CN104027345A - 具有镇咳活性的细辛总多糖提取物及其提取方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物技术领域，公开了一种具有镇咳活性的细辛总多糖提取物及其制备方法和用途。该细辛总多糖提取物是用极性溶剂提取细辛的根与/或根茎，乙醇沉淀，减压干燥，得到细辛总多糖，得率为15wt%，总多糖含量为60wt%-80wt%。发明人通过大量的药效学试验首次证明细辛总多糖提取物具有显著抑制咳嗽的作用，接近可待因的治疗效果，延长咳嗽潜伏期的作用强于可待因，而且还首次发现细辛总多糖提取物具有降低咳嗽的敏感性、抑制气道炎症的作用，对各型咳嗽具有良好的预防和治疗作用，可以用于制备治疗咳嗽相关疾病的药物。本发明活性明确、实验材料来自原植物，成本低。

Description

具有镇咳活性的细辛总多糖提取物及其提取方法和应用
技术领域
本发明属于药物技术领域，更具体而言，涉及一种具有镇咳活性的细辛总多糖提取物及其提取方法和应用。
背景技术
由于工作压力、空气环境污染等诸多因素影响，人类呼吸系统疾病的发病率居高不下，而咳嗽是呼吸系统常见病、多发病，是呼吸科门诊的常见主诉。咳嗽本身是呼系统受到刺激时产生的一种防御性反射活动，是一种有益的动作，有时亦见于健康人群。一般情况下，对于轻度而不频繁的咳嗽无须应用止咳药便可自然缓解。此外，咳嗽对人体健康的影响亦是辩证的，也是一种病理性的反应，长期频繁或过于激烈的咳嗽不仅会增加患者的痛苦，影响休息和睡眠，增加体力消耗，严重时还会促进疾病的发展，产生其他并发症。
根据病程的不同，咳嗽可分为急性、亚急性与慢性咳嗽。急性咳嗽<3周，亚急性咳嗽3-8周，慢性咳嗽≥8周。1）急性咳嗽：目前一般认为急性上呼吸道病毒感染是最常见的病因，其他包括鼻炎、鼻窦炎、急性支气管炎、慢性支气管炎急性发作、支气管哮喘等。上呼吸道感染最常见的病原体是鼻病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒和肠病毒等，其中以鼻病毒最常见。急性咳嗽也可能与哮喘、支气管炎以及其他呼吸系统疾病的急性发作有关。临床上，常可见到不少以急性咳嗽为前驱表现的传染病或其他一些疾患；2）亚急性咳嗽：最常见原因是感染后咳嗽（又称感冒后咳嗽）、细菌性鼻窦炎和哮喘等。作为病原体的病毒以鼻病毒多见，约占30%～50%；其次为冠状病毒和流感病毒，分别为10%～15%和5%～15%。除了呼吸道病毒外，肺炎支原体和肺炎衣原体等亦可导致感染后咳嗽；3）慢性咳嗽：临床上通常将慢性咳嗽定义以咳嗽为唯一症状或主要症状、时间大于8周、胸部X线检查无明显异常者，称为不明原因慢性咳嗽，简称慢性咳嗽。在专科门诊中，慢性咳嗽的比例高达10%-38%。欧美各国的问卷调查显示慢性咳嗽发生率也高达9%-33%。常见病因为嗜酸粒细胞性支气管炎（EB）、上气道咳嗽综合征（UACS，原称鼻后滴流综合征（PNDS））、胃食管反流性咳嗽（GERC）、咳嗽变异性哮喘（CVA）等。
广州呼吸疾病研究所2006年一项针对1087名大学生咳嗽的现场调查显示，该群体咳嗽总发生率为10.9%，其中慢性咳嗽总发生率为3.3%，可以推测社区人群的咳嗽发生率将更高，这类患者的平均病程较长，有的甚至长达数十年。有资料显示，全世界每年约有15%的成年人和10%的未成年人受到不同程度咳嗽的影响。因此，开发安全有效的止咳药物将在满足巨大市场需求的同时，创造出较好的社会效益和经济效益。
根据药物作用机理的不同可将止咳药物分为两大类：第一类为中枢性镇咳药，这类药物能直接选择性的抑制延髓呼吸中枢而产生镇咳作用，如吗啡、可待因等，这类药物镇咳效果较好，但副作用明显，可导致成瘾性及呼吸抑制，甚至诱发幻觉、妄想或其它精神病症状等；第二类为外周性镇咳药，这类药物通过抑制肺-迷走神经反射而阻断咳嗽反射的传入冲动，起到镇咳作用，如苯丙哌林、磷酸苯丙哌林、莫吉斯坦等，多数为生物碱类药物，可能会产生恶心、心悸、头晕等不良反应。虽然临床上用于镇咳的药物繁多，但很多慢性咳嗽患者用这些药物治疗并不能获得有效的缓解。
中医药学是中华民族几千来防病治病丰富实践经验的结晶，中医能辨西医不明之症，中药能治西药难治和不治之症，中医中药对咳嗽的治疗有着悠久的历史与丰富的经验，可以与西医西药互为补充。虽然目前国内有很多治疗咳嗽的中药和中成药，但这些药物的有效组分、适应症并不清楚。另外，对于不明原因且伴有气道炎症的慢性咳嗽患者，还没有很好的治疗药物，因而研发副作用更小且能有效治疗咳嗽的纯天然中药是从事呼吸系统疾病领域药学工作者的首要任务。
中药细辛，始载于《神农本草经》，列为上品。2010版《中国药典》规定细辛来源为马兜铃科植物北细辛Asarum Heterotropoids Fr.Schmidt var.mandshuricum（Maxim.）Kitag.、汉城细辛Asarum sieboldii Miq.var.seoulenseNakai或华细辛Asarum sieboldii Miq.的干燥根与根茎。性温，味辛，归心、肺、肾经。具有解表散寒、祛风止痛、通窍、温肺化饮的功效，用于痰饮咳喘、风寒感冒、头痛、牙痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻渊、风湿痹痛的治疗。古籍有细辛治咳的记载，《本经》谓：“细辛，主咳逆，头痛脑动……利九窍”；《本草纲目》：“辛能泄肺，故风寒咳嗽上气者宜用之”；《日华子本草》：“治咳……胸中结聚”；《长沙药解》：“善降冲逆，专止咳嗽”；《药性论》：“治咳逆上气……”等。目前有关细辛止咳文献的报道大多集中在挥发油中的甲基丁香酚成分（周慧秋.甲基丁香酚药理作用研究.中医药学报.2000,(2):79-80）。我们前期研究发现：细辛挥发油对柠檬酸激发的急性咳嗽豚鼠模型具有明显的镇咳作用，但对于香烟暴露下咳嗽高敏豚鼠模型镇咳效果则明显没有细辛非挥发性成分细辛总多糖好，且大剂量具有一定的副作用。此外，对于细辛非挥发性成分研究报道也较少，仅有报道从细辛根及根茎中分离得到非挥发性成分卡枯醇、l-细辛脂素、l-芝麻脂素、马兜铃酰胺Ⅰ、山奈酚-3-O-葡萄糖苷等（蔡少青.北细辛非挥发性化学成分的研究.北京医科大学学报.1996,28(3):228-230；吕帅.辽细辛地下部分的化学成分（Ⅱ）.沈阳药科大学学报.2010,27(9):707-710；魏青春.汉城细辛化学成分的分离与鉴定.时珍国医国药.2010,21(3):676-677）。已有研究报道细辛多糖的制备方法（李晶晶.细辛多糖的分离纯化与免疫活性研究.长春师范学院学报（自然科学版）.2008,27(1):54-58），但这种方法需要提取3次、每次提取周期较长（6h）、制备过程中需要离心处理，因此不适合工业化大生产；且这种制备方法总多糖得率较低（9.56wt%），糖含量亦较低（48wt%-52wt%）；此外，有报道细辛非挥发性成分细辛多糖具有促进小鼠脾T、B淋巴细胞增殖作用（李晶晶.细辛多糖的分离纯化与免疫活性研究.长春师范学院学报（自然科学版）.2008,27(1):54-58），但目前尚未见有关细辛非挥发性成分细辛总多糖镇咳活性的研究报道。
发明内容
针对以上现有技术的不足，本发明的首要目的在于提供一种具有镇咳活性的细辛总多糖提取物。
本发明的又一目的在于提供上述具有镇咳活性的细辛总多糖提取物的提取方法。
本发明的再一目的在于提供上述具有镇咳活性的细辛总多糖提取物在制备治疗咳嗽药物中的用途。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种具有镇咳活性的细辛总多糖提取物，该细辛总多糖提取物中多糖含量在60wt%-80wt%。
组成所述多糖的单糖包括葡萄糖、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖中的一种以上。
上述具有镇咳活性的细辛总多糖提取物的提取方法，按照以下操作步骤：将细辛的根与/或根茎用极性溶剂热回流提取，减压浓缩干燥得到细辛总提物；将细辛总提物溶于水中，采用体积百分数为40%-100%的乙醇进行沉淀，减压过滤，用乙醇洗涤，减压干燥即得细辛总多糖提取物。
所述极性溶剂优选为水。
所述极性溶剂的重量优选为细辛的根与/或根茎重量的5-20倍。
所述沉淀是优选采用体积百分数为60%-90%的乙醇进行沉淀。
所述细辛为北细辛、汉城细辛或华细辛，更加优选为北细辛；所述用乙醇洗涤是采用体积百分数为60%-100%的乙醇进行洗涤，更加优选用乙醇洗涤是采用体积百分数为80%-100%的乙醇进行洗涤。
所述用乙醇洗涤的次数优选为两次。
本发明具有镇咳活性的细辛总多糖提取物的提取方法，总多糖得率15wt%。
上述具有镇咳活性的细辛总多糖提取物在制备治疗咳嗽药物中的用途，所述细辛总多糖提取物单独或与其他药物组合制备治疗咳嗽药物。
所述细辛总多糖提取物与可用药物载体制成各种剂型。
所述剂型为颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、滴丸剂、泡腾片、软膏剂、糖浆剂、注射剂、口服液、合剂、酊剂、缓释剂、控释剂或靶向制剂。
药学上可接受的载体如：填充剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂或润湿剂。填充剂包括乳糖、蔗糖、玉米淀粉、山梨醇；粘合剂包括糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；润滑剂包括硬脂酸镁；崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、交聚维酮、微晶纤维素；润湿剂如十二烷基硫酸钠。
本发明具有镇咳活性的细辛总多糖提取物的有效剂量按照人的体重60kg来计算，为2.5g-11.0g/人·天。
本发明可采用紫外分光光度法，以无水葡萄糖为对照品，在490nm波长处以苯酚-硫酸法和/或在620nm处以蒽酮法测定细辛总多糖提取物中细辛有效总多糖含量。
本发明的原理：
药理实验证明，本发明的细辛总多糖提取物具有良好的减轻和/或抑制咳嗽的活性，可用于预防或治疗各型咳嗽。
药效学试验结果表明，对于豚鼠急性咳嗽模型，柠檬酸激发后细辛总多糖提取物低、中、高剂量组与空白对照组相比可延长动物的咳嗽潜伏期，降低豚鼠的咳嗽次数；与细辛总挥发油相比细辛总多糖对豚鼠的急性镇咳活性相对较弱；而对于慢性咳嗽敏感性增高并伴有气道炎症的豚鼠模型（香烟暴露14天），柠檬酸激发后细辛总多糖提取物低、中、高剂量组与模型组相比可明显延长动物的咳嗽潜伏期，降低豚鼠的咳嗽次数，同时可以降低豚鼠BALF中的炎症细胞总数及中性粒细胞的比例，抑制气道炎症，达到或接近可待因的效果；与细辛总提取物及细辛总挥发油相比，细辛总多糖提取物高剂量组镇咳率均具有显著性差异（p<0.05），显示细辛总多糖提取物对于长期香烟暴露下的咳嗽高敏豚鼠模型具有更好的镇咳活性。
急性毒性试验结果表明，细辛总多糖提取物经灌胃给药途径，SPF级NIH小鼠的食量、体重未见异常，LD50＞10.0g/kg，表明毒性低，具有良好的用药安全性。
本发明的有益效果是：
（1）本发明为目前镇咳药物提供了一种全新的选择和思路，拓展了镇咳药物的选择领域，也为该技术领域的发展做出了贡献。
（2）本发明首次证明细辛总多糖提取物具有显著的镇咳效果，可以降低咳嗽敏感性和抑制气道炎症的作用，且无成瘾性。
（3）急性毒性试验表明细辛总多糖提取物的毒性低，具有很好的用药安全性。
（4）本发明提供的细辛总多糖提取物的制备工艺能有效的富集并去除杂质，其细辛总多糖得率及含量高，优于现有的方法，质量控制可以通过紫外分光光度法进行含量测定分析，该方法简单易行可控。
（5）本发明提供的提取物制备方法简单、快捷、重现性好；所选用的溶剂低廉、无毒。
附图说明
图1细辛总多糖对急性咳嗽豚鼠模型咳嗽次数的影响其中A：空白组；B：溶剂组（质量分数0.5%CMC-Na）；C：硫酸可待因30mg/kg组；D：细辛总多糖200mg/kg组；E：细辛总多糖400mg/kg组；F：细辛总多糖800mg/kg组；G：细辛总提物1600mg/kg组；H：细辛总挥发油200mg/kg组；与空白组相比：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图2细辛总多糖对慢性咳嗽高敏豚鼠模型咳嗽次数的影响8），其中A：空白组；B：模型组；C：溶剂组（质量分数0.5%CMC-Na）；D：硫酸可待因30mg/kg组；E：细辛总多糖200mg/kg组；F：细辛总多糖400mg/kg组；G：细辛总多糖800mg/kg组；H：细辛总提物1600mg/kg组；I：细辛总挥发油200mg/kg组；与模型组相比：**p<0.01，***p<0.001；与细辛总提物组相比：▲p<0.05；与细辛总挥发油组相比：#p<0.05。
图3细辛总多糖对慢性咳嗽高敏豚鼠模型肺组织病理代表图（HE染色，×200），其中A：空白组；B：模型组；C：溶剂组（质量分数0.5%CMC-Na）；D：硫酸可待因30mg/kg组；E：细辛总多糖200mg/kg组；F：细辛总多糖400mg/kg组；G：细辛总多糖800mg/kg组；H：细辛总提物1600mg/kg组；I：细辛总挥发油200mg/kg组。
图4细辛总多糖对慢性咳嗽高敏豚鼠模型气管组织病理代表图（HE染色，×200），其中A：空白组；B：模型组；C：溶剂组（质量分数0.5%CMC-Na）；D：硫酸可待因30mg/kg组；E：细辛总多糖200mg/kg组；F：细辛总多糖400mg/kg组；G：细辛总多糖800mg/kg组；H：细辛总提物1600mg/kg组；I：细辛总挥发油200mg/kg组。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。
实施例1
细辛总多糖提取物的制备
干燥的细辛根与/或根茎1kg，粉碎成粗粉，过80目筛，用药材重量10倍量的水，微沸加热回流提取5h，提取液经6层纱布滤过，减压浓缩干燥得细辛总提物，将细辛总提物用水加热溶解至1L，加入9倍体积量的无水乙醇至醇体积百分浓度为90%，边加边搅拌，充分沉淀后于4℃冰箱静置过夜，倾倒上清液，沉淀减压抽滤，等量90%体积百分比乙醇洗涤2次，常规干燥，即得细辛总多糖提取物，得率为15wt%。分别采用苯酚-硫酸法和蒽酮法紫外分光光度法测定细辛总多糖含量为68wt%和60wt%。
实施例2
小鼠经口灌胃给予细辛总多糖提取物的急性毒性试验
1实验动物
SPF级NIH小鼠，雌雄各半，体重18-22g，由广东省医学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（粤）2008-0002。
2实验方法
参照《药理学实验方法学》、《中药药理实验方法学》，采用正规Bliss法考察细辛总多糖提取物经口灌胃给予小鼠的急性毒性。首先用最大浓度、最大给药剂量、最大灌胃体积进行试验。试验前禁食不禁水12h试验时按10.0g/kg细辛总多糖提取物灌胃（相当于生药量24.4g/kg，相当于临床用量的12倍）。实验室温度25±2℃，一次给药，观察14天，仔细观察每只动物并详细记录各种毒性反应出现和消失的时间。观察记录的内容包括皮肤、粘膜、毛色、眼睛、呼吸、循环、自主活动及中枢神经系统行为表现等。给予受试物前、后各一周、动物死亡及试验结束时应称取动物的体重。所有动物包括死亡或处死的动物均进行尸检，尸检异常的器官应作组织病理学检查。
3实验结果
试验结果表明：以10.0g/kg的剂量经口灌胃给予小鼠，给药后14天内，未见动物死亡，各动物精神及行为活动状况良好，皮肤被毛清洁，大小便、体重及摄食量的增长均正常，亦未见其他毒性反应症状。观察结束后大体解剖未见脏器明显异常。细辛总多糖的LD50＞10.0g/kg。
以上结果说明，细辛总多糖的安全性高，无严重急性中毒的危险性。
实施例3
细辛总多糖提取物对柠檬酸所致豚鼠咳嗽的急性镇咳作用
1实验材料
实验动物：普通级Hartley豚鼠，雌雄各半，体重250-350g，由广东省医学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（粤）2008-0002。
试剂与仪器：一水合柠檬酸（广州化学试剂厂，批号：20121001-2），用时配制成0.8M的生理盐水溶液；动物无创Buxco肺功能检测系统（美国Buxco公司）；Aeroneb Pro雾化器（Aerogen（爱尔兰）有限公司）；灌胃针（广东省医学实验动物中心）。
2实验方法
采用柠檬酸诱导豚鼠急性咳嗽模型进行药效评价。取128只Hartley豚鼠，将其逐一置于动物无创Buxco肺功能检测系统6L体描仪内，偏流仪空气流速2.5L/min，使用Aeroneb Pro雾化器通入雾化的0.8M的柠檬酸超纯水溶液气溶胶1min，雾化的粒子平均直径2.5μm，观察5min，监测6min内的咳嗽次数，咳嗽的声音由室内放置的麦克风记录和放大，声波经BiosystemXA软件进行分析，再经电脑软件处理声音数据记录咳嗽次数，同时由经过训练的观察者补充观察。挑选咳嗽次数大于10次的豚鼠为合格动物进行试验。
取筛选合格的64只Hartley豚鼠，雌雄各半，随机分成8组，空白组给予1mL/kg的生理盐水，溶剂组给予等体积的相应溶剂（质量百分比浓度0.5%的CMC-Na水溶液），阳性药组给予等体积的30mg/kg磷酸可待因，给药组给予等体积的细辛总多糖提取物（实施例1样品200mg/kg、400mg/kg、800mg/kg）、细辛总提物（1600mg/kg）、细辛总挥发油（200mg/kg，常规水蒸汽蒸馏制备所得），每天1次，连续给药3天。末次给药后2h在动物无创Buxco肺功能检测系统进行柠檬酸雾化激发试验（雾化条件同前），雾化激发1min，诱导豚鼠产生急性咳嗽，观察5min，计算6min内的咳嗽次数（N）、咳嗽潜伏期，并用公式“镇咳率=（N空白对照-N给药组）/N空白对照×100%”计算各给药组的镇咳率。
数据用表示，采用IBM SPSS Statistics19.0统计软件对各组参数进行单因素方差分析。进行组间比较，p<0.05为有显著性差异。
3实验结果
（1）细辛总多糖提取物对急性咳嗽豚鼠模型咳嗽次数的影响
各组动物经过柠檬酸雾化激发后6min内的咳嗽次数及咳嗽抑制率见表1及图1。由表1及图1可知，与空白组相比，细辛总多糖提取物中、高剂量组均可以显著降低豚鼠的咳嗽次数（p<0.05），镇咳率分别达到28.5%和32.3%。细辛总提取物在1600mg/kg剂量时镇咳率为28.8%，而细辛总多糖提取物高剂量组在800mg/kg剂量时镇咳率达到相当水平，显示细辛总多糖提取物的镇咳活性较总提取物为高，进而说明细辛总多糖是细辛镇咳的主要活性组分之一，细辛总多糖提取物与细辛总提取物之间无显著性差异。细辛总挥发油对于豚鼠的急性镇咳活性均比细辛总提取物及细辛总多糖好（镇咳率53.8%），但三者之间均无显著性差异。
以上结果表明，细辛总多糖提取物具有良好的急性镇咳作用，并具量效关系，且用药相对安全。
表1细辛总多糖提取物对急性咳嗽豚鼠模型咳嗽次数的影响
注：与空白组相比：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
（2）细辛总多糖提取物对急性咳嗽豚鼠模型咳嗽潜伏期的影响
各组动物经过柠檬酸雾化激发后6min内的咳嗽潜伏期见表2。由表2可知，与空白组相比，细辛总多糖提取物不同剂量组均可显著的延长豚鼠的咳嗽潜伏期，其中低剂量组p<0.05，中、高剂量组p<0.01，且具量效关系。细辛总多糖提取物不同剂量组延长咳嗽潜伏期的作用均强于磷酸可待因。细辛总提取物及细辛总挥发油也可以延长咳嗽潜伏期，但与空白组相比均无统计学意义（p>0.05）。
表2细辛总多糖提取物对急性咳嗽豚鼠模型咳嗽潜伏期的影响
注：与空白组相比：*p<0.05，**p<0.01。
实施例4
细辛总多糖提取物对慢性咳嗽敏感性增高豚鼠模型的镇咳作用
1实验材料
实验动物：普通级Hartley豚鼠，雌雄各半，体重250-350g，由广东省医学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（粤）2008-0002。
试剂与仪器：一水合柠檬酸（广州化学试剂厂，批号：20121001-2），用时配制成0.8M的生理盐水溶液；动物无创Buxco肺功能检测系统（美国Buxco公司）；Aeroneb Pro雾化器（Aerogen（爱尔兰）有限公司）；细胞计数板（浙江玉环县楚门医用仪器厂）；灌胃针（广东省医学实验动物中心）。
2实验方法
合格动物筛选方法同实施例3。取筛选合格的动物72只，随机分成9组，空白组及模型组给予1mL/kg的生理盐水，溶剂组给予等体积的相应溶剂（质量百分比浓度0.5%的CMC-Na水溶液），阳性药组给予等体积的30mg/kg磷酸可待因，给药组给予等体积的细辛总多糖提取物（实施例1样品200mg/kg、400mg/kg、800mg/kg）、细辛总提物（1600mg/kg）、细辛总挥发油（200mg/kg，常规水蒸汽蒸馏制备所得），每天灌胃给药1次，连续给药14天。除空白组外，每组烟熏20min，每次10只红玫香烟（广东中烟工业有限责任公司，焦油量13mg，烟碱量1.3mg，一氧化碳量15mg），每天2次，连续14天，建立豚鼠慢性咳嗽药效评价模型。末次烟熏后24h，采用柠檬酸雾化激发1min（动物无创Buxco肺功能检测系统，雾化条件同实施例3），诱导豚鼠产生咳嗽，观察5min，计算6min内的咳嗽次数（N）、镇咳率及咳嗽潜伏期。动物激发后24h，质量百分比浓度3%的戊巴比妥钠麻醉，心脏取血，6mL冰的PBS行豚鼠支气管肺泡灌洗（BALF），同时取肺及气管组织，10%甲醛固定。
观测方法及指标：
（1）计算柠檬酸激发6min内的咳嗽次数，并用公式“镇咳率=（N模型 组-N给药组）/N模型组×100%”计算各给药组的镇咳率；
（2）计算柠檬酸激发6min内各给药组的咳嗽潜伏期；
（3）气道炎症指标：①BALF细胞总数（TCC）：取雾化激发结束24h后BALF灌洗液0.5mL，3000r/min离心10min，沉淀加0.3mL红细胞裂解液，振荡混匀，静置10min，3000r/min离心10min，沉淀用0.5mL PBS悬浮，取10μL光学显微镜下细胞计数板行细胞总数计数（TCC）；②BALF细胞分类：固定的BALF细胞涂片，流水冲洗5min，苏木素染色20sec，流水冲洗5min，1%盐酸酒精脱色5sec，流水冲洗5min，伊红染色5sec，流水冲洗5min，烘干后中性树胶封片，光学显微镜下进行细胞分类；③肺、气管组织病理观察：肺、气管组织HE染色；肺组织主要观察支气管、肺泡、伴行小动脉结构是否完整，气道纤毛上皮排列是否整齐，支气管、血管周围有无炎性细胞的浸润、有无充血水肿等；气管组织主要观察上皮是否完整，管腔是否规整，管壁有无增厚，纤毛排列是否整齐，有无脱落，有无炎症细胞浸润等。
3实验结果
（1）细辛总多糖提取物对慢性咳嗽敏感性增高豚鼠模型咳嗽次数的影响
与空白组相比，柠檬酸雾化激发香烟暴露14d后的模型组豚鼠，6min内的咳嗽次数显著增高（p<0.01），咳嗽高敏豚鼠模型造模成功。与模型组相比，细辛总多糖提取物低、中、高剂量组均可以极显著的降低豚鼠的咳嗽次数（p<0.001），镇咳率分别达到54.0%、62.6%和70.9%。与细辛总提取物及细辛总挥发油相比，细辛总多糖提取物高剂量组镇咳率均具有显著性差异（p<0.05）。与磷酸可待因相比细辛总多糖高剂量组无显著性差异，显示细辛总多糖提取物对慢性咳嗽高敏豚鼠模型具有较好的镇咳活性（结果见表3及图3）。
以上结果表明，细辛总多糖提取物对慢性咳嗽敏感性增高豚鼠具有治疗作用，并具量效关系，其中细辛总多糖提取物高剂量组接近可待因的治疗效果。
表3细辛总多糖提取物对慢性咳嗽敏感性增高豚鼠模型咳嗽次数的影响
注：与模型组相比：**p<0.01，***p<0.001；与细辛总提物组相比：▲p<0.05；与细辛总挥发油组相比：#p<0.05。
（2）细辛总多糖提取物对慢性咳嗽敏感性增高豚鼠模型咳嗽潜伏期的影响
各组动物香烟暴露14d后，经过柠檬酸雾化激发后6min内的咳嗽潜伏期见表4。由表4可知，与模型组相比，细辛总多糖提取物不同剂量组均可明显延长豚鼠的咳嗽潜伏期，其中中、高剂量组p<0.001，且具量效关系，与磷酸可待因组相比均无显著性差异，显示细辛总多糖提取物对咳嗽潜伏期的影响接近磷酸可待因的效果。与细辛总提取物及细辛总挥发油相比，细辛总多糖提取物高剂量组咳嗽潜伏期均具有显著性差异（p<0.05）。
表4细辛总多糖提取物对慢性咳嗽敏感性增高豚鼠模型咳嗽潜伏期的影响
注：与模型组相比：*p<0.05，***p<0.001；与细辛总提物组相比：▲p<0.05；与细辛总挥发油组相比：#p<0.05。
（3）细辛总多糖提取物对慢性咳嗽敏感性增高豚鼠模型BALF细胞总数的影响
与空白组相比，香烟暴露14d后的模型组BALF中细胞总数有显著增高（p<0.05），造模成功。与模型组相比，细辛总多糖提取物不同剂量组均可降低豚鼠BALF中炎症细胞总数，其中低剂量组具有较好的显著性差异（p<0.01），中、高剂量组具有非常显著性差异（p<0.001），且具量效关系。与细辛总提取物及细辛总挥发油相比，细辛总多糖提取物中、高剂量组细胞总数计数均具有显著性差异（p<0.05）。磷酸可待因不能降低气道高敏感性气道炎症豚鼠BALF中的炎症细胞总数（见表5）。
表5细辛总多糖提取物对慢性咳嗽敏感性增高豚鼠模型BALF细胞总数的影响
注：与模型组相比：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；与细辛总提物组相比：▲p<0.05；与细辛总挥发油组相比：#p<0.05。
（4）细辛总多糖提取物对慢性咳嗽敏感性增高豚鼠模型BALF细胞分类的影响
与空白组相比，香烟暴露14d后的模型组及溶剂对照组BALF中巨噬细胞（Mac）比例明显降低而中性粒细胞（Neu）比例显著的升高，均具有非常显著性差异（p<0.001），说明造模成功。与模型组相比，细辛总多糖提取物不同剂量组均可降低豚鼠BALF中Neu的比例，且具量效关系，其中高剂量组具有较好的显著性差异（p<0.01）；同时细辛总多糖各剂量组均可升高Mac的比例，其中高剂量组具有较好的显著性差异（p<0.01）；与细辛总提取物及细辛总挥发油相比，细辛总多糖提取物高剂量组可显著的降低Neu的比例；磷酸可待因不能降低气道高敏感性气道炎症豚鼠BALF中的炎症细胞比例（见表6）。
表6细辛总多糖提取物对慢性咳嗽敏感性增高豚鼠模型BALF细胞分类的影响
注：与模型组相比：**p<0.01，***p<0.001；与细辛总提物组相比：▲p<0.05，▲▲▲p<0.001；与细辛总挥发油组相比：#p<0.05。
（5）细辛总多糖提取物对慢性咳嗽敏感性增高豚鼠模型肺、气管组织病理的观察
各组动物香烟暴露及药物干预后肺组织病理结果如图3所示。由图可知，正常组（图3A）豚鼠支气管、肺泡、伴行小动脉结构完整，气道纤毛上皮排列整齐，支气管、血管周围无炎性细胞的浸润、无充血水肿；与正常对照组相比，模型组（图3B）豚鼠肺组织呈现典型病理炎症改变，支气管粘膜上皮纤毛倒伏，支气管壁大量炎症细胞浸润，肺泡间隔增宽，肺泡结构紊乱，部分肺泡间隔断裂；溶剂组（图3C）肺组织病理改变基本同模型组；与模型组比较，细辛总多糖高、中、低剂量组（图3E、F、G）豚鼠肺组织病理均有不同程度改善，其中以高剂量组改善最为明显，支气管、肺泡结构基本完整，支气管纤毛无明显倒伏，气道上皮结构基本完整，肺组织、血管周围炎症细胞浸润明显减少；中剂量组肺泡间隔稍微增宽，气管、血管周围可见少量炎性细胞浸润；低剂量组支气管、肺泡结构破坏，气道纤毛倒伏，支气管、血管周围炎性细胞浸润明显；细辛多糖总提物组（图3H）及细辛总挥发油组（图3I）肺组织病理较模型组也有较大改善，支气管壁结构基本完整，多糖总提物组支气管管腔只见极少量炎性渗出物，总挥发油组支气管管腔几乎不见炎性渗出，支气管、血管周围见少量炎性细胞浸润，两者肺组织病理改善程度大致同细辛总多糖中剂量组；磷酸可待因组（图3D）肺组织病理较模型组亦有所改善，肺泡间隔增宽，支气管、血管周围炎性细胞浸润减少。
各组动物香烟暴露及药物干预后气管病理观察如图4所示。由图可知，正常组（图4A）豚鼠气管上皮完整，管腔规整，管壁无增厚，纤毛排列整齐，基本无炎症细胞浸润；与正常对照组相比，模型组（图4B）豚鼠气管呈现典型病理炎症改变，气管粘膜上皮纤毛倒伏、黏膜上皮细胞脱落，气管壁大量炎症细胞浸润，基底膜不同程度增厚；溶剂组（图4C）气管病理改变基本同模型组；与模型组比较，细辛总多糖高、中、低剂量组（图4E、F、G）豚鼠气管病理不同程度改善，气管上皮结构基本完整，基底膜无明显增生，管腔内渗出物减少，纤毛排列基本规则，无明显炎性细胞浸润，其中以高剂量组改善最为明显；细辛多糖总提物组（图4H）及细辛总挥发油组（图4I）气管组织病理较模型组亦有改善，气道上皮纤毛略有倒伏，基底膜未见明显增厚，管壁少量炎症细胞浸润，两者气管组织病理改善程度比细辛多糖中剂量组稍差；磷酸可待因组（图4D）气管病理基本同模型组，未见明显改善。
实施例5
取实施例1方法制备的细辛总多糖提取物，加蒸馏水溶解，加入单糖浆至含糖量50%以上，加入千分之三的苯甲酸钠和羟苯乙酯，混合均匀，煮沸，趁热过滤，加蒸馏水至规定量，分装即为细辛总多糖止咳糖浆。
实施例6
取实施例1方法制备的细辛总多糖提取物800g和微粉硅胶40g，过60目筛充分混匀，加入24g硬脂酸镁，混合，干法制粒；过40目筛，灌装成胶囊剂。
上述具体实施方式为本发明的优选实施例，并不能对本发明进行限定，其他的任何未背离本发明的技术方案而所做的改变或其它等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种具有镇咳活性的细辛总多糖提取物，其特征在于：该细辛总多糖提取物中多糖含量在60wt%-80wt%。
2.根据权利要求1所述的一种具有镇咳活性的细辛总多糖提取物，其特征在于：组成所述多糖的单糖包括葡萄糖、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖中的一种以上。
3.根据权利要求1所述的一种具有镇咳活性的细辛总多糖提取物的提取方法，其特征在于按照以下操作步骤：将细辛的根与/或根茎用极性溶剂热回流提取，减压浓缩干燥得到细辛总提物；将细辛总提物溶于水中，采用体积百分数为40%-100%的乙醇进行沉淀，减压过滤，用乙醇洗涤，减压干燥即得细辛总多糖提取物。
4.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于：所述极性溶剂为水；所述极性溶剂的重量为细辛的根与/或根茎重量的5-20倍。
5.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于：所述沉淀是采用体积百分数为60%-90%的乙醇进行沉淀；所述用乙醇洗涤的次数为两次。
6.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于：所述细辛为北细辛、汉城细辛或华细辛；所述用乙醇洗涤是采用体积百分数为60%-100%的乙醇进行洗涤。
7.根据权利要求6所述的提取方法，其特征在于：所述细辛为北细辛；所述用乙醇洗涤是采用体积百分数为80%-100%的乙醇进行洗涤。
8.根据权利要求1所述的一种具有镇咳活性的细辛总多糖提取物在制备治疗咳嗽药物中的用途，其特征在于：所述细辛总多糖提取物单独或与其他药物组合制备治疗咳嗽药物。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述细辛总多糖提取物与可用药物载体制成各种剂型。
10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述剂型为颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、滴丸剂、泡腾片、软膏剂、糖浆剂、注射剂、口服液、合剂、酊剂、缓释剂、控释剂或靶向制剂。
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