CN104013576B - 尿酸酶多囊脂质体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物制剂领域。本发明涉及尿酸酶多囊脂质体的配方及制备方法。本发明制备得到的尿酸酶多囊脂质体可以提高尿酸酶的活性、降低其免疫原性，并且能使尿酸酶缓慢释放，延长药物作用时间和药效时间。

Description

尿酸酶多囊脂质体及其制备方法

技术领域

本发明属于医药制剂领域，涉及尿酸酶多囊脂质体及其制备方法。

背景技术

尿酸是人体嘌呤碱基分解代谢终产物，经肾脏排泄。体内尿酸生成超过肾脏排泄时，血清尿酸会显著升高，造成高尿酸血症。高尿酸血症与痛风、心血管疾病、肿瘤裂解综合征及肾脏疾病的引发或加剧密切相关。因此，需要开发安全有效的药物来治疗高尿酸血症。尿囊素的优良水溶性和肾脏对其高效的排泄能力使尿酸酶可能成为治疗高尿酸血症的理想药物。临床研究表明尿酸酶可快速高效降低血尿酸，且专一性高，在治疗肿瘤溶解综合征的高尿酸血症时，尿酸酶比别嘌呤醇更安全有效。尿酸酶还可以用于防治肿瘤化疗时产生的高尿酸血症，也可用于治疗痛风，故将其用作降低血浆尿酸的药物存在巨大需求。多囊脂质体作为新型脂质体，主要用于运载亲水性化学药物(阿米卡星，吗啡，顺铂，阿昔洛韦等)和小分子肽(干扰素，胰岛素样生长因子，载脂蛋白E肽链和人表皮生长因子等)，注射后，作为药物贮库随时间缓慢释放被包封的药物达到缓释长效的作用。尿酸酶为大分子药用酶，其本身具有体内外活性低，体内生理条件下易降解，具有免疫原性等缺点，所以有必要研制能提高尿酸酶活性且具有缓释效果的尿酸酶多囊脂质体。经查询专利及文献，目前尚无药用酶多囊脂质体的任何研究报道，更无尿酸酶多囊脂质体的任何研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种具有活性高、免疫原性低和缓释效果的尿酸酶多囊脂质体及其制备方法。尿酸酶多囊脂质体具有给药频率低，刺激性小，免疫原性低的优点。本发明制备得到的尿酸酶多囊脂质体可用于治疗高尿酸血症、痛风等。尿酸酶多囊脂质体能克服尿酸酶在体内活性低，循环半衰期较短，易诱发机体免疫反应，产生免疫原性和抗原反应等缺点。尿酸酶多囊脂质体可以保持较长时间的有效血药浓度，有效地提高尿酸酶的活性和稳定性，并能降低其免疫原性。本发明提供的尿酸酶多囊脂质体制备工艺简单，成本较低，易于控制，易于工业化生产。

本发明提供的尿酸酶多囊脂质体，其特征在于制剂中各组分重量百分比为：尿酸酶1-3份，磷脂1-3份，胆固醇1-3份，三油酸甘油酯1-3份，葡萄糖(I)2-6份，泊洛沙姆F-683-7份，泊洛沙姆F-12715-30份，缓冲液(I)80-120份，L-赖氨酸1-3份，葡萄糖(II)10-15份，缓冲液(II)200-500份，缓冲液(I)和缓冲液(II)指硼酸盐缓冲液或Tris缓冲液或Bicine缓冲液，pH为8-9。本发明提供的尿酸酶多囊脂质体，可以采用复乳法制备，步骤如下：(1)初乳制备：取处方量的尿酸酶、泊洛沙姆F-127、泊洛沙姆F-68、葡萄糖(I)溶于处方量的内水相中的缓冲液中，称取处方量的磷脂、胆固醇、三油酸甘油酯溶于乙醚作为油相，将缓冲液(I)与油相混合，在涡旋条件下制得W/O型初乳；(2)复乳制备：取处方量的L-赖氨酸与葡萄糖(II)溶于处方量的缓冲液(II)，将初乳快速加入到外水相中，机械分散制成W/O/W型复乳；(3)多囊脂质体制备：将复乳于室温下减压旋转蒸发除去乙醚，即得。

用本发明制得的尿酸酶多囊脂质体的平均粒径约为23μm，95％以上的尿酸酶多囊脂质体的粒径在5～40μm范围(图1)。本发明提供的尿酸酶多囊脂质体的体内药物代谢实验结果表明尿酸酶多囊脂质体在体内可以缓慢释放药物，与普通尿酸酶脂质体(药时曲线下面积AUC_(0-∞)为196.4U/L*h；半衰期t_1/2为2.6h)相比，尿酸酶多囊脂质体(AUC_(0-∞)为361.8Ug/L*h；t_1/2为4.5h)具有明显的缓释作用和较高的生物利用度(图2)。本发明提供的尿酸酶多囊脂质体的体内药效学实验结果表明尿酸酶多囊脂质体降尿酸的效果明显优于游离尿酸酶，尿酸酶多囊脂质体将高尿酸血症大鼠体内的尿酸浓度降到正常水平只需要9小时左右，而游离尿酸酶却需要36小时(图3)。本发明提供的尿酸酶多囊脂质体的免疫原性实验结果表明大鼠静脉注射尿酸酶多囊脂质体后体内产生的抗体水平明显低于静脉注射游离尿酸酶后体内的抗体水平，21天时大鼠静脉注射游离尿酸酶是静脉注射尿酸酶多囊脂质体后体内的抗体量的2倍多，说明尿酸酶多囊脂质体的免疫原性低，与游离尿酸酶相比临床应用更好(图4)。

目前尚无药用酶多囊脂质体的任何研究报道，本专利首次报道尿酸酶多囊脂质体及其制备方法。本专利不同于通常研究报道的化学药物或小分子肽的多囊脂质体的配方和制备工艺。由于尿酸酶的最适pH为8.5，本发明首次在尿酸酶多囊脂质体的配方中用pH8-9的硼酸盐缓冲液或Tris缓冲液或Bicine缓冲液替换普通多囊脂质体配方中的蒸馏水(pH约为7.0)，使尿酸酶能在接近其最适pH环境中，将用本发明制备得到的尿酸酶多囊脂质体静脉注射入体内后，体内缓释效果非常明显。尿酸酶为多肽蛋白质类药物，可溶于水，我们曾采用以前文献报道(Angst MS，Drover DR.Pharmacology of drugs formulated withDepoFoam：a sustained release drug delivery system for parenteraladministration using multivesicular liposome technology[J].ClinPharmacokinet.2006，45(12)：1153-1176；Davidson EM，Barenholz Y，Cohen R，etal.High-Dose bupivacaine remotely loaded into multivesicular liposomesdemonstrates slow drug release without systemic toxic plasma concentrationsafter subcutaneous administration in humans[J].AnesthAnalg.2010，110(4)：1018-1023)的通常用于制备化学药物或多肽类的多囊脂质体的配方和制备工艺得到的普通尿酸酶多囊脂质体，实验结果表明尿酸酶的活性非常低，故本发明首次在尿酸酶多囊脂质体的配方中用pH8-9的硼酸盐缓冲液或Tris缓冲液或Bicine缓冲液替换普通配方中的蒸馏水，使尿酸酶能在接近其最适pH环境中，使得静脉注射本发明制备得到的尿酸酶多囊脂质体后，不但体内保留的活性较游离酶高很多，而且缓释效果也非常明显，分析原因可能如下：当尿酸酶包裹于多囊脂质体，其内部的微环境接近尿酸酶的最适pH，其活性保留高。多囊脂质体为多个非同心圆的囊泡结构，进入体内后其囊泡由外到内缓慢破裂，这样便使易溶于水的尿酸酶达到了缓释的目的。

附图说明

图1为本发明制得的尿酸酶多囊脂质体的粒径

本发明制得的尿酸酶多囊脂质体的平均粒径约为23μm，95％以上的尿酸酶多囊脂质体的粒径在5～40μm范围.

图2为本发明制得的尿酸酶多囊脂质体的体内药代动力学

大鼠静脉给予尿酸酶多囊脂质体，普通脂质体和游离尿酸酶后的体内平均血药浓度一时间曲线如图2。实验结果表明与普通脂质体和游离尿酸酶比较，尿酸酶多囊脂质体在体内可以缓慢释放药物，具有缓释作用。

图3为本发明制得的尿酸酶多囊脂质体的体内药效学

将大鼠造成高尿酸血症模型后，静脉给予尿酸酶多囊脂质体和游离尿酸酶，采用尿酸试剂盒测定尿酸浓度，大鼠体内尿酸水平变化如图3。尿酸酶多囊脂质体将高尿酸血症大鼠体内的尿酸浓度降到正常水平只需要9小时左右，而游离尿酸酶却需要36小时，表明尿酸酶多囊脂质体降尿酸效果明显优于游离尿酸酶。

图4为本发明制得的尿酸酶多囊脂质体的免疫原性实验

连续六周大鼠静脉给予尿酸酶多囊脂质体和游离尿酸酶后，采用ELISA方法测定大鼠体内产生的抗体量，大鼠体内抗体水平变化如图4，阳性对照是卵白蛋白，阴性对照是生理盐水。实验结果表明结果表明大鼠静脉注射尿酸酶多囊脂质体后体内产生的抗体水平明显低于静脉注射游离尿酸酶后体内的抗体水平，21天时大鼠静脉注射游离尿酸酶是静脉注射尿酸酶多囊脂质体后体内的抗体量的2倍多，说明尿酸酶多囊脂质体的免疫原性低，与游离尿酸酶相比更具有临床应用价值。

具体实施方式

为了进一步说明本发明及其优点，给出了下列特定的实施例，应理解这些实施例仅有于具体说明而不是作为本发明范围的限制。

实施例1：

配方中含有的各组分的重量组成比为：卵磷脂1份，胆固醇1份，三油酸甘油酯1份，葡萄糖(I)2份，泊洛沙姆F-683.4份，泊洛沙姆F-12715份，硼酸盐缓冲液pH8(I)80份，L-赖氨酸1份，葡萄糖(II)10份，硼酸盐缓冲液pH8(II)200份。

制备方法包括下列步骤：(1)初乳制备：取处方量的尿酸酶、泊洛沙姆F-127、泊洛沙姆F-68、葡萄糖(I)溶于处方量的硼酸盐缓冲液(I)中，称取处方量的磷脂、胆固醇、三油酸甘油酯溶于乙醚作为油相，将硼酸盐缓冲液(I)与油相混合，在涡旋条件下制得W/O型初乳；(2)复乳制备：取处方量的L-赖氨酸与葡萄糖溶于处方量的硼酸盐缓冲液(II)，将初乳快速加入到硼酸盐缓冲液(II)中，机械分散制成W/O/W型复乳；(3)多囊脂质体制备：将复乳于室温下减压旋转蒸发除去乙醚，即得。

实施例2：

配方中含有的各组分的重量组成比为：卵磷脂1.3份，胆固醇1.4份，三油酸甘油酯1.3份，葡萄糖(I)4份，泊洛沙姆F-684.8份，泊洛沙姆F-12721份，硼酸盐缓冲液pH8.2(I)95份，L-赖氨酸2.2份，葡萄糖(II)12份，Bicine缓冲液pH8.7(II)360份。

制备方法基本同实施例1。

实施例3：

配方中含有的各组分的重量组成比为：卵磷脂1.6份，胆固醇1.6份，三油酸甘油酯1.5份，葡萄糖(I)5.5份，泊洛沙姆F-686.5份，泊洛沙姆F-12728份，硼酸盐缓冲液pH8.9(I)115份，L-赖氨酸1.2份，葡萄糖(II)10.5份，Tris缓冲液pH8.3(II)230份。

制备方法基本同实施例1。

实施例4：

配方中含有的各组分的重量组成比为：卵磷脂1.9份，胆固醇1.9份，三油酸甘油酯2.9份，葡萄糖(I)4.5份，泊洛沙姆F-685.5份，泊洛沙姆F-12725份，硼酸盐缓冲液pH8.2(I)105份，L-赖氨酸2.8份，葡萄糖(II)14.5份，硼酸盐缓冲液pH8.2(II)420份。

制备方法基本同实施例1。

实施例5：

配方中含有的各组分的重量组成比为：卵磷脂2份，胆固醇1.5份，三油酸甘油酯2.1份，葡萄糖(I)3份，泊洛沙姆F-685份，泊洛沙姆F-12722.5份，硼酸盐缓冲液pH8.5(I)100份，L-赖氨酸1.9份，葡萄糖(II)13.3份，硼酸盐缓冲液pH8.5(II)330份。

制备方法基本同实施例1。

实施例6：

配方中含有的各组分的重量组成比为：卵磷脂2.1份，胆固醇2.2份，三油酸甘油酯2.2份，葡萄糖(I)2.8份，泊洛沙姆F-683.8份，泊洛沙姆F-12717份，硼酸盐缓冲液pH8.7(I)85份，L-赖氨酸1.6份，葡萄糖(II)11.5份，Tris缓冲液pH8.7(II)290份。

制备方法基本同实施例1。

实施例7：

配方中含有的各组分的重量组成比为：卵磷脂2.3份，胆固醇2.4份，三油酸甘油酯2.4份，葡萄糖(I)3.2份，泊洛沙姆F-684.2份，泊洛沙姆F-12719份，硼酸盐缓冲液pH9(I)90份，L-赖氨酸2.4份，葡萄糖(II)14份，Bicine缓冲液pH8.2(II)390份。制备方法基本同实施例1。

实施例8：

配方中含有的各组分的重量组成比为：卵磷脂2.6份，胆固醇2.8份，三油酸甘油酯2.8份，葡萄糖(I)5份，泊洛沙姆F-686份，泊洛沙姆F-12727份，硼酸盐缓冲液pH8.2(I)110份，L-赖氨酸1.4份，葡萄糖(II)11份，硼酸盐缓冲液pH8.9(II)260份。

制备方法基本同实施例1。

实施例9：

配方中含有的各组分的重量组成比为：卵磷脂3份，胆固醇3份，三油酸甘油酯3份，葡萄糖(I)6份，泊洛沙姆F-687份，泊洛沙姆F-12730份，硼酸盐缓冲液pH8.5(I)120份，L-赖氨酸3份，葡萄糖(II)15份，硼酸盐缓冲液pH8.8(II)500份。

制备方法基本同实施例1。

Claims (4)

1.一种尿酸酶多囊脂质体，其特征在于制剂中尿酸酶含量为0.5～1.5U/mL，制备制剂所用的缓冲液pH为8～9，离子强度为10～100mM，其余各组分重量比为：

2.根据权利要求1所述的尿酸酶多囊脂质体，其特征在于制备制剂所用的缓冲液是硼酸-硼砂缓冲液、Tris缓冲液、Bicine缓冲液，离子强度为10～100mM，pH值范围在8～9。

3.根据权利要求1所述的尿酸酶多囊脂质体的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：(1)初乳制备：取处方量的尿酸酶、泊洛沙姆F-127、泊洛沙姆F-68、葡萄糖I溶于处方量的缓冲液I中，称取处方量的磷脂、胆固醇、三油酸甘油酯溶于乙醚作为油相，将缓冲液I与油相混合，在涡旋条件下制得W/O型初乳；(2)复乳制备：取处方量的L-赖氨酸与葡萄糖II溶于处方量的缓冲液II中，将初乳快速加入到外水相中，机械分散制成W/O/W型复乳；(3)多囊脂质体制备：将复乳于室温下减压旋转蒸发除去乙醚，即得。

4.根据权利要求1所述的尿酸酶多囊脂质体，其特征在于：尿酸酶多囊脂质体的平均粒径约为23μm，Zeta电位小于-20，脂质纳米粒介导酶的微环境偏碱性，体液pH 7.4时，比较于游离尿酸酶，尿酸酶多囊脂质体的催化活性增加，缓释效果明显，半衰期延长，免疫原性下降。