CN104023722B - 包含gsk-3抑制剂的腹膜透析液 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种腹膜透析液，其包含抑制糖原合酶激酶(GSK)‑3活性，特别是抑制(GSK)‑3β活性的化合物，所述的腹膜透析液用于预防感染性和非感染性腹膜并发症，例如腹膜炎，腹膜损伤、损坏和衰竭，屏障功能障碍和间皮细胞脱落。

Description

包含GSK-3抑制剂的腹膜透析液
技术领域
本发明涉及一种腹膜透析液(在下文中也被称为“PDF”)。
背景技术
与血液透析相比，腹膜透析(PD)是一种安全经济有效，同时提供了更好的生活质量的肾脏替代疗法。但是，腹膜透析治疗常常导致通常与腹膜组织变化和腹膜完整性的损失相关的膜的超滤功能的逐渐衰退(1)。
目前，超过三分之二的患者在他们治疗的头两年遭受着PD相关的感染性或非感染性并发症(例如腹膜炎，腹膜功能退化或技术缺陷)。
不同种类的液体可用于PD。这些液体之间的区别是渗透剂的种类、其浓度和缓冲液的种类和在PD液中的pH值。
在临床实践中，仍然代表约80％的所有PD液的标准液含有非生理性高浓度葡萄糖作为它们的渗透剂。腹膜的病理变化主要由于高渗性高糖浓度和低pH值(2)。更复杂的慢性损伤由葡萄糖降解产物(GDPs)诱发，所述葡萄糖降解产物在腹膜透析液的热杀菌过程中生成(3)。由于更多的腔室系统的使用，新的和更具的生物相容性的葡萄糖基的PD液具有正常pH值和低含量的GDP；但是，这些液体是非常昂贵的，因此其临床应用在全局设置(globalsetting)中仍被限制。
在市场上也有替代的、非葡萄糖基的PD液，例如艾考糊精或氨基磺酸基的PD液，但是，它们的使用被限制为每天一次交换并且其超滤能力不如葡萄糖基的溶液好。而且，它们还具有更低的pH值，其加强了腹膜中不利的细胞变化。
因此，寻找减少PD液毒性的策略仍然是试验和临床肾病中的一个现行的领域，并且具有巨大的医疗和社会经济意义。
之前在许多研究中已证实了HSPs对在试验PD的间皮细胞存活方面具有显著影响，因为由药理学或质粒介导的方式的HSPs的上调保护了间皮细胞不受PD液的毒性(12，13，14)。
然而，有趣的是，用标准葡萄糖基PD液的培养导致间皮细胞中的HSP的下调表达，引起弱化的细胞防御机制。
WO2008/106702公开了一种碳水化合物基的腹膜透析液，其包含选自由以下组成的组的化合物：
-谷氨酰胺，优选L-谷氨酰胺，
-能够释放游离形式的谷氨酰胺，L-谷氨酰胺的二肽，所述的二肽优选选自由谷氨酰-甘氨酸、甘氨酸-谷氨酰胺、谷氨酰胺酰-丙氨酸和丙氨酰-谷氨酰胺组成的组中，
-由两个至七个谷氨酰胺组成的寡肽，优选L-谷氨酰胺残基，和
-它们的混合物。
仍然有需要获得腹膜透析液，使用所述的腹膜透析液，可以预防或至少抑制感染性和非感染性腹膜并发症的发生，例如腹膜炎，腹膜损伤、损坏和衰竭，屏障功能障碍和间皮细胞脱离。通过预防这样的感染性和非感染性腹膜并发症，患者经过PD治疗的技术缺陷可以被抑制。术语“技术缺陷”是本领域技术人员众所周知的，并且意味着需要终止腹膜透析，并切换到可替换的肾脏替代疗法，如血液透析。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供一种腹膜透析液，使用所述的腹膜透析液，可以预防或抑制这种感染性和非感染性腹膜并发症的发生。
一个方面，本发明涉及一种腹膜透析液，其包含抑制糖原合酶激酶(GSK)-3活性，特别是抑制(GSK)-3β活性的化合物，所述的腹膜透析液用于预防感染性和非感染性腹膜并发症，例如腹膜炎，腹膜损伤、损坏和衰竭，屏障功能障碍和间皮细胞脱落。
另一方面，本发明涉及一种艾考糊精基的腹膜透析液，其包含抑制糖原合酶激酶(GSK)-3活性，特别是抑制(GSK)-3β活性的化合物。
再另一方面，本发明涉及一种抑制糖原合酶激酶(GSK)-3活性，特别是抑制(GSK)-3β活性的化合物，所述的化合物用于预防感染性和非感染性腹膜并发症，例如腹膜炎，腹膜损伤、损坏和衰竭，屏障功能障碍和间皮细胞脱落。
附图说明
图1：用具有不同的渗透剂和毒性特性的不同的市售的PD液处理的间皮细胞中的P-GSK-3β的表达。
图2：用具有不同的渗透剂和毒性特性的不同的市售的PD液处理的间皮细胞中的LDH释放。
图3：与对照组细胞相比，由中性红吸附的百分比评估细胞活性。
图4：通过荧光素酶试验评估热休克因子-1活性。
图5：通过蛋白质印迹法评估热休克蛋白-72(HSP-72)的表达。
图6：LDH释放到上清液中。
图7：通过荧光素酶试验评估热休克因子(HSF-1)的转化活性。
图8：通过蛋白质印迹法评估的热休克蛋白-72(HSP-72)的表达。
具体实施方式
糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。GSK-3β本身是由不同的上游激酶在丝氨酸-9残基处通过磷酸化被调节并被抑制，除上游激酶外，Akt和血清和糖皮质激素调节激酶-1(SGK-1)已经获得更多的关注(4)。GSK-3β最初被鉴定为一个关键的酶，其和不同浓度的葡萄糖和GDPs反应，从而调节糖原质合成(5，6)。然而，后续工作证实，GSK-3β在整体细胞存活，细胞周期进程和迁移中具有核心作用。
虽然GSK-3β被描述于约30年前，但是它作为潜在的药物靶标的兴趣仅在本世纪初开始突出，这是由于GSK-3β被发现作为涉及多个生理和病理过程的多面激酶。许多研究报道了通过选择性的小分子抑制剂或具有锂的GSK-3β抑制在各种疾病模型中具有预防特性。GSK-3β抑制被证实在II型糖尿病中改善胰岛素耐受性(23，24)，在类似于阿尔茨海默氏病的神经系统紊乱中具有有益效果(25)，并减少心肌肥大和局部缺血(26)。
许多GSK-3β靶标是转录因子(HSF-1，β-链蛋白，C-Jun，CREB)，其导致改变的应激反应，增加的细胞凋亡和神经传递的变化。GSK-3β还能够调节细胞骨架元素(7，8)，完全使GSK-3β具有在细胞命运中重要作用的细胞信号传输的中枢介导因子。
GSK-3β的主要靶标之一是热休克因子-1(HSF-1)，细胞保护热休克蛋白(HSP)表达的关键诱导物(9，10)。胁迫条件下，HSF-1在多步方法中被活化，所述的方法包括过度磷酸化，转位到细胞核中，HS元素(HSE)的结合，随后由相应的基因转录。HSF-1被磷酸化，并由此通过导致HSP含量减少的GSK-3β被抑制(11)。在丝氨酸-303残基处GSK-3β磷酸化HSF-1，负面调剂它与DNA和HSF-1-依赖型转录的结合，所述HSF-1-依赖型转录导致抑制的HSP-72的生成(21)，另一方面，GSK-3β的抑制增加了对改进细胞防御起作用的热休克反应。
由于GSK-3β是由葡萄糖和GDPs严格调节的(15)，本发明的发明人已考虑到，这可能是在PD-相关的细胞信号中的相关分子角色。但是，GSK-3β和PD之间的直接关联还没有被描述过。
假设抗-存活GSK-3β的活性的增加(可能由PD液体暴露介导的)抑制促存活HSF-1，在PD过程中，热休克蛋白转录的关键调节剂。因此，阻断GSK-3β的活性可能会导致HSF-1活性的增强，从而引起更高的热休克蛋白的表达和较少的细胞毒性。
目前已发现GSK-3的抑制，特别是GSK-3β抑制减少了用PD液体处理过的细胞中的间皮细胞损伤和死亡率。间皮细胞的保护相应于较高的HSF-1活性和HSP-72的表达。
使用选自由碳水化合物基透析液和氨基酸基透析液组成的组中的PD液体，这种效果是特别显著。使用具有pH值为7.3或更低，优选为7.0或更低，最优选为6.0或更低的碳水化合物基的腹膜透析液，这种效果甚至更加显著。
碳水化合物基的腹膜透析液特别是葡萄糖或艾考糊精基的那些。最优选，所述腹膜透析液基于艾考糊精。
因此，本发明特别优选实施方案是基于艾考糊精的腹膜透析液，其包括抑制糖原合酶激酶(GSK)-3活性，特别是抑制(GSK)-3β活性的化合物。
如上所述，本发明的又一方面涉及一种抑制糖原合酶激酶(GSK)-3活性，特别是抑制(GSK)-3β的化合物，所述的化合物用于预防由使用腹膜透析液治疗引起的感染性和非感染性腹膜并发症，例如用腹膜炎，腹膜损伤、损坏和衰竭，屏障功能障碍和间皮细胞脱落。
所述的化合物优选在腹膜透析治疗过程中与一种腹膜透析液一起施用。所述的PD液体优选选自上文已讨论过的PD液体。
抑制糖原合酶激酶(GSK)-3活性，特别是抑制(GSK)-3β活性的化合物优选选自由以下组成的组中：锂，tideglusib，NP-103，GSK-3β抑制剂I(TDZD-8，4-苄基-2-甲基-1，2，4-噻二唑烷-3，5-二酮)，GSK-3β抑制剂II(2-硫代(3-碘苄基)-5-(1-吡啶基)-[1，3，4]-恶二唑)，GSK-3抑制剂IV(SB-216763，3-(2，4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2，5-二酮)，GSK-3抑制剂IX(BIO，(2'Z，3'E)-6-溴靛玉红-3'-肟)，GSK-3β抑制剂VI(2-氯-1-(4，5-二溴-噻吩-2-基)-乙酮)，GSK-3β抑制剂VII(2，4'-对溴苯酰甲基溴)，GSK-3β抑制剂VIII(AR AO14418，N-(4-甲氧基苄基)-N'-(5-硝基-1，3-噻唑-2-基)脲)，GSK-3抑制剂X(BIO-丙酮肟，(2'Z，3'E)-6-溴靛玉红-3'-丙酮肟)，GSK-3β抑制剂XI(3-(1-(3-羟基丙基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-3-基]-4-吡嗪-2-基-吡咯-2，5-二酮，7AIPM)，GSK-3抑制剂XIII(5-甲基-1H-吡唑-3-基)-(2-苯基喹唑啉-4-基)胺)，GSK-3β抑制剂XII(TWS119，3-[[6-(3-氨基苯基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基]氧基苯酚双三氟乙酸盐)，GSK-3β抑制剂XVIII(2-(氯-4-(4-噻吩-2-基-嘧啶-2-基氨基)-苯基)-(4-甲基-哌嗪-1-基)-甲酮)，GSK-3β抑制剂X(BIO-丙酮肟，(2'Z，3'E)-6-溴靛玉红-3'-丙酮肟)，GSK-3β抑制剂XI(3-(1-(3-羟基丙基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-3-基]-4-吡嗪-2-基-吡咯-2，5-二酮，7AIPM)，GSK-3β抑制剂XIX(IM-12，C22H20FN3O2，吲哚基顺丁烯二酰亚胺-衍生物)，GSK-3抑制剂XVI(6-(2-(4-(2，4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)-嘧啶-2-基氨基)乙烷-氨基)-氰基吡啶，CHIR99021)，GSK-3抑制剂XVII(5-苄氨基-3-氧代-2，3-二氢-1，2，4-噻二唑，TDZD-20)，GSK-3抑制剂XXII，化合物A(6-甲基-N-[3-[[3-(1-甲基乙氧基)丙基]氨基甲酰基]-1H-吡唑-4-基]吡啶-3-甲酰胺)，GSK-3β抑制剂XXIII，3F8(5-乙基-7，8-二甲氧基-1H-吡咯并[3，4-C]-异喹啉-1，3-(2H)-二酮)，GSK-3β肽抑制剂(L803，H-KEAPPAPPQSpP-NH2)，GSK-3β肽抑制剂(L803-MTS，MYR-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2)，GF-109203X(2-[1-(3-二甲基氨基丙基)吲哚-3-基]-3-(吲哚-3-基)马来酰亚胺)及其药物可接受的盐和它们的混合物。
在一个优选实施方案中，抑制糖原合酶激酶(GSK)-3活性的化合物是锂盐，具体是氯化锂或碳酸锂。在透析液中锂盐的浓度优选为1mM至10mM，最优选2mM至5mM。
锂是众所周知的通过针对镁竞争抑制GSK-3β的GSK-3β抑制剂(27)。自十九世纪五十年代以来，锂已用于双相心境障碍(bipolar mood disorders)的治疗，而那时并不知道锂的具体作用模式。在1996年，它被发现是GSK-3β的有效抑制剂并且证据越来越多的表示它可能是在双相障碍中对于锂已知且利用的情绪稳定作用的基础机制之一(16,17,18,22)。除了心境障碍，锂正处于肌萎缩侧索硬化症治疗和在供体干细胞移植后的肠道移植物抗宿主病治疗的II期临床试验阶段。
更少知道关于通过锂介导的GSK-3β抑制的下游活动是否涉及HSPs。但是最近，锂保护作用被证实在试验模型中与改进的HSP含量相关，所述的试验模型例如局部缺血性脑损伤(30，31)并且锂的神经保护作用也直接归因于与诱导的HSF-1活性相关(32，33)。
在临床环境中，为了治疗持续不卧床腹膜透析的患者的双相症状，已经将锂添加到葡萄糖基PD液体中；但是，这种应用模式随后没有被引入作为常规给药(28)。在这项研究中，在2L袋子中，以0.9mM的最终剂量的锂被添加于2.5％的腹膜透析液溶液中，并且所述的溶液一天三次变化，从而产生持续的锂暴露。
随后，在一个试验性大鼠PD模型中，锂-碳酸酯与葡萄糖基的PD液体一起给药，从而研究其对急性超滤率、结果的效果，但被证实出相反的效果，即锂降低了超滤速率(29)。在这项研究中，施用5mM的锂。
GSK-3β抑制也可以通过可替代的、具体的药理学抑制剂(GSK-3或GSK-3β抑制剂)实现。市场上有几种可用的抑制剂。这些试剂中的一部分目前正用于治疗特殊症状的临床研究中，但没有一个已被施用在PD溶液中或用于PD-引起的腹膜功能衰退的治疗。
除具体的GSK-3抑制剂外，tideglusib((Zentylor)，非ATP竞争性抑制剂)是唯一一种已获批临床使用的抑制剂。Zentylor在2010年获得FDA的批准，用于进行性核上性麻痹的治疗，并且处于阿尔茨海默氏病治疗的II期试验阶段。其它具体的抑制剂是上述命名的那些。
倘若除了锂或锂盐外的GSK-3抑制剂，在PD液体中适合剂量的相应的抑制剂可以由本领域技术人员容易地确定。
实施例
方法
细胞培养
人类Met-5a细胞系从美国典型培养物保藏中心(ATCC，罗克维尔，MD)购得。全部细胞在补充有L-谷氨酰胺(0.1克/升)、青霉素(100U/毫升)、链霉素(100微克/毫升)、10％的胎牛血清(FBS)的M199培养基中培养，并在37℃的含5％的CO2培养箱的潮湿空气中繁殖。除非另有说明，标准化学品购自Sigma-Aldrich公司(圣路易斯，密苏里州，美国)。FalconTM组织培养塑料(Becton Dickinson公司，富兰克林湖，新泽西州，美国)被用于全部细胞培养过程。
PDF暴露
为了用PDF进行培养，使用葡萄糖基低pH值(5.5)的3.86％的液体(腹膜透析液PD4溶液)，艾考糊精基低pH值(5.5)的液体(多聚糖透析液)；来自BAXTER AG，维也纳，奥地利的氨基酸基的液体(pH值为6.7)(氨基酸透析液)和葡萄糖基中性pH值的乳酸/碳酸氢盐缓冲液(生理性双腔透析液)。葡萄糖基、乳酸缓冲、中性pH的溶液(平衡液)购自奥地利，费森尤斯。
对照溶液是补充有L-谷氨酰胺(0.1克/升)、青霉素(100U/毫升)、链霉素(100微克/毫升)而没有胎牛血清的M199培养基。
PDF暴露模型：在12孔板中的汇合培养在指定时间(30分钟或1小时)被暴露到PD液体溶液或同时保持在照培养基中。对于HSF-1活性试验，在暴露数次后立刻收集细胞并溶解，而对于LDH和HSP-72的测定，p-GSK-3β蛋白质印迹法分析，细胞被允许通过使用含有10％的FBS的标准培养基恢复培养16小时。
氯化锂处理
锂-氯(氯化锂)购自Sigma-Aldrich公司(圣路易斯，密苏里州，美国)，并且根据说明按剂量施用。
LDH释放
对于LDH分析，在上述试验开始后取出200μL等量的上清液并将其保存在-20℃下48小时直到被分析。根据制造商的说明书，使用Sigma TOX-7LDH试剂盒以重复形式进行测定。LDH流出物相对于蛋白质含量被标准化。
中性红吸附
为了通过中性红吸附评估细胞存活率，细胞被接种到96孔板并被暴露于如前描述的不同的治疗方案。根据制造商的说明书，使用标准试剂(Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，MO，美国)测定中性红吸附。
荧光素酶试验
为了确定热休克因子-1(HSF-1)的特异性结合，市售的包含热休克元素[5'CTGGAATTTTCTAGACTGGAATTTTCTAGACTGGAATTTTCTAGA3']的萤光素酶报告载体(LR0038，Panomics公司，意大利)以及一个空白的对照载体是被转染到MET-5a细胞。转染前24小时，MC被接种到96孔细胞培养板中并使其在转染当天达到约80-90％的汇合。转染前，每孔0.15微升的Fugene6(Roche)转染试剂，并且0.1微升的HSE报告载体或对照载体分别用不含FCS的5μl的标准生长培养液稀释并培养5分钟。混合所述的溶液然后培养30分钟。10微升的该混合液分别被添加到每个孔中，并在湿润环境中37℃，5％的CO2下培养24小时。根据上述描述进行试验暴露，并且允许所述细胞恢复6小时以便于荧光素酶的蛋白质合成。冲洗细胞并使用市售的缓冲液(E1531，Promega)裂解。细胞裂解物被转移至白色平底微孔板(Nunc)。使用自动移液管以3秒的间隔将荧光素酶试剂(E1500，Promega)添加，并在2分钟后使用光度计酶标仪(Flx800，BioTek)测定产生的信号。
蛋白质印迹法
对于蛋白质印迹法，蛋白质含量由Bradford试验确定(Biorad，维也纳，奥地利)并且等量的蛋白质样品(2微克/通道)使用Pharmacia Multiphore II单元通过标准SDS-PAGE电泳分离。大小分级的蛋白质随后在Pharmacia Multiphore II Novablot单元通过半干转印转移至PVDF膜。膜被拦截在TBS-吐温的5％的干奶粉中(10mM Tris，150mM氯化钠，0.05％吐温20，pH7.4)。膜与相应的一抗(HSP-72，P-GSK-3β)培养16小时。通过使用第二、过氧化物酶偶联的抗体(抗小鼠或抗兔IgG，DakoCytomation，CA，USA)经过培养完成检测，并且使用ECL蛋白质印迹分析体系增强化学发光(ECL)(Renaissance，NEN-Life Science Products，波士顿，MA，USA)。
数据分析
全部的统计分析使用Sigmaplot11.0软件(Systat软件公司，埃克拉特，德国)进行。来自不同组的数值使用t-test或方差分析(如适用)进行比较。倘若方差分析，Tukey的HSD用作作为事后检验(post-hoc test)。<0.05的P值被认为是显著的。结果被表示为平均数±标准差。
结果
使用常规PD液体培养诱导间皮细胞损伤和死亡
使用葡萄糖基低pH值、乳酸缓冲的腹膜透析液(PDF，腹膜透析液)和低pH值艾考糊精基的PDF(多聚糖透析液)培养间皮细胞导致通过光显微镜和活-死(vital-dead)染色证实的细胞片段的(数据未示出)萎缩、脱落和部分所反映的严重细胞损伤。
这是高LDH释放(数据未示出)、显著降低的细胞活性和高死亡细胞率并行着。
使用PD液体培养增加激活的GSK-3β水平
PDF培养降低了通过免疫荧光染色(数据未示出)并通过蛋白质印迹法(图1)分析的失活的丝氨酸-9磷酸化的GSK-3β(p-GSK-3β)的水平，而总GSK-3β的水平保持不变(图1)，从而导致与对照细胞相比更高的活性的激酶-GSK-3β的净水平(net level)。
细胞表达，特别是，p-GSK-3β的定位是通过免疫荧光染色进行分析。用不同PD液体培养后，存在整体p-GSK-3β更低的表达，同时围绕细胞核明显凝结(数据未示出)，尤其是葡萄糖基低pH的PDF和艾考糊精基的液体处理的细胞中。但是，同样在其它处理(乳酸缓冲、乳酸/碳酸氢盐缓冲和氨基酸基的PD液体)，当与对照细胞相比时，观察到了降低和凝结。
不同市售PD液体对丝氨酸-9P-GSK-3β的影响表明低pH艾考糊精基的PD液体(多聚糖透析液)与葡萄糖基低pH值的溶液具有类似的作用，即p-GSK-3β的显著更低表达。在标准pH值葡萄糖基(乳酸或乳酸/碳酸氢盐缓冲；分别是平衡液和生理性双腔透析液)的PD液体和具有适中酸性pH(pH值6.7)氨基酸基的PD液体(氨基酸透析液)效果更不显著(图1)。这些结果与先前对葡萄糖和GDPs的观察是一致(19，20)。这些研究报道了高浓度的葡萄糖降低了(19)，而最终产品的GDPs上调了GSK-3β的活性(20)。
图1说明：用具有不同的渗透剂和毒性特性的不同的市售的PD液处理的间皮细胞中的p-GSK-3β的表达。对照细胞用标准细胞培养基处理，PDF处理的细胞用具有高GDP含量的葡萄糖基低pH值的PD液体(PDF，腹膜透析液)，艾考糊精基的PD液体(多聚糖透析液)，乳酸缓冲低GDP、pH值7.4的平衡液，乳酸/碳酸氢盐缓冲、低GDP、pH值7.4的生理性双腔透析液，氨基酸基(氨基酸透析液)的PD液处理。(1小时暴露不恢复)。*P<0.01vs.对照。
在PD液体培养后，锂抑制GSK-3β，从而减少间皮细胞的细胞损伤和死亡
与对照相比，葡萄糖基低pH值、含高GDP和低pH值的艾考糊精基的PD液体引起明显的LDH升高，同时细胞存活率显著减少(图2)。葡萄糖基正常pH值的和氨基酸基的PD液体引起的较温和的显著LDH的释放(图2)，这与显著的细胞死亡不相关(数据未示出)。
在这些PD液体暴露系统中，添加10mM的氯化锂，抑制GSK-3β活性，在用观察到的全部PD液体处理后，正如减弱的LDH释放反映的，减少了细胞损伤(图2)。用低pH值葡萄糖基和艾考糊精基的溶液培养后观察到最显著的保护(图2)。
因此，在这些暴露系统中，使用活-死染色和由中性红吸附的活细胞的测定进一步研究氯化锂的保护作用。在用低pH值的葡萄糖基或艾考糊精基的PD液体培养后，用氯化锂的处理导致保持的细胞结构(数据未示出)，死细胞减少的速率(数据未示出)和活细胞增加的数量(图3)。
图2说明：用具有不同的渗透剂和毒性特性的不同的市售的PD液处理的间皮细胞中的LDH释放。对照细胞用标准细胞培养基处理，PDF处理的细胞用具有高GDP含量的葡萄糖基、低pH值的PD液体(腹膜透析液)，艾考糊精基的PD液体(多聚糖透析液)，乳酸缓冲低GDP、pH值7.4的平衡液，乳酸/碳酸氢盐缓冲低GDP、pH值7.4(生理性双腔透析液)的PD液体，氨基酸基的(氨基酸透析液)PD液处理。以10mM的剂量施用氯化锂。#P<0.05vs.对照，*P<0.01vs.非氯化锂处理。(1小时暴露，16小时恢复)。
图3说明：与对照细胞相比，由中性红吸附百分比评估细胞活性。细胞用PDF(具有高GDP含量的葡萄糖基、低pH值的PD液(腹膜透析液))或具有低pH值的艾考糊精基的PD液体(多聚糖透析液)处理。以10mM的剂量施用氯化锂。#P<0.01vs.对照，*P<0.01vs.非氯化锂处理。(1小时暴露，16小时恢复)。对照细胞用标准细胞培养液处理。
氯化锂导致更高的HSF-1活性
荧光素酶分析显示在对照细胞和用葡萄糖基低pH值、含高GDP的和低pH艾考糊精基的PD液体培养后，氯化锂处理显著增加了HSF-1的转录活性(图4)。
图4说明：通过荧光素酶试验评估热休克因子-1活性。对照胞用标准细胞培养液进行处理，PDF处理的细胞用具有高GDP含量的葡萄糖基、低pH值的PD液体(腹膜透析液)，具有低pH值的艾考糊精基的PD液体(多聚糖透析液)处理。以10mM的剂量施用氯化锂。(30分钟暴露，6小时恢复)，分别地，#P<0.01vs.对照，*P<0.01vs.非氯化锂处理。
氯化锂处理导致更高的HSP-72的表达
在用具有高GDP的葡萄糖基、低pH值的PD液体或用给予或不给予氯化锂的艾考糊精基的PD液体处理培养30分钟或1小时后的细胞中评估HSP-72。
与对照细胞相比，在用葡萄糖基低pH值、含高GDP的液体培养30分钟后HSP-72的表达略有增加，1小时后，其表达显著减少(图5)。与对照相比，在用艾考糊精基的PD液体培养30分钟后，HSP-72的表达增加，但1小时后，SP-72的表达保持不变(图5)。当与相应的未处理过的细胞相比，在每种培养设置中，用氯化锂处理显著增加了HSP-72的水平。
图5说明：通过蛋白质印迹法评估热休克蛋白-72(HSP-72)的表达。对照细胞用标准细胞培养基进行处理，PDF处理的细胞用具有高GDP含量的葡萄糖基、低pH值的PD液体(腹膜透析液)，具有低pH值的艾考糊精基的PD液体(多聚糖透析液)处理。以10mM的剂量施用氯化锂。(30分钟-左图-或1小时暴露-右图，16小时恢复)。分别地，*P<0.05vs.对照，％P<0.001vs.对照，&P<0.05vs.非氯化锂处理。
氯化锂施用的剂量曲线分析
为了确定在哪个浓度锂可以有效地改善间皮细胞损伤，在用低pH值葡萄糖基的PDF或艾考糊精基的液体的培养过程中分析剂量曲线。检验1mM，2mM，5mM和10mM的氯化锂剂量。
在低pH值葡萄糖基(PDF)液体中，1mM至5mM的氯化锂剂量没有改变LDH释放到上清液中(图6)，但正如先前所检测到的，与对照相比时，10mM的氯化锂显著减少了LDH的释放(图6)。在用艾考糊精基的液体培养的过程中，呈现剂量依赖型LDH响应曲线：1mM的氯化锂并没有显著变化，而2mM的氯化锂已经降低了LDH水平,并且这种降低在施用5mM和10mM的氯化锂时更为显著(图6)。
图6说明：LDH释放到上清液中。对照细胞用标准细胞培养基进行处理，PDF处理的细胞用具有高GDP含量的葡萄糖基、低pH值的PD液体(腹膜透析液)，艾考糊精基的PD液体具有低pH值(多聚糖透析液)处理。以1mM，2mM，5mM或10mM的剂量施用氯化锂。(30分钟暴露，6小时恢复)。分别地，#P<0.001vs.对照，*P<0.05vs.非氯化锂处理。
通过荧光素酶测定法评估的HSF-1活性显示在用低pH值葡萄糖基的或艾考糊精基的PDF培养的细胞中，与相应的对照细胞相比，存在HSF-1活性的剂量依赖型上调(图7)。
图7说明：通过荧光素酶试验评估热休克因子(HSF-1)的转化活性。对照细胞用标准细胞培养液进行处理，PDF处理的细胞用具有高GDP含量的葡萄糖基、低pH值的PD液体(腹膜透析液)，具有低pH值的艾考糊精基的PD液体(多聚糖透析液)处理。以10mM的剂量施用氯化锂。(30分钟暴露-右图，6小时恢复)。分别地，#P<0.01vs.对照，*P<0.01vs.非氯化锂处理。
在用葡萄糖基、低pH值的PDF液体培养的细胞中，与未处理的细胞相比，仅在施用2mM或10mM的氯化锂后，HSP-72的表达增加(图8)。另一方面，在用艾考糊精基的PD液体培养后，全部施用氯化锂的剂量增加了HSP-72蛋白质的表达(图8)。
图8说明：通过蛋白质印迹法评估的热休克蛋白-72(HSP-72)的表达。对照细胞用标准细胞培养液进行处理，PDF处理的细胞用具有高GDP含量的葡萄糖基、低pH值PD液体(腹膜透析液)，具有低pH值的艾考糊精基的PD液体(多聚糖透析液)处理。以10mM的剂量施用氯化锂。(30分钟暴露-右图，16小时恢复)。分别地，#P<0.05vs.对照，*P<0.05vs.非氯化锂处理。
总结：
在本研究中，氯化锂(LiCl)降低了LDH的释放，减少了细胞死亡速率并改善了细胞活性。用葡萄糖基低pH值的和艾考糊精基的PD液体处理的间皮细胞的作用最为显著，市售的PD液体对GSK-3β活性具有最显著的作用。
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Claims (9)

1.一种腹膜透析液的用途，用于制造预防感染性和非感染性腹膜并发症的药物，
所述腹膜透析液包含抑制糖原合酶激酶(GSK)-3活性，特别是抑制(GSK)-3β活性的化合物，
所述腹膜并发症是腹膜炎，腹膜损伤、损坏或衰竭，屏障功能障碍或间皮细胞脱落，
所述腹膜透析液是基于艾考糊精的，
并且，所述抑制糖原合酶激酶(GSK)-3活性的化合物是锂盐。
2.基于艾考糊精的腹膜透析液，包含抑制糖原合酶激酶(GSK)-3活性，特别是抑制(GSK)-3β活性的化合物，
并且，所述抑制糖原合酶激酶(GSK)-3活性的化合物是锂盐。
3.一种化合物的用途，用于制备预防由于使用基于艾考糊精的腹膜透析液引起的感染性和非感染性腹膜并发症的药物，
所述化合物抑制糖原合酶激酶(GSK)-3活性，特别抑制(GSK)-3β活性，
所述腹膜并发症是腹膜炎，腹膜损伤、损坏或衰竭，屏障功能障碍或间皮细胞脱落，
并且，所述抑制糖原合酶激酶(GSK)-3活性的化合物是锂盐。
4.根据权利要求1所述的腹膜透析液的用途或根据权利要求3所述的化合物的用途，其特征在于，所述抑制糖原合酶激酶(GSK)-3活性的化合物是氯化锂或碳酸锂。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述透析液中锂盐的浓度为1mM至10mM。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述透析液中锂盐的浓度为2mM至5mM。
7.根据权利要求2所述的腹膜透析液，其特征在于，所述抑制糖原合酶激酶(GSK)-3活性的化合物是氯化锂或碳酸锂。
8.根据权利要求7所述的腹膜透析液，其特征在于，所述透析液中锂盐的浓度为1mM至10mM。
9.根据权利要求7所述的腹膜透析液，其特征在于，所述透析液中锂盐的浓度为2mM至5mM。
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