CN104013670A - 迷迭香提取工艺及其在医药中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物技术领域，具体地涉及迷迭香中鼠尾草酸及其二萜酚类物质为主要成分的药物提取和制备方法，该方法提取的药物成分及其制剂在制备神经退行性疾病药物、改善三重脑震荡大鼠伤后学习记忆、活血化瘀药物中的重要作用。其提取方法为称取迷迭香样品5g，按设定的提取条件进行提取，提取条件为乙酸乙酯超声提取4次，每次75min，每次乙酸乙酯的用量为迷迭香的14倍，待提取完成后，合并提取液，滤去残渣，滤液于45℃减压真空装置下浓缩干燥，得到干浸膏；称定干浸膏20mg，甲醇定容于25mL容量瓶中，过0.45μm微孔滤膜过滤，进样高效液相色谱，测定鼠尾草酸含量，计算鼠尾草酸提取率。

Description

迷迭香提取工艺及其在医药中的应用

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体地涉及迷迭香中鼠尾草酸及其二萜酚类物质为主要成分的药物提取方法，该方法提取的药物成分及其制剂在制备神经退行性疾病药物、改善三重脑震荡大鼠伤后学习记忆、活血化瘀药物中的重要作用。

背景技术

迷迭香（Rosmarinus officinalis Linn.）别名艾菊，为唇形科迷迭香属植物，性温、味辛，原产于欧洲及北非地中海沿岸，1981年，中国科学院植物研究所从国外引种并栽培成功，现在云南、贵州、广西、海南、新疆等地都有大面积栽种，其中云南省中部是最适合种植的地区之一。迷迭香含有大量的抗氧化成分，具有延缓衰老、防腐、抗菌、抗氧化和防腐作用、抑制HIV-1作用、抗肿瘤作用、抗肝炎和保肝作用等功效，特别是其提取物在食品、保健、医药、化妆品领域都具有广泛的用途。但是，目前迷迭香中有效成分的提取工艺较差，提取产物不稳定，如鼠尾草酸容易氧化，提取率较低，因此如何克服现有技术的不足，如提取溶剂和方法，是目前药物技术领域亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种迷迭香提取工艺及其在医药中的应用。

本发明采用的技术方案如下：

一种迷迭香中以鼠尾草酸为定量指标的提取方法是：称取迷迭香样品5g，按设定的提取条件进行提取，提取条件为乙酸乙酯超声提取4次，每次75min，每次乙酸乙酯的用量为迷迭香的14倍，待提取完成后，合并提取液，滤去残渣，滤液于45℃减压真空装置下浓缩干燥，得到干浸膏。称定干浸膏20mg，甲醇定容于25mL 容量瓶中，过0. 45μm 微孔滤膜过滤，进样高效液相色谱，测定鼠尾草酸含量，计算鼠尾草酸提取率；提取率计算如式（Ⅰ）所示：

式（Ⅰ），鼠尾草酸平均提取率为2.479%。

上述提取物，或再经过反复石油醚重结晶得到的晶体状鼠尾草酸及其二萜酚类组分（见图17、18），作为制备治疗脑神经损伤疾病药物中的应用。

所述鼠尾草酸及其二萜酚类组分治疗脑神经损伤病药物为治疗Aβ和H2O2诱导的神经细胞的氧化损伤的药物。

所述鼠尾草酸及其二萜酚类组分治疗脑神经损伤病药物为治疗Aβ诱导的正常小鼠海马CA1区长时程增强（LTP）的损伤的药物。

所述鼠尾草酸及其二萜酚类组分治疗脑神经损伤病药物为治疗AD模型小鼠长时程增强（LTP）的损伤的药物。

所述的迷迭香提取物治疗脑神经损伤病药物为治疗三重脑震荡大鼠伤后学习记忆损伤的药物。

所述的迷迭香提取物组分作为制备治疗活血化瘀药物中的应用，它在体外能抑制凝血酶诱导的人血小板聚集作用。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：本发明的迷迭香提取鼠尾草酸及其二萜酚类组分的提取工艺简单易行，产品稳定，提取率较高。该方法提取的药物成分及其重结晶物，其制剂在制备神经退行性疾病药物、改善三重脑震荡大鼠伤后学习记忆、活血化瘀药物中的具有重要作用。

附图说明

图1是鼠尾草酸对照品的HPLC图谱；

图2是本发明提取的迷迭香中鼠尾草酸及其二萜酚类提取物的HPLC图谱；

图3 为Aβ所致神经元损伤的影响中溶剂对照组神经细胞形态；

图4  为Aβ处理组神经细胞形态；

图5 为迷迭香二萜酚类分预处理加Aβ组神经细胞形态；

图6 为鼠尾草酸预处理加Aβ组神经细胞形态；

图7为H2O2所致神经元损伤的影响中溶剂对照组神经细胞形态；

图8 为H₂O₂处理组神经细胞形态；

图9  为迷迭香二萜酚类分预处理加H₂O₂组神经细胞形态；

图10 为鼠尾草酸预处理加H₂O₂组神经细胞形态；

图11为本发明提取的迷迭香中鼠尾草酸对保护Aβ诱导的正常小鼠海马CA1区

长时程增强（LTP）损伤的影响；

图12为本发明提取的迷迭香中鼠尾草酸对保护Aβ诱导的正常小鼠海马CA1

区长时程增强（LTP）损伤的影响方框图；

图13为本发明提取的迷迭香中鼠尾草酸对AD模型小鼠LTP的影响；

图14本发明提取的迷迭香中鼠尾草酸对AD模型小鼠LTP的影响方框图；

图15为各实验组大鼠水迷宫无平台实验各象限停留时间柱状图。

图16为水迷宫逃避潜伏期趋势图。

图17为鼠尾草酸化合物结构图。

图18为鼠尾草酚化合物结构图。

具体实施方式

下面用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。

 

实施例1   迷迭香叶中鼠尾草酸的提取工艺研究

1 仪器与材料

1.1 仪器  P680型高效液相色谱系统(美国戴安公司)；MS204型电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多)；Thermo Scientific BDS HYPERSIL C18色谱柱（4.6 mm×150mm，5μm)；超声清洗仪(深圳市洁盟清洗设备有限公司，JP-040S)。

1.2 材料  迷迭香经南药研究协同创新中心（云南中医学院、昆明医科大学）赵荣华、张荣平教师鉴定为唇形科迷迭香属植物迷迭香(Rosmarinus officinalis L.)地上部分；鼠尾草酸对照品(批号20130402，南京康满林化工实业有限公司，质量分数98.0%)，乙腈为色谱纯，纯净水为娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯试剂。

2 方法

2.1 色谱条件  色谱柱：Thermo Scientific ODS柱（4.6 mm×150mm，5μm)，流动相：乙腈-2.5%甲酸水=65：35，检测波长：284 nm，柱温35℃ ，流速1.0mL/min，进样量20μL，样品经0. 45μm 微孔滤膜过滤，鼠尾草酸色谱峰与其他色谱峰基线分离，阴性试验结果表明阴性无干扰，方法学考察结果显示此条件适用于迷迭香中鼠尾草酸的含量测定，对照品及样品HPLC图谱见图1和图2。

2.2 标准曲线制备  精密称取鼠尾草酸对照品10.100mg，置10mL容量瓶中，甲醇溶解定容，精密量取0.1、0.3、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0mL，分别置于10 mL量瓶中，用甲醇定容，在“2.1”项色谱条件下分别进样，以对照品含量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），建立标准曲线，得到鼠尾草酸对照品的回归方程为Y=4.232X-0.025 ，r=0.9997，表明鼠尾草酸在0.20~ 4.04μg范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.3 供试品溶液的制备及鼠尾草酸提取率的测定

称取迷迭香样品5g，精密称定，按设定的提取条件进行提取，提取条件为乙酸乙酯超声提取4次，每次75min，每次乙酸乙酯的用量为迷迭香的14倍，待提取完成后，合并提取液，滤去残渣，滤液于45℃减压真空装置下浓缩干燥，精密称定，精密称定干浸膏20mg，甲醇定容于25mL 容量瓶中，过0. 45μm 微孔滤膜过滤，进样测定鼠尾草酸含量，计算鼠尾草酸提取率。

 

本发明提取工艺简单易行，产品稳定，鼠尾草酸平均提取率为2.479%，研究结果可为迷迭香药材的开发利用提供依据。

 

实施例2  本发明提取的迷迭香中鼠尾草酸及其二萜酚类组分对神经细胞和组织保护作用及其应用

在细胞水平上，我们取孕龄为18 d的C57小鼠，脱臼处死后无菌操作取出胎鼠的海马，剪碎，0.125% Typsine 37℃消化15 min，用含10% FBS 的DMEM终止消化后，75μm筛网滤过，滤液1000 r/min离心5min，弃上清。加Neurobasal medium 混悬，1000 r/min离心5min，弃上清。加Neurobasal medium 混悬，测细胞浓度，调整细胞浓度为5.2 × 105个/mL，接种于用PLL(0.01% solution) 包被后过的96孔板和6孔板中。培养至72 h后加入终浓度为2.5 mg/L阿糖胞苷纯化神经元。于第7天用于实验，加入迷迭香二萜酚类组分或鼠尾草酸预处理30 min，加入Aβ损伤神经元，迷迭香二萜酚类组分或鼠尾草酸用DMSO溶解，加入相同体积二甲基亚砜(DMSO)作试剂空白对照组。用神经元特异性抗体MAP2染色，共聚焦下观察细胞形态。溶剂对照组结果见图3，Aβ处理组结果见图4，迷迭香二萜酚类成分预处理加Aβ组结果见图5，鼠尾草酸预处理加Aβ组结果见图6，表明迷迭香二萜酚类组分和鼠尾草酸能够保护Aβ诱导的神经细胞的氧化损伤。

我们取孕龄为18 d的C57小鼠，脱臼处死后无菌操作取出胎鼠的海马，剪碎，0.125% Typsine 37℃消化15 min，用含10% FBS 的DMEM终止消化后，75μm筛网滤过，滤液1000 r/min离心5min，弃上清。加Neurobasal medium 混悬，1000 r/min离心5min，弃上清。加Neurobasal medium 混悬，测细胞浓度，调整细胞浓度为5.2 × 105个/mL，接种于用PLL(0.01% solution) 包被后过的96孔板和6孔板中。培养至72 h后加入终浓度为2.5 mg/L阿糖胞苷纯化神经元。于第7天用于实验，加入迷迭香二萜酚类组分或鼠尾草酸预处理30 min，加入H2O2损伤神经元，迷迭香二萜酚类组分或鼠尾草酸用DMSO溶解，加入相同体积二甲基亚砜(DMSO)作试剂空白对照组。用神经元特异性抗体MAP2染色，共聚焦下观察细胞形态。溶剂对照组结果见图7，Aβ处理组结果见图8，迷迭香二萜酚类组分预处理加Aβ组结果见图9，鼠尾草酸预处理加H2O2组结果见图10，表明迷迭香二萜酚类组分和鼠尾草酸能够保护H2O2诱导的神经细胞的氧化损伤。

在离体组织水平，我们按照电生理实验要求，切制小鼠海马脑片，用我们提取分离出的迷迭香二萜酚类组分和其主要成分鼠尾草酸进行处理，研究迷迭香二萜酚类组分和其主要成分鼠尾草酸对学习记忆分子模型长时程增强（LTP）有影响。我们采用常规电生理实验技术，在海马CA1区诱导产生LTP，发现迷迭香二萜酚类组分和其主要成分鼠尾草酸能够保护Aβ诱导的正常小鼠海马CA1区长时程增强（LTP）的损伤（如图11、12）。 

我们又用AD模型小鼠进行实验，采用常规电生理实验技术，在海马CA1区诱导产生LTP，发现AD模型小鼠海马脑片经过迷迭香二萜酚类组分和其主要成分鼠尾草酸进行处理后，海马CA1区受损的长时程增强（LTP）得到逆转，说明迷迭香二萜酚类组分和其主要成分鼠尾草酸能够逆转AD模型小鼠长时程增强（LTP）的损伤（如图13、14），对AD模型小鼠学习记忆能力损伤可能具有保护作用。     

综上，我们的这些发现表明迷迭香对神经细胞和组织具有保护作用，可以用于神经退行性疾病药物用途，这一研究尚未见有研究报道。

 

实施例3  本发明提取的迷迭香提取物血小板聚集和抗血小板聚集试验

试药材料：凝血酶（来自牛血浆，T4648）购自Sigma公司，PAR1-AP来自中国上海吉尔生化，人富含血小板血浆购自云南血液中心。血小板凝集计购自Precil公司（北京）。所有其他试剂购自Sigma公司。迷迭香提取物为自制。

人血小板的预制备：

洗涤血小板的制备如前所述。简单来说，血小板从人富含血小板血浆(PRP)以400g离心5分钟。

血小板聚集和抗血小板聚集试验：

洗涤的血小板试验前在37摄氏度预培养30分钟。然后，血小板用各种试剂如凝血酶、PAR1-AP、本发明提取的迷迭香提取物组分受激，用血小板凝集计记录血小板聚集。

对血小板聚集试验，本发明提取的迷迭香提取物组分粉末用DMSO溶解，并进一步稀释至各浓度梯度(10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 mg/ml)以便活性测定。加1 μL各种浓度的本发明提取的迷迭香提取物组分至血小板，1 μL凝血酶（0.3U/mL）做阳性对照，1 μL  DMSO做阴性对照。用血小板凝集计记录5分钟透光率的改变（间接反映血小板聚集速率）。

对于抗血小板聚集试验，在血小板悬液中加入1 μL各种浓度的迷迭香提取物组分，在37℃水浴孵育5min。孵育期后，用0.08U/ml凝血酶或6μM PAR1-AP受激，记录聚集速率。阳性对照药为预孵化的血小板加1μL DMSO，并加0.08 U/ml凝血酶或6 μM PAR1-AP，阴性对照为血小板加DMSO。

迷迭香提取物组分浓度达到3.3 μg/ml时，诱导人血小板聚集作用增强。

研究本发明提取的迷迭香提取物组分对血小板聚集的影响，包括血小板聚集或抗血小板聚集。首先，我们测试迷迭香提取物组分的血小板聚集活性。药物粉末不溶于水而溶于DMSO，准备了一个从10 mg/ml至1 μg/ml（ 10，1， 0.1 ，0.01， 0.001 mg/ml）的浓度梯度 。对血小板聚集实验，1μL 本发明提取的迷迭香提取物组分加入300μL血小板，所以迷迭香提取物组分的最终浓度分别为33，3.3，0.33，0.033，0.0033μg/ml。实验发现，从0.0033至0.33μg/ml，都不能刺激血小板聚集。然而，浓度超过3.3μg/ml，血小板聚集作用明显增强。浓度为3.3 μg/ml，药物的最大血小板聚集率为8.43%。

浓度低于3.3μg/ml时， 迷迭香提取物组分不能诱导人血小板聚集：在该试验中，使用血小板凝集计记录加药5min后的聚合速率。凝血酶作为阳性对照，DMSO作为阴性对照；迷迭香提取物组分浓度达到或超过3.3μg/ml时，诱导人血小板聚集能力显著增强。

迷迭香提取物组分能抑制凝血酶诱导的人血小板聚集：我们发现药物在浓度为0.033至330 ng/ml范围内可以很好的抑制凝血酶诱导的人血小板聚集。更为重要的是，迷迭香提取物组分的血小板聚集抑制作用是剂量依赖性的。对于以0.08 U/ml凝血酶诱导的血小板聚集，330ng/ml的药物抑制率分别为50.18 ％。当浓度下降至0.33ng/ml时，仍能一定的抑制血小板聚集活性。

迷迭香提取物组分能抑制凝血酶诱导的人血小板凝集：在测定中，所述血小板中加入1微升DMSO作为阴性对照，加入含0.08U凝血酶的DMSO 1μl作为阳性对照。从0.033到330 ng/ml 梯度浓度的迷迭香提取物组分，能很好的抑制凝血酶诱导的人血小板聚集。且这种抑制活性呈现为剂量依赖性。当最低浓度为0.033 ng/ml仍能抑制0.08U凝血酶诱导的人血小板聚集，而迷迭香提取物组分的最低抑制浓度为3.3 ng/ml。

迷迭香提取物组分不能抑制PAR1-AP诱导的人血小板聚集：人血小板在37℃不同浓度的迷迭香提取物组分（3.3，33，330 ng/ml）预温育处理5分钟，以加入1 μl DMSO的血小板作为阴性对照，然后用0.06 μM PAR1-AP受激。结果显示，迷迭香提取物组分 对PAR1-AP诱导的人血小板聚集没有抑制作用。

结论：迷迭香提取物组分在体外能抑制凝血酶诱导的人血小板聚集作用，可用于制备活血化瘀的药物。此外，我们还证明，凝血酶诱导的血小板聚集抑制作用鱼蛋白酶活化受体1（PAR1）相互独立。这提示我们迷迭香提取物组分抑制凝血酶诱导的血小板聚集的机制有可能是作用于凝血酶本身，而不是凝血酶受体（PAR1）。因此，迷迭香提取物组分抑制凝血酶诱导血小板聚集的机制尚需进一步研究。

 

实施例4 本发明提取的迷迭香提取物组分干预三重脑震荡大鼠早期空间认知行为变化研究

本研究在建立MCC动物模型的基础上，建立了连续3天，每天1次打击的脑震荡大鼠模型称为三重脑震荡大鼠模型（MCC损伤组）。并对MCC大鼠迷迭香干预后进行连续16天的水迷宫行为学变化，以此来动态评估大鼠空间学习记忆的恢复情况，从而为临床脑震荡患者的治疗提供参考。

材料和方法

1.1  材料

成年健康雄性Stragu-Dawley（SD）大鼠56只，体重280±20g，购自昆明医科大学动物学部。大鼠于实验前1周运到实验室，在安静环境下（明/暗周期为12h）分笼饲养，自由摄食饮水。饲养环境温度15℃-22℃，湿度50%-60%。

1.2  动物分组与给药

健康雄性大鼠随机分为MCC24h组，正常对照组，MCC吐温组，MCC迷迭香干预组，依达拉奉组。迷迭香干预组分为低中高3个剂量组，每组8只。迷迭香三剂量组分别配本发明提取的迷迭香提取物组分20mg/ml,40mg/ml,80mg/ml。在建立完模型当天进行灌胃，连续7天。

1.3 脑震荡模型的制作

MCC大鼠模型：采用金属单摆闭合性脑损伤打击装置构建脑震荡方法。每间隔24h打击大鼠致单纯性脑损伤一次，连续打击3d，构建MCC大鼠模型。期间凡有一次判定为复杂脑损伤者则剔除实验。

1.4 行为学实验程序：

迷迭香干预后，对各实验组大鼠进行连续16天的水迷宫行为学测试，包括第1至第14天的水下平台实验、第15和第16天的水上平台实验及第16天的无平台实验。

①水下平台实验 第1-14天进行。将大鼠背侧面向池壁随机按4个方向放入水中，以120s为限，记录大鼠从入水至爬上平台的时间（逃避潜伏期），超过120s未能爬上平台者记录为120s，并协助其找到平台。到达平台的大鼠使其在平台上停留30s，然后放回温箱休息4min，开始另一轮实验，直至4个象限都测试完毕。

②水上平台实验 第15-16两天进行。将实验平台升高4厘米并暴露于水面上，并将平台边缘标记成白色，用于加强大鼠的学习记忆能力。记录大鼠找到平台的时间，并使其在平台上停留30s，然后放回温箱休息4min，开始另一轮实验，直至4个象限都测试完毕。

③无平台实验 第16天撤去平台后进行实验，共测试2次，来了解大鼠的参照记忆能力和记忆的保持情况。本实验在第二天水上平台实验完成4min后立即实施。将大鼠从远离平台方向的位置投入水中（即北方和西方），以60s为限分别记录大鼠在4个象限的停留时间。两次实验间期的休息时间仍为4min。

1.5统计学处理

应用SPSS 17.0软件包对实验行为学数据进行单因素方差分析及两两比较的q检验。数据采用均数±标准差(ˉx±S)表示，设P＜0.05时，对比组之间的差异有统计学意义，P＞0.05为差异无统计学意义。

                        

   结果如表1和图15、16所示

表1 水迷宫逃避潜伏期数据表（单位/s  n=8）

NORMAL

MCC24

Y

T

M-A

M-B

M-C

水下平台实验1d

76.87±9.64

111.25±6.03#

90.40±8.48#

109.90±7.14#

72.00±19.57*

89.68±27.55*

80.68±11.63*

水下平台实验2d

37±9.87

106.28±7.07#

61.37±8.18#

100.53±15.88#

56.68±27.17*

65.75±26.98#*

54.50±13.09#*

水下平台实验3d

23.87±9.008

98.12±6.04#

43.84±2.18#

87.87±13.82#

38.78±20.18*

49.75±27.90#*

31.65±15.11*

水下平台实验4d

20.93±8.00

79.34±21.08#

34.78±11.2#

74.90±19.67#

26.18±14.62*

23.84±12.42*

28.15±11.63*

水下平台实验5d

14.37±3.89

67.81±20.63#

28.59±8.64#

54.43±28.80#

16.87±4.43*

21.31±8.99*

23.25±5.34#*+

水下平台实验6d

11.12±1.58

47.93±19.10#

31.68±4.54#

50.31±23.14#

21.53±6.03#*

23.37±12.79#*

24.71±6.90#*

水下平台实验7d

9.37±1.30

40.90±17.23#

18.71±7.09#

40.28±21.41#

15.31±4.40#*

17.28±9.22#*

13.53±5.20#*

水下平台实验8d

7.75±0.70

44.40±15.25#

13.75±4.47#

37.59±18.21#

17.40±6.32#*

16.53±12.27*

14.31±5.18#*

水下平台实验9d

5.87±0.83

27.81±10.74#

14.59±5.44#

32.28±15.33#

9.59±3.56#*

10.59±3.51#*

14.25±4.77#*+

水下平台实验10d

5.25±0.70

23.90±7.42#

12.18±2.80#

30.18±9.28#

10.59±2.91#*

10.53±2.85#*

13.09±6.16#*

水下平台实验11d

3.62±.057

16.43±4.92#

11.59±4.26#

21.00 ±4.92#

9.5±3.57#*

11.43 ±4.90#

13.84 ±6.34#

水下平台实验12d

3.12±0.83

14.21±5.08#

10.21±3.65#

16.93 ±2.14#

10.31 ±4.20#

10.12±3.13#

14.40 ±4.77#

水下平台实验13d

2.75±1.07

12.5±4.41#

9.03±5.46#

16.37±4.40#

9.48±2.50#

9.56±2.76#

11.37±4.23#

水下平台实验14d

2.6±0.53

10.53±3.16#

9.00±5.91#

15.46±5.84#

8.28±3.46#

9.03±1.66#

14.65±6.74#

水上平台实验1d

5.13±0.92

11.81±2.12#

9.69±2.12#

13.90±2.71#

9.81±2.00#

9.93±2.33#

11.46±2.79#+

水上平台实验2d

3.97±0.76

10.28±1.09#

8.71±1.95#

12.5±2.63#

8.65±1.67#

8.43±2.68#

9.90±1.34#

无平台实验第Ⅰ象限

45.63±4.53

35.88±5.37#

39.38±1.40

34.69±4.40#

38.38±6.08

39.25±4.66

38.94±6.41

无平台实验第Ⅱ象限

5.25±2.76

10.13±3.62

8.31±1.98

8.56±1.95

8.31±4.99

7.75±1.81

7.81±2.15

无平台实验第Ⅲ象限

3.75±1.48

6.56±1.89

6.31±0.99

8.81±4.95

6.25±2.67

7.00±3.57

5.31±1.35

无平台实验第Ⅳ象限

5.37±1.84

7.43±2.24

6.37±1.15

8.5±2.13

8.00±3.39

4.25±2.36

7.68±3.02

#表各组与NORMAL组比较P<0.05；*表MCC24和T组与迷迭香干预组及依达拉奉组比较P<0.05；+代表M-A与M-C比较P<0.05；代表M-B与M-C比较P<0.05。

图15各实验组大鼠水迷宫无平台实验各象限停留时间柱状图，代表MCC24和T组在第一象限的时间明显减少。图16为水迷宫逃避潜伏期趋势图。

1.1 Morris水迷宫水下平台、水上平台试验

在MCC24和吐温组（T）14天的水下平台实验的比较中，两者从1-14天p>0.05,均无统计学意义。说明溶剂吐温是没有起到治疗作用的。

在各组与NORMAL组的比较中，MCC24、Y和T组都是P<0.05有明显的统计学意义，M-A在第7天到第14天均有统计学意义，M-B在第2天、第3天、第6天、第7天和第9到10天均是p<0.05，有统计学意义。在M-A,M-B,M-C,Y四组与MCC24的水下平台实验的比较中，M-A和MCC24前11天的比较中p<0.05是有明显的统计学意义的，而在12-14天p>0.05是没有统计学意义的；M-B,M-C,Y与MCC24的比较中，在前10天p<0.05是有明显的统计学意义的，在11-14天当中p>0.05是没有统计学意义的。在M-A,M-B,M-C三组之间的比较当中，M-A和M-C在第5天，第9天，第14天p<0.05有统计学意义，M-B和M-C在第14天p<0.05有统计学意义。在水上平台的比较中，所有组与NORMAL比较都是有意义的。M-A,M-B,M-C三组之间比较都是没有统计学意义的。MCC24和T与M-A,M-B,M-C，Y之间的比较也是没有统计学意义的。

1.2 Morris水迷宫无平台

各组之间比较除开MCC24和T组在第一象限的时间明显减少之外其余的组之间都是没有统计学意义的。

讨论与结论

在本实验中迷迭香干预组在1到10天与MCC组相比逃避潜伏期的时间明显减少，但是后期没有统计学意义。说明迷迭香可以明显改善三重脑震荡后早期的行为学变化。在MCC24和吐温组（T）14天的水下平台实验的比较中，两者从1-14天p>0.05,均无统计学意义 。说明溶剂吐温是没有起到治疗作用的。而在迷迭香干预组之间的比较中M-A和M-C在第5天，第9天，第14天p<0.05有统计学意义，M-B和M-C在第14天p<0.05有统计学意义，M-A与M-B第1到14天都是没有统计学意义的。三个剂量之间还是没有明显的剂效量关系。在水上平台的比较中，所有组与NORMAL比较都是有意义的。M-A,M-B,M-C三组之间比较都是没有统计学意义的。MCC24和T与M-A,M-B,M-C，Y之间的比较也是没有统计学意义的。说明在后期的行为学改变中，迷迭香的改善效果不及早期。Morris水迷宫无平台探测试验中，在原有平台象限(Ⅲ象限)的时间比normal组相比无显著差异，吐温组与MCC相比较也是无差异。在此表明，迷迭香可以改善脑震荡后早期大鼠的空间学习记忆能力。

Claims (8)

1.一种迷迭香中以鼠尾草酸为定量指标的提取方法，其特征在于：

称取迷迭香样品5g，按设定的提取条件进行提取，提取条件为乙酸乙酯超声提取4次，每次75min，每次乙酸乙酯的用量为迷迭香的14倍，待提取完成后，合并提取液，滤去残渣，滤液于45℃减压真空装置下浓缩干燥，得到干浸膏。

2.称定干浸膏20mg，甲醇定容于25mL 容量瓶中，过0.45μm 微孔滤膜过滤，进样高效液相色谱，测定鼠尾草酸含量，计算鼠尾草酸提取率；提取率计算如式（Ⅰ）所示：

  

鼠尾草酸平均提取率为2.479%。

3.权利要求1所述的提取物，或再经过反复石油醚重结晶得到的晶体状鼠尾草酸及其二萜酚类组分（见图17、18），均可作为制备治疗脑神经损伤病药物中的应用。

4.根据权利要求2所述的迷迭香中鼠尾草酸及其二萜酚类组分作为制备治疗脑神经损伤病药物中的应用，其特征在于所述的治疗脑神经损伤病药物为治疗Aβ和H2O2诱导的神经细胞的氧化损伤的药物。

5.根据权利要求2所述的迷迭香中鼠尾草酸及其二萜酚类组分作为制备治疗脑神经损伤病药物中的应用，其特征在于所述的治疗脑神经损伤病药物为治疗Aβ诱导的正常小鼠海马CA1区长时程增强（LTP）的损伤的药物。

6.根据权利要求2所述的迷迭香中鼠尾草酸及其二萜酚类组分作为制备治疗脑神经损伤病药物中的应用，其特征在于所述的治疗脑神经损伤病药物为治疗AD模型小鼠长时程增强（LTP）损伤的药物。

7.根据权利要求1所述的迷迭香提取物组分作为制备治疗脑神经损伤病药物中的应用，其特征在于所述的治疗脑神经损伤病药物为治疗三重脑震荡大鼠伤后学习记忆损伤的药物。

8.根据权利要求1所述的迷迭香提取物组分作为制备治疗活血化瘀药物中的应用。