CN104027820B - 一种miRNA在治疗或诊断高脂血症及动脉硬化疾病中的应用 - Google Patents

Abstract

因此本发明提供一种miRNA在治疗或诊断高脂血症及动脉硬化疾病中的应用，其特征在于，所述miRNA是miRNA‑133a。这一功能的发现对于高脂血症、动脉粥样硬化等心血管疾病的诊断和治疗都有着极其重要的意义。

Description

一种miRNA在治疗或诊断高脂血症及动脉硬化疾病中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学专业领域，具体涉及一种miRNA、miRNA的前体RNA、miRNA反义寡核苷酸序列及其表达载体，以及在诊断和治疗心血管疾病中的用途。

背景技术

心血管疾病是危害人类健康的严重疾病，是造成死亡的主要原因之一。目前，在我国居民的死亡谱中，心血管疾病已经成为仅次于恶性肿瘤的第二号杀手，并且每年另有数以万计的人因患该病导致残疾。该病种类繁多、病因复杂。人们在日常生活中，由于多种原因造成过多的脂肪在血管内壁沉积，导致血管壁增厚，影响血液流动。更为危险的是，血液中过多的脂质会逐步侵蚀血管壁，造成动脉硬化。随着动脉硬化病情的加深，血管壁会进一步硬化，血管壁上的脂质沉积也会逐渐增加；同时，由于此时体内含有过多脂质的血液比较粘稠，因此会造成血管的阻塞，使血液不能正常通过而形成血栓。血栓如出现在大脑中、或脑动脉硬化破裂，可造成大脑局部缺血坏死，即中风；视坏死脑区不同，轻则口眼歪斜、半身不遂，重者死亡。血栓如发生在心脏里，则造成心脏局部缺血坏死，发生心肌梗塞，预后不良。心血管疾病发展到后期，由于心脏长期泵血不良，全身器官都可能淤血缺氧而遭到不同程度的损害。肺部淤血造成易发肺部感染，肝脏长期淤血缺氧可出现肝硬化，高血压造成肾衰等多种并发症，这些症状又反过来加重心血管疾病病情。如心血管疾病合并高血压、糖尿病等疾病，将对身体产生更为严重的危害。

心血管疾病发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高、并发症多，严重威胁人类的生命和健康。因此，世界各国对心脑血管疾病的研究、预防及治疗均十分重视。

微小RNA(miRNA或microRNA)是一种长度为18～25个核苷酸单链的内源性非编码性小RNA，是由前体在酶的加工下生成，前体的序列一般为70～120个核苷酸。通过与靶基因序列特异性相互作用在转录水平调节基因表达，参与多种生物学过程，进化过程保守。最初发现的内源性miRNA是lin24和let27，它们参与基因表达转录后调节，通过与靶mRNA的3′端非编码区或编码区相结合而发挥负性调节作用。近年来已经鉴定出超过400种miRNA，但仍有很多种尚未被发现[Berezikov E，Thuemmler F，van Laake LW，et al.Diversity ofmicroRNAs in human and chimpanzee brain[J].Nat Genet，2006，38(12)：1375-1377.]。对miRNA空间表达的系统性分析表明，很多miRNAs以组织特异性方式表达[Wienholds E，KloostermanWP，Miska E，et al.MicroRNA expression in zebrafish embryonicdevelopment[J].Science，2005，309(5732)：310-311.]。每一种miRNA可以定位于很多种mRNA，使其转录抑制或降解，因此很多种转录子可能受到miRNA的精细调节，使转录-翻译系统有效运转，进而细胞得以快速而有效地控制阈值依赖性的细胞事件。目前普遍认为miRNA的功能是参与生命的一些基本过程如生长发育、器官形成、造血、细胞增殖与凋亡、应激反应和肿瘤生成等。

最初科学家们发现miRNA与细胞的癌变有着极为密切的关系，对肿瘤抑制基因起作用的miRNA下降或者缺失会导致肿瘤的发生。已发现的的miRNA与肺癌、乳腺癌、结肠癌、慢性淋巴细胞白血病等多种癌症密切相关。2006年末，科学家开始注意到miRNA在心脏疾病发生发展过程中所起的重要作用[Van Rooij E，Sutherland LB，L iu N，et al.Asignature pattem of stress-responsive microRNAs that can evoke cardiachypertrophy and heart failure[J].PNAS，2006，103：18255-18260.]，并在心律失常、心力衰竭等疾病的研究中取得了一系列重要进展，使miRNA成为国际心血管研究领域的热点。

心血管疾病相关miRNA的发现可能对该疾病的相关基因治疗产生重大的影响。通过对心血管疾病患者和正常人群的miRNA差异表达分析，可以鉴定得到相关的敏感miRNA，进而通过引入特异性的miRNA互补的反义核苷酸抑制或者通过病毒载体或质粒载体过表达的方法，调控相关miRNA或其前体的表达量，从而达到治疗心血管疾病的目的。因此，发现特异性表达的miRNA对于心血管疾病的诊断和治疗具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种miRNA对于治疗和诊断高脂血症及动脉硬化疾病新用途。本发明人经潜心研究，发现如下SEQ ID1、SEQ ID2、SEQ ID3、SEQ ID4能够用于治疗和诊断高脂血症及动脉硬化疾病，尤其是作为医药组合物，对于治疗和诊断高脂血症及动脉硬化疾病取得了意想不到的技术效果，从而完成了本发明。

具体的说，本发明所提供的人源miRNA-133a(has-miRNA-133a)和鼠源miRNA-133a(mmu-miR-133a)均包含如下序列：

5’-UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG-3’(SEQ ID5)。

本发明所提供的人源miRNA-133a的前体RNA有2种，包含如下序列：

hsa-mir-133a-1 (MI0000450)

5’-ACAAUGCUUUGCUAGAGCUGGUAAAAUGGAACCAAAUCGCCUCUUCAAUGGAUUUGGUCCCCUUCAACCAGCUGUAGCUAUGCAUUGA-3’

SEQ ID1

hsa-mir-133a-2 (MI0000451)

5’-GGGAGCCAAAUGCUUUGCUAGAGCUGGUAAAAUGGAACCAAAUCGACUGUCCAAUGGAUUUGGUCCCCUUCAACCAGCUGUAGCUGUGCAUUGAUGGCGCCG-3’ SEQ ID2

本发明所提供的鼠源miRNA-133a的前体RNA有2种，包含如下序列：

mmu-mir-133a-1 (MI0000159)

5’-GCUAAAGCUGGUAAAAUGGAACCAAAUCGCCUCUUCAAUGGAUUUGGUCCCCUUCAACCAGCUGUAGC-3’

mmu-mir-133a-2 (MI0000820) SEQ ID3

5’-AGAAGCCAAAUGCUUUGCUGAAGCUGGUAAAAUGGAACCAAAUCAGCUGUUGGAUGGAUUUGGUCCCCUUCAACCAGCUGUAGCUGCGCAUUGAUCACGCCGCA-3’ SEQ ID4

本发明所提供的人源miRNA-133a(has-miRNA-133a)和鼠源miRNA-133a(mmu-miR-133a)的反义寡核苷酸均包含如下序列：

5’-CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA-3’(SEQ ID6)。

本发明所提供的人源miRNA-133a的前体hsa-mir-133a-1在人染色体上定位于18q11.2，前体hsa-mir-133a-2定位于人染色体20q13.33。

本发明以人外周血单核细胞、C57/BL6J野生型小鼠(WT小鼠)，高脂血症模型ApoE基因敲除小鼠(ApoE-/-小鼠)心脏、大动脉血管为材料进行miRNA分子的克隆分析。采用常规分子生物学技术，从细胞和组织中提取总RNA，经过特异性的引物进行反转录和PCR扩增。荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测结果表明，miRNA-133a在高脂状态下其表达量明显降低；运用特异性互补的反义核苷酸抑制miRNA-133a及其前体的表达，由大动脉血管分离所得的血管平滑肌细胞(VSMC)的增殖和分化受到明显的抑制。而运用合成的miRNA-133a前体RNA增加细胞内miRNA-133a的表达，可以明显的促进VSMC的增殖和分化。

高脂血症、动脉粥样硬化的病人由于血管中的血脂含量极高，而受损的血管壁细胞正常的增殖和分化受到抑制，不能及时地修补受损的血管从而造成脂质积聚和动脉硬化加速发展，最终导致中风、心肌梗死等严重后果。高脂血症、动脉粥样硬化病人外周血单核细胞内的miRNA-133a的表达量特异性的降低，利用这一特征性的表现可以将其作为诊断高脂血症和动脉硬化的指征；由于miRNA-133a对于血管细胞的增殖和分化有明显的调节作用，因此能够运用病毒载体或质粒载体过表达的方法，将病人血管细胞中的miRNA-133a表达量增加，使其能够正常的增殖和分化，及时修补受损的血管壁进而有效的控制高脂血症和动脉硬化病情的发展。miRNA-133a这一功能的发现对于高脂血症、动脉粥样硬化等心血管疾病的诊断和治疗都有着极其重要的意义。

因此本发明提供一种miRNA在治疗或诊断高脂血症及动脉硬化疾病中的应用，其特征在于，所述miRNA是miRNA-133a。所述miRNA的序列为SEQ ID1、SEQ ID2、SEQ ID3或SEQID4。

并且，将SEQ ID1、SEQ ID2、SEQ ID3和SEQ ID4分别应用于受试体时，本发明人惊奇地发现，将人源序列SEQ ID1、SEQ ID2与鼠源序列SEQ ID3、SEQ ID4混合后再使用，与单独使用所述4段序列相比，其对血管平滑肌细胞(VSMC)的增殖和分化的促进效果更为显著。虽然，目前对于不同来源的miRNA-133a序列的混合作用为什么效果更显著的机理还不是十分清楚，但是本发明人认为不同来源的序列，对于作用的靶标的特异性位点有协同效果，或者起到相互竞争的关系，导致与靶基因序列特异性相互作用起到正相关效果，从而在转录水平更加调节基因表达，其结果更加有效和快速地修复了受损的血管壁，进而更加有效地控制了高脂血症和动脉硬化的发展。使得miRNA在治疗或诊断高脂血症及动脉硬化疾病中取得更加显著的效果。

附图说明

图1.高脂血症、动脉粥样硬化等心血管疾病人外周血单核细胞内miRNA-133a的表达量明显降低。*：p<0.05，与对照组相比有统计学意义

图2.高脂血症和动脉硬化疾病模型ApoE-/-小鼠血管中miR-133a的表达量明显降低。*：p<0.05，与对照组相比有统计学意义

图3.WT小鼠和ApoE-/-小鼠动脉血管平滑肌细胞(VSMC)的分离和免疫荧光鉴定

(DAPI为细胞核荧光染料，TRITC为VSMC特异性抗体所带荧光)

上：为阴性对照；非VSMC细胞不能观测到荧光，只有细胞核被染色，前两张图片叠加后只能观测到细胞核荧光。

中：为WT小鼠VSMC的免疫荧光照片；VSMC既可以观测到细胞核荧光，也可以观测到抗体所带的红色荧光。第三张图片为前两张图片的叠加。

下：为ApoE-/-小鼠VSMC的免疫荧光照片；VSMC既可以观测到细胞核荧光，也可以观测到抗体所带的红色荧光。第三张图片为前两张图片的叠加。

图4.高脂状态(oxLDL50ug/ml)培养WT和ApoE-/-小鼠VSMC细胞内miR-133a的表达量。*：p<0.05，与相应的对照组相比有统计学意义。

图5.运用miRNA-133a的反义寡核苷酸序列anti-miR-133a，可以降低细胞内miRNA-133a的表达。*：p<0.05，与对照组相比有统计学意义。

图6.降低细胞内miRNA-133a的表达水平将抑制VSMC细胞的增殖和分化(普通光学显微镜观察细胞数量和形态)

图7.降低细胞内miRNA-133a的表达水平将抑制VSMC细胞的增殖和分化(荧光显微镜观察细胞数量和形态)

图8.运用miRNA-133a的前体RNA pre-miR-133a，可以增加细胞内miRNA-133a的表达。*：p<0.05，与对照组相比有统计学意义。

图9.增加细胞内miRNA-133a的表达水平将促进VSMC细胞的增殖和分化(荧光显微镜观察细胞数量和形态)

图10.不同方式培养的野生型WT小鼠VSMC细胞生长曲线

图11.不同方式培养的ApoE-/-基因敲除小鼠VSMC细胞生长曲线

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步阐述。

本发明所公开的RNA序列均能够以人工合成的方法或其它生物学方法获得。

实施例1

健康人与高脂血症动脉硬化病人外周血单核细胞内miRNA-133a表达量比较。

(1)人外周血单核细胞分离

采用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单核细胞，具体操作方式如下：

1)在离心管中加入适量Ficoll分离液。

2)取肝素抗凝静脉血与2倍体积的磷酸缓冲液(PBS)充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心800g×30分钟。

3)离心后管内分为三层，上层为血浆和PBS，下层主要为红细胞和粒细胞。在上、下层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。

4)用吸管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一离心管中，加入5倍以上体积的PBS，室温离心800g×5分钟，洗涤细胞两次。

5)重悬细胞后加入红细胞裂解液，室温放置3分钟后离心800g×5分钟。

6)离心后弃上清，加入不含血清的RPMI1640培养液重悬细胞。室温离心800g×5分钟，不含血清RPMI1640洗涤细胞两次。最后加入含有10％小牛血清的RPMI1640培养液重悬细胞。

7)取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数细胞总数并检测细胞活力。用本法分离PBMC，纯度在90％以上，收获率可达80～90％，活细胞百分率在95％以上

(2)细胞总RNA提取(TRIzol法)

1)收获细胞1-5×107，移入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min。

2)加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。

3)4℃离心，12000g×15min，取上清。

4)加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。

5)4℃离心，12000g×10min，弃上清。

6)加入1ml75％乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清。

7)晾干，加入适量的DEPC H2O溶解(65℃促溶10-15min)。测定OD260和OD280值，初步断定RNA质量。

8)总RNA提取采用无RNA酶的DNA酶I处理，QIAGEN RNeasy试剂盒纯化总RNA，详细操作原理和方法见试剂盒说明书。

(3)qRT-PCR检测细胞内miRNA-133a的表达量。

以人单核细胞总RNA作为模板，用miR-133a特异性的mirVana qRT-PCR引物(AM30032，Ambion)扩增miR-133a基因。使用实时TaqMan miRNA分析检测试剂盒(ABI)进行定量PCR检测细胞内miRNA-133a的表达量，详细操作原理和方法见试剂盒说明书。

实施例2

WT小鼠和ApoE-/-小鼠不同组织miRNA-133a表达量的差异。

1.常规方法分离WT小鼠和ApoE-/-小鼠的心脏(Heart)和主动脉血管(Aorta)。

2.组织总RNA提取(TRIzol法)

取50-100mg组织置1.5ml离心管中，加入1ml Trizol充分匀浆，室温静置5min。后续步骤参照实施例1中步骤(2)中的2)-8)。

3.qRT-PCR检测不同组织中miRNA-133a的表达量

以小鼠心脏和主动脉血管总RNA作为模板，进行qRT-PCR检测。(方法步骤同实施例1中步骤(3))

实施例3

WT小鼠和ApoE-/-小鼠动脉血管平滑肌细胞(VSMC)的分离和免疫荧光鉴定

1)小鼠动脉血管平滑肌细胞(VSMC)的分离

1)常规方法分离小鼠主动脉。在显微镜下用镊子主动脉周围附着的结缔组织露出肌层。将主动脉沿纵轴剪开后再将其剪成1×1mm的小块。

2)将7.5mg胶原蛋白酶(II型)溶解在5.5ml的无血清的新鲜DMEM细胞培养液中，将其用0.22um的微孔滤膜过滤后备用。

3)将剪好的血管组织块放入含有胶原酶的DMEM培养液中。将其置入37℃，5％CO₂的培养箱中孵育4-6小时。

4)从孵箱中取出孵育后的消化组织，加入3ml含血清的DMEM培养液终止消化过程。

5)将组织消化液移入15ml离心管中，室温离心，300g×5min，弃上清。加入5ml含血清的DMEM细胞培养液重悬细胞。

6)将细胞混悬液加入48孔细胞培养板，将其置于标准的细胞培养箱中孵育5天后正常传代培养。

(2)小鼠动脉血管平滑肌细胞(VSMC)的免疫荧光鉴定

1)细胞爬片后用4％多聚甲醛固定10min；PBS漂洗5min；

2)0.5％Triton穿孔15min；PBS漂洗2次，每次5min；

3)1％BSA封闭30min；

4)加入1％BSA稀释的一抗Anti-α-SM-actin，于37℃杂交2h；PBS漂洗2次，每次5min；

5)加入1％BSA稀释的二抗，于37℃杂交1h；PBS漂洗2次，每次5min；

6)5ug/ml DAPI染色2min；

7)抗淬灭封片剂封片后荧光显微镜观察

实施例4

检测VSMC细胞内miR-133a的表达量以及细胞增殖分化情况

(1)检测高脂状态培养WT和ApoE-/-小鼠VSMC细胞内miR-133a的表达量

1)细胞接种于24孔培养板，每孔细胞数4×10⁴。

2)在不含脂质的DMEM培养液中加入ox-LDL使其浓度达到50ug/ml。

3)将其放入标准的细胞培养箱中孵育72小时。

4)收集细胞总RNA进行qRT-PCR检测细胞内miRNA-133a的表达量。具体方法参照实施例2。

(2)运用miRNA-133a的反义寡核苷酸序列anti-miR-133a和前体RNApre-miR-133a调节细胞内miRNA-133a的表达

1)细胞接种于24孔培养板，每孔细胞数4×10⁴。

2)将1ul的转染试剂siPORT NeoFX(AM4510，Ambion)和25ul的OPTI-MEM I培养液(Invitrogen)混合放置于室温孵育10分钟。

3)将反义寡核苷酸序列anti-miR-133a(或者前体RNA pre-miR-133a)用OPTI-MEMI培养液稀释，两者混匀后放置于室温孵育10分钟。运用无功能的miRNA序列处理细胞(Scrambled miRNA，无关序列miRNA)作为对照组。

4)混匀稀释好的anti-miR-133a(或者pre-miR-133a)和转染试剂，放置于室温孵育10分钟使其形成转染复合物。

5)将含有转染复合物的培养液加入细胞培养板，与细胞共同孵育72小时。显微镜观察细胞生长状态。动脉平滑肌细胞分化标志性蛋白α-SM-actin荧光染色，具体方法参照实施例2。

6)收集细胞总RNA进行qRT-PCR检测细胞内miRNA-133a的表达量，具体方法参照实施例2。

(3)不同方式培养小鼠血管平滑肌细胞绘制细胞生长曲线

1)细胞接种于96孔培养板，每孔细胞数1×10⁴。

2)用含有

正常血清、

高脂血清(50ug/ml ox-LDL，含有量下同)、

anti-miR-133a(或者pre-miR-133a)(10ng/ml的miR溶液，取10μl，下同)、

高脂血清和anti-miR-133a(或者pre-miR-133a)、

高脂血清和SEQ ID1、

高脂血清和SEQ ID2、

高脂血清和SEQ ID3、

高脂血清和SEQ ID4、

高脂血清和不同比例混合的SEQ ID1和SEQ ID3)(取10ng/ml的miR溶液混合，总量为10μl，下同)、

高脂血清和不同比例混合的SEQ ID2和SEQ ID4

的DMEM培养液分别培养细胞。

3)分别制作以上种培养方式作用下VSMC细胞生长曲线。一次取3孔细胞，常规消化计数，求其平均值，连续7天，记录结果以及制作VSMC生长曲线。

统计学处理

所有数据以均数±标准差表示，两样本之间比较用t检验，以p<0.05具有统计学意义。

结果：

1.高脂血症、动脉粥样硬化等心血管疾病人外周血单核细胞内miRNA-133a的表达量与正常健康人相比明显降低(图1)。该结果提示：检测外周血中单核细胞内miRNA-133a表达量的方法可以作为诊断高脂血症、动脉粥样硬化的指针。

2.作为高脂血症及动脉硬化研究模型的ApoE-/-小鼠，其主动脉血管的miRNA-133a表达量明显低于正常野生型WT小鼠(图2)。而心脏组织的miRNA-133a表达量没有明显差异。该结果表明miRNA-133a的表达和调控存在有一定的组织特异性。

3.平滑肌细胞分化标志性蛋白α-SM-actin只在成熟的平滑肌细胞中表达，由WT小鼠和ApoE-/-小鼠主动脉分离所得到的平滑肌细胞均可观察到专门针对该蛋白的抗体所产生特异性荧光，细胞分离方法可靠方便(图3)。

4.高脂状态(ox-LDL50ug/ml)培养WT和ApoE-/-小鼠VSMC细胞内miR-133a的表达量明显降低(图4)；miRNA-133a反义寡核苷酸可以抑制miRNA-133a在细胞内的表达水平(图5)，随着miRNA-133a表达量的降低，显微镜观察细胞的增殖和分化受到抑制，细胞数量和形态与相应对照组相比均发生明显的变化(图6和图7)。而miRNA-133a的前体RNA pre-miR-133a可以增加miRNA-133a在细胞内的表达水平(图8)，促进细胞的增殖和分化，细胞数量和形态与相应对照组相比均发生明显的变化(图9)。

5.根据绘制的细胞生长曲线，ApoE-/-小鼠的细胞增殖速度要低于同样方式培养的WT小鼠细胞；高脂和miRNA-133a反义寡核苷酸单独作用时均可抑制细胞的增殖，两者共同作用时效果更为明显。而miRNA-133a的前体RNApre-miR-133a可以促进细胞的增殖，在一定程度上消除高脂对细胞增殖的影响(图10，图11)。

6.各种不同条件下培养的小鼠血管平滑肌细胞结果如下表1(仅显示第5和第7天的结果)，结果显示本发明的SEQ ID1、SEQ ID2、SEQ ID3和SEQ ID4均能帮助恢复小鼠血管平滑肌细胞的增长，并且将不同来源的上述miRNA-133a序列混合使用时，效果更为显著。

表1培养第5天和第7天时的小鼠血管平滑肌细胞数

Claims (3)

1.不同物种来源的miRNA在制备治疗高脂血症及动脉硬化疾病药物中的应用，其特征在于，所述不同物种来源的miRNA是人源miRNA-133a和小鼠源miRNA-133a，

所述应用是将所述不同物种来源的miRNA混合应用，

所述人源miRNA-133a的序列为SEQ ID1、SEQ ID2；

所述小鼠源miRNA-133a的序列为SEQ ID3、SEQ ID4，

所述混合应用是将选自SEQ ID1、SEQ ID2中的1种或2种人源miRNA，与选自SEQ ID3、SEQ ID4中的1种或2种小鼠源miRNA进行混合，

所述混合应用中，所述人源miRNA与所述小鼠源miRNA的混合比例为1∶9～9∶1。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，

所述miRNA能够促进血管平滑肌细胞(VSMC)的增殖和分化。

3.一种治疗高脂血症及动脉硬化疾病的药物组合物，其特征在于，含有药学上可接受的载体和有效量的不同物种来源的miRNA，

所述不同物种来源的miRNA是人源miRNA-133a和小鼠源miRNA-133a，并将不同物种来源的miRNA-133a进行混合应用，

所述人源miRNA-133a的序列为SEQ ID1、SEQ ID2；

所述小鼠源miRNA-133a的序列为SEQ ID3、SEQ ID4，

所述混合应用是将选自SEQ ID1、SEQ ID2中的1种或2种人源miRNA，与选自SEQ ID3、SEQ ID4中的1种或2种小鼠源miRNA进行混合，

所述混合应用中，所述人源miRNA与所述小鼠源miRNA的混合比例为1∶9～9∶1。