CN104011201A - 用于治疗椎间盘退变性疾病的成纤维细胞 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于通过体内机械牵张力将细胞包括人成纤维细胞分化成软骨细胞样细胞的方法和组合物。在具体的方面，将成纤维细胞递送至关节例如椎间盘，随后成纤维细胞分化成软骨细胞样细胞以治疗其中软骨的功能障碍，包括例如修复退变的椎间盘。由于细胞的定位(如在纤维环的裂隙中)或其它生物力学和生物化学微环境因素而未分化成软骨细胞的成纤维细胞可产生纤维基质分子以帮助髓核和纤维环的组织修复和再生。在某些方面，在递送至个体之前，在例如生长因子、体外机械牵张力和/或基质分子不存在的情况下处理成纤维细胞。

Description

用于治疗椎间盘退变性疾病的成纤维细胞

本申请要求2011年11月9日提交的美国临时专利申请系列No.61/557,479和2012年8月21日提交的美国临时专利申请系列No.61/691391的优先权，将所述两个申请通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明的领域包括医学、外科学、解剖学、生物学、细胞生物学和/或分子生物学的领域。在某些实施方案中，本发明的领域涉及用于治疗与需要软骨的身体部分例如脊柱或关节相关的医学病况的方法和组合物。

发明背景

椎间盘，也称为椎间纤维软骨，位于脊柱内的相邻椎骨之间，并且每一个椎间盘形成软骨关节以允许椎骨轻度运动，从而充当将椎骨保持在一起的系带。椎间盘包含对应于椎体终板表面形态的纤维软骨板。椎间盘在承重中起着重要作用。椎间盘包括外层纤维环(annulusfibrosus)，其围绕内部胶质状髓核(nucleus pulposus)。髓核插入椎体终板表面上的光滑圆形边缘内。髓核接触透明软骨板，所述软骨板附着至椎体的粗糙表面。

椎间盘疾病(Invertebral Disc Disease)，也称为椎间盘障碍，包括椎间盘退变性疾病(DDD)，是例如其中存在脊椎盘的功能障碍(包括恶化和/或疝出)的医学病况。在DDD中，存在髓核的逐渐脱水。此后，通常被髓核吸收的物质被非均匀地转移通过纤维环，其可经历进行性结构性劣化。当纤维环因损伤或因老化而撕裂，随后髓核可开始挤出通过撕裂时，椎间盘突出(其可称为滑出椎间盘、椎间盘破裂或脊柱盘脱出)发生。

本领域需要对于治疗椎间盘疾病有效并且具有最小侵入性和/或准备时间的方法和组合物。

发明概述

本发明涉及用于治疗有此需要的个体，包括需要软骨修复的个体的系统、方法和组合物。本发明涉及用于任何类型的软骨包括例如椎间和关节软骨的生物修复的方法和组合物。在具体的方面，本发明涉及软骨修复例如关节软骨修复的领域。更具体地，本发明的实施方案包括用于在机械应力下生长、增殖细胞和/或将细胞分化成软骨细胞样细胞的方法。

在某些方面，本发明例如从例如成纤维细胞体内产生天然组织。更具体地，但非专有地，本发明涉及用于例如生长人成纤维细胞并将其分化成软骨细胞样细胞的方法。在某些实施方案中，细胞可以是自体的或同种异体的或其混合物。

在具体实施方案中，本发明使用某些细胞向软骨细胞样细胞的分化。在具体实施方案中，在特定条件下将例如人真皮成纤维细胞(HDF)分化成软骨细胞样细胞。细胞向软骨细胞或软骨细胞样细胞的分化可以以任何适当的方式(包括在植入后在体内)发生。

在具体实施方案中，本发明提供了用于体内再生关节例如椎间盘、肘、膝、肩、髋、颞下颌关节等的方法。

在某些实施方案中，作为本发明应用焦点的软骨是椎间盘软骨。在本发明的具体方面，将本发明中使用的细胞经历体内机械牵张力以进行软骨形成分化。

本发明的一个示例性目的是提供意欲修复退变性椎间盘例如恢复椎间盘解剖学和改善其功能的方法。在本发明的具体方面，提供了修复受损椎间盘的方法。在本发明的一个实施方案中，存在修复个体的关节(例如椎间盘)内的受损软骨的方法，包括将根据本发明的成纤维细胞递送至个体的相应关节(例如椎间盘)。在本发明的具体实施方案中，在不进行除去退变椎间盘的部分或全部的情况下将成纤维细胞递送至椎间盘中。

在机械应力下，提供的细胞将在例如中心部分获得核细胞的特征，在外围获得环纹细胞的特征。可以例如通过活组织检查从皮肤收集示例性成纤维细胞。

在本发明的某些方面，除了本发明的方法以外，还给个体提供另一种疗法。例如，在成纤维细胞的递送之前、期间和/或之后，个体可接受一种或多种抗生素。示例性的术后疗法包括非甾体抗炎药(NSAIDs)、简单的止痛药(镇痛药)和/或肌肉松弛药(根据需要)，并且其可随后进行术后(例如在术后第一周、第二周、第三周和更多周后)功能恢复。在具体实施方案中，可给个体提供抗生素、抗真菌剂或抗病毒剂中的一种或多种。

在本发明的某些方面，细胞分化成软骨细胞或软骨细胞样细胞，例如其中软骨细胞或软骨细胞样细胞分泌选自聚集蛋白聚糖、II型胶原、Sox-9蛋白、软骨链蛋白、基底膜聚糖及其组合的分子。在一些具体情况下，细胞从成纤维细胞分化而来，示例性的成纤维细胞包括真皮成纤维细胞、肌腱成纤维细胞、韧带成纤维细胞、滑膜成纤维细胞、包皮成纤维细胞或其混合物。

在具体实施方案中，在体内递送至有此需要的个体之前、期间或之后不给成纤维细胞提供生长因子，包括生长因子例如骨形态发生蛋白2(BMP-2)、BMP-4、BMP-6、BMP-7、软骨源性形态发生蛋白(CDMP)、转化生长因子β(TGF-β)、胰岛素生长因子1(IGF-I)、成纤维细胞生长因子(FGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、FGF-2、血小板衍生生长因子(PDGF)及其混合物。

在另一个实施方案中，提供了包括置于一个或多个适当容器中的成纤维细胞的试剂盒。在具体实施方案中，试剂盒还包括一种或多种适合用于增强从成纤维细胞向软骨细胞或软骨细胞样细胞的体内分化的试剂。在一些实施方案中，本发明的试剂盒包括用于将成纤维细胞递送至个体的一个或多个装置。

在本发明的一些实施方案中，存在与将成纤维细胞递送至有此需要的个体的体内部点相关的方法和组合物。在具体实施方案中，所述位点是体内的并且需要软骨细胞，包括需要软骨。例如，需要软骨细胞的部点包括关节，例如软骨关节(例如，椎骨)。在一些实施方案中，成纤维细胞获自需要软骨的个体。在具体实施方案中，成纤维细胞被递送至个体内的至少一个椎间盘。在一些情况下，例如，在获得后操作成纤维细胞，无论它们是否获自有此需要的个体或无论它们是从第三方获得的还是商购获得的。可通过培养扩增成纤维细胞。在某些实施方案中，在向椎骨内移植之前或期间或之后，不给成纤维细胞提供生长因子、基质分子、机械牵张力(mechanical strain)或其组合。

在一些实施方案中，在椎间盘中存在成纤维细胞和软骨细胞。在一些实施方案中，并非所有被体内递送的成纤维细胞都将分化成椎间盘中的软骨细胞，而椎间盘中产生的纤维组织在改善椎间盘高度和生物机械功能方面无疑是有用的。

在一些实施方案中，存在将人真皮成纤维细胞在体内分化成软骨细胞样细胞的方法，其包括将成纤维细胞递送至个体的关节的步骤，其中在递送之前，不将成纤维细胞经历生长因子、基质分子、机械牵张力或其组合。在一些具体情况下，个体具有椎间盘疾病。在一些情况下，关节是椎间盘。

在一些实施方案中，椎间盘中一些未分化的成纤维细胞和已分化的软骨细胞样细胞被进一步定义为产生纤维性基质分子、软骨性基质分子或两者的细胞。在某些方面，软骨细胞样细胞被进一步定义为产生基质分子例如胶原蛋白I、胶原蛋白II、蛋白聚糖或其组合的细胞。在具体实施方案中，胶原包括I型和II型胶原。在一些情况下，蛋白聚糖之一是聚集蛋白聚糖。

在具体情况下，成纤维细胞被递送至椎间盘之间。在某些情况下，成纤维细胞被递送至髓核与内纤维环的裂隙之间或其内。成纤维细胞可被递送至例如椎间盘之间，包括髓核与内部纤维环内的裂隙。

本发明的方法的一些方面包括从个体获得成纤维细胞。获得可包括从身体取出成纤维细胞，或可包括例如从第三方(包括商业性地)或从贮藏库取回已获得的成纤维细胞。在某些方面，将成纤维细胞扩增例如至少一天。在一些情况下，将所获得的成纤维细胞传代例如超过1次。在具体的方面，将成纤维细胞扩增并传代。

在一些实施方案中，提供了在个体的关节中产生纤维组织和/或软骨组织的方法，其包括将成纤维细胞递送至关节的步骤，其中在递送至关节之前或期间或之后成纤维细胞未被暴露于生长因子、基质分子、机械牵张力或其组合。在具体实施方案中，纤维和/或软骨细胞组织包含例如具有特定生物化学标志物例如I型和II型胶原和/或在软骨和纤维组织中发现的许多蛋白聚糖的细胞。

在本发明的某些实施方案中，在递送至个体的关节之前和/或之后成纤维细胞的存在和/或成纤维细胞的死亡触发了一个或多个细胞的反应。在具体的情况下，成纤维细胞的存在和/或成纤维细胞的死亡触发来自关节内的其它细胞的反应，所述其它细胞可以是任何类型，包括个体的内源细胞，例如软骨细胞、成纤维细胞、椎间盘干细胞等。在具体的方面，内源细胞反应包括生长的刺激，例如如关节中至少一些成纤维细胞死亡。因此，在具体实施方案中，成纤维细胞的仅仅存在和/或细胞死亡时细胞内因子的释放可能刺激椎间盘中存在的细胞的细胞生长反应。在具体情况下，细胞生长反应导致椎间盘的再生长(或关节修复)。

在本发明的具体实施方案中，作为成纤维细胞向关节的递送的间接或直接结果，瘢痕组织可在关节内形成。在至少一些特定的情况下，例如当关节是椎间盘时，通过为环状裂隙(annular fissure)提供稳定性、强度、减震、封闭等，这样的瘢痕组织形成对于关节是有益的。

上述内容已相当广地概括了本发明的特征和技术有利方面，以更好地理解下面的本发明详细描述。在下文中描述了形成本发明权利要求主题的本发明的另外的特征和有利方面。本领域技术人员应理解，公开的概念和具体的实施方案可被容易地用作用于改变或设计实现本发明相同目的的其它结构的基础。本领域技术人员还认识到，这样的等同的构造不背离所附权利要求中所示的本发明的精神和范围。当与附图结合考虑时，根据下列描述可更好地理解据信在其组织和操作方法方面为本发明特征的新型特征以及其它目的和有利方面。然而，应明确理解，每一个附图被提供来仅用于举例说明和描述，而无意界定本发明的界限。

发明详述

本发明通过引用将2010年5月7日提交的美国专利申请系列No.12/775,720整体并入本文。

如在本文中在说明书中所用，"一个/一种(a)"或"一个/一种(an)"可意指一个或多个。如本文权利要求中所使用的，当与单词"包含"结合使用时，单词"一个/一种(a)"或"一个/一种(an)"可意指一个或超过一个。如本文中所用，“另一个”可意指至少第二或更多个。在具体实施方案中，本发明的方面可以例如“基本上由本发明的一个或多个要素或步骤组成”或“由本发明的一个或多个要素或步骤组成”。本发明的一些实施方案可由本发明的一个或多个要素、方法步骤和/或方法组成或基本上由其组成。预期本文中描述的任何方法或组合物可根据本文中描述的任何其它方法或组合物来执行。

如本文中所用，术语“软骨细胞样细胞”是指不是原代软骨细胞而是衍生自例如成纤维细胞的细胞。这类软骨细胞样细胞具有软骨细胞(软骨的细胞)的表型，包括例如软骨细胞(例如多边形和/或菱形细胞)的形状和/或能够聚集并产生软骨基质组分，例如硫酸化蛋白聚糖和II型胶原。因此，软骨细胞样细胞的示例性标志物包括聚集蛋白聚糖的一种或多种，其为硫酸软骨素和硫酸角质素蛋白聚糖、II型胶原、Sox-9蛋白、软骨链蛋白和基底膜聚糖(其为例如硫酸肝素蛋白聚糖)。

如本文中所用，术语“关节”是指身体中其中骨架的两块骨连接的区域。

虽然可通过本发明的方法至少部分地修复任何组织，包括任何软骨组织，但在具体的示例性实施方案中，椎间盘软骨或关节软骨被修复。本发明的一般实施方案是将HDF用作用于工程化新软骨以用于椎间盘的细胞来源，因为这些细胞容易收集和生长。本发明包括将这些细胞分化成软骨细胞样细胞。

I.本发明中使用的细胞

在本发明的某些实施方案中，可使用任何细胞，只要细胞能够分化成软骨细胞或软骨细胞样细胞。然而，在具体实施方案中，细胞是成纤维细胞，例如真皮成纤维细胞、肌腱成纤维细胞、韧带成纤维细胞或滑膜成纤维细胞。可使用自体细胞，尽管在一些变通实施方案中，可使用同种异体细胞；在一些具体实施方案中，已对同种异体细胞测定疾病，所述细胞被认为适合用于人传送。在本发明的某些方面，细胞是自体的，尽管在一些变通实施方案中，细胞是同种异体的。在其中细胞不是自体的情况下，在用于本发明之前，可通过本领域的标准装置处理细胞以除去潜在危险的物质、病原体等。

使用自体HDF作为细胞来源的装置的原理包括：1)HDF可以例如从小至3.0mm直径的圆形皮肤样品的打孔活检组织非侵入性地收集；2)不存在来自另一个供体的污染的风险(例如乙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、克雅氏病等)；和3)HDF可在培养中容易地扩增并且在特定培养条件下分化成软骨细胞样细胞。可使用其它成纤维细胞群体，例如肌腱或韧带成纤维细胞群体。在一个实施方案中，自体成纤维细胞是优选的。本发明的一些方面可使用商业购买的例如从实验室(例如Cascade Biologics)购买的HDF。细胞可以是成人HDF或新生儿HDF。新生儿包皮成纤维细胞是例如非常方便的细胞来源。这些细胞可在商业上使用并且可容易地获得以及易于生长。

根据本发明，从个体的皮肤组织的打孔活检组织(6mm)收集自体HDF。在实验室中，可用剪刀剖除皮下脂肪和深真皮。可将剩余组织切碎，在0.25％胰蛋白酶中于4℃温育过夜。随后，将真皮与表皮碎片分离，例如机械地分离。可将活检组织的真皮碎片切碎，可将碎片用于开始外植体培养。可将从外植体收集的成纤维细胞在37℃于8％CO2中生长在含有10％胎牛血清的Dulbecco’s MEM(DMEM)中。在一些特定方面，可在分化成软骨细胞之前将这些细胞进行扩增。

在一些具体的方面，人真皮成纤维细胞的软骨细胞样分化可通过应用机械牵张力来促进。在本发明的一些具体实施方案中，在从成纤维细胞分化后，体内所得的细胞包含表示I型和II型胶原和蛋白聚糖的某些生物化学标志物的表达。

在一些具体的方面，人真皮成纤维细胞的软骨细胞样分化可在体内发生，其中椎间盘的微环境有助于软骨细胞分化。在一些特定的实施方案中，椎间盘中以及椎间盘的其它生物化学环境中静水荷载、缺氧、以及与驻留软骨细胞的细胞间相互作用可促进从成纤维细胞向软骨细胞的分化。在本发明的具体实施方案中，细胞移植后椎间盘中的细胞为纤维细胞性细胞和软骨细胞性细胞的组合，所述细胞产生具有在软骨和纤维组织中发现的I型和II型胶原和/或一些蛋白聚糖的生物化学标志物的纤维和软骨细胞组织。

II.本发明示例性方法(包括修复受损软骨的方法)的实施方案

在本发明的实施方案中，提供了在体内将细胞包括成纤维细胞(例如，人)分化成软骨细胞样细胞的方法。所述方法可包括将成纤维细胞递送至个体的关节的步骤，其中在递送之前，不将成纤维细胞经历生长因子、基质分子、机械牵张力或其组合。在体内递送之前可以将或可以不将成纤维细胞暴露于缺氧条件。

机械应力/牵张力是软骨发生的重要因素。本发明的方法在体内使用机械牵张力，在一些具体的实施方案中，使用来自脊柱的固有压力来提供机械牵张力。在一些实施方案中，所述方法可在其它类型的压力包括间歇性流体静力压、流体切应力等不存在的情况下发生。在一些实施方案中，所述方法在不存在除固有脊柱压外的压力、低氧张力、生长因子、基质中的培养等的情况下发生。在一些实施方案中，来自脊柱的压力荷载被用于诱导成纤维细胞向其它细胞的分化。

成纤维细胞可获自供体来源(同种异体的)或自体皮肤活检组织。可从皮肤分离细胞和在培养中扩增它们，在某些情况下，不处理所述细胞或仅最低程度地处理细胞(例如，暴露于血清、抗体等)。可将这些细胞置于装置(例如，具有来自单层培养物培养基中的重悬浮细胞的注射器)中，将其注射入个体。用于饲养细胞以进行扩增的血清可用培养基例如DMEM来洗涤，以避免任何外来血清被注射入个体。在本系统的一些实施方案中，未使用基质，包括无藻酸盐。在本发明的一些实施方案中，例如仅注射所述细胞(或最少量的流体以悬浮细胞用于注射)并且不注射培养基。包含细胞的液体悬浮液可包含作为DMEM组分的缓冲剂、氨基酸、盐、葡萄糖和/或维生素。未用于本发明的方法步骤的细胞处理示例性基质分子包括聚合物(包括例如PGA、PLGA和PCL)；天然水凝胶例如胶原、透明质酸、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖；和合成水凝胶例如PEO、PVA、PAA等)。

在本发明的一些特定方面，细胞被诱导以经历向软骨细胞或软骨细胞样细胞的分化。这样的分化在体内递送后发生。在本发明的一些具体实施方案中，机械应力刺激HDF的软骨发生分化。

在本发明的一些方面，可通过增加椎间盘尺寸、胶原含量和/或某些生物分子的水平来改善基质生物力学和椎间盘的生物学。在本发明的一些实施方案中，椎间盘中的细胞，只要它们不渗漏出空间和不死亡，就可产生基质分子例如胶原、蛋白聚糖等。在某些方面，生物分子提供有益的生物力学性质例如抗压性/拉伸负荷。经历因正常站立/行走/脊柱的弯曲而产生的负荷的细胞在体内将分化成软骨细胞或软骨样细胞。椎间盘中的成纤维细胞和软骨细胞可产生可改善椎间盘高度和体积以及增强生物力学性质的纤维和/或软骨基质或组织。

在本发明的一些方法中，在获得成纤维细胞后，可扩增细胞的数目，尽管在一些备选实施方案中，在任何先前扩增不存在的情况下将成纤维细胞体内提供给有此需要的个体。本领域技术人员承认培养的细胞需要营养并且可利用培养基例如FBS(胎牛血清)饲养细胞。在一些情况下可防止污染或感染(例如，通过添加抗生素)。在将细胞注射至个体之前，用例如DMEM培养基洗涤细胞以除去FBS和抗生素，将悬浮细胞用于注射。流体悬浮物可包含少量培养基(其包含例如缓冲液、氨基酸、盐、葡萄糖和/或维生素)。成纤维细胞的体外生长可包括在体内使用之前生长至少一天或多天。在某些情况下，可检查或监控细胞以确保至少一些细胞发生分裂。可除去不分裂的细胞。

在某些实施方案中，椎间盘高度得到改善和/或在植入的细胞中显示某些生物化学标志物。椎间盘高度可使用例如平面放射线影像检查(plain radiographs)、比较治疗前后的情况来测量。在至少一些特定的情况下，还可使用磁共振成像(MRI)、生物化学标志物测定和/或组织学。恢复椎间盘高度改善了横穿脊柱的脊神经的空间，并且除了改善该区域的椎间盘生物力学和生物学以外，其还以这样的方式具有间接益处。在一些具体的实施方案中，成纤维细胞移植后的组织学变化可显示纤维细胞和软骨细胞与因更加丰富的组织而具有增加的椎间盘高度的基质的组合。

在一些实施方案中，将成纤维细胞注射在椎骨或椎间盘之间，并且髓核中的细胞可迁移至环关联椎间盘退变(annulus associateddisc degeneration)的裂隙。这些细胞将增强髓核和纤维环中的基质形成以帮助修复和组织再生。髓核中的细胞将更多地朝向软骨细胞分化并且纤维环中的细胞将因髓核和纤维环的机械和生物化学环境而更加纤维细胞化。

在一些实施方案中，成纤维细胞的分化直至体内植入时才开始，并且由于不同的生物力学和生物化学环境的原因，并非所有移植的细胞都能分化成软骨细胞。

在本发明的一些实施方案中，从例如待治疗的个体获得成纤维细胞，从另一个个体(包括例如尸体或活的供体)获得它们，或商购获得它们。可获取皮肤活检组织，在一些实施方案中可处理皮肤活检组织。例如，可消化皮肤组织过夜以获得成纤维细胞，培养所述细胞以进行扩增，将它们提供给个体，包括通过将它们注射进入个体。在递送至个体之前，取决于需要的细胞数目，将细胞传代1次或多次，例如包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。传代可在1或更多天，包括例如2、3、4、5、6、7、8、9或10天，或1、2、3、4或更多周的过程中发生。在一些实施方案中，将细胞例如传代5-7天。

在本发明的一些实施方案中，通过在体内给有此需要的个体(包括对所述疾病易感的个体，例如衰老的个体)提供成纤维细胞来预防椎间盘疾病。在一些实施方案中，个体是成人。处于患该疾病的风险中的个体包括运动员(专业的或业余的)、吸烟者、肥胖个体和/或其职业或生活方式需要例如体力劳动，包括过度抬举的那些个体。

实施例

下列实施例用来显示本发明的一些优选实施方案。本领域技术人员应当理解，下列实施例中公开的技术代表了本发明人发现的在本发明的实施中运行良好的技术，从而可被认为构成用于其实施的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解可在公开的具体实施方案中进行许多变化，仍然获得相同或相似的结果而不背离本发明的精神和范围。

实施例1

成纤维细胞注射和体内分化

在本发明的一些实施方案中，将成纤维细胞例如递送至哺乳动物椎骨以改善椎间盘退变。在一些实施方案中，将成纤维细胞递送至哺乳动物椎骨以诱导软骨细胞分化或以继续软骨细胞分化。

使用兔模型，其包括穿刺纤维环，在损伤后约4周将椎间盘高度减小(因例如基质丢失和退变而引起的)至约70％的正常高度。在纤维环穿刺后约4周进行该模型的细胞移植，椎间盘高度在例如随后3-4周逐渐增加。被注射的细胞包含在椎间盘中，其是存活的以产生更多基质(纤维和软骨组织)来增加椎间盘高度。更多的基质和增加的椎间盘高度在个体中导致更好的生物力学功能和更少的疼痛。在一些具体实施方案中，例如基于MRI，再生组织大多数为纤维软骨而非具有高蛋白聚糖和水的透明型软骨。在某些方面，生物化学分析显示I型和II型胶原被表达，这显示存在软骨组分，从而表明至少在一些情况下存在软骨组织(如果其全部为纤维(瘢痂组织)，则主要表达I型胶原而无II型胶原，但软骨组织表达II型胶原)。

在操作上文提及的兔模型时，椎间盘高度在成纤维细胞的移植后增加。

尽管已更详细地描述了本发明及其有利方面，但应理解可在本文中进行各种变化、替代和改变而不背离所附权利要求定义的本发明的精神和范围。此外，本申请的范围无意限于说明书中描述的方法、机器、制造、物质的组成、装置、方法和步骤的具体实施方案。本领域技术人员根据本说明书的公开内容十分清楚，可以根据本发明使用目前存在的和将来待开发的与本文中描述的对应的实施方案大体上起相同的功能或获得与其大体上相同的结果的方法、机器、制造、物质的组成、装置、方法或步骤。因此，所附权利要求意欲在它们的范围内包括这样的方法、机器、制造、物质的组成、装置、方法或步骤。

Claims (21)

1.一种将人真皮成纤维细胞体内分化成软骨细胞样细胞的方法，其包括将成纤维细胞递送至个体的关节的步骤，其中在递送之前，所述成纤维细胞未经历生长因子、基质分子、机械牵张力或其组合。

2.权利要求1的方法，其中所述个体具有椎间盘疾病。

3.权利要求1的方法，其中所述关节是椎间盘。

4.权利要求3的方法，其中所述椎间盘中的成纤维细胞和软骨细胞样细胞是产生纤维性基质分子、软骨性基质分子或两者的细胞。

5.权利要求1的方法，其中所述软骨细胞样细胞是产生基质分子的细胞。

6.权利要求4的方法，其中所述基质分子是I型胶原、II型胶原、蛋白聚糖或其组合。

7.权利要求6的方法，其中所述胶原包括I型和II型胶原。

8.权利要求6的方法，其中蛋白聚糖之一是聚集蛋白聚糖。

9.权利要求3的方法，其中所述成纤维细胞被递送至椎间盘之间。

10.权利要求9的方法，其中成纤维细胞被递送至髓核与内部纤维环中的裂隙内或之间。

11.权利要求1的方法，其还包括从所述个体获得成纤维细胞。

12.权利要求11的方法，其中将所述获得的成纤维细胞进行扩增。

13.权利要求12的方法，其中将所述获得的成纤维细胞扩增至少一天。

14.权利要求11的方法，其中将所述获得的成纤维细胞传代。

15.权利要求14的方法，其中所述传代进行超过一次。

16.权利要求1的方法，其中在将所述成纤维细胞递送至个体的关节后，许多成纤维细胞死亡。

17.权利要求16的方法，其中所述成纤维细胞的死亡导致来自所述个体的内源关节细胞的细胞反应。

18.权利要求17的方法，其中所述细胞反应包括刺激个体的内源关节细胞的生长。

19.权利要求1的方法，其中在将所述成纤维细胞递送至关节后，存在来自所述个体的内源关节细胞的细胞反应。

20.权利要求19的方法，其中所述细胞反应包括刺激所述个体的内源关节细胞的生长。

21.权利要求1的方法，其中在将所述成纤维细胞递送至所述个体的关节后，在所述关节中产生瘢痕组织。