发明内容
因此,本发明的目的在于克服上述缺陷,提供了I-D1-6和L-脯氨酸的 共结晶I,该共结晶I具有稳定的外观状态,有助于进一步提高I-D1-6的纯度,并且提高了保存稳定性,可以稳定地供给制备原料药,并且还提供了该晶型的制备方法和应用。
该共结晶I的化学结构式如下:
本发明提供了一种(1S)-1-[4-氯-3-(4-乙氧基苄基)苯基]-1,6-二脱氧-D-葡萄糖(I-D1-6)和L-脯氨酸的共结晶I,以2θ角度表示的X-射线粉末衍射(PXRD,Powder X-ray Diffraction)在4.74、7.32、9.74、14.28、16.46、17.60、18.70、19.52、20.62、21.58、23.02、23.50、26.30、27.90附近处具有衍射峰。
根据本发明的共结晶I,其中,其X-射线粉末衍射在晶面间距d值为18.63、12.07、9.07、6.20、5.38、5.04、4.74、4.54、4.30、4.11、3.86、3.78、3.39、的位置附近处具有衍射峰。优选地,所述晶面间距d值与2θ角度之间可以具有如下对应关系:
。
根据本发明的共结晶I,其中,其差热分析(DTA,Differential Thermal Analysis)图谱可以在170℃处具有吸热峰。
根据本发明的共结晶I,其中,其X-射线粉末衍射图谱基本上如图2所示。
本发明还提供了制备上述共结晶I的方法,该方法包括:将L-脯氨酸和水溶于乙醇,得到含有L-脯氨酸的混合溶液,然后在搅拌下向所述混合溶液加入(1S)-1-[4-氯-3-(4-乙氧基苄基)苯基]-1,6-二脱氧-D-葡萄糖的乙醇溶液,继续搅拌析晶,抽滤收集结晶,然后干燥,得到共结晶I。
根据本发明的方法,其中,在所述含有L-脯氨酸的混合溶液中,L-脯氨酸与水的质量体积比(g/ml)为4:0~4,优选为4:3~3.5;L-脯氨酸与乙醇的质量体积比(g/ml)为4:30~60,优选为4:33~40;优选地,在所述(1S)-1-[4-氯-3-(4-乙氧基苄基)苯基]-1,6-二脱氧-D-葡萄糖的乙醇溶液中,(1S)-1-[4-氯-3-(4-乙氧基苄基)苯基]-1,6-二脱氧-D-葡萄糖与乙醇的质量体积比(g/ml)为1:15~25,优选为1:20;更优选地,所述(1S)-1-[4-氯-3-(4-乙氧基苄基)苯基]-1,6-二脱氧-D-葡萄糖与所述L-脯氨酸的质量比(g/g)为10:3~6,优选为10:6。
优选地,上述操作均可在室温下进行,例如在室温下搅拌析晶等。该室温例如为25~35℃,可以为25~27℃,可优选为25℃。
优选地,使用真空油泵进行干燥操作,干燥时间为4~8小时,优选为5小时。
本发明还提供了一种药物组合物,所述药物组合物包含有效量的本发明的共结晶I和一种或多种药学上可接受的辅料。所述药学上可接受的辅料可以是保持药物剂型的基质或辅料,通过根据不同的药剂来选用或组合物使用,可选择性地包括载体、赋形剂、稀释剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、矫味剂、防腐剂、包衣材料等。赋形剂包括例如微晶纤维素、乳糖、预胶化淀粉、淀粉、糊精、磷酸钙、蔗糖、右旋糖酐、甘露醇、山梨醇、葡萄糖、果糖、水、聚乙二醇、丙二醇、甘油、环糊精、环糊精衍生物中的一种或几种的组合物。填充剂包括例如乳糖、蔗糖、糊精、淀粉、预胶化淀粉、甘露醇、山梨醇、磷酸氢钙、硫酸钙、碳酸钙、微晶纤维素的一种或几种的组合物。粘合剂包括例如蔗糖、淀粉、聚维酮、羧甲基纤维素钠、羟丙甲纤维素、羟丙纤维素、甲基纤维素、聚乙二醇、药用乙醇、水的一种或几种的组合物。崩解剂包括例如淀粉、交联聚微酮、交联羧甲基 纤维素钠、低取代羟丙基纤维素、羧甲纤维素钠、泡腾崩解剂的一种或几种的组合物。
根据本发明的药物组合物,其中,所述药物组合物可以为固体口服制剂、液体口服制剂或注射剂。优选地,所述固体口服制剂包括分散片、肠溶片、咀嚼片、口崩片、胶囊或颗粒剂;所述液体口服制剂包括口服溶液剂;所述注射剂包括注射用水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。
本发明还提供了本发明的共结晶I或按照本发明的方法制备的共结晶I在制备用于治疗糖尿病的药物组合物中的用途。本发明人已发现I-D1-6具有SGLT2酶的抑制作用,可作为有效成分用于制备糖尿病方面的治疗药物。并且通过体外对人源化SGLT2的抑制和大鼠尿糖排泄模型验证证实,本发明的I-D1-6和L-脯氨酸的共结晶I具有较高的SGLT2酶抑制活性。
本发明所述的I-D1-6的共结晶I在相当宽的剂量范围内是有效的。例如每天服用的剂量约在1mg~300mg/人范围内,分为一次或数次给药。实际服用本发明所述的I-D1-6和L-脯氨酸的共结晶I的剂量可由医生根据有关的情况来决定。这些情况包括:被治疗者的身体状态、给药途径、年龄、体重、对药物的个体反应,症状的严重程度等。
与通过直接蒸干溶液等方式制得的介于泡沫状和正常固体之间的I-D1-6样品相比,本发明所制备的I-D1-6和L-脯氨酸的共结晶I在批次间具有良好的外观稳定性(是白色固体,而非具有一定程度的泡沫状特征)和重现性,并且纯度进一步提高。例如,本发明人通过试验发现,该共结晶I在连续制备17批的批次范围内,其外观是稳定的,均是正常的白色固体,且经过PXRD和DTA分析每批均是稳定的共结晶I。另外,各批经过HPLC分析,共结晶I的纯度为99.49%~99.64%,均显著高于I-D1-6原料的纯度99.20%,且杂质个数比原料少(原料有7个杂质,所有批次的共结晶I均稳定在3个杂质)。同时,各批次经1H NMR测试发现共结晶I中的I-D1-6与L-脯氨酸的摩尔比例均能稳定地保持为1:1。
此外,本发明的I-D1-6和L-脯氨酸的共结晶I还具有良好的保存稳定性。例如,本发明人通过实验验证,该共结晶I在为期两周的对光、热、水蒸气的稳定性实验中,其杂质没有明显增加,且共结晶I中的I-D1-6与L-脯氨酸的摩尔比例均能稳定地保持为1:1,因而具有良好的贮存稳定性。
基于上述特性,本发明的I-D1-6和L-脯氨酸的共结晶I能够作为I-D1-6原料药的稳定供给源,更适于工业化生产。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明,但是,应当理解为,这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用,而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的,但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚,在上下文中,如果未特别说明,本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
结合以下实施例,本发明对共结晶I的测定条件如下:
X-射线粉末衍射(PXRD)条件:
仪器:日本理学D/Max-2500型18kW
衍射仪:多晶粉末衍射仪
靶:Cu-Kα辐射,2θ=3~50°
管压:40KV
管流:100mA
扫描速度:8℃/min
晶体石墨单色器
DS/SS=1°
RS:0.3mm
差热分析(DTA)条件:
仪器:日本理学PTC-10A TG-DTA分析仪
升温速率:10°C/min
扫描温度范围:0~300°C
参比物:Al2O3
样品量:5.0 mg的待测共结晶I
高效液相色谱(HPLC)条件:
色谱柱:C18,150 mm×4.6 mm,5um
流动相:甲醇:水:乙酸 = 70:30:0.25
波长:230 nm
流速:0.8 ml/min
进样量:10 uL
柱温:35℃
仪器:
普析通用L6液相色谱仪
日立 L-7250 自动进样器
普析通用LC Win色谱工作站
核磁共振(NMR)条件:
仪器:Bruker公司AV400型核磁共振仪
溶剂:DMSO-d6
实施例1
本实施例用于说明本发明I-D1-6和L-脯氨酸的共结晶I及其制备过程。制备I-D1-6作为原料。可以参照以下反应流程:
具体制备过程可以为:
将40.9g(100mmol)上式化合物1溶于300mL干燥的DMF中,冰水浴冷却下搅拌,加入27.2g(400mmol)咪唑,而后在15分钟内慢慢滴加16.6g(110mmol)TBDMSCl(叔丁基二甲基氯化硅)。加完后,反应化合物在室温下继续搅拌3小时。反应混合物用1500mL二氯甲烷稀释,用500mL×3的饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥。过滤除去干燥剂,滤液在旋转蒸发仪上蒸去溶剂,得到的残余物经过硅胶柱层析,得到纯品2,为白色泡沫状固体。
将41.9g(80mmol)化合物2溶于300mL吡啶中,冰水浴冷却下搅拌。慢慢滴加150mL醋酸酐,而后再加入1g DMAP(4-二甲氨基吡啶)。加完后,反应混合物在室温下继续搅拌过夜。反应混合物倾倒到2000mL冰水中,搅拌,用500mL×3二氯甲烷萃取。合并有机相,依次用500mL5%的稀盐酸和1000mL饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥。过滤除去干燥剂,滤液在旋转蒸发仪上蒸去溶剂,得到的残余物经过硅胶柱层析,得到纯品3,为白色固体,熔点101-102°C。
将39.0g(60mmol)化合物3溶于500mL90%的醋酸水溶液中,在45°C下搅拌5小时,而后倾倒到2000mL冰水中,用饱和NaHCO3溶液调节至pH=7-8。用500mL×3二氯甲烷萃取。合并有机相,用1000mL饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥。过滤除去干燥剂,滤液在旋转蒸发仪上蒸去溶剂,得到的残余物经过硅胶柱层析,得到纯品4,为白色固体,熔点120-121°C。
将126.9g(500mmol)碘溶解到500mL干燥的二氯甲烷中,冰水浴冷却下搅拌,慢慢加入131.1g(500mmol)三苯基膦,加完后反应化合物继续搅拌 10分钟。再慢慢加入136.2g(2mol)咪唑,加完后继续搅拌一小时。往上述所得体系中加入26.7g(50mmol)化合物5,加完后反应化合物室温下搅拌过夜。反应混合物用2000mL二氯甲烷稀释,饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥。过滤除去干燥剂,滤液在旋转蒸发仪上蒸去溶剂,得到的残余物经过硅胶柱层析,得到纯品5,为白色固体,熔点141-142°C。
将19.3g(30mmol)化合物5、29.1g(100mmol)n-Bu3SnH和4.9g(30mmol)AIBN溶解到200mL干燥的苯中,在氮气气氛下升温回流3小时。反应混合物冷却后用1000mL二氯甲烷稀释,饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥。过滤除去干燥剂,滤液在旋转蒸发仪上蒸去溶剂,得到的残余物经过硅胶柱层析,得到纯品6,为白色泡沫状固体。
将100mL干燥的无水甲醇中加入0.5g金属钠,室温氮气保护下搅拌,直到金属钠消失。而后加入5.2g(10mmol)化合物6,室温下继续搅拌3小时。往反应体系中加入5g强酸性阳离子交换树脂,室温下搅拌过夜,直到反应混合物pH=7。抽滤除去树脂,滤液在旋转蒸发仪上蒸干,得到的残余物在真空油泵上进一步干燥,得到产物I-D1-6,为白色泡沫状固体。其DTA图谱如图4所示,PXRD图谱如图5所示。
L-脯氨酸的DTA图谱和PXRD图谱分别如图6、图7所示。
取1.00g(2.5mmol)按照上述方法制得的化合物I-D1-6,在微热下溶于20mL无水乙醇中,得到I-D1-6的乙醇溶液。另外,向50mL的圆底烧瓶中加入0.60g(5.2mmol)L-脯氨酸、0.5mL水和5mL无水乙醇,室温下搅拌,得到澄清的混合溶液。将上述I-D1-6的乙醇溶液在搅拌下慢慢加入到含有L-脯氨酸的所述混合溶液中,得到澄清的溶液。将该溶液在室温下继续搅拌过夜。得到一白色晶浆状体系。抽滤收集结晶,并在真空油泵上30°C下干燥5小时,得到白色固体0.83g。
该白色固体产品(共结晶I)的差热分析(DTA)图谱和X-射线衍射(PXRD)图谱分别如图1和图2所示,其1H NMR图谱如图3所示,可确定本实施例制得的白色固体为本发明的I-D1-6和L-脯氨酸的共结晶I。
实施例2
本实施例用于说明本发明I-D1-6和L-脯氨酸的共结晶I及其制备过程。
按照实施例1中相同的方法制备化合物I-D1-6作为原料。
取1.00g(2.5mmol)上述制得的化合物I-D1-6,在微热下溶于20mL无水乙醇中,得到I-D1-6的乙醇溶液。另外,向50mL的圆底烧瓶中加入0.40g(3.5mmol)L-脯氨酸、0.3mL水和4mL无水乙醇,室温下搅拌,得到 澄清的混合溶液。将上述I-D1-6的乙醇溶液在搅拌下慢慢加入到含有L-脯氨酸的所述混合溶液中,得到澄清的溶液。将该溶液在室温下继续搅拌过夜。得到一白色晶浆状体系。抽滤收集结晶,并在真空油泵上30°C下干燥4小时,得到白色固体0.80g。
通过DTA和PXRD确定该白色固体为I-D1-6和L-脯氨酸的共结晶I。其DTA图谱在170°C附近具有吸收峰。
实施例3
本实施例用于说明本发明I-D1-6和L-脯氨酸的共结晶I及其制备过程。
按照实施例1中相同的方法制备化合物I-D1-6作为原料。
取1.00g(2.5mmol)上述制得的化合物I-D1-6,在微热下溶于20mL无水乙醇中,得到I-D1-6的乙醇溶液。另外,向50mL的圆底烧瓶中加入0.29g(2.5mmol)L-脯氨酸、0.3mL水和4mL无水乙醇,室温下搅拌,得到澄清的混合溶液。将上述I-D1-6的乙醇溶液在搅拌下慢慢加入到含有L-脯氨酸的所述混合溶液中,得到澄清的溶液。将该溶液在室温下继续搅拌过夜。得到一白色晶浆状体系。抽滤收集结晶,并在真空油泵上30°C下干燥5小时,得到白色固体0.79g。
通过DTA和PXRD确定该白色固体为I-D1-6和L-脯氨酸的共结晶I。其DTA图谱在170°C附近具有吸收峰。
实施例4
本实施例用于说明本发明I-D1-6和L-脯氨酸的共结晶I及其制备过程。
按照实施例1中相同的方法制备化合物I-D1-6作为原料。
取1.00g(2.5mmol)上述制得的化合物I-D1-6,在微热下溶于20mL无水乙醇中,得到I-D1-6的乙醇溶液。另外,向50mL的圆底烧瓶中加入0.40g(3.5mmol)L-脯氨酸和6mL无水乙醇,40℃下搅拌,得到澄清的混合溶液。将上述I-D1-6的乙醇溶液在搅拌下慢慢加入到含有L-脯氨酸的所述混合溶液中,得到澄清的溶液。将该溶液自然降至室温并继续搅拌过夜。得到一白色晶浆状体系。抽滤收集结晶,并在真空油泵上30°C下干燥8小时,得到白色固体0.80g。
通过DTA和PXRD确定该白色固体为I-D1-6和L-脯氨酸的共结晶I。其DTA图谱在170°C附近具有吸收峰。
实施例5
本实施例用于说明含有本发明的I-D1-6和L-脯氨酸的共结晶I的片剂的制备。
处方 用量/片
实施例1制得的样品 7mg
微晶纤维素 80mg
预胶化淀粉 70mg
聚乙烯吡咯烷酮 6mg
羧甲基淀粉钠盐 5mg
硬脂酸镁 2mg
滑石粉 2mg
将实施例1制得的样品共结晶I、预胶化淀粉和微晶纤维素过筛,以处方量充分混合,加入含有处方量聚乙烯吡咯烷酮的溶液,混合,制软材,过筛,制湿颗粒,于40~50℃干燥;然后将羧甲基淀粉钠盐、硬脂酸镁和滑石粉预先过筛,以处方量加入到上述干燥后的颗粒中,压片,即得含有I-D1-6和L-脯氨酸的共结晶I的片剂。
试验例1
按照文献(Meng,W.et al,J.Med.Chem.,2008,51,1145-1149)记载的方法测定实施例1制得的I-D1-6和L-脯氨酸的共结晶I对SGLT2和SGLT1抑制的IC50值。测定结果如下表1所示:
表1I-D1-6和L-脯氨酸的共结晶I对SGLT2和SGLT1抑制的IC50值
根据上表中IC50值的测定结果可知,I-D1-6和L-脯氨酸的共结晶I为强选择性的SGLT2抑制剂。
试验例2
采用HPLC测定实施例1制得的I-D1-6和L-脯氨酸的共结晶I的纯度,其纯度为99.49%,共有3个小的杂质峰(分别为0.27%、0.07%和0.17%)。而用于制备共结晶I的I-D1-6原料测得纯度为99.11%,共有7个小的杂质峰(与共结晶I中对应的杂质分别为0.32%、0.08%和0.19%,另有4个多余杂质0.11%、0.10%、0.03%和0.06%)。由此可知共结晶I的纯度明显提高,更适合用于药品的批量生产。
试验例3
将实施例1制得的I-D1-6和L-脯氨酸的共结晶I与作为对比的I-D1-6原料进行影响因素试验,分别在光照(自然太阳光,平均约为80000Lx)、高温(45℃)和高湿(30℃下的30%相对湿度)的条件下放置两周(14天),与第0天比较外观、杂质个数及杂质量(以HPLC测定)。试验结果分别见表2~4。
表2光照稳定性试验数据
表3高温稳定性试验数据
表4高湿稳定性试验数据
由表2~4可知,在为期两周的光照、高温、高湿条件下的稳定性试验中,本发明共结晶I的外观未发生可见的变化,晶型保持稳定,同时通过HPLC测定,其杂质数和杂质总量也未明显增加,因而与I-D1-6原料相比,共结晶I具有更好的贮存稳定性,可以作为I-D1-6原料药的稳定来源。
试验例4
通过大鼠尿糖排泄模型测定I-D1-6和L-脯氨酸的共结晶I对SGLT2的抑制能力。
正常SD大鼠高脂高糖喂养一个月后,用链佐霉素小剂量多次腹腔注射造模(2型糖尿病模型),测定造模前后血糖含量。造模成功后将造模大鼠按照24小时尿糖量和体重随机分组(8只/组),分别为一组空白组(给予等体积 0.5%CMC钠溶液)和待测化合物组(8mg/kg)。各组大鼠实验前禁食16小时。灌胃给予实验大鼠实施例1制得的I-D1-6和L-脯氨酸的共结晶I0.5h后,再灌胃给予葡萄糖(2g/kg)。收集给药后0~12h时间段的尿液,用葡萄糖氧化酶法测定各时间段的尿糖值。实验测得共结晶I在该实验中能诱导产生912mg尿糖/200g体重,说明共结晶I具有较强的尿糖排出能力。
尽管本发明已进行了一定程度的描述,明显地,在不脱离本发明的精神和范围的条件下,可进行各个条件的适当变化。可以理解,本发明不限于所述实施方案,而归于权利要求的范围,其包括所述每个因素的等同替换。