CN104415331A - 一种包载抗体的长循环脂质体、其制备方法以及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及一种包载抗体的长循环脂质体及其制备方法和用途。本发明中包载抗体的长循环脂质体，由治疗性抗体和脂质体成分组成，以脂质体为载体，包含长循环辅料。脂质体是以磷脂、胆固醇和长循环脂质体辅料为材料制成。本发明的长循环脂质体能够长时间、稳定的释放抗体活性成分，使玻璃体腔内的药物存在时间较单纯注射抗体延长3倍，注射后能够长期有效的治疗眼内炎症，减轻视网膜的损伤。能减少给药次数，降低治疗的风险，提高对眼部疾病的疗效，同时减少全身不良反应，具有新的临床实用价值。

Description

一种包载抗体的长循环脂质体、其制备方法以及应用

技术领域

本发明属于医药技术领域。具体涉及一种包载抗体的长循环脂质体、制备方法以及其应用。

背景技术

自身免疫性眼科炎症性疾病由于其病因复杂、治疗效果不一、往往伴有副作用等现状，是目前眼科疾病的难题之一。例如，葡萄膜视网膜炎就是一类复杂的自身免疫性眼科炎症性疾病，它多发生于青壮年，常反复发作，易导致盲目，且多为不可治盲，因此在致盲眼病中占有重要地位。葡萄膜视网膜炎的治疗一直是眼科的难题。研究表明，肿瘤坏死因子α（TNF-α）是炎症级联反应中重要的促炎症细胞因子，在人体正常的免疫功能和多数自身免疫性疾病的发病机制中发挥关键性作用。很多研究表明，TNF-α在强直性脊柱炎、类风湿关节炎、自身免疫性葡萄膜视网膜炎等的发病机制中发挥重要的作用。在葡萄膜视网膜炎的研究中发现，活化的炎症细胞分泌TNF-α，而TNF-α又促进炎症细胞进一步活化，加速趋化因子和粘附分子的合成，促进中性粒细胞在眼内聚集，T淋巴细胞增生活跃，从而引起眼组织的免疫病理损伤。

TNF-α是炎症级联反应中处于中心位置的细胞因子，所以，中和TNF-α可以改善机体的炎症状态，有效的治疗疾病。抗肿瘤坏死因子α单克隆抗体（Infliximab单抗）是一种新型的生物单抗制剂，其商品名为类克（Remicade），是人/鼠嵌合的抗TNF-αIgG1κ同型链单克隆抗体(75%为人源化，25%为鼠源化)，它与巨噬细胞和T细胞的细胞膜表面TNF-α高亲和结合，通过经典的补体激活途径和抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（ADCC作用）导致细胞溶解，从而使TNF-α丧失生物活性。另外Infliximab还可以和可溶性的TNF-α结合，从而抑制TNF-α与其受体的相互作用。目前Infliximab主要用在治疗类风湿关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病以及自身免疫性葡萄膜视网膜炎等疾病，自2007年9月上市以来，以其良好的临床疗效，成为各大医院治疗这类疾病的有效用药。

在Infliximab显示良好治疗前景的同时，其不良反应也日益受到关注。在国外的临床研究报告中，该药常见的副作用是呼吸困难、上下呼吸道感染，其次是皮肤及其附属器的副作用。欧洲药物评估机构报告该药物主要的皮肤及附属器不良反应包括：皮疹、瘙痒、荨麻疹、多汗、皮肤干燥、迟发过敏性反应性皮炎伴严重脱发等。

鉴于Infliximab全身用药的不良反应常见，对于眼内炎症性病变，可以采用玻璃体腔内注射的方法，既增加了眼内局部药物的浓度，同时又不会产生明显的全身副作用。研究表明，玻璃体腔内注射Infliximab可以有效的治疗眼内炎症，且不会造成毒性反应。但是，由于眼内的炎症往往是慢性反复发作的，一次性给药后，在短期内玻璃体的药物浓度就会下降，不能长期控制炎症；而且，在眼内炎症的过程中，血-眼屏障被破坏，血液中的成分进入眼内，炎症细胞及细胞因子聚集，加速药物的清除。因此，要长期有效的控制炎症，往往需要重复注射。但是，反复进行玻璃体腔内注药会增加手术带来的风险和并发症。而且，一次性给药会造成眼内的药物浓度的即刻增高，增加药物对眼内结构的副作用，影响疗效。因此，有必要进行长效的新型制剂的研究，以延长有效成分在眼内的滞留时间，保持玻璃体内相对稳定的药物浓度，提高治疗效果，降低副作用，同时减轻重复注射带来的风险和并发症。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种包载抗体的长循环脂质体制剂。

本发明的第二个目的是提供所述脂质体制剂的制备方法。

本发明的第三个目的是提供所述脂质体制剂在制备抗眼内炎症药剂中的应用。

本发明提供的一种包载治疗性抗体的脂质体，以抗肿瘤坏死因子α单克隆抗体（Infliximab）为治疗药物举例，由磷脂、胆固醇、长循环辅料等附加剂共同组成。本发明基于眼内炎症的免疫病理学特性，以拮抗炎症级联反应中关键性的细胞因子的特异性抗体为治疗药物，以长循环脂质体为载体，制备一种高效、稳定、缓释的抗体脂质体。

本发明中所述的长循环脂质体一种包载抗体的长循环脂质体，由抗体和脂质体组成。

其中，脂质体为载体，抗体为包封的治疗性抗体，所述的脂质体是以磷脂、胆固醇和长循环脂质体辅料为材料制成。

所述的治疗性抗体可以选自抗IL-17单克隆抗体、抗IFN-γ单克隆抗体、抗IL-2单克隆抗体、抗Infliximab单克隆抗体或者抗VEGF单克隆抗体；抗体与磷脂的比值为5～100μg抗体：1μmol磷脂；磷脂与胆固醇的摩尔比为1.2～4:1；长循环脂质体辅料占脂质体摩尔量的3%～17%。

在本发明的一个优选例中，所述的治疗性抗体为Infliximab单抗。

本发明中所述的磷脂可以是大豆卵磷脂（SPC）、蛋黄卵磷脂（EPC）、二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）等。

本发明中所述的长循环脂质体辅料包括二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH₂（DSPE-PEG-NH₂）等。

另一方面，本发明还提供了包载抗体的长循环脂质体的制备方法，包括步骤：

1）以磷脂、大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂或二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH₂为原料，采用薄膜水化法制备长循环脂质体；

2）加入含标记染料的PBS溶液10ml超声水化，振荡，并用0.22微米的聚碳酸酯膜反复挤压后得到标记的包载抗体的脂质体颗粒。

在本发明的一个实施例中，所述的标记染料为罗丹明。

具体而言，经过长期测试选择了脂质体，又通过反复试验优化条件，本发明最终获得了高性能的Infliximab长循环脂质体。其制备方法包括步骤：

1.制备Infliximab长循环脂质体

采用薄膜水化法制备包载抗体的长循环脂质体。称取大豆卵磷脂，蛋黄卵磷脂或二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH₂（DSPE-PEG-NH₂）（磷脂与胆固醇的摩尔比为1.2～4:1；DSPE-PEG-NH₂占脂质摩尔量的3%～17%)，共溶于氯仿或三氯甲烷/甲醇中作为油相，在梨形瓶中80～120r·min^-1旋转蒸发除去有机溶剂，然后加入含抗体（Infliximab、抗IL-17单克隆抗体、抗IFN-γ单克隆抗体、抗IL-2单克隆抗体或抗VEGF抗体）的PBS溶液（0.3～2mg/mL）超声水化，并用0.22微米的聚碳酸酯膜反复挤压后得载抗体的脂质体纳米粒。

2.制备罗丹明标记的Infliximab长循环脂质体

取大豆卵磷脂，蛋黄卵磷脂或二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇、DSPE-PEG-NH2（磷脂与胆固醇的摩尔比为1.2～4:1；DSPE-PEG-NH2占脂质摩尔量的3%～17%)，共溶于氯仿或三氯甲烷/甲醇中作为油相，在梨形瓶中80～120r·min-1旋转蒸发除去有机溶剂，然后加入含罗丹明123的PBS溶液10ml超声水化，振荡，并用0.22微米的聚碳酸酯膜反复挤压后得载抗体的脂质体纳米粒。

3.Infliximab长循环脂质体的表征

电镜照片显示，本发明制备的Infliximab长循环脂质体形态呈球形，大小均匀，外观圆整，分散性好（如图1所示）；

Infliximab长循环脂质体平均粒径为351.3±58nm（如表1所示）；

Infliximab长循环脂质体包封率：采用紫外分光光度法测定Infliximab长循环脂质体对Infliximab的包封率为90.65±2.68%；

Infliximab长循环脂质体稳定性考察：将载抗体脂质体混悬液于温度(25±2)℃、湿度(60±10)%条件下放置保存，1天、15天、30天、60天、90天后，其平均粒径、分散指数、表面电位、磷脂含量变化（胆固醇渗漏率）和抗体渗漏率无显著性变化（p﹥0.05），样品放置稳定（如表2所示）。

体外释放试验结果表明，Infliximab长循环脂质体中的抗体在180小时内累计释放百分率小于70％，表明长循环脂质体可显著减慢药物的体外释放。

包封率和载药率的测定方法：取0.5ml载抗体的长循环脂质体，15000r/min离心分离30min，取上清用紫外分光光度法测定抗体含量。

其中包封率采用如下公式计算：

其中W_总为制备胶束时所使用的抗体总质量;W_上清为离心后上清液中的抗体质量，即未被包载的抗体质量。

实际载药率(DL)采用如下公式计算：

$\mathrm{DL}(\%)=\frac{W_A}{W_B}\×100\%,$

其中W_A为脂质体所含抗体的质量;W_B为聚合物质量和其中所含抗体质量之和。

缓释曲线测定方法：

取载抗体的长循环纳米脂质体溶液0.5ml，加到含有10.0mlPBS的离心管中；设置不同的时间点，1h，3h，6h，10h，1天，2天，4天，7天；将所有离心管放入37℃恒温气浴摇床上，以恒定的速度（80r/min）进行释放实验；在指定的时间点将离心管取出，高速离心（2万转/min）分离，取上清在紫外分光光度计上测量释放出来的抗体含量。

经计算数据如下，载药率：6.03±0.17%

包封率：90.65±2.68%

缓释曲线见图2。

载抗体脂质体粒径分布及表面电位见表1和图3。

表1.载抗体脂质体粒径分布及表面电位

	粒径(nm)	分散指数PDI	电位(mV)
				空载脂质体	349.6±42	0.265	-32.1±12.7
载抗体脂质体	351.3±58	0.386	-20.8±9.78

4.稳定性测试：

将载抗体脂质体混悬液于温度(25±2)℃、湿度(60±10)%条件下放置保存，在1天、15天、30天、60天、90天后，分别测定平均粒径、分散指数、表面电位、抗体渗漏率和磷脂含量的变化等（如表2所示）。

其中抗体渗漏率的测定方法为：在固定时间内取出样品后，高速离心（2万转/min）分离，取上清在紫外分光光度计上测量渗漏出来的抗体含量。

表2Infliximab长循环脂质体稳定性试验

注：其中胆固醇的测试采用总胆固醇试剂盒-CHO（酶法）。

所制备的载抗体脂质体比较稳定，放置90天后，粒径变化不大，胆固醇和抗体渗漏率均不大。

本发明还提供了所述的包载抗体的长循环脂质体在制备治疗眼部疾病药剂中的应用。

所述的眼部疾病可以是眼内炎、葡萄膜炎、视网膜炎、视网膜血管炎或者眼部新生血管性疾病。

给药途径可以采用玻璃体腔内注射。

本发明的一个优选例中，Infliximab长循环脂质体形态呈球形，大小均匀，外观圆整，分散性好（如图1所示），平均粒径为351.3±58nm（如表1所示）。

在本发明的一个优选例中，Infliximab长循环脂质体中脂质体对抗体活性成分的包封率为：90.65±2.68%。

本发明中，Infliximab长循环脂质体稳定性考察结果显示：将载抗体脂质体混悬液于温度(25±2)℃、湿度(60±10)%条件下放置保存1天、15天、30天、60天、90天后，测得平均粒径、分散指数、表面电位、磷脂含量和抗体渗漏率等无显著性变化（p﹥0.05），样品放置稳定（如表2所示）。

本发明的长循环脂质体能够长时间、稳定的释放抗体活性成分，使玻璃体腔内的药物存在时间较单纯注射抗体延长3倍，注射后能够长期有效的治疗眼内炎症，减轻视网膜的损伤。能减少给药次数，降低治疗的风险，提高对眼部疾病的疗效，同时减少全身不良反应，具有新的临床实用价值。

本发明的Infliximab长循环脂质体制剂既能显著提高贮存的稳定性，又能使长循环脂质体中的药物持续释放，延长药物在体内的滞留时间，提高药物的生物利用度，达到高效、长效的目的。

附图说明

图1Infliximab长循环脂质体透射电镜下照片。

图2Infliximab长循环脂质体的缓释曲线。

图3Infliximab长循环脂质体粒径和电位。

图4玻璃体腔内注射Infliximab或Infliximab长循环脂质体后眼内液的抗体浓度曲线。

图5大鼠眼球内长循环脂质体长效示例。玻璃体腔内注射罗丹明标记的载抗体脂质体后第60天，大鼠眼球冰冻切片荧光共聚焦显微镜下观察仍可见视网膜内部有罗丹明标记的脂质体颗粒存在。

具体实施方式

申请人长期致力于相关领域药物载体的研究，为改善药物成分在眼内的滞留时间，保持玻璃体内相对稳定的药物浓度，同时降低副作用，进行了成千上百次的试验。

脂质体技术的发展为这一医学难题的解决带来了希望。长循环脂质体（longcirculatingliposomes，LCL）是一种表面含有天然或合成聚合物修饰的新型脂质体，这些亲水性聚合物形成立体的柔性亲水表面，像一道立体屏障，防止生物分子、细胞与脂质体发生作用，使脂质体不易被血液成分中的调理素（opsonin）识别,从而可以降低网状内皮系统对脂质体的清除率，增加其在眼内环境中的稳定性。长循环脂质体既可以包封脂溶性药物，也能包封水溶性药物，可以持久地延长药物在体内的停留时间，以获得更充足的时间到达靶向部位，特别适合于作为药物载体应用于临床对肝、脾以外组织或器官的靶向性缓释给药。

测试证明，脂质体及包封的药物在体内的保留时间，多数要比游离药物长得多。体内药代动力学研究指出，不同的脂质体药物在体内的存留时间不同。这样，就可以根据需要,设计具有不同半衰期的脂质体作为长效的药物载体，使药物缓慢地从脂质体中释放出来，在细胞的生长周期中更好地发挥作用，提高治疗指数，从而达到减少药物用量、增强疗效、减少副作用的目的。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的包载治疗性抗体的脂质体进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

实施例1

1.制备Infliximab长循环脂质体

采用薄膜水化法制备包载抗体的长循环脂质体。称取大豆卵磷脂，蛋黄卵磷脂或二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH₂（DSPE-PEG-NH₂）（磷脂与胆固醇的摩尔比为1.2～4:1；DSPE-PEG-NH₂占脂质摩尔量的3%～17%)，共溶于氯仿或三氯甲烷/甲醇中作为油相，在梨形瓶中80～120r·min^-1旋转蒸发除去有机溶剂（温度应高于磷脂的相变温度），然后加入含抗体（Infliximab、抗IL-17单克隆抗体、抗IFN-γ单克隆抗体、抗IL-2单克隆抗体或抗VEGF抗体）的PBS溶液（0.3～2mg/mL）超声水化，并用0.22微米的聚碳酸酯膜反复挤压后得载抗体的脂质体纳米粒。

2.制备罗丹明标记的Infliximab长循环脂质体

取大豆卵磷脂，蛋黄卵磷脂或二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇、DSPE-PEG-NH₂（磷脂与胆固醇的摩尔比为1.2～4:1；DSPE-PEG-NH₂占脂质摩尔量的3%～17%)，共溶于氯仿或三氯甲烷/甲醇中作为油相，在梨形瓶中80～120r·min^-1旋转蒸发除去有机溶剂（温度应高于磷脂的相变温度），然后加入含罗丹明123的PBS溶液10ml超声水化，振荡，并用0.22微米的聚碳酸酯膜反复挤压后得载抗体的脂质体纳米粒。

3.Infliximab长循环脂质体的表征

1）形态观察：

取脂质体悬液适量以生理盐水稀释50倍，以醋酸铀染色，经透射电镜观察其形态。可见脂质体呈球形，大小基本均一（如图1所示）。

2）粒径测定:

取适量脂质体悬液以蒸馏水适当稀释后于25℃下经激光粒径测定仪测定其粒径分布。Infliximab长循环脂质体平均粒径为351.3±58nm（如表1所示）。

3）包封率测定：

包封率和载药率的测定方法：取0.5ml载抗体的长循环脂质体，15000r/min离心分离30min，取上清用紫外分光光度计测定抗体含量。

4）缓释曲线测定方法：

取载抗体的长循环纳米脂质体溶液0.5ml，加到含有10.0mlPBS的离心管中；设置不同的时间点，1h，3h，6h，10h，1天，2天，4天，7天；将所有离心管放入37℃恒温气浴摇床上，以恒定的速度（80r/min）进行释放实验；在指定的时间点将离心管取出，高速离心（2万转/min）分离，取上清在紫外分光光度计上测量释放出来的抗体含量。

5）稳定性考察：

将载抗体脂质体混悬液于温度(25±2)℃、湿度(60±10)%条件下放置保存：取干燥器，然后在其底部放置饱和溴化钠溶液（相对湿度58%，20℃），放入样品后，密闭干燥器，将其放入25±2℃的恒温箱内。在1天、15天、30天、60天、90天后，分别测定平均粒径、分散指数、表面电位、抗体渗漏率和磷脂含量的变化等（如表2所示）。

其中抗体渗漏率的测定方法为：在固定时间内取出样品后，高速离心（2万转/min）分离，取上清在紫外分光光度计上测量渗漏出来的抗体含量。

实施例2Infliximab长循环脂质体效果测试

1.Infliximab长循环脂质体的体内实验

健康雌性SD大鼠，4-5周龄，随机分为3组，每组3只（6只眼）：

（1）玻璃体腔内注射空白脂质体5μl，（2）玻璃体腔内注射抗体5μl（含Infliximab40μg）、（3）玻璃体腔内注射载抗体脂质体5μl（含Infliximab40μg），（4）玻璃体腔内注射罗丹明标记的载抗体脂质体5μl（含Infliximab40μg），注射后1小时、6小时，24小时，7天，14天，21天，28天，45天，60天，90天，处死大鼠。取1-3组大鼠玻璃体腔内液体，应用高效液相色谱仪检测Infliximab抗体浓度。

结果显示，玻璃体腔内注射Infliximab抗体后，大鼠玻璃体腔内抗体浓度迅速下降，在注射后第7天起即不能检测到，而玻璃体腔内注射载Infliximab抗体的脂质体后，直到第60天仍然可以检测到抗体的存在（图4）。

第4组大鼠在玻璃体腔内注射罗丹明标记的载抗体脂质体后，对大鼠眼球进行了冰冻切片，在荧光共聚焦显微镜下观察发现，注射后第60天，仍可见视网膜内部有罗丹明标记的脂质体颗粒存在（图5）。

2.Infliximab长循环脂质体对实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎（EAU）大鼠的治疗作用

取健康雌性Lewis大鼠，4-5周龄，随机分为3组，每组3只（6只眼）：

诱导EAU大鼠动物模型：应用IRBPR16多肽30μg+弗氏完全佐剂+结核分枝杆菌H37Ra2.5mg/mL，共0.1mL，制备成乳剂，进行足底注射。在注射后后第10天，将大鼠随机分为3组，（1）玻璃体腔内注射空白脂质体5μl、（2）玻璃体腔内注射抗体5μl（含Infliximab40μg）、（3）玻璃体腔内注射载抗体脂质体5μl（含Infliximab40μg），玻璃体腔内注射后每天分组处死大鼠，直至第7天，摘除眼球，固定后做石蜡切片，进行炎症分级。

结果显示：玻璃体腔内注射载抗体脂质体能够有效地减轻眼内炎症的严重程度（表3）。

表3.玻璃体腔内注射对EAU的治疗作用

Claims (10)

1.一种包载抗体的长循环脂质体，其特征在于，由抗体和脂质体组成；

其中，抗体为包封的治疗性抗体，脂质体为载体；所述的脂质体是以磷脂、胆固醇和长循环脂质体辅料为材料制成；

所述的治疗性抗体选自抗IL-17单克隆抗体、抗IFN-γ单克隆抗体、抗IL-2单克隆抗体、抗Infliximab单克隆抗体或者抗VEGF单克隆抗体；抗体与磷脂的比值为5～100μg抗体：1μmol磷脂；

磷脂与胆固醇的摩尔比为1.2～4:1；

长循环脂质体辅料占脂质体摩尔量的3%～17%。

2.按照权利要求1所述的包载抗体的长循环脂质体，其特征在于，所述的磷脂选自大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂或二棕榈酰磷脂酰胆碱。

3.按照权利要求1所述的包载抗体的长循环脂质体，其特征在于，所述的长循环脂质体辅料是二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH₂。

4.按照权利要求1所述的包载抗体的长循环脂质体，其特征在于，所述的治疗性抗体为Infliximab单抗。

5.按照权利要求1所述的包载抗体的长循环脂质体，其特征在于，所述的包载抗体的长循环脂质体的平均粒径为351.3±58nm。

6.按照权利要求1所述的包载抗体的长循环脂质体，其特征在于，包载抗体的长循环脂质体对抗体活性成分的包封率为：90.65±2.68%。

7.权利要求1所述的包载抗体的长循环脂质体的制备方法，其特征在于，包括步骤：

1）以磷脂、大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂或二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH₂为原料，采用薄膜水化法制备长循环脂质体；

2）加入含标记染料的PBS溶液，超声水化，振荡，并用聚碳酸酯膜反复挤压后得到标记的包载抗体的脂质体颗粒。

8.按照权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的标记染料为罗丹明。

9.权利要求1的所述的包载抗体的长循环脂质体的用途，其特征在于，其用途是所述的包载抗体的长循环脂质体在制备治疗眼部疾病药剂中的应用。

10.按照权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的眼部疾病是眼内炎、葡萄膜炎、视网膜炎、视网膜血管炎或者眼部新生血管性疾病。