CN104042605A

CN104042605A - Egcg在制备防治心肌能量代谢障碍的食品和药物的应用

Info

Publication number: CN104042605A
Application number: CN201410024805.XA
Authority: CN
Inventors: 刘健康; 龙建纲; 刘甲; 唐颖; 冯智辉; 严炯
Original assignee: Xian Jiaotong University
Current assignee: Xian Jiaotong University
Priority date: 2014-01-20
Filing date: 2014-01-20
Publication date: 2014-09-17

Abstract

EGCG在制备防治心肌能量代谢障碍的食品和药物的应用，EGCG的作用靶点为细胞内FoxO1信号通路，可抑制心肌能量代谢障碍引发的心肌细胞自噬，缓解心肌线粒体丢失，EGCG对心肌细胞的有效作用浓度为20uM；或按个体体重的摄取量为5-10mg/kg/日，能够调节心肌能量代谢能力，恢复能量代谢障碍所致的心肌细胞功能不全；还用于抑制心肌细胞H9c2糖代谢障碍相关的自噬上调；还用于抑制心肌细胞H9c2糖代谢障碍相关的氧化应激；还用于降低心肌细胞H9c2糖代谢障碍相关的胰岛素抵抗；本发明即可以食品功能因子、也可以药物形式用于心肌能量代谢障碍、心肌胰岛素抵抗、高血糖等因素所致心肌损伤等疾病的预防与治疗。

Description

EGCG在制备防治心肌能量代谢障碍的食品和药物的应用

技术领域

本发明涉及生物学、营养学和药学领域，特别涉及表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)在制备防治心肌能量代谢障碍的食品和药物的应用。

背景技术

心肌正常工作需要稳定、持续的能量供应。心肌能量代谢功能障碍是指心肌利用葡萄糖、脂肪酸能力下降，能量供应发生障碍，导致心肌细胞功能不全，进而影响心脏的正常搏动。心肌能量代谢功能障碍不仅是心肌功能不全、冠心病等重要心血管疾病的早期共同病理特征之一，也是糖尿病等代谢性疾病的重要并发症之一。防治心肌能量代谢功能障碍是降低心血管疾病发生率、改善糖尿病相关的心肌病的根本手段之一。

心肌细胞中，线粒体通过糖、脂的氧化磷酸化，提供细胞90%以上的能量，是细胞动力工厂。我们近期研究发现，心肌线粒体功能异常可能是心肌能量代谢、特别是糖代谢能力损伤的关键因素。从改善心肌线粒体功能的角度来预防或治疗心肌损伤，可能成为防治心肌能量代谢障碍以及相关疾病的共同有效途径。

如何靶向于线粒体从而改善线粒体功能？基于大量的实验证据，我们提出“线粒体营养素”理论，即针对线粒体功能障碍相关疾病中的线粒体功能紊乱，我们筛选发现一类天然产物或线粒体中关键酶的辅基、辅酶可靶向性调控线粒体相关代谢途径，有效缓解线粒体功能障碍，防治疾病，详见“1.Long J,Aksenov V,Rollo CD,Liu J(2012)A complex dietary supplement modulates nitrative stress in normal mice and in a new mouse model of nitrative stress and cognitive aging.Mech Ageing Dev.”“2.Long J,Gao H,Sun L,Liu J,Zhao-Wilson X(2009)Grape extract protects mitochondria from oxidative damage and improves locomotor dysfunction and extends lifespan in a Drosophila Parkinson's disease model.Rejuvenation Res12:321-331.”“3.Liu J,Shen W,Zhao B,Wang Y,Wertz K,et al.(2009)Targeting mitochondrial biogenesis for preventing and treating insulin resistance in diabetes and obesity:Hope from natural mitochondrial nutrients.Adv Drug Deliv Rev61:1343-1352.”。其中，针对心肌能量代谢损伤，我们研究发现，绿茶中的主要成分EGCG，可显著改善心肌线粒体功能，是一种重要的线粒体营养素。

EGCG的化学分子结构式为：分子式为C₂₂H₁₈O₁₁，分子量为458.4克/摩尔。EGCG占绿茶毛重的9%-13%，是绿茶主要的活性和水溶性成份，具有极强的抗氧化活性。大量临床及动物试验已经证实绿茶具有血糖调节及提高胰岛素敏感性的作用。

在防治心血管疾病，绿茶也具有功效。Kim等发现，于大鼠肠系膜动脉床内给与急性ECGC处理可诱导血管舒张，详见Kim J,Formoso G,Li Y,Potenza MA,Marasciulo FL,et al.(2007)Epigallocatechin gallate,a green tea polyphenol,mediates NO-dependent vasodilation using signaling pathways in vascular endothelium requiring reactive oxygen species and Fyn.Journal of Biological Chemistry282:13736-13745.。持续两周摄入绿茶能够显著改善长期吸烟者血流介导的内皮依赖性血管舒张，提高其外周血管内皮祖细胞数，详见“Kim W,Jeong MH,Cho SH,Yun JH,Chae HJ,et al.(2006)Effect of green tea consumption on endothelial function and circulating endothelial progenitor cells in chronic smokers.Circulation journal:official journal of the Japanese Circulation Society70:1052.。”此外，EGCG亦能够改善缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡，改善心肌肥大和氧化应激,详见“Piao CS,Kim DS,Ha KC,Kim HR,Chae HJ,et al.(2011)The Protective Effect of Epigallocatechin-3Gallate on Ischemia/Reperfusion Injury in Isolated Rat Hearts:An ex vivo Approach.The Korean Journal of Physiology&Pharmacology15:259-266.。”近期，国内学者一项研究发现短期EGCG干预对早期糖尿病大鼠心肌细胞缝隙连接功能异常有改善，详见“于路(2012)EGCG对高糖环境下大鼠心肌细胞缝隙连接的影响及其机制探讨:浙江大学”。

尽管众多研究揭示了绿茶，尤其是其主要成分EGCG在糖尿病及心血管疾病中的重要作用，但针对心肌损伤和心肌能量代谢障碍，EGCG是否具有改善作用未见研究报道。特别是，EGCG是否改善心肌能量代谢障碍？线粒体作为心肌能量代谢的关键细胞器，EGCG是否通过改善线粒体功能防治心肌糖代谢障碍？心肌糖脂代谢障碍是心肌功能不全、冠心病等心血管疾病的早期共同病理特征，也是糖尿病等代谢性疾病的重要并发症之一，目前缺乏有效的预防和治疗手段。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供EGCG在制备防治心肌能量代谢障碍的食品和药物的应用，EGCG作用于心肌线粒体，有效恢复心肌线粒体功能，改善糖脂代谢和心肌胰岛素抵抗，修复心肌细胞损伤，从而对于心肌能量代谢功能障碍相关疾病，包括心肌能量代谢障碍、高血糖或糖尿病所致的心肌功能不全、心肌胰岛素抵抗等疾病具有预防和治疗作用。

EGCG源于绿茶，因此EGCG既可以功能食品形式作为预防心肌功能不全、心肌胰岛素抵抗、心肌能量代谢障碍的预防产品，也可以药物形式治疗上述心肌能量代谢障碍及相关疾病。

为了达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

EGCG在制备防治心肌能量代谢障碍的食品和药物的应用，EGCG的作用靶点为细胞内FoxO1信号通路，可抑制心肌能量代谢障碍引发的心肌细胞自噬，缓解心肌线粒体丢失；EGCG对心肌细胞的有效作用浓度为20uM，或按个体体重的摄取量为5-10mg/kg/日，能够有效改善心肌能量代谢和心肌功能。

细胞作用浓度为20μM EGCG，或按个体体重的摄取量为5-10mg/kg/日，还用于改善心肌线粒体功能，从而调节心肌糖代谢能力，恢复糖代谢障碍所致的心肌细胞功能不全。

细胞作用浓度为20μM EGCG还用于抑制心肌细胞H9c2糖代谢障碍相关的自噬上调。

细胞作用浓度为20μM EGCG还用于抑制心肌细胞H9c2糖代谢障碍相关的氧化应激。

细胞作用浓度为20μM EGCG还用于降低心肌细胞H9c2糖代谢障碍相关的胰岛素抵抗。

本发明的主要优点在于：

（1）首次发现心肌细胞线粒体是重要的药物或功能因子作用靶点，首次证明EGCG对心肌细胞的有效作用浓度为20uM，或个体摄取量5-10mg/kg体重/天（人体），能够有效作用于心肌线粒体，防治心肌糖代谢障碍,改善心肌功能。

（2）心肌能量代谢障碍是心血管疾病的共同病理特征。因此，本发明对于高血糖及非高血糖因素导致的心肌能量代谢障碍的早期预防具有普遍意义。

（3）明确EGCG心肌保护作用的分子靶点是FoxO1信号途径，EGCG可以有效调节靶分子FoxO1的表达。

（4）EGCG作为绿茶中的有效成分，安全性高，保护效应明确。既可作为食品功能因子，也可以作为药物用于代谢障碍相关的心肌损伤的预防和治疗。

附图说明

图1是EGCG恢复Goto-Kakizaki大鼠(GK大鼠，一种糖代谢紊乱的大鼠模型，表现为遗传性非肥胖型高血糖，心肌功能不全)心脏线粒体功能的柱状示意图。其中，图1A和图1B 为EGCG喂养的GK大鼠(灌胃剂量100mg/kg体重/天，折算为人口服剂量10mg/kg体重/天)心脏中线粒体复合物以及VDAC1蛋白变化的蛋白免疫印迹示意图，图1A线粒体相关蛋白的表达量；图1B线粒体相关蛋白的表达量统计学结果；图1C为EGCG喂养的GK大鼠心脏中线粒体呼吸链复合体I，III以及a-酮戊二酸脱氢酶活性的柱状示意图，数据来源于6组大鼠，以平均值±标准误的形式表示；+P﹤0.05,++P﹤0.01,+++P﹤0.001vs.Wistar对照组；*P﹤0.05,**P﹤0.01，***P﹤0.001vs.GK对照组。

图2是EGCG降低GK大鼠心脏中二相酶，机体中氧化损伤增强一般会激活该类酶的表达)蛋白表达升高的蛋白免疫印迹示意图，其中图2A是二项酶蛋白免疫印迹；其中图2B二项酶蛋白表达的统计学结果。+P﹤0.05,+++P﹤0.001vs.Wistar对照组；*P﹤0.05,**P﹤0.01vs.GK对照组。

图3是EGCG对GK大鼠心脏中线粒体生成以及线粒体动态变化相关蛋白表达影响的蛋白免疫印迹示意图。其中，EGCG喂养的GK大鼠心脏中线粒体生成相关蛋白表达降低的蛋白免疫印迹示意图(图3A，线粒体生成相关蛋白表达降低的蛋白免疫印迹；图3B，线粒体生成相关蛋白表达降低的蛋白的统计学结果)；以及EGCG喂养的GK大鼠心脏中线粒体动态学相关蛋白表达的蛋白免疫印迹示意图，图3C,线粒体动态学相关蛋白表达的蛋白免疫印迹；图3D，线粒体动态学相关蛋白表达的蛋白表达的统计学结果)，数据来源于6组大鼠，以平均值±标准误的形式表示；+P﹤0.05,++P﹤0.01,+++P﹤0.001vs.Wistar对照组；*P﹤0.05,**P﹤0.01，***P﹤0.001vs.GK对照组。

图4是EGCG抑制GK大鼠心脏中自噬(心肌细胞自噬是线粒体降解或丢失的主要途径)相关蛋白表达的蛋白免疫印迹示意图。其中，图4A为EGCG喂养的GK大鼠心脏中自噬标志分子表达降低的蛋白免疫印迹示意图(图4B、图4C为图A的统计学结果)；图4D和4E为EGCG喂养的GK大鼠心脏中调控自噬上游蛋白表达降低的蛋白免疫印迹示意图及其统计学结果。数据来源于6组大鼠，以平均值±标准误的形式表示；+P﹤0.05,++P﹤0.01,+++P﹤0.001vs.Wistar对照组；*P﹤0.05,**P﹤0.01，***P﹤0.001vs.GK对照组。

图5是EGCG能有效恢复心肌细胞H9c2中由高糖诱导所产生的胰岛素抵抗，自噬上调，线粒体损失以及氧化应激增加的柱状示意图。其中图5A为EGCG能有效阻止高糖诱导的H9c2细胞中胰岛素抵抗相关蛋白磷酸化降低的蛋白免疫印迹示意图，图5B是统计学结果；图5C显示EGCG能有效阻止高糖诱导的H9c2细胞中自噬相关蛋白表达上调的蛋白免疫印迹示意图，5D,5E是统计学结果；图5F显示EGCG能有效阻止高糖诱导的H9c2细胞中线粒体数目相关蛋白表达减少以及二相酶相关蛋白表达增加蛋白免疫印迹示意图，图5G统计学结果；图5H为EGCG能有效阻止高糖诱导的H9c2细胞中ROS产生增加的柱状示意图；图图5I为EGCG能减少高糖诱导的H9c2细胞中自噬泡形成的激光共聚焦示意图。图A-G，H9c2细胞用20μmol/L EGCG预处理24小时，随后用25mmol/L葡萄糖处理24小时检测活性氧产生的变化；最后用100nmol/L胰岛素处理10分钟，收集蛋白用于免疫印迹分析。数据来源于5个独立重复实验，以平均值±标准误的形式表示。+P﹤0.05,++P﹤0.01,+++P﹤0.001vs.正常对照组，*P﹤0.05,**P﹤0.01vs.高糖处理组。图I，H9c2细胞用EGFP-LC3转染12个小时后，先用20μmol/L EGCG预处理24小时，随后用25mmol/L葡萄糖处理24小时，激光共聚焦显微镜检测自噬泡的形成。

图6是在高糖作用下，心肌细胞H9c2通过FoxO1来调控自噬的蛋白免疫印迹示意图。其中，图6A为FoxO1RNA干扰后能抑制高糖诱导的H9c2细胞中自噬上调的蛋白免疫印迹示意图，图6B，6C为统计学结果；图6D为FoxO1过表达后通过非转录调控的方式增加H9c2细胞自噬的蛋白免疫印迹示意图，图6E、6F统计学结果。数据来源于3个独立重复实验，以平均值±标准误的形式表示。*P﹤0.05,**P﹤0.01,***P﹤0.001vs.对照组。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施方式对本发明做详细阐述。

Ⅰ、材料与方法

1、材料

EGCG（(-)-epigallocatechin-3-gallate），葡萄糖（Glucose）,胰岛素（Insulin），辅酶Q1(CoQ1)，癸泛醌（decylubiquinone），细胞色素C（Cytochrome C），2,6-Dichlorobenzenone-indophenol（DCIP），2-（P-碘苯基）-3（P-硝基苯基）-5-苯基四氮唑氯（2-(p-iodophenyl)-3(p-nitrophenyl)-5-phenyl tetrazolium chloride，INT），辅酶A（CoASH），焦磷酸硫胺素（thiamine pyrophosphate），monodansylcadaverine（MDC）以及针对Tubulin，GAPDH的一抗来自西格玛奥德里奇公司（Sigma，St Louis,MO）。L-DMEM培养基，青霉素（penicillin），链霉素（streptomycin），2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，H₂DCFDA），胰蛋白酶（trypsin）以及针对OxPhos Complexes I,II,III and IV的一抗来自Invitrogen公司(Carlsbad,USA)；针对NQO1,HO-1,SOD2,VDAC1,PGC1,mtTFA,DRP1,Mfn1,Mfn2,OPA1和Ac-FoxO1的一抗来自Santa Cruz公司(Heidelberg,Germany)；针对FoxO3a,FoxO1,p-FoxO1(Thr24),Atg5,Atg7,Beclin1,LC3B,p-Akt(Ser473),Akt,p-AMPKα(Thr172),p-GSK3β,AMPKα, p-mTOR(Ser2448),mTOR的一抗来自Cell Signaling Technology公司(Beverly,MA,USA)；辣根过氧化物酶偶联的针对鼠/兔/山羊的二抗购自杰克逊免疫研究实验室（Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc）；胎牛血清购自PAA Laboratories GmbH(Linz,Austria)；细胞裂解液购自江苏海门碧云天生物技术公司。其他试剂购自本地供销商。

2、实验方法

动物饲养

四周龄雄性GK大鼠（本实验中作为心肌糖代谢障碍模型大鼠）以及同龄Wistar大鼠购自SLAC Laboratory Animal Co.Ltd(Shanghai,China).按照NIH动物饲养原则饲养大鼠，所有老鼠分为三组，Wistar对照组，GK对照组以及EGCG喂养的GK大鼠组，EGCG的喂养量为100mg/kg体重/天（折算为人口服剂量为10mg/kg体重/天），对照组给予相应体积的生理盐水。饲养三个月后，收取心脏组织用以实验。

细胞培养

大鼠心肌细胞H9c2购自美国ATCC公司，生长在含10%胎牛血清，100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的L-DMEM培养基中，并被置于恒温（37℃）恒湿的5%二氧化碳培养箱中，2天换液一次，所有细胞处于10代以内。

蛋白免疫印迹分析

收集心脏组织（100mg）或者处理过的H9c2细胞，加入细胞裂解液于冰上孵育30分钟。17,000g离心15分钟，收集上清，蛋白定量，并将上清保存于-20℃。取约20μg蛋白通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转至NC膜上，NC膜用5%脱脂奶粉（溶解于TBST）封闭1小时，接着用一抗室温孵育1小时，TBST漂洗3次15分钟，然后二抗室温孵育1小时，TBST漂洗3次15分钟，最后通过化学发光底物HRP反应，使用感光胶片记录光亮度的变化。

线粒体呼吸链复合体酶I,III以及a-酮戊二酸脱氢酶活性的检测

线粒体抽提。将剪碎的大鼠心脏组织用预冷的A液（120mM NaCl,20mM HEPES,2mMMgCl2,1mM EGTA,and5g/l bovine serum albumin;pH7.4)重悬，于冰上静置5分钟后用匀浆器将其匀浆，将组织匀浆于600g离心10分钟。收集得到的上清再于17000g离心10分钟。线粒体沉淀用A液重悬后，于7000g离心10分钟，沉淀用B液（300mM sucrose,2mMHEPES,0.1mM EGTA;pH7.4）重悬，并于3500g离心10分钟，得到的线粒体沉淀用B液重悬后进行蛋白定量。以上所有操作都在4℃进行。所得到的线粒体保存于-80℃直至酶活检测。

NADH–CoQ氧化还原酶(complex I)

反应体系为：50mmol/L Tris–HCl pH8.1，0.05mmol/L DCIP，0.35%牛血清白蛋白（BSA），1μmol/L抗霉素A（antimycin A），0.2mmol/L叠氮钠（NaN₃），0.05mmol/L辅酶Q1（coenzyme Q1），通过200μmol/L还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）启动反应，然后在30℃条件下读取600nm处吸光值的变化2分钟。

CoQ–cytochrome c还原酶(complex III)

反应体系为：50mmol/L Tris-HCl pH7.8，0.2mmol/L叠氮钠（NaN₃），0.05%吐温-20（Tween-20），0.01%牛血清白蛋白（BSA），0.05mmol/L细胞色素C（Cytochrome C），通过0.05mmol/L decylubiquinol启动反应，然后在30℃条件下读取550nm处吸光值的变化2分钟。

a-酮戊二酸脱氢酶复合体(a-KGDH)

反应体系为：35mmol/L磷酸钾缓冲液（potassium phosphate buffer pH7.25），2mmol/L叠氮钠（NaN₃），0.5mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA），2.5μmol/L鱼藤酮（rotenone），5mmol/L氯化镁（MgCl₂），0.5mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺），0.2mmol/L焦磷酸硫胺素（thiamine pyrophosphate），2mmol/L a-酮戊二酸（a-Ketoglutarate），通过0.04mmol/L辅酶A（CoASH）启动反应，然后在30℃条件下读取340nm处吸光值的变化2分钟。

细胞内氧化应激的测定

按600,000/孔的比例，将心肌细胞H9c2种在6孔培养板内，静置待细胞贴壁恢复正常生长状态，使用20μmol/L EGCG预处理24小时，随后用25mmol/L葡萄糖处理24小时，摒弃培养基，用PBS清洗一遍，然后加入溶解在无血清的L-DMEM培养基中的H₂DCFDA于37℃培养箱中孵育0.5小时，接着去除H₂DCFDA溶液，用PBS清洗一遍，加入细胞裂解液（10mmol/L Tris，150mmol/L NaCl，0.1mmol/L EDTA，0.5%Triton X-100，pH7.5），离心（15000g，10min，4℃）得到上清液用荧光分析仪检测（激发光485nm，发射光538nm），同时用BCA试剂盒测定蛋白浓度，最终以荧光OD值/蛋白含量表示活性氧的变化情况。

自噬泡（自噬小体和自噬溶酶体）的观察

H9c2细胞用EGFP-LC3转染12个小时后，先用20μmol/L EGCG预处理24小时，随后用25mmol/L葡萄糖处理24小时，摒弃培养基，用多聚甲醛固定15分钟后，于激光共聚焦显微镜检测自噬泡的形成。

FoxO1siRNA干扰和过表达

按照150000/孔的比例，将H9c2细胞接种于6孔板中，第二天按照脂质体2000的说明书进行操作，将FoxO1的siRNA（序列为5’-UGAAUAGCAAGGUGUCUGCTT-3’）转入H9c2细胞，24小时后，用25mmol/L葡萄糖再处理24小时，收集蛋白用于免疫印迹分析。

按照脂质体2000的说明书进行操作，将FoxO1野生型表达载体pCDNA3-FoxO1-FLAG以及磷酸化位点突变的表达载体pCDNA3-FoxO1(3A)-FLAG转入心肌细胞H9c2中，48个小时后，收集蛋白用于免疫印迹分析。

统计分析

实验数据从至少3次独立重复实验中得出的平均值±标准误表示。使用SPSS统计软件的单向方差分析方法(ANOVA)中的Fisher's LSD方法进行结果的差异显著性分析。差异显著性按如下说明：+P﹤0.05,++P﹤0.01,+++P﹤0.001；*P﹤0.05,**P﹤0.01，***P﹤0.001。

实施例一

EGCG对糖代谢障碍的GK大鼠心脏中线粒体功能紊乱的治疗效果

分别从正常Wistar大鼠，心肌糖代谢障碍模型GK大鼠和EGCG喂养的GK大鼠心脏中提取蛋白质及线粒体，然后用蛋白免疫印迹的方法来检测线粒体相关蛋白的表达量，结果见图1A,线粒体相关蛋白的表达量；图1B线粒体相关蛋白的表达量统计学结果)。GK大鼠心脏中线粒体呼吸链复合体以及VDAC1的表达量都有所下降，而EGCG对其有很好的恢复作用；用酶活测定的方法来检测线粒体相关酶的酶活性，结果见图1C，EGCG对于增加GK大鼠心脏中粒体呼吸链复合体酶（I，III）以及a-酮戊二酸脱氢酶复合体酶的酶活性有着显著的作用。

实施例二

EGCG对GK大鼠心脏中二相酶表达上调的恢复效果。

二相酶的表达量是体内抗氧化系统的重要指标，它的升高也能从侧面反应体内的氧化应激增加。分别从正常Wistar大鼠，糖代谢障碍GK大鼠模型和EGCG喂养的GK大鼠心脏中提取蛋白质，用蛋白免疫印迹的方法来检测二相酶的表达量。从图2中可以看出，GK大鼠心脏中的二相酶（NQO1，HO1，MnSOD）表达量相对于Wistar大鼠有着显著的上调，而EGCG的饲养能够有效的减少二相酶的表达量。

实施例三

EGCG对GK大鼠心脏中线粒体生成及动态学相关蛋白表达量的影响。

我们发现GK大鼠心脏中线粒体有着功能紊乱以及数目减少的现象，推测这些现象可能与线粒体生成及动态变化有关。从图3A、3B可以看出，GK大鼠心脏线粒体生成相关蛋白的表达量有所增加，EGCG的饲养对其有恢复作用；从图3C、3D可以看出，GK大鼠心脏线粒体融合相关蛋白没有变化，但分裂相关蛋白Drp1有所减少，EGCG则能够恢复其到正常大鼠Wistar的表达水平。

实施例四

EGCG对GK大鼠心脏中自噬相关蛋白表达量上调的抑制效果。

根据上述结果，我们推测GK大鼠心脏中线粒体功能障碍的现象是由于自噬增加所引起的，EGCG对自噬可能有一定的抑制作用从而达到恢复线粒体功能的效果。我们用蛋白免疫印迹的方法来检测自噬相关蛋白的表达量，结果见图4A-C，EGCG对于GK大鼠心脏中的自噬上调（LC3B，Atg家族蛋白表达量的增加）有着明显的抑制效果。而从图4D、4E中可以看出在胰岛素的作用下控制自噬的两条通路中，mTOR无明显变化，而FoxOs家族蛋白量在GK大鼠心脏中的表达量升高会被EGCG所抑制。

实施例五

EGCG能抑制心肌细胞H9c2中糖代谢障碍，自噬增加，氧化应激上调以及线粒体数目减少。

H9c2细胞用20μmol/L EGCG预处理24小时，随后用25mmol/L葡萄糖处理24小时，最后用100nmol/L的胰岛素处理10分钟，蛋白免疫印迹杂交检测相关蛋白的表达量。如图5A及5B所示，p-AKT和p-GSK3β是胰岛素抵抗和糖代谢障碍的两个标志分子，高糖处理组中p-AKT和p-GSK3β有着明显的下降，说明25mmol/L葡萄糖能够诱导H9c2细胞产生胰岛素抵抗，而20μmol/L EGCG预处理则能够有效预防胰岛素抵抗的发生；从图5C及5D可以看出，EGCG对于高糖诱导自噬相关蛋白FoxO1,FoxO3a,Atg7,Atg12-Atg5和LC3B的表达升高都有着明显的抑制效果；LC3-II/LC3-I的比值代表着自噬的强度，图5E说明EGCG能有效的抑制H9c2细胞中由高糖引起的自噬上调；线粒体功能紊乱与胰岛素抵抗密切相关，从图5F、5G显示，高糖诱导可造成H9c2细胞中线粒体成分Complex III,Complex IV和VDAC1的减少，EGCG则可以阻止这种现象的发生；活性氧主要是由于线粒体氧化磷酸化过程中电子渗漏造成的(图5H)，图5F、G同时说明EGCG可以抑制由高糖引起的活性氧产生以及相应的二相酶上调；当自噬发生时，细胞内的LC3会聚集起来，形成自噬泡，用EGFP-LC3转染H9c2细胞12小时后，先用20μmol/L EGCG预处理24小时，随后用25 mmol/L葡萄糖处理24小时，激光共聚焦显微镜检测自噬泡的形成，如图5I，EGCG处理组细胞中的LC3斑点明显少于高糖诱导组。

实施例六

FoxO1所调控的自噬在心肌细胞H9c2糖代谢障碍中起重要作用。

动物试验中我们发现心肌细胞自噬的上调与FoxO1有关，我们用FoxO1siRNA转染H9c2细胞，随后用25mmol/L葡萄糖处理24小时，结果发现FoxO1干扰的H9c2细胞中自噬下调，同时线粒体成分Complex IV和VDAC1都有所上升，说明FoxO1在高糖诱导H9c2细胞的自噬上调中起重要作用，如图6A、B、C；FoxO1野生型表达载体pCDNA3-FoxO1-FLAG以及磷酸化位点突变的表达载体pCDNA3-FoxO1(3A)-FLAG转染心肌细胞H9c2，结果表明磷酸化位点突变的FoxO1过表达并不能引起自噬的增加，说明FoxO1过表达后通过非转录调控的方式增加H9c2细胞自噬，如图6D-F。

由上述结果可见，EGCG可以有效的改善心肌糖代谢障碍、胰岛素抵抗及其所伴随的线粒体功能障碍、自噬增加以及氧化应激上调，并揭示了FoxO1可能作为一个EGCG的分子靶点，在调控心肌细胞自噬中起了非常重要的作用。

Claims

1.EGCG在制备防治心肌能量代谢障碍的食品和药物的应用，其特征在于，EGCG的作用靶点为细胞内FoxO1信号通路，可抑制心肌能量代谢障碍引发的心肌细胞自噬，缓解心肌线粒体丢失；EGCG对心肌细胞的有效作用浓度为20uM；或按个体体重的摄取量为5-10mg/kg/日，能够有效改善心肌能量代谢和心肌功能。

2.EGCG在制备防治心肌能量代谢障碍的食品和药物的应用，其特征在于，细胞作用浓度为20μM EGCG，或按个体体重的摄取量为5-10mg/kg/日，还用于改善心肌线粒体功能，从而调节心肌糖代谢能力，恢复糖代谢障碍所致的心肌细胞功能不全。

3.EGCG在制备防治心肌能量代谢障碍的食品和药物的应用，其特征在于，细胞作用浓度为20μM EGCG还用于抑制心肌细胞H9c2糖代谢障碍相关的自噬上调。

4.EGCG在制备防治心肌能量代谢障碍的食品和药物的应用，其特征在于，细胞作用浓度为20μM EGCG还用于抑制心肌细胞H9c2糖代谢障碍相关的氧化应激。

5.EGCG在制备防治心肌能量代谢障碍的食品和药物的应用，其特征在于，细胞作用浓度为20μM EGCG还用于降低心肌细胞H9c2糖代谢障碍相关的胰岛素抵抗。