해성을 가진다. 폴리-암포테리신 B 분자는 생체 내에서 에스테라아제 또는 아미노아실라제에 의해 서서히 가수분해되고 자유 암포테리신 B를 방출함으로써 지속적으로 유효한 혈청 농도를 유지하고 더 나은 항진균 치료 효과를 달성할 수 있다. 중합성 거대분자 담체는 또한 서서히 소분자로 분해되고 체외로 배출될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 다중접합체는 카복실산형 폴리아미노산과 폴리엔 마크롤라이드 물질, 예컨대 암포테리신 B의 축합에 의해, 폴리아미노산 내 카복실 그룹과 암포테리신 B 내의 하이드록실 그룹 사이에 에스테르 결합을 형성함으로써 얻어진다. 암포테리신 B와 폴리아스파르트산에 의해 형성된 다중접합체를 고려하여 예를 들면 화학 결합의 하나의 예시적인 패턴은 다음과 같다:
Figure 112016007439486-pct00009
암포테리신 B는 축합제로서 DCC를 사용하는 화학적 축합 반응으로 37번째 위치에서 그의 대부분의 활성적 하이드록실 그룹(활성 하이드록실)을 통해 폴리아스파르트산내 카복실 그룹과 반응하여 H2O 분자를 제거함으로써 에스테르 결합(-COO-)을 형성한다. 폴리아스파르트산의 펩티드 사슬 내 다수의 자유 카복실 그룹은 축합 반응의 특정 조건(예를 들면, 충전량, 반응 온도, 반응 시간 등)에 따라 소정량의 암포테리신 B와 결합할 수 있다. 예를 들어 암포테리신 B의 중량은 다중접합체의 총 중량의 5-60%(예를 들어 10-50%, 10-40%, 10-35%)를 차지할 수 있다. 생성된 다중접합체는 염기성 물질과 반응하여 약학적으로 허용가능한 염, 예를 들면 나트륨 염을 형성할 수 있다. 상술한 바와 같이, 특정 요구에 따라, 축합 반응의 조건을 변경함으로써 다중접합체를 형성하기 위한 암포테리신 B의 다른 하이드록실 그룹과 폴리아스파르트산을 축합하는 것이 이론적으로 가능하고, 다중접합체 내 화학 결합의 부위는 특별한 제한은 없다. 상기 언급된 카복실산형 폴리아미노산의 전형적인 예는 D-아스파르트산(Asp), L-아스파르트산, DL-아스파르트산, D-글루탐산(Lys), L-리신, DL-글루탐산 및 이들의 조합, 예를 들어 임의 혼합 비율, 예컨대 1-99% 비율의 임의 배열의 아스파르트산과 임의 배열의 글루탐산의 중합에 의해 생성된 카복실산형 폴리아미노산을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 다중접합체는 아미노형 폴리아미노산과 암포테리신 B와 같은 폴리엔 마크롤라이드 물질을 축합하여 얻어진다. 예를 들어, 폴리아미노산-암포테리신 B는 촉매의 존재 하에서 폴리아미노산 분자 내의 자유 아미노 그룹(-NH2)과 암포테리신 B 분자 내의 자유 카복실 그룹(-COOH)의 축합으로 하나의 물 분자가 제거됨으로써 수득된다. 폴리오르니틴과 암포테리신 B에 의해 형성된 다중접합체로 예를 들면, 화학 결합의 한가지 예시적인 패턴은 다음과 같다:
Figure 112016007439486-pct00010
상기 언급된 폴리아스파르트산-암포테리신 B 다중접합체와 유사하게, 폴리-오르니틴 사슬 내 복수의 자유 아미노 그룹은 특정의 축합 반응 조건(예를 들면, 충전량, 반응 온도, 반응 시간 등)에 따라, 소정량의 암포테리신 B와 결합할 수 있다. 마찬가지로, 이후 자외선 분광법 및 HPLC에 의해 물리적 결합(예, 수소 결합)이 아닌 화학 결합에 의해서 다중접합체가 제공되며, 다중접합체 내에서 화학 결합의 위치에는 특별한 제한이 없다. 전형적인 아미노형 폴리아미노산의 예로는 D-오르니틴(Orn), L-오르니틴, DL-오르니틴, D-리신(Lys), L-리신, DL-리신, D-아르기닌(Arg), L-아르기닌, DL-아르기닌, D-하이드로리신(Hyl), L-하이드로리신, DL-하이드로리신, 및 이들의 조합, 예를 들어 임의 혼합 비율, 예컨대 0-99% 비율의 임의 배열의 오르니틴과 임의 배열의 리신의 중합에 의해 생성된 아미노형 폴리아미노산을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 다중접합체는 폴리아미노헥소스와 암포테리신 B와 같은 폴리엔 마크롤라이드 물질의 축합으로 얻어진다. 예를 들어, 폴리아미노헥소스-암포테리신 B는 촉매의 존재 하에서 폴리아미노헥소스(폴리글루코사민) 분자 내의 자유 하이드록실 그룹(-OH)과 암포테리신 B 분자 내의 자유 카복실 그룹(-COOH)의 축합으로 하나의 물 분자가 제거되고 에스테르 결합(-COO0)이 형성됨으로써 수득된다. 폴리글루코사민과 암포테리신 B에 의해 형성된 다중접합체로 예를 들면, 화학 결합의 한가지 예시적인 패턴은 다음과 같다:
Figure 112016007439486-pct00011
상기 언급된 폴리아스파르트산-암포테리신 B 다중접합체와 유사하게, 폴리글루코사민 사슬 내 복수의 자유 하이드록실 그룹은 특정의 축합 반응 조건(예를 들면, 충전량, 반응 온도, 반응 시간 등)에 따라, 소정량의 암포테리신 B와 결합할 수 있다. 마찬가지로, 이후 자외선 분광법 및 HPLC에 의해 물리적 결합(예, 수소 결합)이 아닌 화학 결합에 의해서 다중접합체가 제공되며, 다중접합체 내에서 화학 결합의 위치에는 특별한 제한이 없다. 전형적인 폴리아미노헥소스의 예로는 폴리글루코사민, 폴리갈락토사민, 폴리아세틸 글루코사민, 폴리아세틸 갈락토사민 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 화합물을 합성하는 과정에서, 사용되는 모든 원료 물질은 선행 기술에 따라 당업자에 의해 제조되거나, 또는 선행 기술에 공지된 방법에 따라 제조되거나, 또는 상업적으로 입수할 수 있다. 상기 반응식에 사용되는 중간체, 원료 물질, 시약 및 반응 조건은 모두 당업자에 의해 적절히 변경될 수 있다.
본 발명의 다중접합체는 아나필락시스와 같은 추가적인 부작용이 생성되지 않는 한, 다른 활성 성분과 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 다중접합체는 약물 단독으로 사용되거나, 본 발명의 다중접합체와 상승 및/또는 상가적인 효과를 제공하는 하나 이상의 추가적인 약물과 조합되어 사용될 수 있다. 조합 요법은 각 치료 성분들을 동시에, 순차적으로 또는 별도로 투여하여 수행된다.
본 발명에서, 용어 "약학 조성물"은 상기 지정된 성분들을 상기 지정된 양으로 포함하는 생성물 및 지정된 다양한 성분들을 지정된 양으로 조합하여 직접 또는 간접적으로 수득된 임의의 생성물을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "약학 조성물"은 용어 "조성물"과 상호교환적으로 사용된다.
본 발명의 약학 조성물 중 다양한 활성 성분의 실제 용량 수준은 특정 환자, 화합물 및 투여 방식에 따라 원하는 치료 효과가 달성될 수 있도록 다양할 수 있다. 용량 수준은 특정 화합물, 투여 경로, 치료할 질병의 중증도, 환자의 상태 및 병력에 따라 결정되어야 한다. 그러나, 당업계의 통상적인 방법은 원하는 치료 효과를 달성하기 위한 것보다 더 낮은 수준에서부터 원하는 치료 효과를 달성하기에 충분한 수준으로 서서히 화합물의 용량을 증가시키는 것이다.
상기 언급된 것이거나 또는 기타 치료 및/또는 예방에 있어서, 치료 및/또는 예방적으로 유효한 양의 본 발명의 다중접합체는 순수한 화합물의 형태 또는 본원에 개시된 다중접합체 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 다중접합체의 "치료 및/또는 예방적 유효량"이라는 어구는 다중접합체가 합리적인 혜택-위험 비율로 예방 및/또는 치료 효과를 달성하기에 충분한 양으로 존재함을 의미한다. 본 발명의 다중접합체 또는 약학 조성물의 1일 총량은 의사에 의해 신뢰성 있는 의학상 판단의 범위 내에서 결정되어야 하는 것으로 이해해야 한다. 임의의 특정 환자에 대해, 특정 치료량은 치료할 질병 및 그의 중증성, 사용되는 특정 다중접합체의 활성, 사용되는 특정 약학 조성물, 환자의 연령, 성별, 체중, 일반적인 건강 상태, 식이; 투여 시간과 경로 및 사용되는 특정 약학 조성물의 제거율, 특정 약학 조성물과 병용으로 또는 이와 동시에 투여되는 공동 약제/약물(들), 공동 약물 뿐만 아니라, 의학 분야에서 잘 알려져 있는 다른 유사한 요인을 비롯해, 다양한 요인에 기초하여 결정되어야 한다. 예를 들어, 원하는 치료 효과를 달성하기 위한 것보다 더 낮은 수준에서부터 원하는 치료 효과를 달성하기에 충분한 수준으로 서서히 화합물의 용량을 증가시키는 것이 당업계에서는 통상적인 방법이다. 일반적으로, 포유동물, 특히 인간에 대한 본 발명의 다중접합체의 용량은 0.0001-1000 mg/체중 kg/일, 예컨대 0.001-500 mg/체중 kg/일, 0.001-100 mg/체중 kg/일일 수 있다.
본 발명의 다중접합체를 유효량 포함하는 약학 조성물은 당업자에게 주지인 약물 담체를 사용하여 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 무독성 담체와 함께 제형화된 본 발명의 다중접합체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 약학 조성물은 특히 경구 투여, 비경구 주사 또는 직장 투여용의 고체 또는 액체 형태로 제형화될 수 있다.
약학 조성물은 투여가 용이한 다양한 투약 형태, 예를 들어 경구 제제(예컨대 정제, 캡슐, 용액 또는 현탁액); 주사제(예컨대 주사용 용액 또는 현탁액, 또는 주사 전에 물을 첨가하여 즉시 사용할 수 있는 주사가능한 건조 분말)로 제형화될 수 있다. 약학 조성물 중의 담체는 경구 제제의 경우 결합제(예컨대, 전분, 전형적으로 옥수수, 밀 또는 쌀 전분, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 소듐 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈), 희석제, 윤활제(예컨대, 이산화규소, 활석, 스테아르산 또는 그의 염, 전형적으로 스테아르산마그네슘 또는 스테아르산칼슘 및/또는 폴리에틸렌 글리콜), 필요하다면, 붕해제, 예컨대 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 염, 전형적으로 알긴산나트륨 및/또는 발포 혼합물, 공-용매, 안정화제, 현탁제, 착색제, 향미제 등; 주사용 제제의 경우 방부제, 가용화제, 안정제 등; 국소 제제의 경우 기재, 희석제, 윤활제 등을 추가로 포함한다. 약학 제제는 경구 또는 비경구적으로(예컨대 정맥 내, 피하 또는 국소적으로) 투여될 수 있고, 위 조건에서 안정하지 않은 일부 약물의 경우에는 장용성 코팅 정제로 제형화될 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 약학 조성물은 경구, 직장, 비경구, 관강 내, 질 내, 복강 내, 국소적(예컨대 분말, 연고 또는 점적제를 통해), 인간 또는 다른 포유 동물에 볼 내로 투여될 수 있거나, 또는 구강 스프레이 또는 비강 스프레이로서 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "비경구"는 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 흉강 내, 피하 및 관절 내 주사 또는 수액을 포함한 투여 방식을 의미한다.
비경구 주사에 적합한 약학 조성물은 생리적으로 허용되는 멸균 수성 또는 비수성 용매, 분산제, 현탁화제, 또는 유화제뿐만 아니라, 멸균 주사 용액 또는 분산액을 재형성하기 위한 멸균 분산제를 포함할 수 있다. 적합한 수성 또는 비수성 담체, 희석제, 용매 또는 매질의 예로는 물, 에탄올, 폴리올(프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세롤 등), 식물성 기름(예컨대 올리브유), 주사용 유기 에스테르, 에틸 올레에이트 및 이들의 적절한 혼합물을 포함한다.
이들 약학 조성물은 부형제, 예컨대 방부제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 추가로 포함할 수 있다. 예컨대 니파긴, 나우티산, 페놀, 소르브산 등의 각종 항균제 및 항진균제의 사용으로 미생물의 퇴치 효과를 확보할 수 있다. 당, 염화나트륨 등과 같은 등장화제를 포함하는 것이 또한 바람직하다. 흡수 지연제, 예를 들면 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용으로 주사가능한 약제 형태의 장기간 흡수를 유도할 수 있다.
현탁액은 활성 화합물 외에도 현탁화제, 예컨대 에톡실화 이소옥타데칸올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄, 미정질 셀룰로스, 메타-알루미늄 하이드록사이드, 벤토나이트, 한천 및 트라가칸트 검, 또는 이들 물질의 혼합물을 추가로 포함할 수 있다.
일부 경우에는, 약물의 효과를 연장시키기 위해 피하 또는 근육 내로 투여되는 약물의 흡수 속도를 감소시키는 것이 바람직하다. 이는 결정 또는 무정형의 수난용성 액체 현탁액을 사용하여 실현할 수 있다. 이에 의해, 약물의 흡수 속도는 그의 용해 속도에 좌우되는 반면, 용해 속도는 결정의 크기 및 형상에 좌우된다. 또는, 비경구 투여 약물의 흡수 지연은 약물을 오일 매질에 용해 또는 분산시켜 달성할 수도 있다.
폴리락타이드-폴리글리콜라이드와 같은 생분해성 중합체 중에 약물의 마이크로캡슐 기재를 형성함으로써 주사형 데포 투약 형태를 제조할 수 있다. 약물의 방출 속도는 약물 대 중합체의 비율 및 특히 사용되는 중합체의 성질에 따라 제어될 수 있다. 생분해성 중합체의 다른 예는 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(무수물)을 포함한다. 주사형 데포 투약 형태는 또한 신체 조직에 적합한 리포솜 또는 마이크로에멀젼에 약물을 봉입하여 제조할 수도 있다.
주사 제제는 세균 제거 필터를 사용하여 여과에 의해 멸균될 수 있거나, 또는 멸균 고체 조성물 형태의 멸균화제를 도입하여 멸균될 수 있고, 고체 조성물은 임상 적용 전에 멸균수 또는 다른 멸균 주사 매질에 용해 또는 분산될 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 그의 약학 조성물은 경구 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 경구 투여용의 것은 정제, 캡슐, 코팅 투약 형태일 수 있고, 비경구 투여용 약학 제제는 주사제 및 좌약일 수 있다. 이들 제제는 당업자에게 잘 알려진 방법에 따라 제조된다. 정제, 캡슐 및 코팅 투약 형태를 제조하기 위해 사용되는 부형제는 일반적으로 사용되는 부형제, 예컨대 전분, 젤라틴, 아라비아검, 실리카, 폴리에틸렌 글리콜이고, 액체 투약 형태에 사용되는 용매는 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 식물성 기름(예컨대, 옥수수유, 땅콩유, 올리브유 등)이다. 본 발명의 화합물을 포함하는 제제는 추가로 다른 보조 물질, 예컨대 계면활성제, 윤활제, 붕해제, 방부제, 향미제 및 착색제 등을 포함할 수 있다. 정제, 캡슐, 코팅 투약 형태, 주사제 및 좌제에서, 본 발명의 다중접합체의 용량은 단위 투약 형태에 존재하는 폴리엔 마크롤라이드의 양으로 표현된다. 단위 투약 형태에서, 본 발명의 폴리엔 마크롤라이드 화합물의 양은 보통 0.01 내지 5000 mg이고, 바람직한 단위 투약 형태는 0.1 내지 500 mg을 함유하며 더욱 바람직한 단위 투약 형태는 1 내지 500 mg을 함유한다. 구체적으로, 본 발명에서 제공된 바와 같은 경구 투여용 고체 투약 형태는 캡슐, 정제, 환제, 분말 및 과립을 포함한다. 고체 투약 형태의 경우, 활성 화합물은 적어도 하나의 불활성인 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체, 예컨대 시트르산나트륨 또는 인산이칼슘 및/또는 다음의 물질과 혼합될 수 있다: a) 충전제 또는 벌크화제; b) 결합제, 예컨대 카복시메틸 셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 수크로스 및 아라비아검; C) 보습제, 예컨대 글리세롤; d) 붕해제, 예컨대 한천, 탄산칼슘, 감자 또는 카사바 전분, 알긴산, 일부 실리케이트 및 탄산나트륨; e) 용액 차단제, 예컨대 파라핀 왁스; f) 흡수 촉진제, 예컨대 4급 암모늄 화합물; g) 습윤제, 예컨대 세탄올 및 글리세롤 모노스테아레이트; h) 흡착제, 예컨대 카올린 및 벤토나이트; 및 i) 윤활제, 예컨대 활석, 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 도데실설페이트 및 이들의 혼합물 등. 캡슐, 정제 및 환제의 경우, 이들 투약 형태는 또한 완충제를 포함할 수도 있다.
유사 형태의 고체 조성물은 연질 캡슐 및 경질 캡슐의 충전제로서도 사용될 수 있는 락토스 및 고분자량 폴리에틸렌 글리콜과 같은 부형제를 채용한다.
정제, 당의정, 캡슐, 환제 및 과립제의 고체 투약 형태는 의약 제제 분야에서 잘 알려진 장용 코팅 물질 및 다른 코팅 물질과 같은 코팅제 및 쉘 물질을 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 고체 투약 형태는 임의로 자외선 차단제를 포함할 수 있으며, 그의 조성은 이들이 활성 성분을 장관의 일부 부위에서 임의로 지연 방식으로 단순히 또는 우선적으로 방출할 수 있도록 허용할 수 있다. 가능한 포매 조성물의 예들은 고분자 물질 및 왁스를 포함한다. 필요에 따라, 활성 물질은 상기 언급된 하나 이상의 부형제와 함께 마이크로캡슐 형태로 제형화될 수 있다.
경구 투여용 액체 투약 형태는 약학적으로 허용되는 유화제, 용매, 현탁화제, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 액체 투약 형태는 활성 화합물 외에, 당업계에 일반적으로 사용되는 불활성 희석제, 예컨대 물 또는 다른 용매, 가용화제 및 유화제, 예컨대 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 부탄-1,3-디올, 디메틸 포름아미드, 오일(예컨대 면실유, 땅콩유, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유, 참기름 등), 글리세롤, 테트라하이드로푸르푸릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜의 지방산 에스테르, 소르비탄 및 이들의 혼합물을 포함한다. 경구 투여용 조성물은 불활성 희석제 이외에도 보조 물질, 예컨대 습윤제, 유화제, 현탁화제, 감미제, 향미제 및 향료를 추가로 포함할 수 있다.
직장 또는 질 투여용 조성물은 바람직하게는 좌약이다. 좌약은 본 발명의 다중접합체를 적합한 비자극성 부형제 또는 담체, 예컨대 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜 또는 좌약 왁스와 혼합하여 제조할 수 있으며, 이들은 실온에서 고체이나 체온에서 액체일 수 있고, 직장강 또는 질관에서 활성 화합물을 방출할 수 있다.
또한 본 발명의 다중접합체를 국소 투여용으로 사용하는 것이 바람직하다. 국소 투여를 위한 본 발명의 다중접합체의 투약 형태는 분말, 스프레이, 연고 및 흡입을 포함한다. 활성 물질 및 약학적으로 허용가능한 담체는 무균 조건 하에서 임의의 바람직한 방부제, 완충제 또는 추진제와 혼합될 수 있다. 안과용 제제, 안연고, 분말 및 용액 모두 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명의 다중접합체는 리포솜의 형태로 투여될 수 있다. 이는 당업계에서 주지이며, 리포솜은 일반적으로 인지질 또는 다른 지질을 사용하여 제조된다. 리포솜은 수성 매질에 분산된 단층 또는 다층 수화 액정으로 형성된다. 리포솜을 형성할 수 있는 임의의 생리학적으로 허용되는 비독성 대사성 지질이 사용될 수 있다. 리포솜 형태의 본 발명의 화합물은 본 발명의 화합물 이외에, 안정화제, 방부제, 부형제를 포함할 수 있다. 바람직한 지질은 천연 및 합성 인지질 및 포스파티딜콜린(레시틴)이며, 이들은 단독으로 또는 함께 사용될 수 있다. 리포솜의 형성방법은 당업계에 주지이다. 예를 들어 [Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), p. 33]을 참조할 수 있다.
놀랍게도, 본 출원의 발명자들은 본 발명의 다중접합체가 생물학적 및/또는 물리적 및/또는 화학적 측면에서 유리한 효과를 조성하는 것을 발견하였다.
도 1은 암포테리신 B의 자외-가시광선 흡수 스펙트럼이다
도 2는 폴리아스파르트산의 자외-가시광선 흡수 스펙트럼이다.
도 3은 폴리아스파르트산-암포테리신 B 다중접합체(PA-AB)의 자외-가시광선 흡수 스펙트럼이다.
도 4는 암포테리신 B(AB, 28 ㎍/㎖)의 고속 액체 크로마토그램이다.
도 5는 폴리아스파르트산(제조예 1에서 사용됨, PA, 80 ㎍/㎖)의 고속 액체 크로마토그램이다.
도 6은 폴리아스파르트산-암포테리신 B 다중접합체의 고속 액체 크로마토그램이다.
도 7은 폴리아스파르트산-암포테리신 B 다중접합체와 자유 암포테리신 B의 물리적 혼합물의 고속 액체 크로마토그램이다.
도 8은 폴리아스파르트산-암포테리신 B 다중접합체(PA-AB)의 수소 핵자기 공명(1H NMR) 스펙트럼이다.
도 9는 폴리아스파르트산-암포테리신 B 다중접합체(PA-AB)의 탄소 핵자기 공명(13C NMR) 스펙트럼이다.
도 10은 자외선(UV) 검출과 함께 폴리아스파르트산-암포테리신 B 다중접합체(PA-AB)의 고속 액체 크로마토그래피(HPLC) 분리를 도해한 것이다.
도 11은 질량 분석(MS)과 함께 폴리아스파르트산-암포테리신 B 다중접합체(PA-AB)의 HPLC 분리를 도해한 것이다.
도 12는 UV 검출과 함께 암포테리신 B(AB)의 HPLC 분리를 도해한 것이다.
도 13은 질량 분석(MS)과 함께 암포테리신 B(AB)의 HPLC 분리를 도해한 것이다.
실시예
본 발명이 하기 제조 및 실험 실시예를 참조하여 보다 상세히 설명된다. 그러나, 이들 실시예는 단지 예시의 목적으로만 제공되며, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아님을 이해해야 한다.
실시예에서 사용된 물질 및 방법은 본 발명에서 일반적으로 및/또는 구체적으로 기술된다. 본 발명의 목적을 달성하기 위해 사용되는 많은 물질 및 조작 방법이 당업계에 공지되었지만, 가능한 상세히 설명하려고 하였다. 본 발명에 사용된 물질 및 방법이 특별히 설명되지 않았다면, 이는 당업계에 주지인 것임을 당업자는 명확히 알고 있다.
A. 다중접합체의 시험 방법
방법 1: 자외 - 가시선 분광광도법 (UV- VIS )
암포테리신 B(25 ㎍/㎖, DMSO에 용해, 블랭크 대조군으로 DMSO 사용)를 도 1에 나타낸 바와 같이, 자외-가시선(UV-VIS) 분광광도법으로 분석하였다. 도면은 300 nm 보다 짧고 500 nm 보다 긴 파장에서 흡수가 없고 350 nm 내지 450 nm 사이의 파장에서 흡수가 존재하는데, 특히 371 nm, 391 nm 및 415 nm에서 전형적인 흡수 피크가 존재한다는 것을 보여준다.
폴리아스파르트산(제조예 1에서 사용됨, 100 ㎍/㎖, 물에 용해)을 도 2에 도시된 바와 같이, UV-VIS 분광광도법으로 분석하였다. 도면은 250 nm 보다 긴 파장에서 흡수가 없고 250 nm 보다 짧은 파장에서 전형적인 단흡수 피크가 존재한다는 것을 보여주는데, 이는 폴리아스파르트산이 250 nm 보다 긴 파장에서 다중접합체 또는 암포테리신 B의 흡수값에 기여하지 않음을 제시한다.
폴리아스파르트산-암포테리신 B 다중접합체(PA-AB)(제조예 1에서 사용됨, 100 ㎍/㎖, 물에 용해)를 도 3에 도시된 바와 같이, UV-VIS 분광광도법으로 분석하였다. 도면은 500 nm 보다 긴 파장에서 흡수가 없고 250 nm 보다 짧은 파장에서 전형적인 단흡수 피크(폴리아스파르트산 기여)가 존재하며, 350 nm 내지 450 nm 사이의 파장에서 흡수(주로 암포테리신 B 기여)가 존재하는데, 특히 366 nm, 385 nm 및 409 nm에서 전형적인 흡수 피크가 존재한다는 것을 보여준다. 경우에 따라 다중접합체에서 화학 결합의 형성에 의해, 이들 전형적인 세 흡수 피크는 도 1에 도시된 대응 피크의 파장에 비해 약간 시프트되지만, 여전히 전체적으로 암포테리신 B의 전형적인 흡수 스펙트럼을 제공한다.
도 1 내지 3은 분광광도 측정에서, 세 물질, 즉 폴리아스파르트산, 암포테리신 B 및 이들 다중접합체가 모두 특유의 독립적인 스펙트럼 거동 및 이들의 UV-VIS 흡수 스펙트럼에 의해 특정되는 스펙트럼 기여도를 가지고 있어서 이들 세 물질이 HPLC 방법에 의해 정성적 및 정량적으로 분석될 수 있음을 입증한다.
또한, 본 발명자들은 추가 실험에 의해 다른 폴리아미노산, 폴리아미노헥소스, 폴리엔 마크롤라이드 항생제뿐만 아니라 폴리아미노산 또는 폴리아미노헥소스와 폴리엔 마크롤라이드 항생제로 구성된 다중접합체의 UV-VIS 흡수 스펙트럼이 모두 폴리아스파르트산, 암포테리신 B 및 이들의 다중접합체로부터 얻어지는 상기 UV-VIS 흡수 스펙트럼의 것과 유사한 특성을 나타냄을 발견하였다. 분광광도 분석에서 이들 3종 물질이 나타내는 특징적인 독립적 스펙트럼 거동 및 스펙트럼 기여에 의해 이들을 HPLC 방법에 의해 정성적 및 정량적으로 분석하는 것이 가능하다. 예를 들어, 폴리오르니틴, 폴리글루코사민, 폴리글루타메이트는 폴리아스파르트산과 유사하며, 암포테리신 B의 스펙트럼 특성에 영향을 미치지 않고/간섭하지 않는다. 다른 실시예에서, 나타마이신의 스펙트럼 특성은 폴리아스파르트산, 폴리오르니틴, 폴리글루타메이트, 폴리글루코사민, 폴리갈락토사민 등에 의해 영향을 받지 않거나 간섭받지 않는다.
방법 2: 고속 액체 크로마토그래피( HPLC )
중국 약전 2010, Part II, 328 쪽에 "detection of substances related to amphotericin B" 표제 아래에 설명된 방법에 따른 조건은 다음과 같다: C18 크로마토그래피 컬럼(4.6×30 mm, 5 ㎛), 이동상: 아세토니트릴-메탄올-0.073% 에틸렌디아민 테트라아세트산을 함유하는 0.05 mol/L 암모늄 아세테이트(pH 값은 빙초산에 의해 5.0으로 조정됨)(260:450:320): 유속: 1.0 ㎖/분, 검출 파장: 405 nm. 도 4는 암포테리신 B (AB, 28 ㎍/㎖)의 고속 액체 크로마토그램으로서, 암포테리신 B의 제1 피크가 약 12분에 나타났다.
폴리아스파르트산의 고속 액체 크로마토그램을 상술한 HPLC 방법에 따라 얻었다. 도 5에 도시된 바와 같이, 약 3분에 작은 크로마토그래피 피크가 405 nm의 검출 파장에서 PA의 약한 흡수로 일어났다.
폴리아스파르트산-암포테리신 B 다중접합체(PA-AB, 제조예 1의 생성물, 105 ㎍/㎖, 도 4에 사용된 샘플 용액의 것에 필적하는 농도의 암포테리신 B 함유)의 고속 액체 크로마토그램을 상술한 HPLC 방법에 따라 얻었다. 도 6에 도시된 바와 같이, 약 12분에 크로마토그래피 피크가 검출되지 않았지만(즉, 자유 AB가 없음), 약 3분에서의 크로마토그래피의 피크는 도 4에서의 것에 필적한말한 피크 면적을 가졌다. 이는 본 발명의 방법이 고순도(AB의 중량을 기준으로 순도 99% 이상)의 PA-AB 다중접합체를 생성할 수 있음을 입증하며, 이는 다중접합체가 실질적으로 자유 AB를 포함하지 않음을 의미하는 것이다(피크 면적 백분율이 면적 정규화의 계수로 1% 미만). PA-AB는 화학 결합을 통해 형성된 안정한 화합물이며, 크로마토그래피 조건 하에 분해되지 않을 것이다. 폴리아미노산의 강한 극성때문에, PA-AB의 다중접합체는 PA와 유사한 크로마토그래피 거동 및 PA와 동일한 시간에서의 피크를 가진다. 또한, 다중접합체에서 AB의 비율, 즉 활성 약물의 함량은 HPLC 방법과 도 4의 측정 결과를 결합하여 산출할 수 있다. 제조예 1의 활성 약물 함량은 23.4%(w/w)이다.
폴리아스파르트산-암포테리신 B 다중접합체와 자유 암포테리신 B의 물리적 혼합물(PA-AB, 100 ㎍/㎖; AB 26 ㎍/㎖)의 고속 액체 크로마토그램을 상기 HPLC 방법에 따라 얻었다. 도 7에 도시된 바와 같이, AB가 나타내는 크로마토그래피의 피크는 약 12분에 검출되었는데, 이는 AB 첨가량에 해당하는 피크이며, PA-AB 피크가 약 3분에 검출되었는데, 이는 PA-AB 첨가량에 해당하는 피크이다. PA-AB 다중접합체 및 자유 AB의 크로마토그래피 거동이 독립적이고, 서로 간섭을 하지 않음이 입증되었다.
HPLC 방법을 또한 암포테리신 B 및 다른 거대분자 중합체로 구성된 다중접합체를 분석하는데 적용할 수 있다. 이 방법은 HPLC 조건의 큰 변경없이, 이들 다중접합체를 정성적 또는 정량적으로 분석하는데 사용할 수 있다.
HPLC 방법은 또한 다른 폴리엔 마크롤라이드 항생제와 거대분자 중합체로 구성된 다중접합체를 분석하는데 적용할 수 있다. 이 방법은 HPLC 조건, 예컨대 이동상을 적절히 변경함으로써, 이들 다중접합체를 정성적 또는 정량적으로 분석하는데 사용될 수 있다. 다른 약물 표준 및 기준에 대해 설명되어 있는 다른 폴리엔 마크롤라이드 화합물에 대해 채용되는 HPLC 방법 및 조건(예를 들어, HPLC 방법 및 조건을 JP16에서 찾을 수 있는 트리코마이신)을 참조로 사용할 수 있다.
B. 다중접합체의 제조
제조예 1. 폴리아스파르트산 - 암포테리신 B 다중접합체의 화학적 합성
합성 과정을 하기 반응식에 개략적으로 나타내었다:
Figure 112016007439486-pct00012
-디사이클로헥실카보디이미드, 4-디메틸아미노 피리딘→
Figure 112016007439486-pct00013
합성 단계: 폴리-L-아스파르트산 800.0 mg (분자량 28,000 Da)을 5 ml 디메틸 포름아미드에 용해시켰다. 암포테리신 B 280.0 mg (0.30 mol)을 디메틸 포름아미드 용액에 첨가하고, 교반하여 용해시켰다. 디사이클로헥실카보디이미드 62.5 mg (0.30 mol) 및 4-디메틸아미노 피리딘 37.0 mg (0.30 mol)을 디메틸 포름아미드 용액에 첨가하고, 실온(23-25℃) 하에 12시간 동안 자석식으로 교반하였다. 100 ml 1M NaHCO3을 반응 용액에 첨가하고, 1시간 동안 자석식으로 교반한 후, 이 염기성 용액을 투석 백으로 옮겨, 탈이온수에 대해 5시간 동안 투석한 다음, 0.2 μ 필터에 통과시키고, 동결건조시켰다. 1,033.4 mg의 폴리-아스파르트산-암포테리신 B 다중접합체를 수득하였다.
도 8은 본 제조예로부터 수득한 폴리-아스파르트산-암포테리신 B 다중접합체의 수소-핵자기 공명(1H-NMR) 스펙트럼으로서, 다중접합체의 것과 일치하는 스펙트럼선을 나타낸다.
도 9는 본 제조예로부터 수득한 폴리-아스파르트산-암포테리신 B 다중접합체의 탄소-핵자기 공명(13C-NMR) 스펙트럼으로서, 다중접합체의 것과 일치하는 스펙트럼선을 나타낸다.
도 10은 본 제조예로부터 수득한 폴리-아스파르트산-암포테리신 B 다중접합체의 고속 액체 크로마토그래피(HPLC) 분리 스펙트럼이 자외선(UV) 검출과 결합된 것이다.
도 11은 본 제조예로부터 수득한 폴리-아스파르트산-암포테리신 B 다중접합체의 도 10에서 사용된 것과 동일한 HPLC 조건 하에서의 HPLC 분리 스펙트럼이 질량 분석법(MS)과 결합된 것이다. 도면은 암포테리신 B에 의해 형성된 다수의 단편들을 나타내며, 이는 다중접합체에 암포테리신 B의 존재를 가리키며, 이것은 HPLC 시스템에서 거대분자 중합체와 함께 용출되었다.
도 12는 본 제조예로부터 수득한 폴리-아스파르트산-암포테리신 B 다중접합체의 다른 시험 조건 세트 하에서의 HPLC 분리 스펙트럼이 UV 검출과 결합된 것이다.
도 13은 본 제조예로부터 수득한 폴리-아스파르트산-암포테리신 B 다중접합체의 도 12에서 사용된 것과 동일한 HPLC 조건 하에서의 HPLC 분리 스펙트럼이 질량 분석법(MS)과 결합된 것이다. 도면은 암포테리신 B에 의해 형성된 다수의 단편들을 나타내며, 이는 다중접합체에 암포테리신 B의 존재를 가리키며, 이것은 HPLC 시스템에서 거대분자 중합체와 함께 용출되었다.
실험 데이터에 따라, 활성 약물 함량은 23.4% (w/w)이고, 자유 활성 약물 함량은 0.2% 미만이다(도 6에서의 AB 피크의 피크 면적을 피크 PA-AB의 피크로 나누고 100%를 곱하여 계산됨).
제조예 2. 폴리 -오르니틴- 암포테리신 B 다중접합체 의 화학적 합성
합성 과정을 하기 반응식에 개략적으로 나타내었다:
Figure 112016007439486-pct00014
-디사이클로헥실카보디이미드, 4-디메틸아미노 피리딘→
Figure 112016007439486-pct00015
합성 단계: 폴리-D-오르니틴 250.0 mg (분자량 34,000 Da)을 3 ml 디메틸 포름아미드에 용해시켰다. 암포테리신 B 75.0 mg (0.08 mol)을 디메틸 포름아미드 용액에 첨가하여 용해시켰다. 디사이클로헥실카보디이미드 16.7 mg (0.08 mol) 및 4-디메틸아미노 피리딘 10.0 mg (0.08 mol)을 디메틸 포름아미드 용액에 첨가하고, 실온(23-25℃) 하에 12시간 동안 자석식으로 교반하였다. 50 ml의 물을 반응 용액에 첨가하고, 이 용액을 투석 백으로 옮겨, 탈이온수에 대해 5시간 동안 투석한 다음, 0.2 μ 필터에 통과시키고, 동결건조시켰다. 323.0 mg의 폴리-오르니틴-암포테리신 B 다중접합체를 수득하였다.
화학 결합에 의해 형성된 수득한 다중접합체를 제조예 1의 생성물을 입증하기 위해 사용된 UV-VIS 분광법, HPLC, 수소-핵자기 공명(1H-NMR), 탄소-핵자기 공명(13C-NMR), HPLC-UV, 및 HPLC-MS로 확인하였다.
실험 데이터에 따라, 활성 약물 함량은 20.8% (w/w)이고, 자유 활성 약물 함량은 0%(비검출)이었다.
제조예 3. 폴리 -글루코사민- 암포테리신 B 다중접합체 의 화학적 합성
합성 과정을 하기 반응식에 개략적으로 나타내었다:
Figure 112016007439486-pct00016
-디사이클로헥실카보디이미드, 4-디메틸아미노 피리딘→
Figure 112016007439486-pct00017
합성 단계: 폴리-글루코사민 532.0 mg (분자량 85,000 Da)을 6 ml 디메틸 포름아미드에 용해시켰다. 암포테리신 B 305.0 mg (0.33 mol)을 디메틸 포름아미드 용액에 첨가하여 용해시켰다. 디사이클로헥실카보디이미드 68.1 mg (0.33 mol) 및 4-디메틸아미노 피리딘 40.3 mg (0.33 mol)을 디메틸 포름아미드 용액에 첨가하고, 실온(23-25℃) 하에 12시간 동안 자석식으로 교반하였다. 80 ml 0.1 M HCl을 반응 용액에 첨가하고, 이 산성 용액을 투석 백으로 옮겨, 탈이온수에 대해 5시간 동안 투석한 다음, 0.2 μ 필터에 통과시키고, 동결건조시켰다. 803.5 mg의 폴리-글루코사민-암포테리신 B 다중접합체를 수득하였다.
화학 결합에 의해 형성된 수득한 다중접합체를 제조예 1의 생성물을 입증하기 위해 사용된 UV-VIS 분광법, HPLC, 수소-핵자기 공명(1H-NMR), 탄소-핵자기 공명(13C-NMR), HPLC-UV, 및 HPLC-MS로 확인하였다.
실험 데이터에 따라, 생성물 내 활성 약물 함량은 33.6% (w/w)이고 자유 활성 약물 함량은 0.4% 미만이었다.
제조예 4. 거대분자- 암포테리신 B 다중접합체 의 화학적 합성
본 방법은 폴리-DL-아스파르트산 1,400.0 mg (분자량 15,000 Da)을 거대분자 중합체로 사용하는 것만을 제외하고 제조예 1에서 사용된 방법을 참고하였다. 1,511.5 mg의 다중접합체를 수득하였다. 실험 데이터에 따라, 수득한 생성물 내 활성 약물 함량은 15.7% (w/w)이고, 자유 활성 약물 함량은 0.8% 미만이었다.
제조예 5. 거대분자 중합체- 암포테리신 B 다중접합체 의 화학적 합성
본 방법은 폴리-(L-오르니틴/L-리신) 1,000.0 mg (몰비 1:1) (분자량 25,000 Da)을 거대분자 중합체로 사용하는 것만을 제외하고 제조예 1에서 사용된 방법을 참고하였다. 1,191 mg의 다중접합체를 수득하였다. 실험 데이터에 따라, 수득한 생성물 내 활성 약물 함량은 19.8% (w/w)이고, 자유 활성 약물 함량은 0% (비검출)이었다.
제조예 6. 거대분자 중합체- 암포테리신 B 다중접합체 의 화학적 합성
본 방법은 폴리-갈락토사민 (분자량 150,000 Da)을 거대분자 중합체로 사용하는 것만을 제외하고 제조예 3에서 사용된 방법을 참고하였다. 811 mg의 다중접합체를 수득하였다. 실험 데이터에 따라, 수득한 생성물 내 활성 약물 함량은 23.5% (w/w)이고, 자유 활성 약물 함량은 0.3% 미만이었다.
제조예 6. 거대분자 중합체- 암포테리신 B 다중접합체 의 화학적 합성
본 방법은 폴리-글루코사민 (분자량 25,000 Da)을 거대분자 중합체로 사용하고 90 mg 활성 약물을 사용하는 것만을 제외하고 제조예 3에서 사용된 방법을 참고하였다. 602 mg의 다중접합체를 수득하였다. 실험 데이터에 따라, 수득한 생성물 내 활성 약물 함량은 11.2% (w/w)이고, 자유 활성 약물 함량은 0.2%이었다.
제조예 7. 거대분자-활성 약물 다중접합체 의 화학적 합성
본 방법은 나이스타틴을 활성 약물로 사용하는 것만을 제외하고 제조예 1에서 사용된 방법을 참고하였다. 실험 데이터에 따라, 수득한 생성물 내 활성 약물 함량은 27.1% (w/w)이고, 자유 활성 약물 함량은 0.3% 미만이었다.
제조예 8. 거대분자-활성 약물 다중접합체 의 화학적 합성
본 방법은 나타마이신을 활성 약물로 사용하는 것만을 제외하고 제조예 2에서 사용된 방법을 참고하였다. 실험 데이터에 따라, 수득한 생성물 내 활성 약물 함량은 18.7% (w/w)이고, 자유 활성 약물 함량은 0.2% 미만이었다.
제조예 9. 거대분자-활성 약물 다중접합체 의 화학적 합성
본 방법은 트리코마이신을 활성 약물로 사용하는 것만을 제외하고 제조예 3에서 사용된 방법을 참고하였다. 실험 데이터에 따라, 수득한 생성물 내 활성 약물 함량은 20.4% (w/w)이고, 자유 활성 약물 함량은 0.2% 미만이었다.
제조예 10. 거대분자 중합체-활성 약물 다중접합체 의 화학적 합성
본 방법을 메파트리신, 칸니트라신, 필리핀, 아우레오펀긴, 에트루스코마이신, 하마이신, 페리마이신 A를 활성 약물로 사용하는 것만을 제외하고 제조예 1에서 사용된 방법을 참고로 수행하여 각각 7종의 거대분자 중합체-활성 약물 다중접합체를 수득하였다. 수득한 이들 생성물 내에 활성 약물 함량은 모두 10-35%의 범위이었고, 자유 활성 약물 함량은 모두 1.0% 미만이었다.
제조예 21. 다중접합체의 화학적 합성(001056255, CN1310025A , 실시예 4)
폴리(글루타메이트/아스파르트산, 분자량 28,000 Da) 및 파클리탁셀의 중합체: 두 성분을 N,N-DMF에 4:1의 비(몰비)로 용해시키고, 축합제로 DCC를 사용하였다. 383 mg의 폴리-디펩티드를 8 ml DMF에 용해시키고, 8.5 mg N,N-디메틸아미노 피리딘 및 209.4 mg 파클리탁셀을 152.2 mg DCC에 첨가한 뒤, 상기 혼합물에 첨가하였다. 실온 하에 22시간동안 교반하였다. 우레아를 여과하고, 얻은 용액을 클로로포름으로 ?겼다. 생성물을 여과하고, 중탄산나트륨에 재용해시켰다. 증류수에 대해 투석시킨 후(컷오프 MW 10,000 Da), 생성물을 동결건조시켜 611 mg을 얻었다. 실험 데이터에 따라, 수득한 생성물 내 활성 약물 함량은 23.8% (w/w)이고, 자유 활성 약물 함량은 3.6%이었다.
제조예 22. 다중접합체의 화학적 합성(028121953, CN1596129A , 실시예 1 내지 실시예 2)
하이드록시에틸 전분(HES) 130 kD의 산화: 10 g의 하이드록시에틸 전분(130 kD)을 반응 용기에 투입하고, 최소량의 물에 용해시켰다. 2 ml 0.1N 요오드 용액 및 약 3 ml 0.1 N NaOH를 용액에 첨가하고, 모든 I2가 반응하여 혼합물의 색이 없어질 때까지 (자석식 교반 장치에 의해) 교반하였다. 총 10 ml의 0.1 N 요오드 용액 및 20 ml의 0.1 N NaOH가 첨가될 때까지 요오드 용액 및/또는 NaOH 용액을 여러 번 반복해서 첨가하였다. 이어, 얻은 용액을 수소 이온 교환 컬럼(Amberlite IR120)에 로딩하고, 배제 한계 4-6 kD의 투석관에서 20시간 동안 증류수에 대해 투석을 실시하였다. 동결건조시키고 투석물의 산화도를 SOMOGYI 방법에 의해 측정하였다.
산화 측정: 수득한 산화 HES(ox-HES)를 SOMOGYI 방법(Meth. Carbohydrate Chem., I, 384-386, 1962)을 이용하여 평가하였다. 이 방법은 Cu2 + 에서 Cu+로 환원시키는 공정 중에 생성된 자유 알데하이드의 양을 측정하는 것에 기초한다. 요오드 및 요오드산염은 다시 Cu+ 에서 Cu2 +로 산화된 요오드를 생성하며, 과다 요오드는 차아황산염으로 적정될 것이다.
암포테리신 B-하이드록시에틸 전분 다중접합체의 합성: 650 mg (1.5×10-5 mole) 건조 ox-HES (130 kD, 약 100% 산화) 및 2.8 mg (3.0×10-6 mole) 암포테리신 B를 실온 하 및 질소 분위기에서 반응 용기 내의 약 4 ml 무수 DMSO에 용해시켰다. 혼합물을 교반하고 70℃에서 24시간 동안 차광 하에 반응시켰다. 물을 10배 부피로 첨가하고, 반응 생성물을 4℃에서 48시간 동안 차광 하에 물에 대해 투석시킨 후, 물을 4배로 다시 채웠다. 생성물을 동결건조하여 옅은 노란색 분말을 수득하였다. 실험 데이터에 따라, 수득한 생성물 내 활성 약물 함량은 0.58% (w/w)이고, 자유 활성 약물 함량은 4.8%이었다.
C. 실험예
실험예 1: 다중접합체의 용해도 분석
제조예로부터 수득한 거대분자 중합체 및 활성 약물의 다중접합체의 용해도를, 물을 용매로 사용하여 실온 (22 내지 25℃)에서 측정하였다. 용해도는 그 안에 용해된 활성 약물의 양으로 특정된다. 예를 들어, 10 g의 다중접합체가 물 100 ml에 용해되고, 그 안에 25%의 활성 약물이 함유된 경우 활성 약물의 용해도는 2.5%이다.
실험 데이터에 따라, 제조예 1 내지 제조예 9에서의 다중접합체는 모두 용해도가 1.4 내지 2.8%의 범위로, 1.4%를 초과한다. 예를 들어, 제조예 1의 다중접합체의 용해도는 약 1.95%이다. 그러나, 제조예 10으로부터 수득한 7종 다중접합체의 용해도는 모두 0.13 내지 0.47%로 0.5% 미만이다. 예를 들어, 폴리아스파르트산-메파트리신 다중접합체의 용해도는 0.27%이다.
또한, 제조예 21 생성물의 활성 약물 용해도는 0.53%이고; 제조예 22로부터 생성된 생성물의 활성 약물 암포테리신 B의 용해도는 0.026%이다.
실험예 2: 다중접합체의 용혈 분석
용혈 분석을 CN 1596129 A(FRESENIUS KABI)의 명세서 12-14쪽에 있는 실시예 3에 기재된 방법을 참조하여 수행하였다. 시험 대상의 용혈은 용혈 초기 폴리엔 마크롤라이드 물질의 농도로 특정된다. 참조 방법에서, 시판 제제는 0.1 ㎎/㎖의 암포테리신 B 농도에서 용혈을 일으키기 시작했으며, 이에 반해 암포테리신 B-HES 다중접합체는 0.4 ㎎/㎖의 암포테리신 B 농도에서 용혈을 일으키기 시작했다.
실험 데이터에 따라, 11종 다중접합체(제조예 1 내지 제조예 9, 메파트리신 다중접합체 및 제조예 10의 칸니트라신 다중접합체)는 모두 용혈 농도가 2.2 내지 4.6 ㎎/㎖의 범위 내로, 2.2 ㎎/㎖ 보다 높았다. 예를 들어, 제조예 2 다중접합체의 용혈 농도는 3.56 ㎎/㎖로서, 이는 본 발명의 다중접합체의 안전역이 우수함을 나타낸다. 그러나, 기타 제조예 10의 다중접합체 및 제조예 21 및 22로부터 생성된 다중접합체의 용혈 농도는 모두 0.7 ㎎/㎖ 보다 낮았다. 예를 들어, 제조예 10의 필리핀 다중접합체, 제조예 21의 다중접합체 및 제조예 22의 다중접합체는 용혈 농도가 각각 0.45 ㎎/㎖, 0.6 ㎎/㎖ 및 0.4 ㎎/㎖이었다.
실험예 3: 다중접합체의 생체 내 거동 분석
본 분석을, 자오 롱솅(ZHAO, Rongsheng) 등에 의한 (The pharmacokinetic characteristics of amphotericin B liposomes injection compared with market injection in rabbits after intravenous administration. Journal of Peking University (Health Science), 2001, 33(3):243)에 기재된 방법을 참조하여 수행하였다.
시험 샘플: 제조예 1, 2, 3으로부터 수득한 세 암포테리신 B 다중접합체; 대조군으로 암포테리신 B 리포솜 주사액(상품명: 암포텍, 제품의 등록 번호: H20090963, 100 mg 암포테리신 B/바이알, Three Rivers Co.)를 사용하였다; 이들은 사용 직전에 5% 포도당 주사액을 사용하여 멸균 용액으로 제조되었다(본 발명의 다중접합체는 0.9% NaCl 주사액 또는 5% 포도당 주사액에 용해 후 주사될 수 있다; 본 발명의 다중접합체는 두 용매와의 상용성이 우수하였다; 그러나, 암포텍과 같은 시판 암포테리신 B 리포솜 주사액은 0.9% 염화나트륨 주사액과 혼합할 수 없었다).
반은 수컷/반은 암컷으로 이루어진 체중 2.7-3.2 kg의 토끼(총 20 마리)를 밤새 금식시킨 후 그룹 당 5 마리의 그룹으로 무작위로 분류하고, 상기 네 시험 샘플을 체중 kg 당 1 mg의 용량으로 밤새 금식시킨 후의 귀의 연변 정맥을 통해 정맥 내 주사하였다. 투약 후 즉시, 0시(투여 30분 전) 및 투여 후 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 18, 21, 24, 28, 32, 36시간에 연변 귀 정맥을 통해 2 ml의 혈액 샘플을 채혈하고, 혈액 샘플을 헤파린 항응고제 튜브에 투입한 다음, 3,000 rpm으로 10분 간 원심 분리하여 혈장을 분리하였다. 나머지 절차는 참조 문헌에서와 동일하다.
결과: 제조예 1, 2, 3의 다중접합체의 AUC는 각각 대조군의 것의 1.62, 1.84, 1.77배이었다. 또한, 각 동물에 대한 시간 대 혈청 농도의 곡선을 생성하고, 약물의 혈청 농도가 0.5 mg/L를 초과하는 기간을 얻었다(자오 롱솅(ZHAO, Rongsheng) 등에 의한 것에서, 투약 3시간 후 시판 암포테리신 B 주사액의 혈청 농도는 0.5 mg/L로 감소하였고, 따라서 최소 유효 혈청 농도는 0.5 mg/L인 것으로 가정하였다). 제조예 1, 2, 3으로부터 수득한 세 다중접합체의 경우, 지속 시간은 각각 18.4시간(투약 후 0.82시간부터 투약 후 19.2시간까지), 21.8시간 및 17.41시간이었고, 반면 대조군에 대한 지속시간은 11.7시간(투약 후 1시간부터 투약 후 11.7시간까지)이었다. 약물의 최소 유효 혈청 농도가 0.5 mg/L라는 가정 하에, 본 발명의 다중접합체는 동일한 용량에서 상당히 더 긴 기간의 유효 치료 시간을 유지할 수 있다. 또한, 놀랍게도, 본 발명의 다중접합체는 종래 주사 투여(예컨대, 대조 제제는 0시에서 혈청 농도 피크를 가짐)의 것이 아닌, 경구 투여에 의해 얻어진 혈청 농도 곡선과 유사한 자유 약물의 혈중 농도 패턴을 나타내었고(예를 들어, 제조예 1의 다중접합체는 7.2시간에서 혈청 농도 피크를 가짐), 종래 주사 투여의 초기 단계에 매우 높은 혈청 농도를 피할 수 있기 때문에 이미 그 자체로 높은 독성을 가지는 고농도 암포테리신 B에 의해 발생되는 독성 또는 부작용을 제거 또는 감소시킬 수 있다.
실험예 4: 상용성 시험
시험 대상: 본 발명의 제조예 1 내지 10으로부터 수득한 다중접합체, 시판 암포테리신 B 리포솜 주사(상품명: 암포텍).
시험 1: 적당량의 시험 대상(100 mg의 활성 성분에 상응)을 주사용수 20 ㎖, 50 ㎖ 또는 100 ㎖에 용해시키고, 약물의 용해; 특히 임의의 불용성 입자의 존재유무를 관찰하였다. 이어, 용해된 약물 용액을 4℃의 냉장고에 6시간 동안 놓아 두고, 약물의 용해; 특히 임의의 불용성 입자의 존재유무를 관찰하였다. 이어서, 용해된 약물 용액을 30℃에서 6시간 동안 놓아 두고, 약물의 용해; 특히 임의의 불용성 입자의 존재유무를 관찰하였다. 그 결과 세 조건 하의 관찰에 따라 제조예 1 내지 10으로부터 수득한 모든 다중접합체는 어떤 불용성 입자도 생성하지 않았으나, 암포텍은 30℃에서 6시간 후에 불용성 입자를 생성한 것으로 나타났다.
시험 2: 적당량의 시험 대상(100 mg의 활성 성분에 상응)을 0.9% 염화 나트륨 주사액 20 ㎖, 50 ㎖ 또는 100 ㎖에 용해시키고, 그의 용해를 "분석 1"의 방법에 따라 관찰하였다. 그 결과 세 조건 하의 관찰에 따라 제조예 1 내지 10으로부터 수득한 모든 다중접합체는 어떤 불용성 입자도 생성하지 않았으나, 암포텍은 30℃에서 6시간 후에 불용성 입자를 생성한 것으로 나타났다.
시험 3: 적당량의 시험 대상(100 mg의 활성 성분에 상응)을 5% 포도당 주사액 20 ㎖, 50 ㎖ 또는 100 ㎖에 용해시키고, 그의 용해를 "분석 1"의 방법에 따라 관찰하였다. 그 결과 세 조건 하의 관찰에 따라 제조예 1 내지 10으로부터 수득한 모든 다중접합체 및 암포텍은 어떤 불용성 입자도 생성하지 않았다.
실험예 5: 약물 안전성 시험
래트에서의 정맥 내 암포테리신 B에 대한 LD50 값은 1.6 mg/kg인 것으로 입증되었다(www.pfizer.com/.../Amphotericin%20B%20 INJECTION.pdf, MATERIAL SAFETY DATA SHEET, Revision date: 20-Dec-2007,Version: 1.1, Page 3). 참조에 따라 마우스에서 암포테리신 B의 LD50은 2.3 mg/kg이고 래트에서는 1.6 mg/kg이라고 추가로 기재되었다(R T Proffitt, A Satorius, S M Chiang, L Sullivan, J P Adler-Moore, JAntimicrobChemother. 1991 Oct; 28 Suppl B: 49-61　 1778892　 Cit:108).
본 실험예에서는 동물에서 제조예 1로부터 수득한 폴리아스파르트산-암포테리신 B 다중접합체(PA-AB로도 지칭됨, 그의 활성 약물의 함량은 23.4%임)의 안전성에 대해 시험하였다.
시험 약물의 제조: PA-AB를 멸균 염수에 용해하여 즉시 사용가능한 용액 5 ㎎/㎖를 제조하였다(1 ml의 용액은 5 ㎎의 등가 암포테리신 B를 함유한다).
암컷 래트를 그룹 당 3 마리씩 무작위로 여섯 그룹으로 분류하였다. 대조군에는 멸균 염수를 투여하고(주사 부피는 15 ㎎/㎏ 투약 그룹의 경우와 동일하다), 다른 다섯 그룹은 각각 5 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏, 15 ㎎/㎏, 18 ㎎/㎏, 30 ㎎/㎏으로 정맥 주사에 의해 투여하였다. (투약 직전) 0일, 및 투약 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8일에 동물의 체중을 재었다. 각 그룹에 대한 평균 체중 및 0일에 대한 백분율로 표현된 체중 증가를 계산하고 다음 표에 나타내었다:
Figure 112016007439486-pct00018
참고: * 용량에서 PA-AB로 투여된 것은 암포테리신 B 등가물로서 표시되었다. # 18 ㎎/㎏ 용량 그룹에서, 3일 및 4일 째에 동물 한 마리가 사망한 것이 관찰되었다; 30 mg/kg 용량 그룹에서, 2일 째에 동물 두 마리가 사망하고, 3일 째에 또 다른 한 마리가 사망한 것이 관찰되었다; 기타 그룹의 동물들은 모두 생존하여 실험 완료 후 초기 체중을 회복하였다.
또한, 본 발명의 제조예 2 내지 제조예 10으로부터 수득한 다중접합체의 다양한 배치를 15 ㎎/㎏의 용량으로 전술한 방법에 따라 시험하였다. 그 결과 모든 동물이 8일 째 생존하였고, 실험 완료 후 초기 체중을 회복한 것으로 나타났다. 실험 결과는 본 발명의 다중접합체가 15 ㎎/㎏ 이하의 용량에서는 동물에 치명적이지 않음을 보여준다; 이에 반해 종래 암포테리신 B의 LD50은 1.6 ㎎/㎏인 것으로 보고되었으며, 이는 본 발명의 다중접합체가 훨씬 더 좋은 안전역을 가지고 있음을 나타내는 것이다.
실험예 6: 약력학적 분석
방법: 종래의 방법으로 면역결핍시킨(백혈구수 ≤100) 마우스를 칸디다 알비칸스(Candida albicans)로 감염시키고, 그룹당 20 마리씩 무작위로 여덟 그룹으로 분류하였다. 마우스에 꼬리 정맥을 통한 주사로 하기 표에 나타낸 처치를 하였다. 그룹 및 용량(암포테리신 B의 양적인 면)을 하기 표에 나타내었다. 7일 간 동물의 생존을 지속적으로 모니터링하고, 7일 째에 사망한 마우스의 수를 세었다. 결과는 다음 표에서와 같다:
Figure 112016007439486-pct00019
상기 결과로부터, 대조 그룹(암포테리신 B의 종래 약물이 투여된 동물)의 50%의 유효 용량은 약 1 ㎎/㎏인 반면; 시험 그룹(다중접합체를 투여받은 동물)의 50% 유효 용량은 0.25 ㎎/㎏ 내지 0.125 ㎎/㎏의 범위인 것으로 나타났으며, 이는 본 발명의 다중접합체 중의 암포테리신 B가 종래 약물의 것보다 상당히 더 높은 치료 효과를 가지고 있음을 보여준다.

Claims (30)

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  8. 활성 약물 물질 및 거대분자 중합체를 포함하되 활성 약물 물질은 화학 결합에 의해 거대분자 중합체와 접합되어 있는 다중접합체의 제조방법으로서,
    i) 거대분자 중합체를 제공하고 이를 용매에 용해시켜 용액을 형성하는 단계;
    ii) 상기 단계 (i)에서 얻은 용액에 활성 약물 물질을 첨가하여 용해시키는 단계;
    iii) 상기 단계 (ii)에서 얻은 용액에 촉매 및 축합제를 첨가하고, 거대분자 중합체와 활성 약물 물질을 축합하여 그의 다중접합체를 형성하는 단계로서, 여기서 거대분자 중합체와 활성 약물 물질은 화학 결합에 의해 서로 결합되어 있는 것인 단계; 및
    (iv) 얻은 다중접합체를 분리 및 추출하는 단계를 포함하고;
    여기서, 활성 약물 물질이 암포테리신 B, 나이스타틴, 나타마이신, 트리코마이신, 메파트리신, 칸니트라신, 필리핀 III, 아우레오펀긴, 에트루스코마이신, 하마이신 및 페리마이신으로부터 선택되는 폴리엔 마크롤라이드 항생제이고,
    거대분자 중합체가 아미노산의 중합에 의해 형성된 폴리아미노산이고, 아미노산은 카복실산형 아미노산, 아미노형 아미노산, 또는 이들의 조합으로부터 선택되며, 카복실산형 아미노산이 아스파르트산(Asp), 글루타메이트(Glu), 또는 이들의 조합으로부터 선택되고, 아미노형 아미노산이 오르니틴(Orn), 리신(Lys), 아르기닌(Arg), 하이드록시리신(Hyl), 또는 이들의 조합으로부터 선택되며,
    아미노산이 카르복실산형 아미노산인 경우, 상기 화학 결합은 에스테르 결합이고, 아미노산이 아미노형 아미노산인 경우, 상기 화학 결합은 아미드 결합이며,
    단계 (i)에서의 용매가 디메틸포름아미드 및 디메틸 설폭사이드로부터 선택되는 유기 용매이고;
    단계 (iii)에서의 촉매가 4-디메틸아미노피리딘이고; 및
    단계 (iii)에서의 축합제가 디사이클로헥실카보디이미드인, 방법.
  9. 활성 약물 물질을 화학 결합에 의해 거대분자 중합체와 결합하여 다중접합체를 형성하는 단계를 포함하되, 해당 단계가 제8항에 따른 방법으로 수행되는, 활성 약물 물질의 용해도를 증가시키는 방법.
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  13. 제9항에 있어서, 폴리아미노산 중의 아미노산이 D-아미노산, L-아미노산 및 DL-아미노산을 포함하는, 방법.
  14. 제9항에 있어서, 폴리아미노산의 평균 분자량이 5,000 내지 100,000 달톤인, 방법.
  15. 제9항에 있어서, 활성 약물 물질의 중량이 다중접합체 총 중량의 5 내지 60%를 차지하는, 방법.
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