CN104031636A - 一种自发荧光的纳米球及其制备方法与应用 - Google Patents
一种自发荧光的纳米球及其制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104031636A CN104031636A CN201410258182.2A CN201410258182A CN104031636A CN 104031636 A CN104031636 A CN 104031636A CN 201410258182 A CN201410258182 A CN 201410258182A CN 104031636 A CN104031636 A CN 104031636A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nanometer ball
- nanosphere
- biological
- peptide
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种自发荧光的纳米球及其制备方法与应用。本发明涉及的纳米球为实心纳米球,由具有生物相容性的肽生物分子或氨基酸分子与交联剂分子反应制备而成。具体制备方法包括以下步骤:通过溶剂将肽或氨基酸溶解后加入经水浴加热的含脂肪族二醛的水溶液,室温静置24小时后即形成具有自发荧光性质的纳米球。本发明涉及的纳米球制备方法具有简单易行、条件温和及高重复性等特点,而且制备的纳米球具有自发荧光性质,避免了纳米球在生物技术应用时需要进行荧光标记的缺点,此外本发明中的纳米球具有非常好的稳定性与生物形容性,为制备高生物相容性纳米球提供了新的更有效的途径。
Description
技术领域
本发明属于化学领域,涉及一种纳米材料,具体涉及一种自发荧光的纳米球及其制备方法与应用。
背景技术
肽分子由两个或两个以上氨基酸分子脱水缩合后形成,由于其起源于各种生命活动,因此具有良好的生物相容性与生物可降解性,是制备各种功能生物材料的优选原料;而且肽分子可以模拟部分蛋白的行为与功能,为更好的理解蛋白的作用提供了一定的理论模型;除此之外,肽分子具有非常好的组装性能,进而可以非常容易形成包含不同功能的各种有序结构。因此,在过去几十年中,大量的肽分子,主要包括:环状肽,枝状肽,两亲肽,共聚肽与芳香肽等,被选用来制备各种功能材料并探究其在生命科学与纳米技术领域的应用。其中,肽纳米球由于在生物医学与药剂学方面有广泛的应用前景而倍受青睐,因此,制备尺寸均一并且可以稳定存在的肽纳米球是需首要解决的问题。
目前针对肽纳米球的制备方法主要有以下几种:(1)乳化法;(2)聚合反应法;(3)肽分子自组装法。乳化法需要创造油水混溶体系并且往往需要有表面活性剂的参与,而聚合反应虽不需创造油水混合体系,但往往也需要加入引发剂,这两种方法中的表面活性剂与引发剂基本不具有生物兼容性,在纳米球制备之后又不容易去除,因此会产生一定的细胞毒性,大大降低肽纳米球的生物相容性。肽分子自组装法虽不像以上两种方法需借助于特殊分子的作用,但其肽分子自身的合成与分离通常会有一定难度,而且该方法只能针对特定某一个分子,不具有普适性。并且这些肽纳米球往往不具有自发光性质,不利于肽纳米球在生物体内的定位与实时观察。以上方法制备的肽纳米球存在着或多或少不利因素而限制了其在生物科学与药剂学方面的应用,因此获得生物相容性好并且稳定性好的肽纳米球对其在生命科学领域的应用具有重大意义。
当前,针对自发光肽纳米球研究主要集中于自发荧光的性质层面上,制备的基本思路是向其中引入拥有荧光特性的物质后,再将其制备成纳米球,主要方法包括如下两种:(1)将量子点与肽分子混合后再通过物理方法使其共组装形成纳米球;(2)通过荧光分子如异硫氰酸荧光素(FITC)对肽分子进行标记后再将其组装成肽纳米球,但是这两种方法都引入了外源物,这样不仅使肽纳米球的制备复杂化,而且外源引入的物质必然会对生物体产生不可忽视的影响,这些不利因素都严重影响了肽纳米球的应用。因此,发展一种简单易行而且不引入外源物的自发荧光肽纳米球的制备方法是非常有必要的。
苯丙氨酸的二聚体(二苯丙氨酸)被发现是阿尔兹海默症Aβ-淀粉样多肽成纤维的主要识别基序,自从二苯丙氨酸被发现以来,基于二苯丙氨酸的多种功能性纳米结构已被获得,如:纳米管、囊泡、纳米纤维、纳米带与图案化等,这些纳米结构可以应用于无机纳米材料的制备、基因运输、生物成像、细胞三维培养等方面(参见Chem.Soc.Rev.2010,39,1877-1890,Self-assembly and application of diphenylalanine-basednanostructure),但是迄今基于二苯丙氨酸的自发荧光纳米球却鲜有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种自发荧光的纳米球及其制备方法与应用。
本发明提供的自发荧光的纳米球,由生物肽或生物氨基酸与交联剂反应制备而得;
其中,所述生物肽为苯丙氨酸的二聚体(也即二苯丙氨酸)或二苯丙氨酸羧基端酰胺化的盐酸盐(也即阳离子二肽);
所述生物氨基酸为苯丙氨酸;
所述交联剂为脂肪族二醛的水溶液。
具体的,所述交联剂的质量百分浓度为20-30%,具体为25%;
所述脂肪族二醛为戊二醛或丁二醛;
所述二苯丙氨酸的构型均为L型。
所述纳米球为实心纳米球,直径为350-550nm,具体为450nm;
所述荧光为红色荧光、蓝色荧光和绿色荧光中的至少一种,上述荧光的激发光波长可为405nm。
本发明提供的制备所述自发荧光的纳米球的方法,包括如下步骤:
1)将所述生物肽或生物氨基酸溶于溶剂a形成溶液a;
2)将所述交联剂用溶剂b稀释形成溶液b;
3)将步骤1)所得溶液a与步骤2)所得溶液b混匀进行席夫碱反应,反应完毕得到所述自发荧光的纳米球。
上述方法的步骤1)中,溶解生物肽的溶剂a选自六氟异丙醇和二甲基亚砜中的至少一种;
含生物肽的溶液a中,生物肽的浓度为100mg/ml~150mg/ml,具体为125mg/ml;
溶解生物氨基酸的溶剂a为水,具体为超纯水;
含有生物氨基酸的溶液a中,生物氨基酸的浓度为5mg/ml~50mg/ml,具体为40mg/ml。
所述步骤2)中,溶剂b选自水、乙醇和甲醇中的至少一种;
所述溶液b的质量百分浓度小于25%,具体为0.06-0.6%。
所述生物肽与交联剂的投料摩尔比为5:1~1:5,具体为1:1。
所述生物氨基酸与交联剂的投料摩尔比为10:1~1:10,具体为1:1。
所述反应为席夫碱反应;所述反应步骤中,温度为室温到90℃,具体为65℃,时间为大于12小时,具体为24小时。
另外,上述本发明提供的自发荧光的纳米球在荧光标记中的应用及在制备荧光标记材料或具有生物相容性的荧光标记材料中的应用,也属于本发明的保护范围。
本发明利用自组装技术,借助共价键与芳香环作用等相互作用,通过一步法简单的制备了自发荧光肽纳米球,该方法不仅不需要乳化剂或引发剂的加入,而且不需要引入外援发光物质:如量子点与荧光素等,简化了制备步骤。
本发明提供的纳米球,具有如下优点:
(1)稳定性好:通过向二苯丙氨酸羧基端酰胺化的盐酸盐阳离子二肽纳米球(CDPNSs)浊液中滴加NaOH后发现该纳米球可以在pH为3到8的溶液中可以稳定存在,之后将一定量该纳米球浸泡于细胞培养介质中,间隔相同时间进行动态光散射表征,发现其在细胞培养介质中可以稳定存在10天以上。
(2)好的生物兼容性与生物可降解性:CDPNSs纳米球与细胞共培养10天后,细胞仍能保持90%以上的成活率,表现出非常好的生物相容性,而且被细胞内吞的CDPNSs纳米球可以直接被细胞分解。
(3)自发荧光:由于该方法在制备肽纳米球的过程中有席夫碱键的生成,因而使纳米球表现出自发荧光的性质。
附图说明
图1为CDPNSs纳米球制备过程中涉及的反应方程式。
图2是肽纳米球制备过程示意图。
图3是自然干燥CDPNSs纳米球扫描电镜图。
图4是自然干燥CDPNSs纳米球透射电镜图。
图5是CDPNSs纳米球的激光共聚焦图,A、B、C为通过405nm激光激发样品时分别于蓝色(430-480nm)、绿色(500-550nm)与红色(590-64-nm)通道收集的荧光图,D为A、B、C三通道的荧光叠加图,表明其有自发荧光性质。
图6是CDPNSs纳米球在含胰蛋白酶的PBS中培养不同时间的透射电镜图。
图7是CDPNSs纳米球生物相容性评价图:CDPNSs纳米球与Hela细胞(a)或COS-7细胞(b)共培养十天后,两种细胞都能保持90%以上的成活率,说明CDPNSs纳米球有非常好的生物相容性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述,但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。所用苯丙氨酸的二聚体(二苯丙氨酸)的英文名为di-L-phenylalanine(Phe-Phe),购自Sigma公司,货号为P4126;二苯丙氨酸羧基端酰胺化的盐酸盐(阳离子二肽)的英文名为cationic dipeptide(H-Phe-Phe-NH2·HCl),购自Bachem公司,货号为G-2930。
实施例1、二苯丙氨酸纳米球(FFNSs)的制备
1)将1mg生物肽二苯丙氨酸溶于8μl六氟异丙醇中,得到生物肽的六氟异丙醇溶液(也即溶液a),浓度为125mg/ml,4℃存放24小时以上使其充分溶解;
2)将1.2μl质量百分浓度为25%的戊二醛的水溶液通过超纯水稀释到500μl,得到溶液b,浓度为0.06%;二苯丙氨酸与戊二醛的投料摩尔比为1:1;
3)将溶液b于65℃水浴加热至恒温充分溶解后,加入到溶液a中,经席夫碱反应,室温静置24小时老化后,溶液变为淡黄色浊液,离心既得FFNSs。
实施例2、阳离子二肽纳米球(CDPNSs)的制备
1)将1mg阳离子二肽溶于8μl六氟异丙醇中,得到生物肽的六氟异丙醇溶液(也即溶液a),浓度为125mg/ml,4℃存放24小时以上使其充分溶解;
2)将1.2μl质量百分浓度为25%的戊二醛的水溶液通过超纯水稀释到500μl,得到溶液b,浓度为0.06%;阳离子二肽与戊二醛的投料摩尔比为1:1;
3)将溶液b于65℃水浴加热至恒温充分溶解后,加入到溶液a中,经席夫碱反应,室温静置24小时老化后,溶液变为淡黄色浊液,离心既得CDPNSs。该方法涉及的反应如图1所示,具体制备过程如图2所示。
实施例3、苯丙氨酸纳米球(FNSs)的制备
1)将20mg生物氨基酸苯丙氨酸溶于500μl超纯水中,得到苯丙氨酸的水溶液(也即溶液a),浓度为40mg/ml,4℃存放24小时以上使其充分溶解;
2)将12μl质量百分浓度为25%的戊二醛的水溶液通过超纯水稀释到500μl,得到溶液b,浓度为0.6%;苯丙氨酸与戊二醛的投料摩尔比为1:1;
3)将溶液b于65℃水浴加热至恒温充分溶解后,加入到溶液a中,经席夫碱反应,室温静置24小时老化后,溶液变为淡黄色浊液,离心既得FNSs。
实施例4、实施例2所得CDPNSs纳米球的表征
CDPNSs纳米球扫描电镜表征:将5μl经过离心洗涤的纳米球悬浊液滴于硅片表面,真空将其抽干后,通过导电胶固定于样品台,通过溅射仪向其表面喷洒Au颗粒后于HITACHI S-4800扫描电镜显微镜下观察,其加速电压为10kV。
由图3可知,所得材料为纳米球状结构并且具有非常好的单分散性。
CDPNSs纳米球透射电镜表征:将5μl经过离心洗涤的纳米球悬浊液滴于铜网表面于真空将其抽干后于JEOL JEM-1011透射电镜显微镜下观察,其加速电压为100kV。
由图4可知,所得纳米球为实心纳米球,直径为450nm。
CDPNSs纳米球激光共聚焦表征:将20μl纳米球稀释至1ml后加入到共聚焦培养皿内,5分钟后于Olympus FV500共聚焦显微镜下选用405nm激光器激发,在对应波长范围内观察。
所得结果如图5所示。
由图可知,当用405nm激光激发纳米球时,在三个发射通道蓝光(A)、绿光(B)和红光(C)都观察到了明显的荧光,说明该方法制备的纳米球有强的自荧光性质,D图为A、B、C三通道的叠加图。
CDPNSs纳米球体外纳米球降解测试:将一定量CDPNSs纳米球置于含胰酶PBS溶液中于37℃培养0天,1天,4天和10天后,取5μl滴于碳膜覆盖的铜网上真空抽干后于JEOL JEM-1011透射电镜显微镜下观察,其加速电压为100kV。
所得结果如图6所示。
由图可知,开始时CDPNSs纳米球表面光滑,随着培养时间增长,CDPNSs纳米球表面出现了不同大小的洞,当培养时间延长至10天时,CDPNSs纳米球基本消失而且只能发现少量纳米球的边缘,说明CDPNSs纳米球可以在酶的作用下而分解。
实施例1和3所得纳米球的表征结果与上无实质性差别,不再赘述。
将实施例2所得CDPNSs纳米球进行生物相容性测试:选用人宫颈癌细胞(Hela)与非洲绿猴肾成纤维细胞(COS-7)为例进行纳米球生物相容性测试。
具体步骤如下:将细胞置于聚苯乙烯(Corning)培养皿中,在37℃培养箱(STERI371,Thermo Electron Corporation)且含有5%(v/v%)CO2的湿空气中培养,培养基中含10%(v/v%)的胎儿牛血清,1%的链霉素和青霉素。当细胞丰度达到90%时,用标准的消化技术经PBS洗涤、消化与离心后将细胞种于多个96培养孔板,24小时后,吸去原培养液,换新液,其中一行中不加入任何样品,作为参比样,另外几行中分别加入不同体积(5、10、15、20、25、30μl)CDPNSs纳米球(2mg/ml)样品,继续培养2天、4天、7天与10天后测细胞相对成活率,进而反映出纳米球的生物相容性。
为了测定细胞的成活率,每孔中各加入20μl5mg/ml MTT溶液,在培养箱中避光继续孵育4h后,去除所有孔中的液体,然后在每个孔中加入400μL DMSO,震荡20min使沉淀于培养板底部的MTT-甲臜晶体充分溶解。
随后通过酶标仪检测其在490nm处的吸光度值,吸光度与活细胞数量成正比,以没有加纳米球的孔中的细胞成活率计为100%,通过吸光度作比计算加入纳米球的孔中的细胞相对成活率。
所得结果如图7所示。
由图可知,两种细胞的成活率都保持于90%以上,说明CDPNSs纳米球有非常好的生物相容性。
Claims (9)
1.一种自发荧光的纳米球,由生物肽或生物氨基酸与交联剂反应制备而得;
其中,所述生物肽为苯丙氨酸的二聚体或二苯丙氨酸羧基端酰胺化的盐酸盐;
所述生物氨基酸为苯丙氨酸;
所述交联剂为脂肪族二醛的水溶液。
2.根据权利要求1所述的纳米球,其特征在于:所述交联剂的质量百分浓度为20-30%,具体为25%;
所述脂肪族二醛为戊二醛或丁二醛;
所述二苯丙氨酸的构型均为L型;
所述纳米球为实心纳米球,直径为350-550nm,具体为450nm;
所述荧光为红色荧光、蓝色荧光和绿色荧光中的至少一种。
3.一种制备权利要求1-2任一所述自发荧光的纳米球的方法,包括如下步骤:
1)将所述生物肽或生物氨基酸溶于溶剂a形成溶液a;
2)将所述交联剂用溶剂b稀释形成溶液b;
3)将步骤1)所得溶液a与步骤2)所得溶液b混匀进行席夫碱反应,反应完毕得到所述自发荧光的纳米球。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于:所述步骤1)中,溶解生物肽的溶剂a选自六氟异丙醇和二甲基亚砜中的至少一种;
含生物肽的溶液a中,生物肽的浓度为100mg/ml~150mg/ml,具体为125mg/ml;
溶解生物氨基酸的溶剂a为水,具体为超纯水;
含有生物氨基酸的溶液a中,生物氨基酸的浓度为5mg/ml~50mg/ml,具体为40mg/ml。
5.根据权利要求3或4所述的方法,其特征在于:所述步骤2)中,溶剂b选自水、乙醇和甲醇中的至少一种;
所述溶液b的质量百分浓度小于25%,具体为0.06%-0.6%。
6.根据权利要求3-5任一所述的方法,其特征在于:所述生物肽与所述交联剂中脂肪族二醛的投料摩尔比为5:1~1:5;
所述生物氨基酸与所述交联剂中脂肪族二醛的投料摩尔比为10:1~1:10。
7.根据权利要求3-6任一所述的方法,其特征在于:所述反应步骤中,温度为室温到90℃,具体为65℃,时间为大于12小时,具体为24小时。
8.权利要求1-2任一所述自发荧光的纳米球在荧光标记中的应用。
9.权利要求1-2任一所述自发荧光的纳米球在制备荧光标记材料或具有生物相容性的荧光标记材料中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410258182.2A CN104031636B (zh) | 2014-06-11 | 2014-06-11 | 一种自发荧光的纳米球及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410258182.2A CN104031636B (zh) | 2014-06-11 | 2014-06-11 | 一种自发荧光的纳米球及其制备方法与应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104031636A true CN104031636A (zh) | 2014-09-10 |
CN104031636B CN104031636B (zh) | 2015-08-12 |
Family
ID=51462639
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201410258182.2A Active CN104031636B (zh) | 2014-06-11 | 2014-06-11 | 一种自发荧光的纳米球及其制备方法与应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN104031636B (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106242995A (zh) * | 2016-07-25 | 2016-12-21 | 中国科学院化学研究所 | 一种具有pH响应的可快速释放客体分子的纳米载体及其制备方法与应用 |
CN115282120A (zh) * | 2022-08-12 | 2022-11-04 | 山东大学 | 一种席夫碱超分子组装纳米颗粒及其作为递送载体的应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006118876A2 (en) * | 2005-05-02 | 2006-11-09 | Nalco Company | Method for using an all solid-state fluorometer in monitoring and controlling chemicals in water |
CN102408445A (zh) * | 2011-06-15 | 2012-04-11 | 东北林业大学 | 六氨基酸酯苯氧基环三磷腈和其荧光纳米微球及制备方法 |
CN102533256A (zh) * | 2012-02-21 | 2012-07-04 | 上海瑞靖环境技术发展有限公司 | 一种荧光标记示踪剂及其制备方法 |
-
2014
- 2014-06-11 CN CN201410258182.2A patent/CN104031636B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006118876A2 (en) * | 2005-05-02 | 2006-11-09 | Nalco Company | Method for using an all solid-state fluorometer in monitoring and controlling chemicals in water |
CN102408445A (zh) * | 2011-06-15 | 2012-04-11 | 东北林业大学 | 六氨基酸酯苯氧基环三磷腈和其荧光纳米微球及制备方法 |
CN102533256A (zh) * | 2012-02-21 | 2012-07-04 | 上海瑞靖环境技术发展有限公司 | 一种荧光标记示踪剂及其制备方法 |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106242995A (zh) * | 2016-07-25 | 2016-12-21 | 中国科学院化学研究所 | 一种具有pH响应的可快速释放客体分子的纳米载体及其制备方法与应用 |
CN115282120A (zh) * | 2022-08-12 | 2022-11-04 | 山东大学 | 一种席夫碱超分子组装纳米颗粒及其作为递送载体的应用 |
CN115282120B (zh) * | 2022-08-12 | 2023-11-24 | 山东大学 | 一种席夫碱超分子组装纳米颗粒及其作为递送载体的应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN104031636B (zh) | 2015-08-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Zhang et al. | Supramolecular self-assembly bioinspired synthesis of luminescent gold nanocluster-embedded peptide nanofibers for temperature sensing and cellular imaging | |
JP6494794B2 (ja) | ウイルス検出用キット | |
Ren et al. | Self-assembling small molecules for the detection of important analytes | |
Dubavik et al. | Penetration of amphiphilic quantum dots through model and cellular plasma membranes | |
Reches et al. | Formation of closed-cage nanostructures by self-assembly of aromatic dipeptides | |
Aubert et al. | Bright and stable CdSe/CdS@ SiO2 nanoparticles suitable for long-term cell labeling | |
Tovar et al. | Probing the interior of peptide amphiphile supramolecular aggregates | |
Kubota et al. | Microscopic imaging techniques for molecular assemblies: electron, atomic force, and confocal microscopies | |
CN107389636B (zh) | 一种可检测内源性谷胱甘肽的荧光传感器的制备及应用 | |
Cardoso Dos Santos et al. | Lanthanide-complex-loaded polymer nanoparticles for background-free single-particle and live-cell imaging | |
Wang et al. | Biocompatible fluorescent supramolecular nanofibrous hydrogel for long-term cell tracking and tumor imaging applications | |
Kuo et al. | Studies of intracorneal distribution and cytotoxicity of quantum dots: risk assessment of eye exposure | |
Liu et al. | Incorporation of tyrosine phosphate into tetraphenylethylene affords an amphiphilic molecule for alkaline phosphatase detection, hydrogelation and calcium mineralization | |
CN107920964A (zh) | 融合脂质体包被的多孔硅纳米颗粒 | |
CN101939329A (zh) | 以氨基酸配对为基础的自组装肽和方法 | |
Chang et al. | Ratiometric fluorescent carbon dots for enantioselective sensing of L-lysine and pH discrimination in vivo and in vitro | |
Su et al. | Multi-dimensional correlative imaging of subcellular events: combining the strengths of light and electron microscopy | |
Sloan-Dennison et al. | Protein corona-resistant SERS tags for live cell detection of integrin receptors | |
Howes et al. | Synthesis, characterisation and intracellular imaging of PEG capped BEHP-PPV nanospheres | |
Zhang et al. | Simultaneous single-particle tracking and dynamic pH sensing reveal lysosome-targetable mesoporous silica nanoparticle pathways | |
CN104826126A (zh) | 一种制备高机械强度的三组分荧光水凝胶的方法 | |
Chiou et al. | Fluorescent silica nanoparticles to label metastatic tumor cells in mineralized bone microenvironments | |
CN106947471A (zh) | 一种水溶性的金纳米簇荧光材料、制备方法及应用 | |
EP2924434B1 (en) | Cell analysis method | |
Nishikawa et al. | Nitric oxide release in human aortic endothelial cells mediated by delivery of amphiphilic polysiloxane nanoparticles to caveolae |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |