CN104031937A - 谷子SiREM6基因在提高植物抗盐性的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种谷子SiREM6基因在提高植物抗盐性的应用，将含有谷子SiREM6基因开放阅读框序列的表达载体经农杆菌介导转化到植物中，可获得了抗盐性提高的转基因植物，有利于农业生产。

Description

谷子SiREM6基因在提高植物抗盐性的应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及谷子SiREM6基因在提高植物抗盐性的应用。

背景技术

谷子(Setaria italica L.)，属于禾本科，狗尾草属，广泛栽培于欧亚大陆的温带和热带。谷子的适应能力极强，它既耐旱、耐贫瘠的土壤，又耐酸、耐碱，尤以耐旱能力最强，所以谷子除了分布在我国北方干旱地区外，在我国南方某些干旱、贫瘠的山区，也有种植。为了提高植物的抗逆境能力，通过对冀谷11号基因组的分析，从谷子中挖掘了一些有应用潜力的和抗逆相关的基因。其中，谷子的Remorin蛋白家族基因可能参与了植物对于非生物胁迫的响应。第一个被发现的Remorin蛋白是定位于马铃薯叶片质膜上的一个约为34kDa大小的蛋白质，该蛋白在体外可以被寡半乳糖醛酸(Oligogalacturonide,OGA)磷酸化。

发明内容

本发明提供谷子SiREM6基因在提高植物抗盐性的应用。

前述应用，具体是将含有谷子SiREM6基因开放阅读框序列的表达载体经农杆菌介导转化到植物中。

本发明还提供了含有谷子SiREM6基因开放阅读框序列的载体，所述谷子SiREM6基因开放阅读框序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了含有所述载体的工程菌。

本发明从谷子cDNA中筛选得到一个Remorin蛋白家族基因，称之为SiREM6基因。该基因的开放阅读框的序列长度为639bp，其核苷酸序列如图2A所示。通过核苷酸序列推测，SiREM6编码一个含212个氨基酸的蛋白，富含赖氨酸(18.99％,w/w)和谷氨酸(22.39％,w/w)。根据DNAMAN6.0.3.48软件分析，该蛋白大小为23kDa，等电点为5.4。通过InterProScan预测出该蛋白含有一个典型而保守的Remorin蛋白的C端和Remorin蛋白的N端结构域。进一步分析该蛋白的氨基酸序列表明，该蛋白的N端含有9个脯氨酸，C端包含一个coiled-coil结构域(图2)。根据谷子中的11个Remorin蛋白及其它植物Remorin蛋白的氨基酸序列(分析中涉及到的所有Remorin蛋白的Gene/EST编号请见表1)，用MEGA5.2.2软件进行了Remorin蛋白的进化分析，结果如图3所示，SiREM6蛋白和水稻OsREM1.5及玉米ZmREM1.2的亲缘关系较近，属于第1-3组Remorin蛋白。进一步，根据Raffaele等(Raffaele et al.,2007,Plant Physiol.Vol.145,pp.593-600)人对Remorin蛋白的分类方法，比较N端的氨基酸序列发现，SiREM6蛋白属于第1组Remorin蛋白，而第1组Remorin蛋白可能参与了植物对于非生物胁迫的响应。SiREM6定位于谷子原生质体的细胞质中，在体外能自聚成类似于纤维状的结构。qRT-PCR研究表明SiREM6在谷子的根、茎、叶和花序中均有表达，而且在不同程度上受到ABA、盐和冷胁迫诱导表达，但几乎不受PEG诱导表达。

表1系统进化分析中所有Remorin蛋白

本发明构建了含有SiREM6开放阅读框的拟南芥表达载体。在一个优选的实施方式中，将SiREM6基因的开放阅读框(不包含终止密码子)与编码Flag蛋白的基因融合，然后将其与花椰菜花叶病毒35S启动子和来自胭脂碱合成酶(nos)基因的3’转录终止区域连接，构建植物表达载体，以潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)作为选择标记基因。该载体被命名为p1300-SiREM6-Flag。

本发明将上述的植物表达载体p1300-SiREM6-Flag转化拟南芥，获得了抗盐性提高的转基因植物。

本发明的有益效果在于：

本发明筛选到了一个Remorin蛋白基因SiREM6，将所述的基因转化到拟南芥中可使拟南芥的抗盐性增加。本发明提供了一种利用所述基因增加植物抗盐性的新方法，有利于农业生产。

附图说明

图1为克隆SiREM6(ORF)的PCR产物的1.0％琼脂糖凝胶电泳图。

图2为本发明SiREM6的开放阅读框序列及SiREM6蛋白的氨基酸序列和预测的蛋白结构域；

A：SiREM6的开放阅读框序列及SiREM6蛋白的氨基酸序列；其中：红色圈代表N端的脯氨酸残基；下划线的一段为C端的coiled-coil结构域；B：预测的SiREM6蛋白结构域。

图3为多种植物Remorin蛋白的进化分析。

图4为本发明SiREM6基因在ABA、NaCl、冷和干旱处理后相对表达量的分析。

图5为本发明SiREM6基因在谷子组织器官中的表达情况。

图6为本发明亚细胞定位载体pRok219-SiREM6-GFP的构建策略。

图7为本发明SiREM6蛋白在谷子原生质体中的亚细胞定位；

图中A-C为GFP在谷子原生质体中的亚细胞定位；

图中D-F为SiREM6-GFP在谷子原生质体中的亚细胞定位；其中：Bright，明场；Merged，绿色荧光和明场的叠加；Bar＝5μm。

图8为本发明植物表达载体p1300-SiREM6-Flag的构建策略。

图9为本发明T₁代再生植株中SiREM6的PCR检测；其中：1-30，30棵抗性苗；M，Marker D2000plus；WT，野生型植株作为对照。

图10为本发明T₃代转基因和野生型植株中SiREM6的转录水平分析。

图11为本发明T₃代转基因和野生型拟南芥种子在盐胁迫处理下的萌发表型分析及鲜重和干重的测定；

A：转基因转基因和野生型拟南芥种子经0、100、150和175mmol/L NaCl处理7天后的萌发表型；B：转基因和野生型拟南芥种子经0、100、150和175mmol/L NaCl处理7天后的萌发率统计；C：转基因和野生型拟南芥种子在含0和100mmol/L NaCl的MS培养基上生长7天后的鲜重和干重分析；其中：约80粒转基因或WT拟南芥种子用于种子萌发实验；约50棵转基因或WT幼苗用于鲜重和干重的测定；实验重复三次，数据为三次实验的平均值；误差线为标准偏差；*P<0.05,**P<0.01(t检验)。

图12为本发明T₃代转基因和野生型拟南芥幼苗在盐胁迫处理下的表型分析及存活率和电导率的测定；

A：5天大的幼苗在含有0、150、200和220mmol/L NaCl培养基上培养5天；B：5天大的幼苗在含有220mmol/L NaCl培养基上培养5天后的存活率；C：转基因和WT幼苗在0、50、100、150和200mmol/L NaCl处理5天后的电导率分析；其中：约30棵转基因或WT幼苗用于表型分析、存活率或电导率的测定；实验重复三次，数据为三次实验的平均值；误差线为标准偏差；*P<0.05,**P<0.01(t检验)。

图13为本发明T₃代转基因和野生型拟南芥在盐胁迫处理下的表型分析及存活率和脯氨酸含量的测定；

A：三周大的转基因和WT拟南芥经400mmol/L NaCl浇灌处理三周；B：三周大的转基因和WT植株经400mmol/L NaCl浇灌处理三周后的存活率；C：三周大的转基因和WT拟南芥经400mmol/LNaCl溶液处理10和14天后的脯氨酸含量；其中约30棵转基因或WT拟南芥用于表型、存活率或脯氨酸含量的分析；实验重复三次，数据为三次实验的平均值；误差线为标准偏差；*P<0.05,**P<0.01(t检验)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 SiREM6(ORF)的克隆

根据谷子中编号为SiPROV019639m的基因序列，设计克隆SiREM6(ORF)的引物P1和P2(引物序列见表2)。以谷子cDNA为模板，进行PCR扩增。扩增条件如下：95℃，变性5min；60℃，退火0.5min；72℃，延伸45sec；扩增循环数35；最后72℃，延伸10min；4℃保存。将PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶中电泳(见图1)，用试剂盒回收目的条带。取适量回收产物，与pMD19-T vector连接转化大肠杆菌感受态。碱裂解法小量提取该质粒pMD19T-SiREM6(ORF)，经BamHⅠ和HindⅢ酶切鉴定后测序。SiREM6(ORF)的核苷酸序列如图2A所示，其编码蛋白的氨基酸序列及预测的蛋白结构域如图2B所示。

表2引物列表

实施例2 SiREM6在逆境胁迫处理下的表达模式分析

取17天的冀谷11幼苗，经过100μmol/L ABA、150mmol/L NaCl、4℃及20％PEG(v/v)处理后，分别提取不同处理时间幼苗的总RNA，经DNaseⅠ消化后，取2μg RNA进行反转录合成cDNA，以这些cDNA为模板，用P3和P4引物(引物序列见表2)扩增SiREM6，谷子actin基因(GenBank:AF288226)作为内参，扩增引物为P5和P6(引物序列见表2)。扩增条件为：95℃，10min；95℃，10sec；60℃，1min；40个循环，每个循环结束后读取荧光值，以2^-ΔΔCt计算样品间基因表达水平的相对差异。qRT-PCR结果显示，SiREM6经ABA处理12h后，相对表达量达到最高为9.1倍，随后又下降到原始状态；SiREM6在NaCl处理0.5h后开始上调表达，在3h时基因表达上调倍数最高为5.00倍，随后在处理6h和12h时基因表达量略有下降；SiREM6在4℃处理0.5h后开始上调表达，在6h时基因表达上调倍数最高为3.90倍，随后在处理12h时基因表达量略有下降；在PEG处理下，SiREM6的表达量与未处理时相比，几乎没有明显的变化(见图4)。

实施例3 SiREM6在不同组织中的表达模式分析

分别提取14天谷子幼苗的根、茎、叶以及开花期花序的总RNA，经DNaseⅠ消化后，取2μg RNA进行反转录合成cDNA，然后分别以这些cDNA为模板，用引物P3和P4(引物序列见表2)扩增SiREM6基因，谷子actin基因作为内参，扩增引物为P5和P6(引物序列见表2)。扩增条件为：95℃，10min；95℃，10sec；60℃，1min；40个循环，每个循环结束后读取荧光值，以2^-ΔΔCt计算样品间基因表达水平的相对差异。qRT-PCR结果显示，SiREM6在谷子的根、茎、叶以及花序中均有表达，且在根与叶中的表达量较高(见图5)。

实施例4 SiREM6蛋白的亚细胞定位

瞬时表达定位载体pRok219-GhLRP-GFP的构建策略如图6所示。以pET32a-SiREM6(ORF)为模板，应用引入BamHⅠ和SmaⅠ酶切位点的引物P7和P8(引物序列见表2)，扩增得到SiREM6(ORF)，将其连到pMD19-T上。测序正确后，用BamHⅠ和SmaⅠ酶切消化，回收SiREM6(ORF)片段，连到pRok219-GFP载体相同的酶切位点上，酶切鉴定构建的载体正确。将SiREM6蛋白的亚细胞定位载体pRok219-SiREM6-GFP和对照载体pRok219-GFP通过PEG转化法，分别转入谷子原生质体中，黑暗培养16h后，在激光共聚焦显微镜下观察SiREM6蛋白的定位。结果如图7所示，对照组的GFP信号在细胞的各个部位均有分布，而实验组中只能在细胞质中检测到GFP信号，说明了SiREM6蛋白定位在谷子原生质体的细胞质中。

实施例5 用于拟南芥中表达SiREM6(ORF)的表达载体的构建和转化农杆菌

将SiREM6基因的开放阅读框(不包含终止密码子)与编码Flag蛋白的基因融合，然后将其与花椰菜花叶病毒35S启动子和来自胭脂碱合成酶(nos)基因的3’转录终止区域连接，构建植物表达载体，以潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)作为选择标记基因。该载体被命名为p1300-SiREM6-Flag，载体的构建策略如图8所示。根据SiREM6(ORF)序列，设计上游引物P9和下游引物P10(引物序列见表2)，P13引入HindⅢ酶切位点，为了获得SiREM6-Flag融合蛋白，P14不含TAA碱基，引入SpeⅠ酶切位点。以pMD19T-SiREM6为模板，应用引物P13和P14，扩增得到不含终止密码子的SiREM6(ORF)，将其连到pMD19-T载体上。测序正确后，用HindⅢ和SpeⅠ酶切消化，回收SiREM6(ORF)片段，连到经过改造的pCAMBIA1300载体相同的酶切位点上，酶切鉴定构建的载体正确。将p1300-SiREM6-Flag采用电击法直接转化农杆菌GV3101，获得含有重组质粒p1300-SiREM6-Flag的农杆菌GV3101(p1300-SiREM6-Flag)。农杆菌转化技术为公知技术。

实施例6 p1300-SiREM6-Flag表达载体转化拟南芥

1、从保存的菌板上挑一环GV3101菌接种到5ml LB液体培养基(含50μg/ml Kan和50μg/ml Gen)中，28℃，180rpm培养过夜；

2、吸取5ml菌液转接至1L LB液体培养基(含50μg/ml Kan和50μg/ml Gen)中，28℃，180rpm培养OD₆₀₀至1.0；

3、4000rpm，室温离心10min，收集菌体，再用800ml转化液(1/2MS，5％蔗糖，40μl Silwet L-77)悬浮菌体；

4、将拟南芥平放，使花序浸泡在制备好的农杆菌菌液中侵染5min；

5、22℃平放暗培养24h，第二天竖直见光培养至收种。

实施例7 T₁代转基因拟南芥的PCR检测

T₀代收获种子后，将其灭菌并春化72h，然后铺于含50mg/L潮霉素的MS培养基中进行筛选，共得到30棵抗性苗。将这些抗性苗移入小盆中培养，待长至3周大时取少量的叶片提取基因组DNA，用引物P3和P4(引物序列见表2)扩增SiREM6基因。扩增条件如下：95℃，变性5min；60℃，退火0.5min；72℃，延伸0.5min；扩增循环数35；最后72℃，延伸10min；4℃保存。结果如图9所示，30个株系的基因组中均扩增出特异性条带，大小约为150bp，这说明SiREM6基因已经成功地整合到拟南芥基因组中。

实施例8 T₃代转基因和野生型植株中SiREM6的转录水平分析

通过潮霉素筛选，共获得9个单拷贝且纯合的T₃代转基因株系。从这9个单拷贝株系中随机选取了3个转基因株系L3、L12和L19进行进一步的分析。分别提取3周大的T₃代L3、L12、L19幼苗和WT拟南芥的总RNA，经DNaseⅠ消化后，取2μg RNA进行反转录合成cDNA。以该cDNA为模板，用引物P3和P4(引物序列见表2)扩增SiREM6基因，扩增条件如下：95℃，变性5min；60℃，退火0.5min；72℃，延伸0.5min；扩增循环数25；最后72℃，延伸10min；4℃保存。同时用拟南芥UBQ5基因(GenBank:AT3G62250)的扩增量显示模板量，扩增引物为P11和P12，扩增条件如下：95℃，变性5min；60℃，退火0.5min；72℃，延伸0.5min；扩增循环数25；最后72℃，延伸10min；4℃保存。RT-PCR结果如图10所示，SiREM6在L3、L12和L19株系中均有转录，且在L19中的转录水平较高。

实施例9 盐胁迫处理下转基因拟南芥种子萌发阶段的表型分析

将约80粒灭菌和4℃春化处理的T₃代转基因和野生型拟南芥种子播种于含有0、100、150和175mmol/L NaCl的MS培养基上，在22℃和光照周期为16h/8h(光照/黑暗)的培养箱中萌发生长7天，统计萌发率。结果如图11A和11B所示，在对照MS培养基上，L3、L12、L19和WT拟南芥种子都能够正常地萌发，萌发率达到100％，而且转基因和WT幼苗都能展开两片子叶；当NaCl浓度达到100mmol/L时，L3、L12、L19和WT拟南芥种子的萌发率略有降低，大多数转基因幼苗均能展开两片子叶，而只有很少部分WT幼苗能展开两片子叶；当NaCl浓度达到150mmol/L时，L3、L12、L19和WT拟南芥种子的萌发率均降到80％左右，而且只有很少部分的转基因幼苗能够长出子叶，而WT没有长出子叶；当NaCl浓度达高达175mmol/L时，L3和WT拟南芥种子的萌发率急剧下降，为40％左右，而L12和L19拟南芥种子的萌发率显著高于WT，为60％左右，但转基因和WT拟南芥均没有长出子叶。进一步，将转基因和WT拟南芥种子铺在含100mmol/L NaCl的MS培养基上，22℃培养7天后，分别取50棵幼苗进行鲜重和干重的测定。结果如图11C所示，与对照组相比，转基因拟南芥在盐胁迫处理下的鲜重和干重显著地高于WT。

实施例10 转基因拟南芥幼苗在盐胁迫处理下的表型分析

将灭菌和4℃春化处理的T₃代转基因和野生型拟南芥种子播种于MS培养基上，在22℃和光照周期为16h/8h(光照/黑暗)的培养箱中培养5天，然后再将萌发的幼苗移至含有0、150、200和220mmol/L NaCl的MS培养基上培养5天，观察表型并统计存活率。结果如图12A和B所示，在对照MS培养基上，L3、L12、L19和WT拟南芥幼苗的长势较为一致；当用不同浓度的NaCl处理后，转基因和WT拟南芥幼苗的生长均受到抑制，叶片开始萎蔫，但转基因拟南芥幼苗的长势仍好于WT；当NaCl浓度高达220mmol/L时，WT拟南芥叶片白化，存活率仅为20％以下，而转基因拟南芥幼苗的叶片大部分仍为绿色，植株存活率要远高于WT植株。

同时，将灭菌和4℃春化处理的T₃代转基因和野生型拟南芥种子播种于MS培养基上，在22℃和光照周期为16h/8h(光照/黑暗)的培养箱中培养5天，然后再将萌发的幼苗移至含0、50、100、150和200mmol/L NaCl的MS培养基上培养5天；选取30棵处理过的拟南芥整株放在50ml离心管中，加10ml去离子水，至于摇床中慢摇16h或过夜，然后用电导仪测定初电导率记为S1，再将各个样品置沸水浴中煮沸15min，取出置于摇床摇2h，再测总电导率记为S2，空白对照为蒸馏水电导率记为S0；电导率的计算公式为：相对电导率(％)＝(S1-S0)×100/(S2-S0)。结果如图12C所示，未处理时，转基因和WT植株的电导率相似，在20％左右，随着NaCl处理浓度的增加，转基因和WT拟南芥叶片的电导率均增加，但WT植株显著高于转基因植株。

实施例11 转基因拟南芥植株在盐胁迫处理下的表型分析

选取在小盆中生长2周，长势一致的T₃代转基因和野生型拟南芥，用400mmol/L NaCl溶液直接浇灌，每4天浇灌相同体积的盐水，共处理3周，然后观察拟南芥的表型并统计存活率。结果如图13A和B所示，NaCl处理3周后，转基因和WT拟南芥的生长均受到不同程度的抑制，但转基因植株的长势要好于WT植株，WT植株的大部分叶片已失绿且边缘萎蔫，小部分已干枯死亡，存活率低于50％，而转基因植株的小部分叶片仍保持绿色，存活率均达到60％以上。

同时，也测定了三周大的转基因和WT拟南芥经400mmol/LNaCl溶液处理10天和14天后的脯氨酸含量。脯氨酸含量的测定方法如下：

1、标准曲线的制作：

取7只干燥试管，标明编号，按下表加入：

向各管分别加入2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，沸水浴30min，冷却到温室后加入5ml甲苯，充分振荡以萃取红色产物，避光静置4h以上，待完全分层后，用注射器轻轻吸取甲苯层至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色，绘制标准曲线。

2、样品的测定：

准确称取0.5g烘干后磨碎的叶片，分别置于50ml离心管中，加入5ml3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取15min(提取过程中要经常摇动)，冷却后过滤，滤液即为脯氨酸提取液，吸取2ml提取液于干净的试管中，加入2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，在沸水浴中加热30min，冷却后加入5ml甲苯，静置后，吸取上层溶液至比色杯中进行测定。

3、计算：

脯氨酸(％)＝(C×V/a)×100/(W×10⁶)

C：从标准曲线上查得脯氨酸的含量(μg/ml)，

V：总提取液体积(ml)，

a：测定时所用提取液体积(ml)，

W：样品干重(g)。

结果如图13C所示，未处理时，转基因和WT植株的脯氨酸含量相似；NaCl处理10天后，转基因和WT植株的脯氨酸含量均提高，且L19植株的脯氨酸含量显著提高；NaCl处理14天后，L3、L12和L19植株的脯氨酸含量均显著地高于WT植株。

实施例12 数据的统计分析

在本发明涉及的各种测定分析实验中，分别进行三次技术与生物学重复，结果被表示为平均值±标准偏差。通过t-检验对各个样品与对照之间的差异进行显著性分析(*p<0.05；**p<0.01)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.谷子SiREM6基因在提高植物抗盐性的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将含有谷子SiREM6基因开放阅读框序列的表达载体经农杆菌介导转化到植物中。

3.含有谷子SiREM6基因开放阅读框序列的载体，其特征在于，所述谷子SiREM6基因开放阅读框序列如SEQ ID No.1所示。

4.含有权利要求3所述载体的工程菌。