CN104055735A

CN104055735A - 一种萨摩鲁泰的脂质体及其制备方法

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Publication number: CN104055735A
Application number: CN201310093730.6A
Authority: CN
Inventors: 徐春莲; 郑春莲; 刘建; 马亚平; 袁建成
Original assignee: Hybio Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Hybio Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2013-03-22
Filing date: 2013-03-22
Publication date: 2014-09-24
Anticipated expiration: 2033-03-22
Also published as: CN104055735B

Abstract

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种萨摩鲁泰的脂质体及其制备方法。本发明提供的萨摩鲁泰脂质体，包括：磷脂、萨摩鲁泰、胆固醇和药学上可接受的冷冻保护剂，粒径为50nm～200nm。本发明提供的萨摩鲁泰脂质体以磷脂和胆固醇为膜材料，将萨摩鲁泰包裹其中，形成带有负电荷的脂质体。从而降低了萨摩鲁泰对胰腺和肾脏的损伤、减轻了服用萨摩鲁泰后的胃肠道反应，并提高了萨摩鲁泰的稳定性和生物利用度。

Description

一种萨摩鲁泰的脂质体及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种萨摩鲁泰的脂质体及其制备方法。

背景技术

糖尿病可分为4种类型，分别为：I型糖尿病，II型糖尿病，其他类型糖尿病、妊娠期糖尿病。其中，II型糖尿病最为常见，又被称之为非胰岛素依赖糖尿病，引起II型糖尿病的原因为B细胞功能低下、胰岛素相对缺乏和胰岛素抵抗。近年来，II型糖尿病的患病率逐渐增加，据世界卫生组织预测，至2030年，全球将有3亿II型糖尿病患者。

目前，针对II型糖尿病的治疗药物主要有胰岛素和口服降糖药，如二甲双胍、阿卡波糖、格列吡嗪、瑞格列奈。虽然这些药物能有效降低血糖，并改善患者症状，但这些药物副作用均较大，如引起患者的低血糖以及体重的增加，引发高胰岛素血症，并伴有恶心、呕吐、消化不良、肝功能损害、皮疹等不良反应。由于现有的治疗方法存在不同的缺陷和弊端，因此随着对糖尿病基础理论研究的深入，新的药物作用靶点正在不断被开发。

胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide 1，GLP 1)是一种肠促胰岛素(incretin)，是回肠内分泌细胞分泌的一种肠源性激素，1983年由Bell等在对胰高血糖素原（proglucagon）基因进行序列分析时发现。胰高血糖素原在肠道的Ｌ细胞中，被裂解为GLP-1（1-37）、GLP-2和肠高血糖素。在GLP-1（1-37）的Ｎ端水解掉6个氨基酸后，形成具有生物活性的GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)-NH₂。

由于GLP-1可促进胰岛素分泌并保护胰岛β细胞、减慢胃排空、抑制食欲，近年来已成为糖尿病治疗领域的研究热点。目前被美国食品和药物管理局批准上市的艾塞那肽、利拉鲁肽等药皆为GLP-1的类似物。GLP-1的生理作用具体为：①刺激胰岛素分泌，由于GLP 1是葡萄糖依赖型激素，只有在血糖高于正常值时才能促进胰岛素分泌发挥降糖作用，因此，GLP-1不会引起患者低血糖，安全性较好。②抑制胰高血糖素分泌。③降低患者食欲，减少饮食，延迟胃排空，从而控制患者体重。④对胰腺B细胞群具有营养作用，促进B细胞再生、成长及分化，抗细胞凋亡。GLP-1在体内不稳定，易被二肽基肽酶IV(DPPIV)降解，并迅速被肾脏清除，其半衰期很短(t1/2≤2min)。DPPIV普遍存在于哺乳动物器官中和组织中，可切割氨基酸序列N端第二位含有脯氨酸、丙氨酸或羟基脯氨酸残基的多肽，所得产物不具有降糖活性，甚至还会对降糖效果起拮抗作用。GLP-1易降解的特性导致其不能够在体内发挥长效作用。因此，设计并合成长效化的GLP-1及其类似物成为目前抗糖尿病研究的热点之一。而为了延长GLP-1在体内的生物半衰期，目前常采用的主要的方法有：①通过酰化反应引入脂肪酸链将GLP-1制备成脂肪酸衍生物是肽类物质长效化的方法之一，例如，丹麦的诺和诺德公司开发的利拉鲁肽是目前唯一上市的GLP-1脂肪酸化衍生物，该化合物皮下注射给药1天1次，半衰期接近12h，动物和人体试验证实具有降低血糖作用。②研发新的GLP-1类似物，例如，艾塞那肽即Exendin-4及其衍生物，最初由毒蜥唾液中分离得到，与GLP-1具有53%氨基酸同源性，皮下注射给药1日2次，其血浆半衰期为2h～4h。③蛋白融合GLP-1类似物，如LY2189265和Albiglutide半衰期都得到了延长。④改变GLP-1肽链结构，如KGLP-1、mGLP-1、（Val8）GLP-1、Taspoglutide、CJG-1131等半衰期都得到改变。

目前，越来越多的长效GLP-1及其类似物被开发，但GLP-1及其类似物在使用时产生的副作用仍然阻碍其在临床的运用。这些副作用包括：胃肠道反应（表现为恶心、呕吐）、胰腺炎、肾脏损伤的加重等。

萨摩鲁泰（Semaglutide）是一种GLP-1类似物修饰物，分子式为C₁₈₇H₂₉₁N₄₅O₅₉，分子量为4114，其结构如式I所示：

式I

萨摩鲁泰由丹麦诺和诺德公司研制，通过促胰岛素分泌来降低血糖，同时还具有减少体重的作用，只需1周给药1次，已进入到晚期开发阶段。但是，萨摩鲁泰在人体内不稳定、生物利用度低、且副作用较强。其副作用主要表现为：胃肠道反应、恶心、呕吐。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种萨摩鲁泰脂质体及其制备方法，本发明提供的萨摩鲁泰脂质体作为注射液使用可降低副作用并提高其在人体内的生物利用度，且制备工艺简单。

本发明提供了一种萨摩鲁泰脂质体，包括：磷脂、萨摩鲁泰、胆固醇和药学上可接受的冷冻保护剂，萨摩鲁泰脂质体的粒径为50nm～200nm。

脂质体是指将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型泡囊体。本发明提供的萨摩鲁泰脂质体以磷脂和胆固醇为膜材料，将萨摩鲁泰包裹其中，形成带有负电荷的脂质体。从而降低了萨摩鲁泰对胰腺和肾脏的损伤、减轻了服用萨摩鲁泰后的胃肠道反应，并提高了萨摩鲁泰的稳定性和生物利用度。

作为优选，本发明提供的萨摩鲁泰脂质体中萨摩鲁泰、磷脂、胆固醇和药学上可接受的冷冻保护剂的质量比为（0.001～5）：（0.1～500）：（0.01～50）：（0.01～100）。

作为优选，本发明提供的萨摩鲁泰脂质体中磷脂与萨摩鲁泰的质量比为（1～100）:1。

作为优选，本发明提供的萨摩鲁泰脂质体中磷脂类与冷冻保护剂的质量比为（5～30）:1。

作为优选，本发明提供的萨摩鲁泰脂质体中磷脂类与胆固醇的质量比为（1～10）:1。

本发明通过调各组分之间的比例，提高了脂质双层膜的稳定性，减少了膜的流动性，降低渗透率。

作为优选，本发明提供的萨摩鲁泰脂质体中磷脂为蛋黄卵磷脂、脑磷脂、大豆磷脂、磷酸二鲸蜡酯、二月桂酰卵磷脂、二硬脂酰卵磷脂、二油酰基卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰甘油、二棕榈酰磷脂酸、二棕榈酰卵磷脂、二月桂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酸中一种或两者以上的混合物。

优选地，本发明提供的萨摩鲁泰脂质体中磷脂为二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油中一种或两者以上的混合物。

更优选地，本发明提供的萨摩鲁泰脂质体中磷脂为二棕榈酰磷脂酰胆碱。

本发明采用的磷脂饱和度高脂肪链长，具有更高的稳定性，得到的脂质体包封率高，渗漏低，稳定性好，避免了贮存过程中发生的聚集、成团、结块等不稳定性现象。

作为优选，本发明提供的萨摩鲁泰脂质体中药学上可接受的冷冻保护剂为甘露醇、海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、甘氨酸中一种或两者以上的混合物。

优选地，本发明提供的萨摩鲁泰脂质体中药学上可接受的冷冻保护剂为甘露醇、海藻糖、蔗糖、乳糖中一种或两者以上的混合物。

冷冻保护剂的加入减弱了冻干过程对脂质体的破坏作用，降低了脂质体的渗透率，抑制了脂质体的融合，保证了冻干后的脂质体再水化后有较高的包封率。

本发明提供的萨摩鲁泰脂质体的包封率为85%～89%，载药量为10.31%～9.18%。

本发明提供的萨摩鲁泰脂质体的制备方法可以采用薄膜分散法。

本发明提供的萨摩鲁泰脂质体的制备方法包括如下步骤：取磷脂、胆固醇溶于氯仿后，旋转蒸发去除氯仿，加入含有萨摩鲁泰的PBS缓冲液，搅拌状态下与药学上可接受的冻干保护剂水溶液混合，经冷冻干燥，即得。

采用薄膜分散法制备的萨摩鲁泰脂质体的粒径为50nm～200nm。

优选地，含有萨摩鲁泰的PBS缓冲液中，磷酸盐的摩尔-体积浓度为0.01mol/L，pH值为6.5。

优选地，含有萨摩鲁泰的PBS缓冲液中，磷酸盐为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠。

优选地，含有萨摩鲁泰的PBS缓冲液中，萨摩鲁泰的质量-体积浓度为35mg/ml。

该含有萨摩鲁泰的PBS缓冲液的渗透压与人体渗透压相等。

本发明提供的萨摩鲁泰脂质体的制备方法可以采用逆向蒸发法。

本发明提供的萨摩鲁泰的制备方法包括如下步骤：取磷脂和胆固醇溶于氯仿和/或乙醚，与萨摩鲁泰水溶液混合，经超声制得W/O型乳液；经第一减压蒸发除去W/O型乳液中的氯仿和/或乙醚后滴加PBS缓冲液，经第二减压蒸发制得水性混悬液；除去未包入的药物后与药学上可接受的冻干保护剂水溶液混合，冷冻干燥，即得。

采用逆向蒸发法制备的萨摩鲁泰脂质体的粒径为50nm～200nm。

优选地，萨摩鲁泰水溶液与溶解有磷脂的氯仿和/或乙醚的体积比为1:（3～6）。

本发明提供的萨摩鲁泰脂质体的制备方法可以采用注入法。

本发明提供的萨摩鲁泰脂质体的制备方法包括以下步骤：取磷脂和胆固醇溶于乙醚或乙醇，制得药液，搅拌条件下将药液经注射器注入萨摩鲁泰的PBS缓冲液中，搅拌除去乙醚和/或乙醇，经高压乳匀获得脂质体溶液；取药学上可接受的冻干保护剂水溶液与脂质体溶液混合，冷冻干燥，即得。

优选地，采用注入法制备的萨摩鲁泰脂质体的粒径为50nm～200nm。

更优选地，含有萨摩鲁泰的PBS缓冲液中，磷酸盐为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠。

作为优选，本发明提供的萨摩鲁泰脂质体的制备方法还可以采用冷冻干燥法、超声波分散法或pH梯度法。

本发明还提供了一种萨摩鲁泰脂质体注射剂，包括本发明提供的萨摩鲁泰脂质体。

作为优选，本发明提供的萨摩鲁泰脂质体注射剂的剂型为粉针剂或注射液。

优选地，本发明提供的萨摩鲁泰脂质体注射液中，萨摩鲁泰脂质体的含量为0.847g/L～917g/L。

本发明提供的萨摩鲁泰脂质体了包括：磷脂、萨摩鲁泰、胆固醇和药学上可接受的冷冻保护剂，萨摩鲁泰脂质体的粒径为50nm～200nm。本发明提供的萨摩鲁泰脂质体以磷脂和胆固醇为膜材料，将萨摩鲁泰包裹其中，形成带有负电荷的脂质体。从而降低了萨摩鲁泰对胰腺和肾脏的损伤、减轻了服用萨摩鲁泰后的胃肠道反应，并提高了萨摩鲁泰的稳定性和生物利用度。实验表明，本发明提供的萨摩鲁泰脂质体形态圆整、分布均匀，不聚集，包封率为85%～89%，载药量为10.31%～9.18%，室温放置180天后渗透率不超过0.66%。与萨摩鲁泰的普通注射液相比，本发明提供的萨摩鲁泰脂质体的生物利用度提高40.57%，对胃组织损伤的发生率降低10.03%，对肾脏组织的损伤的发生率及胰腺组织损伤的发生率分别降低10%。

附图说明

图1示本发明实施例5制备的萨摩鲁泰脂质体放大2×10⁵倍电镜图；

图2示本发明实施例15制备萨摩鲁泰脂质体注射液与市售普通萨摩鲁泰注射液在大鼠体内平均血药浓度-时间曲线图，其中，其中，曲线1示注射了本发明实施例15制备萨摩鲁泰脂质体注射液后Wistar大鼠眼眶静脉血中血药浓度随时间变化曲线；曲线2示注射了市售萨摩鲁泰普通注射液后Wistar大鼠眼眶静脉血中血药浓度随时间变化曲线。

具体实施方式

本发明提供了一种萨摩鲁泰脂质体及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明的实施例中，本发明提供的萨摩鲁泰脂质体中磷脂、萨摩鲁泰、胆固醇和药学上可接受的冷冻保护剂的质量比为（0.001～5）：（0.1～500）：（0.01～50）：（0.01～100）。

本发明提供的萨摩鲁泰脂质体中磷脂与萨摩鲁泰的质量比为（1～100）:1。

本发明提供的萨摩鲁泰脂质体中磷脂类与药学上冷冻保护剂的质量比为（5～30）:1。

本发明提供的萨摩鲁泰脂质体中磷脂类与胆固醇的质量比为（1～10）:1。

为提高萨摩鲁泰脂质体的包封率，本发明提供的萨摩鲁泰脂质体中磷脂为蛋黄卵磷脂、脑磷脂、大豆磷脂、磷酸二鲸蜡酯、二月桂酰卵磷脂、二硬脂酰卵磷脂、二油酰基卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰甘油、二棕榈酰磷脂酸、二棕榈酰卵磷脂、二月桂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酸中一种或两者以上的混合物。

为进一步提高萨摩鲁泰脂质体的包封率，本发明提供的萨摩鲁泰脂质体中磷脂为二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油中一种或两者以上的混合物。

本发明提供的萨摩鲁泰脂质体中磷脂为二棕榈酰磷脂酰胆碱时，包封率更高。

为提高萨摩鲁泰脂质体的稳定性，本发明提供的萨摩鲁泰脂质体中药学上可接受的冷冻保护剂为甘露醇、海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、甘氨酸中一种或两者以上的混合物。

为进一步提高萨摩鲁泰脂质体的稳定性，本发明提供的萨摩鲁泰脂质体中药学上可接受的冷冻保护剂为甘露醇、海藻糖、蔗糖、乳糖中一种或两者以上的混合物。

经检测，本发明提供的萨摩鲁泰脂质体的包封率为85%～89%，载药量为10.31%～9.18%。

采用薄膜分散法制备的萨摩鲁泰脂质体的粒径为50nm～200nm。

采用薄膜分散法制备的萨摩鲁泰脂质体含有萨摩鲁泰的PBS缓冲液中磷脂、萨摩鲁泰、胆固醇和药学上可接受的冷冻保护剂的质量比为（0.001～5）：（0.1～500）：（0.01～50）：（0.01～100）。

磷酸盐的摩尔-体积浓度为0.01mol/L，pH值为6.5。

含有萨摩鲁泰的PBS缓冲液中，磷酸盐为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠。

含有萨摩鲁泰的PBS缓冲液中，萨摩鲁泰的质量-体积浓度为35mg/ml。

该含有萨摩鲁泰的PBS缓冲液的渗透压与人体渗透压相等。

冷冻干燥具体为：将样品放置预冻箱内，1min内设置搁板温度降至-10℃，维持预冻3.33h后在2.33h内设置搁板温度降至-40℃，维持预冻5.67h，再1min内快速升温至0℃进行一次干燥16h，之后在1min内升温至20℃，进行二次干燥维持8h。

本发明提供了萨摩鲁泰的制备方法，包括如下步骤：取磷脂和胆固醇溶于氯仿和/或乙醚，与萨摩鲁泰水溶液混合，经超声制得W/O型乳液；经第一减压蒸发除去W/O型乳液中的氯仿或乙醚后滴加PBS缓冲液，经第二减压蒸发制得水性混悬液；除去未包入的药物后与药学上可接受的冻干保护剂水溶液混合，冷冻干燥，即得。

采用逆向蒸发法制备的萨摩鲁泰脂质体的粒径为50nm～200nm。

萨摩鲁泰水溶液与溶解有磷脂的氯仿和/或乙醚的体积比为1:（3～6）。

溶解磷脂采用氯仿和乙醚的混合物效果较好。

溶解磷脂采用氯仿和乙醚的混合物中氯仿与乙醚的体积比为4:1时效果更好。

超声的时间为4min。

超声的功率为400w。

采用逆向蒸发法制备的萨摩鲁泰脂质体含有萨摩鲁泰的PBS缓冲液中磷脂、萨摩鲁泰、胆固醇和药学上可接受的冷冻保护剂的质量比为（0.001～5）：（0.1～500）：（0.01～50）：（0.01～100）。

本发明提供的萨摩鲁泰脂质体的制备方法可以采用注入法。

本发明提供的萨摩鲁泰脂质体的制备方法，包括以下步骤：磷脂和胆固醇溶于乙醚或乙醇，制得药液，搅拌条件下将药液经注射器注入萨摩鲁泰的PBS缓冲液中，搅拌除去乙醚或乙醇，经高压乳匀获得脂质体溶液；取药学上可接受的冻干保护剂水溶液与脂质体溶液混合，冷冻干燥，即得。

采用注入法制备的萨摩鲁泰脂质体的粒径为50nm～200nm。

采用注入法制备的萨摩鲁泰脂质体含有萨摩鲁泰的PBS缓冲液中磷脂、萨摩鲁泰、胆固醇和药学上可接受的冷冻保护剂的质量比为（0.001～5）：（0.1～500）：（0.01～50）：（0.01～100）。

含有萨摩鲁泰的PBS缓冲液中，磷酸盐的摩尔-体积浓度为0.01mol/L，pH值为6.5。

本发明提供的萨摩鲁泰脂质体的制备方法还可以采用冷冻干燥法、超声波分散法或pH梯度法。

本发明提供的萨摩鲁泰脂质体注射剂的剂型为粉针剂或注射液。

本发明提供的萨摩鲁泰脂质体注射液中，萨摩鲁泰脂质体的含量为0.847g/L～917g/L。

本发明采用的试剂皆为普通市售品，皆可于市场购得。

其中部分试剂的英文缩写如表1所示：

表1试剂的中文名称及其英文缩写

英文缩写	中文名称
		PBS	磷酸盐缓冲液
DCM	二氯甲烷
		EPC	蛋黄卵磷脂
SPC	大豆磷脂
		DCP	磷酸二鲸蜡酯
DLPC	二月桂酰卵磷脂
		DSPC	二硬脂酰卵磷脂
DOPC	二油酰基卵磷脂
		DPPE	二棕榈酰磷脂酰乙醇胺
DPPG	二棕榈酰甘油
		DPPA	二棕榈酰磷脂酸
DPPC	二棕榈酰卵磷脂
		DLPG	二月桂酰磷脂酰甘油
DOPG	二油酰磷脂酰甘油
		DMPA	二肉豆蔻酰磷脂酸

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1薄膜分散法制备萨摩鲁泰脂质体

称取各组分：

萨摩鲁泰	7mg
		二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）	700mg
胆固醇	70mg
		甘露醇	70mg

取二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）700mg、胆固醇70mg置于圆底烧瓶中，加入10mL氯仿搅拌溶解后，真空蒸发除去氯仿，在器壁上形成均匀透明的薄膜；在氮气保护下，在圆底烧瓶中加入200μL等渗的PBS缓冲液（pH6.5,0.01mol/L磷酸盐），内含萨摩鲁泰7mg，搅拌4min，在25℃条件下放置2小时，使薄膜充分吸胀；在25℃搅拌2小时，得到大单室脂质体混悬液；使所得大单室脂质体混悬液通过高压乳匀机2次，0.20μm微孔滤膜过滤，制得小单室脂质体混悬液；将70mg甘露醇溶于10mL注射用水中，加入到萨摩鲁泰脂质体混悬液中，用注射用水定容至1000mL，经0.20μm微孔滤膜过滤，冷冻干燥制得萨摩鲁泰脂质体粉末。

实施例2薄膜分散法制备萨摩鲁泰脂质体

称取各组分：

萨摩鲁泰	70mg
		二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）	2g
胆固醇	200mg
		甘露醇	100mg

取二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）2g、胆固醇200mg置于圆底烧瓶中，加入50mL氯仿搅拌溶解后，真空蒸发除去氯仿，在器壁上形成均匀透明的薄膜；在氮气保护下，在圆底烧瓶中加入2mL等渗的PBS缓冲液（pH6.5,0.01mol/L磷酸盐），内含萨摩鲁泰70mg，搅拌4min，在25℃放置2小时，使薄膜充分吸胀；再在25℃搅拌2小时，得到大单室脂质体混悬液；所得脂质体混悬液通过高压乳匀机2次，0.20μm微孔滤膜过滤，制得小单室脂质体混悬液；将100mg甘露醇溶于10mL注射用水中，加入到萨摩鲁泰脂质体混悬液中，用注射用水定容至1000mL，经0.20μm微孔滤膜过滤，冷冻干燥制得萨摩鲁泰脂质体粉末。

实施例3薄膜分散法制备萨摩鲁泰脂质体

称取各组分：

萨摩鲁泰	700mg
		二油酰基卵磷脂	50g
胆固醇	4g
		葡萄糖	7g

取二油酰基卵磷脂50g、胆固醇4g置于圆底烧瓶中，加入300mL氯仿搅拌溶解后，真空蒸发除去氯仿，在器壁上形成均匀透明的薄膜；在氮气保护下，在圆底烧瓶中加入20mL等渗的PBS缓冲液（pH6.5,0.01mol/L磷酸盐），内含萨摩鲁泰700mg，搅拌4min，在25℃放置2小时，使薄膜充分吸胀；再在25℃搅拌2小时，得到大单室脂质体混悬液；所得脂质体混悬液通过高压乳匀机2次，0.20μm微孔滤膜过滤，制得小单室脂质体混悬液；将7g葡萄糖溶于100mL注射用水中，加入到萨摩鲁泰脂质体混悬液中，用注射用水定容至1000mL，经0.20μm微孔滤膜过滤，冷冻干燥制得萨摩鲁泰脂质体粉末。

实施例4薄膜分散法制备萨摩鲁泰脂质体

称取各组分：

萨摩鲁泰	1g
		二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）	80g
胆固醇	6g
		甘露醇	15g

取二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）80g、胆固醇6g置于圆底烧瓶中，加入400mL氯仿有机溶剂搅拌溶解后，真空蒸发除去氯仿（DCM），在器壁上形成均匀透明的薄膜；在氮气保护下，在圆底烧瓶中加入28.5mL等渗的PBS缓冲液（pH6.5,0.01mol/L磷酸盐），内含萨摩鲁泰1g，搅拌4min，在25℃放置2小时，使薄膜充分吸胀；再在25℃搅拌2小时，得到大单室脂质体混悬液；所得脂质体混悬液通过高压乳匀机2次，0.20μm微孔滤膜过滤，制得小单室脂质体混悬液；将15g甘露醇溶于150mL注射用水中，加入到萨摩鲁泰脂质体混悬液中，用注射用水定容至1000mL，经0.20μm微孔滤膜过滤，冷冻干燥制得萨摩鲁泰脂质体粉末。

实施例5薄膜分散法制备萨摩鲁泰脂质体

称取各组分：

萨摩鲁泰	7g
		二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）	700g
胆固醇	70g
		甘露醇	140g

取二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）700g、胆固醇70g置于圆底烧瓶中，加入600mL氯仿有机溶剂搅拌溶解后，真空蒸发除去氯仿（DCM），在器壁上形成均匀透明的薄膜；在氮气保护下，在圆底烧瓶中加入200mL等渗的PBS缓冲液（pH6.5,0.01mol/L磷酸盐），内含萨摩鲁泰7g，搅拌4min，在25℃放置2小时，使薄膜充分吸胀；再在25℃搅拌2小时，得到大单室脂质体混悬液；所得脂质体混悬液通过高压乳匀机2次，0.20μm微孔滤膜过滤，制得小单室脂质体混悬液；将140g甘露醇加入到萨摩鲁泰脂质体混悬液中，溶解后用注射用水定容至1000mL，经0.20μm微孔滤膜过滤，冷冻干燥制得萨摩鲁泰脂质体粉末。

实施例6逆向蒸发法制备萨摩鲁泰脂质体

称取各组分：

萨摩鲁泰	35mg
		二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）	2g
蛋黄卵磷脂	1g
		胆固醇	200mg
甘露醇	300mg
		海藻糖	100mg

将二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）2g、蛋黄卵磷脂1g、胆固醇200mg溶于50mL氯仿和乙醚（氯仿与乙醚的体积比为4:1）混合溶剂中，搅拌溶解；加入1mL等渗的PBS缓冲液（pH6.5,0.01mol/L磷酸盐），内含萨摩鲁泰35mg，超声处理4min（处理0.9秒，间歇0.9秒，功率为400W）；在水浴中减压旋转蒸发至呈凝胶状，漩涡振荡使凝胶转相，继续蒸发除尽氯仿和乙醚，制得水性混悬液；超速离心法除去游离药物，沉淀用注射用水洗三次，得沉淀用PBS缓冲液稀释；将300mg甘露醇和100mg海藻糖溶于50mL注射用水中，加入到萨摩鲁泰脂质体混悬液中，注射用水定容至1000mL，经0.20μm微孔滤膜过滤，冷冻干燥制得萨摩鲁泰脂质体粉末。

实施例7逆向蒸发法制备萨摩鲁泰脂质体

称取各组分：

萨摩鲁泰	140mg
		蛋黄卵磷脂	7g
大豆磷脂	7g

胆固醇	1g
		甘露醇	1.5g
蔗糖	1g

将蛋黄卵磷脂7g、大豆磷脂7g、胆固醇1g溶于100mL氯仿和乙醚（氯仿与乙醚的体积比为4:1）混合溶剂中溶解，搅拌溶解；加入4mL等渗的PBS缓冲液（pH6.5,0.01mol/L磷酸盐），内含萨摩鲁泰140mg，水溶液和有机溶剂体积比为1:4，超声处理4min（处理0.9秒，间歇0.9秒，功率为400W）；在水浴中减压旋转蒸发至呈凝胶状，漩涡振荡使凝胶转相，继续蒸发除尽氯仿和乙醚，制得水性混悬液；超速离心法除去游离药物，沉淀用注射用水洗三次，得沉淀用PBS缓冲液稀释；将1.5g甘露醇和1g蔗糖溶于50mL注射用水中，加入到萨摩鲁泰脂质体混悬液中，注射用水定容至1000mL，经0.20μm微孔滤膜过滤，冷冻干燥制得萨摩鲁泰脂质体粉末。

实施例8逆向蒸发法制备萨摩鲁泰脂质体

称取各组分：

萨摩鲁泰	500mg
		脑磷脂	30g
二硬脂酰卵磷脂	10g
		胆固醇	3g
麦芽糖	3g
		甘氨酸	2g

将脑磷脂30g、二硬脂酰卵磷脂10g、胆固醇3g溶于300mL氯仿和乙醚（氯仿与乙醚的体积比为4:1）混合溶剂中溶解，搅拌溶解；加入14.3mL等渗的PBS缓冲液（pH6.5,0.01mol/L磷酸盐），内含萨摩鲁泰500mg，超声处理4min（处理0.9秒，间歇0.9秒，功率为400W）；在水浴中减压旋转蒸发至呈凝胶状，漩涡振荡使凝胶转相，继续蒸发除尽氯仿和乙醚，制得水性混悬液；超速离心法除去游离药物，沉淀用注射用水洗三次，得沉淀用PBS缓冲液稀释；将3g麦芽糖和2g甘氨酸溶于100mL注射用水中，加入到萨摩鲁泰脂质体混悬液中，注射用水定容至1000mL，经0.20μm微孔滤膜过滤，冷冻干燥制得萨摩鲁泰脂质体粉末。

实施例9逆向蒸发法制备萨摩鲁泰脂质体

称取各组分：

萨摩鲁泰	5g
		二棕榈酰磷脂酰乙醇胺	200g
二棕榈酰甘油	100g
		胆固醇	30g
麦芽糖	20g
		甘氨酸	10g

将二棕榈酰磷脂酰乙醇胺200g、二棕榈酰甘油100g、胆固醇30g溶于500mL氯仿和乙醚（氯仿与乙醚的体积比为4:1）混合溶剂中溶解，搅拌溶解；加入143mL等渗的PBS缓冲液（pH6.5,0.01mol/L磷酸盐），内含萨摩鲁泰5g，超声处理4min（处理0.9秒，间歇0.9秒，功率为400W）；在水浴中减压旋转蒸发至呈凝胶状，漩涡振荡使凝胶转相，继续蒸发除尽氯仿和乙醚，制得水性混悬液；超速离心法除去游离药物，沉淀用注射用水洗三次，得沉淀用PBS缓冲液稀释；将20g麦芽糖和10g甘氨酸溶于150mL注射用水中，加入到萨摩鲁泰脂质体混悬液中，注射用水定容至1000mL，经0.20μm微孔滤膜过滤，冷冻干燥制得萨摩鲁泰脂质体粉末。

实施例10注入法制备萨摩鲁泰脂质体

称取各组分：

萨摩鲁泰	10mg
		二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）	700mg
磷酸二鲸蜡酯（DCP）	200mg
		胆固醇	100mg
甘露醇	100mg
		乳糖	50mg

取二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）700mg、磷酸二鲸蜡酯（DCP）200mg、胆固醇100mg共溶于50mL乙醚中，搅拌溶解；于搅拌条件下将此混合溶液经注射器缓慢注入285μL50℃等渗的PBS缓冲液（pH6.5,0.01mol/L磷酸盐）中，内含萨摩鲁泰10mg；不断搅拌至乙醚除尽为止，通过高压乳匀机2次，每次30min，即得脂质体溶液；将100mg甘露醇和50mg乳糖溶于10mL注射用水中，加入到萨摩鲁泰脂质体混悬液中，用注射用水定容至1000mL，经0.20μm微孔滤膜过滤，冷冻干燥制得萨摩鲁泰脂质体粉末。

实施例11注入法制备萨摩鲁泰脂质体

称取各组分：

萨摩鲁泰	100mg
		二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）	5g
二月桂酰卵磷脂（DLPC）	5g
		胆固醇	1g

甘露醇	1g
		乳糖	1g

称取二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）5g、二月桂酰卵磷脂（DLPC）5g、胆固醇1g共溶于100mL乙醇中，搅拌溶解；于搅拌条件下将此混合溶液经注射器缓慢注入2.85mL50℃等渗的PBS缓冲液（pH6.5,0.01mol/L磷酸盐），内含萨摩鲁泰100mg；不断搅拌至乙醇除尽为止，通过高压乳匀机2次，每次30min，即得脂质体溶液；将1g甘露醇和1g乳糖溶于50mL注射用水中，加入到萨摩鲁泰脂质体混悬液中，注射用水定容至1000mL，经0.20μm微孔滤膜过滤，冷冻干燥制得萨摩鲁泰脂质体粉末。

实施例12注入法制备萨摩鲁泰脂质体

称取各组分：

萨摩鲁泰	800mg
		二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）	50g
二月桂酰磷脂酰甘油	20g
		胆固醇	6g
甘露醇	10g

称取二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）50g、二月桂酰磷脂酰甘油20g、胆固醇6g共溶于适量乙醇中，搅拌溶解；于搅拌条件下将此混合溶液经注射器缓慢注入23mL50℃等渗的PBS缓冲液（pH6.5,0.01mol/L磷酸盐），内含萨摩鲁泰800mg；不断搅拌至乙醇除尽为止，通过高压乳匀机2次，每次30min，即得脂质体溶液；将10g甘露醇溶于100mL注射用水中，加入到萨摩鲁泰脂质体混悬液中，注射用水定容至1000mL，经0.20μm微孔滤膜过滤，分装成冷冻干燥制得萨摩鲁泰脂质体粉末。

实施例13注入法制备萨摩鲁泰脂质体

称取各组分：

萨摩鲁泰	2g
		二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）	150g
二肉豆蔻酰磷脂酸	30g
		胆固醇	17g
甘露醇	35g

称取二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）150g、二肉豆蔻酰磷脂酸30g、胆固醇17g共溶于适量乙醇中，搅拌溶解；于搅拌条件下将此混合溶液经注射器缓慢注入57mL50℃等渗的PBS缓冲液（pH6.5,0.01mol/L磷酸盐），内含萨摩鲁泰2g；不断搅拌至乙醇除尽为止，通过高压乳匀机2次，每次30min，即得脂质体溶液；将35g甘露醇溶于150mL注射用水中，加入到萨摩鲁泰脂质体混悬液中，注射用水定容至1000mL，经0.20μm微孔滤膜过滤，冷冻干燥制得萨摩鲁泰脂质体粉末。

实施例14萨摩鲁泰脂质体注射用粉针剂的制备

取本发明实施例1～13中任一项制备的萨摩鲁泰脂质体在无菌条件下分装即得。

实施例15萨摩鲁泰脂质体注射液的制备

取本发明实施例1～13中任一项制备的萨摩鲁泰脂质体在无菌条件以无菌的生理盐水溶解，使萨摩鲁泰脂质体在生理盐水中的浓度为0.847g/L～917g/L，灭菌、分装，即得。

实施例16本发明提供的萨摩鲁泰脂质体形态检测

采用电镜将本发明实施例1～13中任一项制备的萨摩鲁泰脂质体放大2×10⁵倍，其中，本发明实施例5制备的萨摩鲁泰脂质体电镜图如图1所示，观察发现，本发明提供的方法制备的萨摩鲁泰脂质体成球形或近球形，无成团聚集，分布均匀。本发明其他实施例制备的萨摩鲁泰脂质体的检测结果与此相似。

实施例17本发明提供的萨摩鲁泰脂质体Zeta电位、平均粒径和粒径分布检测

采用Zeta电位及粒度分布检测仪对本发明实施例1～13中任一项制备的萨摩鲁泰脂质体的Zeta电位、平均粒径和粒径分布进行检测，其中，对本发明实施例1、4、7、10制备的萨摩鲁泰脂质体的检测结果如表2所示：

表2对萨摩鲁泰脂质体Zeta电位、平均粒径和粒径分布的检测结果

实施例	Zeta电位/mV	平均粒径/nm	粒径分布/nm
				1	-21.24	132.57	50～200
4	-19.70	148.94	60～200
				7	-19.59	152.02	70～200
10	-18.32	156.35	80～200

本发明其他实施例制备的萨摩鲁泰脂质体的检测结果与此相似。

实施例18本发明提供的萨摩鲁泰脂质体的包封率和载药量检测

首先，测定药物总量：

取脂质体样品10g用10mL无水乙醇溶解摇匀，取50μL高效液相色谱法测定药物总量（W1）；

然后，测定游离药物含量：

取脂质体样品10g加磷酸盐缓冲液10mL，溶解均匀，3×104r·min^-1超速离心20min，离心三次，合并上清液，高效液相色谱法检测游离药物含量（W2）。

包封率的计算公式为：

载药量的计算公式为：

其中，对本发明实施例1、4、7、10制备的萨摩鲁泰脂质体包封率及载药量的检测结果如表3所示：

表3本发明制备的萨摩鲁泰脂质体包封率及载药量的检测结果

实施例	包封率	载药量
			1	88.76%	10.13%
4	88.12%	9.98%
			7	86.09%	10.31%
10	85.45%	9.18%

由表3可知，本发明实施例1、4、7、10制备的萨摩鲁泰脂质体包封率大于85%，载药量大于9.18%。对本发明其他实施例制备的萨摩鲁泰脂质体包封率及载药量的检测结果与此相似。

实施例19本发明提供的萨摩鲁泰脂质体的包封率和载药量检测

渗漏率表示脂质体产品在储存期间包封率的变化情况，是脂质体不稳定性的主要指标，将本发明实施例1、4、7、10制备的萨摩鲁泰脂质体在室温条件下，放置时间为0天、30天、60天、90天、180天，采用高效液相色谱法按时间点监测渗漏率，渗漏率由以下公式计算：

其中，对本发明实施例1、4、7、10制备的萨摩鲁泰脂质体渗透率的检测结果如表4所示：

表4本发明制备的萨摩鲁泰脂质体的渗透率检测结果

由表4可知，本发明实施例1、4、7、10制备的萨摩鲁泰脂质体渗透率在放置180天后，仍不足0.7%，可见，本四个实例的渗漏率变化不大，说明所制备的萨摩鲁泰脂质体较稳定。对本发明其他实施例制备的萨摩鲁泰脂质体包封率及载药量的检测结果与此相似。

实施例20本发明提供的萨摩鲁泰脂质体的体内药代动力学检测

选Wistar大鼠，雌雄各半，体重为250g±20g，随机分为市售普通萨摩鲁泰注射液注射组和本发明提供的萨摩鲁泰脂质体注射液注射组，每组6只。分别灌注市售萨摩鲁泰普通注射液和本发明实施例15制备萨摩鲁泰脂质体注射液，每千克动物体重给药160μg，即给药量为160μg/kg，分别在0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h的时间点自大鼠眼眶静脉取血0.3mL，离心，取血浆0.1mL处理，高效液相色谱法测定药物浓度。本发明实施例15制备萨摩鲁泰脂质体注射液与市售普通萨摩鲁泰注射液在大鼠体内平均血药浓度-时间曲线图见图2。其中，曲线1示注射了本发明实施例15制备萨摩鲁泰脂质体注射液后Wistar大鼠眼眶静脉血中血药浓度随时间变化曲线；曲线2示注射了市售萨摩鲁泰普通注射液后Wistar大鼠眼眶静脉血中血药浓度随时间变化曲线。如图可知，本发明提供的萨摩鲁泰脂质体注射液制剂与萨摩鲁泰普通注射液制剂相比，相对生物利用度提高达40.57%。

实施例21本发明提供的萨摩鲁泰脂质体对肠胃道、胰腺、肾脏的损伤试验

取Wistar大鼠270只，雌雄各半，体重为250g±20g。随机分为对照组（CK）、市售普通萨摩鲁泰注射液注射组（A组）和本发明提供的萨摩鲁泰脂质体注射液注射组（B组），每组90只。对照组给予生理盐水，A组注射市售普通萨摩鲁泰注射液，B组注射本发明实施例14提供的萨摩鲁泰脂质体注射用粉针剂。注射量为：每只大鼠每周注射一次，每次注射取一支冻干粉针，用1mL灭菌生理盐水溶解注射，每7天，在三组中分别随机挑选出30只大鼠处死，取胃组织、胰腺组织和肾脏组织，用伊红-苏木素（HE）染色观察组织粘膜的损伤情况，连续观察21天。观察结果如表5所示：

表5大鼠连续用药21天时胃组织、胰腺组织和肾脏组织损伤情况

观察结果为：对照组大鼠的胃组织、胰腺组织和肾脏组织，层次清楚，排列整齐，粘膜层完整，无充血、水肿、渗出和糜烂等损伤情况。A组大鼠的胃组织、胰腺组织和肾脏组织在连续用药7天时部分已出现明显的粘膜层损伤，并伴有渗出和糜烂。而B组大鼠胃组织、胰腺组织和肾脏组织在连续用药21天时仍层次清楚，排列整齐，粘膜层仅出现轻微的损伤，轻度糜烂。

表明：本发明提供的萨摩鲁泰脂质体注射液比市售普通萨摩鲁泰注射液在胃组织损伤、胰腺组织损伤和肾脏组织损伤试验中出现数量更少，发生率更低。其中，对胃组织损伤的发生率降低10.03%，对肾脏组织的损伤的发生率及胰腺组织损伤的发生率分别降低10%。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种萨摩鲁泰脂质体，其特征在于，包括：磷脂、萨摩鲁泰、胆固醇和药学上可接受的冷冻保护剂，所述萨摩鲁泰脂质体的粒径为50nm～200nm。

2.根据权利要求1所述的萨摩鲁泰脂质体，其特征在于，所述萨摩鲁泰、磷脂、胆固醇和药学上可接受的冷冻保护剂的质量比为（0.001～5）：（0.1～500）：（0.01～50）：（0.01～100）。

3.根据权利要求1所述的萨摩鲁泰脂质体，其特征在于，所述磷脂与萨摩鲁泰的质量比为（100～1）:1。

4.根据权利要求1所述的萨摩鲁泰脂质体，其特征在于，所述磷脂为蛋黄卵磷脂、脑磷脂、大豆磷脂、磷酸二鲸蜡酯、二月桂酰卵磷脂、二硬脂酰卵磷脂、二油酰基卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰甘油、二棕榈酰磷脂酸、二棕榈酰卵磷脂、二月桂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酸中一种或两者以上的混合物。

5.根据权利要求1所述的萨摩鲁泰脂质体，其特征在于，所述磷脂为二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油中一种或两者以上的混合物。

6.根据权利要求1所述的萨摩鲁泰脂质体，其特征在于，所述药学上可接受的冷冻保护剂为甘露醇、海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、甘氨酸中一种或两者以上的混合物。

7.一种如权利要求1～6任一项所述萨摩鲁泰脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：取磷脂、胆固醇溶于氯仿后，旋转蒸发去除氯仿，加入含有萨摩鲁泰的PBS缓冲液，搅拌状态下与药学上可接受的冻干保护剂水溶液混合，经冷冻干燥，即得。

8.一种如权利要求1～6任一项所述萨摩鲁泰脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：取磷脂和胆固醇溶于氯仿和/或乙醚，与萨摩鲁泰水溶液混合，经超声制得W/O型乳液；经第一减压蒸发除去W/O型乳液中的氯仿或乙醚后滴加PBS缓冲液，经第二减压蒸发制得水性混悬液；除去未包入的药物后与药学上可接受的冻干保护剂水溶液混合，冷冻干燥，即得。

9.一种如权利要求1～6任一项所述萨摩鲁泰脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：取磷脂和胆固醇溶于乙醚或乙醇，制得药液，搅拌条件下将药液经注射器注入萨摩鲁泰的PBS缓冲液中，搅拌除去乙醚或乙醇，经高压乳匀获得脂质体溶液；取药学上可接受的冻干保护剂水溶液与脂质体溶液混合，冷冻干燥，即得。

10.一种萨摩鲁泰脂质体注射剂，其特征在于，包括如权利要求1～6任一项所述的萨摩鲁泰脂质体。