CN104011198A - Acf检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于通过在分子水平分析大肠组织的待测区域来检测ACF的方法。即,提供一种ACF检测方法,其是检测ACF(畸变隐窝灶)的方法,使用选自由SLC2a1及SLC7a7组成的组中的1种以上的ACF特异性表达上调分子作为ACF检测用标记物,检测大肠组织的待测区域中的上述ACF检测用标记物;一种ACF检测用标记物,其是用于检测ACF的标记物,其是SLC2a1或SLC7a7;以及一种方法,其使用上述ACF检测方法,基于待测者的大肠组织的待测区域中的ACF的检测结果,评价该待测者的结肠直肠癌及结肠直肠腺瘤的风险。
Description
技术领域
本发明涉及以ACF(畸变隐窝灶)特异性高表达的分子作为指标来检测ACF的方法。
本申请要求基于2011年12月27日在日本提交的日本特愿2011-285215号的优先权,并将其内容援引于此。
背景技术
结肠直肠癌是日本的死亡原因第一位,在美国是因癌而导致的死亡原因的第二位。在美国每年约15万人被新发现患结肠直肠癌,每年5万人以上死亡(由美国癌症协会评估)。另一方面,由于结肠直肠癌从良性肿瘤向恶性肿瘤的发展需要几十年的例子也多,所以早期的风险评价·发现被期待有助于良好的预后及预防。
作为目前通常进行的结肠直肠腺瘤·肿瘤筛查检查方法,存在便潜血检查、灌肠X射线造影检查、全大肠内窥镜检查、S状结肠内窥镜检查等。然而,例如在便潜血检查的情况下,由于存在因除腺瘤、肿瘤以外的因子也会检测到血液的情况,所以对结肠直肠腺瘤·肿瘤的特异性不能说高,在以早期检测作为目的的情况下容易变成假阳性。另一方面,灌肠X射线造影检查虽然可以检测形态大的进行性癌(advanced cancer),但存在难以检测小的病变的缺点。
此外,由于利用内窥镜的检查直接识别病变部位,所以检查结果的可靠性高,显示有助于结肠直肠癌死亡率及发生率的降低。然而,由于就早期癌而言病变部位微小,所以存在难以通过利用内窥镜的检查来检测的问题。
这样,结肠直肠癌由于有效地抽取高风险组或早期癌的检测技术依然不成熟,所以在疾病已发展到一定程度的阶段首次被诊断到的情况较多。因此,期望能够在早期、且低损或无损地进行结肠直肠癌的风险评价·发现的灵敏度·特异性高的检查方法。
作为从早期病变的阶段检测结肠直肠癌的方法,使用核酸或蛋白质的分析技术在分子水平进行分析的方法受到注目。例如,结肠直肠癌的风险因子包括以家族性腺瘤性息肉(familial adenomatous polyposis,FAP)为代表的遗传背景,可以通过分析待测者的基因来进行结肠直肠癌的风险评价。此外,近年来,已知在具有FAP那样的特征性遗传背景的群体和不具有这样的遗传背景的群体中的任一者中,年龄(50岁以上)、肥胖·饮酒·吸烟的生活习惯因素均会提高将来的结肠直肠癌风险。因此,作为预测将来的结肠直肠癌的方法,由生活习惯引起的分子异常(表观遗传学、表达异常)受到注目。实际上,由GWAS(全基因组关联分析)研究成果等发现许多暗示与结肠直肠癌有关的分子。
作为捕捉大肠中的分子异常的技术,已开发了粪便或血液中的核酸分析技术。然而,来自微小病变的核酸非常微量,难以检测早期的分子异常。特别是,从分析装置的灵敏度的方面来看,由50个以下隐窝构成的或大小是直径为1mm以下的微小病变内的变化反映在血液中也是困难的。此外,由于粪便中除了大量的肠内细菌以外,还包含了从病变以外的区域剥离的上皮细胞,所以干扰变多。因此,为了以粪便作为样本来检测早期的结肠直肠癌·结肠直肠腺瘤,需要在癌化·腺瘤化的早期与正常组织相比表达量增大的优异的分子标记物。这样,通过检测大肠中的早期的分子异常在早期评价结肠直肠癌风险的技术开发尚未实现。
另一方面,1987年Bird等报道指出,在投与了致癌物质(氧化偶氮甲烷)的大鼠的大肠中畸变隐窝灶(ACF)为被亚甲基蓝浓染的微小病变。ACF是形态学上可以检测的最初的异常形态(例如,参照非专利文献1。),可见到细胞增殖活性的亢进、K-ras突变,所以暗示了与结肠直肠癌、结肠直肠腺瘤的发病有关。报道了在人大肠摘出标本中,同样地也在癌患者、息肉患者中见到被亚甲基蓝浓染的病变,该病变的数目按照健康人、息肉患者、癌患者的顺序变多(例如,参照非专利文献2。)。基于这些发现,使用ACF作为结肠直肠癌预防研究的指标的情况逐渐增加。
1mm以下的微小ACF难以通过通常的内窥镜检查来检测,通常采用放大内窥镜来检测。然而,放大内窥镜检查在操作上需要长时间,所以使用机会受到限制,难以用于早期的结肠直肠癌的一次筛查。这样,以显微镜·内窥镜来检测微小ACF并评价结肠直肠癌风险的技术开发还没有实现。
为了在分子水平分析ACF,正在进行有用的标记物分子的探索。例如,作为在ACF中表达量发生变动的分子,报道了TRIM29(tripartite motifcontaining29,三结构域蛋白29)、细胞周期蛋白(cyclin)D1、COX2(环氧化酶2)、β联蛋白(catenin,beta1)、iNOS(诱导型氧化氮合成酶2)、EGFR(表皮生长因子受体)、及CD44(CD44分子)等。例如,在TRIM29现有研究(参照非专利文献3。)的例子中,使用50个以下隐窝的ACF样品来分析分子变动。但是,均是来自小规模试验的报道,与结肠直肠癌不同,还没有进行涉及关于ACF病变中的分子变动的大规模试验评价的报道。
为了能够进行低损的检查·诊断,与结肠部相比,检查部位远远优选直肠部。进而,直肠也是在大肠癌中超过半数的发病部位。因此,需求可分析直肠的ACF的标记物分子。然而,例如,在TRIM29现有研究(参照非专利文献3。)的例子中,虽然暗示了TRIM29有希望作为用于ACF检测的标记物分子的可能性,但是是将上行结肠及下行结肠中的ACF样品作为分析对象,在直肠中是否也可以作为标记物使用并不清楚。
另一方面,从大肠癌发病与饮食生活等生活习惯的关联性出发,已经进行了以代谢关联因子为首的对分子水平的大肠癌分析有效的标记物的探索。具体而言,作为在大肠癌中表达量发生较大变动的分子,报道了SLC2a1[GLUT1(solute carrier family2(facilitated glucose transporter),member1,即,溶质载体家族2(易化葡萄糖转运蛋白),成员1))](例如,参照非专利文献4。)、SLC2a4[GLUT4(solute carrier family2(facilitated glucosetransporter),member4)](例如,参照非专利文献5。)、PTGER2[EP2(prostaglandin E receptor2(subtype EP2))](例如,参照非专利文献6。)、CD24(CD24molecule)(例如,参照非专利文献7。)、ADAM17(ADAMmetallopeptidase domain17)(例如,参照非专利文献8。)、EPHB3(Eph receptorB3)(例如,参照非专利文献9。)、GPX2[glutathione peroxidase2(gastrointestinal)](例如,参照非专利文献9。)等。但是,还没有涉及ACF病变部中的这些分子的表达变动的报道,在以微小ACF为代表的微小病变阶段(即,早期)分析表达量发生变动的分子,在分子生物学上捕捉将来的结肠直肠癌风险并简便地进行评价还未能实现。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2007-229054号公报
非专利文献
非专利文献1:Kelloff等39人,2006年,Clinical Cancer Research,第12卷,第12号,第3661~3697页。
非专利文献2:Takayama等9人,The New England Journal of Medicine,1998年,第339卷,第18号,第1277~1284页。
非专利文献3:Globov等6人,Cancer Epidemiology,Biomarkers andPrevention,2006年,第15卷,第11号,第2253~2262页。
非专利文献4:Younes等2人,Clinical Cancer Research、1996年、第2卷、第1151~1154页。
非专利文献5:野口(Noguchi)等9人,CANCER LETTERS,2000年,第154卷,第2号,第137~142页。
非专利文献6:马场(Baba)等9人,Cancer Epidemiology,Biomarkersand Prevention,2010年,第19卷,第3号,第822~831页。
非专利文献7:Choi等8人,World journal of gastroenterology,2009年,第15卷,第18号,第2258~2264页。
非专利文献8:Jossic等7人,The Journal Of Pathilogy,2005年,第207卷,第2号,第156~163页。
非专利文献9:Chiu等4人,Cancer Epidemiology,Biomarkers andPrevention,2005年,第14卷,第2号,第437~443页。
非专利文献10:Yamada等3人,nature protocols,2007年,第2卷,第3号,第753~762页。
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供一种用于通过在分子水平分析大肠组织的待测区域来检测ACF的方法。
用于解决问题的方案
本发明人为了解决上述课题进行了深入研究,结果发现,SLC2a1及SLC7a7[solute carrier family7(amino acid transporter light chain,y+Lsystem),member7,即,溶质载体家族7(氨基酸转运蛋白轻链,y+L系统),成员7]在直径为1mm以下或由50个以下隐窝构成的微小的ACF中,与正常组织相比表达量增大,从而完成本发明。
(1)本发明的第一方案是一种ACF检测方法,其是检测ACF(畸变隐窝灶)的方法,其使用选自由SLC2a1及SLC7a7组成的组中的1种以上的ACF特异性表达上调分子作为ACF检测用标记物,检测大肠组织的待测区域中的上述ACF检测用标记物。
(2)在上述(1)的ACF检测方法中,上述待测区域优选包括疑似为ACF的区域。
(3)在上述(1)的ACF检测方法中,优选将上述待测区域中的上述ACF检测用标记物的量与和上述待测区域位于同一大肠组织内的正常组织区域中的该ACF检测用标记物的量进行比较。
(4)在上述(1)~(3)中任一项的ACF检测方法中,上述待测区域优选为从生物体中采集的样本。
(5)在上述(1)~(3)的ACF检测方法中,优选在生物体内进行上述ACF检测用标记物的检测。
(6)在上述(1)~(5)中任一项的ACF检测方法中,上述ACF检测用标记物优选通过对该ACF检测用标记物进行荧光标记来检测。
(7)在上述(1)~(6)中任一项的ACF检测方法中,上述ACF检测用标记物优选为mRNA或蛋白质。
(8)在上述(1)~(7)中任一项的ACF检测方法中,优选使用被荧光物质标记的探针或特异性抗体将上述待测区域中的上述ACF检测用标记物进行荧光标记后,使用能够进行分光检测的内窥镜或消化道视频示波器进行检测。
(9)本发明的第二方案为一种ACF检测用标记物,其是用于检测ACF的标记物,其是SLC2a1或SLC7a7。
(10)本发明的第三方案为一种方法,其使用上述(1)~(8)中任一项的ACF检测方法,基于待测者的大肠组织的待测区域中的ACF的检测结果来评价该待测者的结肠直肠癌及结肠直肠腺瘤的风险。
发明的效果
根据本发明的ACF检测方法,可以使用分子生物学的方法来检测ACF。特别是本发明的ACF检测方法连直径为1mm以下或由50个以下隐窝构成的微小ACF也能够以良好的精度进行检测。
由于ACF被视为结肠直肠癌、结肠直肠腺瘤的指标,所以本发明的ACF检测方法在结肠直肠癌、结肠直肠腺瘤的早期检测、或发病风险评价等中也是有用的。
附图说明
图1是表示实施例1中各样品的以18SrRNA表达量标准化后的SLC2a1基因表达量的分布图。
图2是表示实施例1中各样品的以18SrRNA表达量标准化后的SLC7a7的基因表达量的分布图。
图3是表示实施例1中各样品的以18SrRNA表达量标准化后的TRIM29的基因表达量的分布图。
图4是表示实施例1中各样品的以18SrRNA表达量标准化后的SLC2a4的基因表达量的分布图。
图5是表示实施例1中各样品的以18SrRNA表达量标准化后的CD24的基因表达量的分布图。
图6是表示实施例1中各样品的以18SrRNA表达量标准化后的ADAM17的基因表达量的分布图。
图7是表示实施例1中各样品的以18SrRNA表达量标准化后的PTGER2的基因表达量的分布图。
图8是表示实施例1中各样品的以18SrRNA表达量标准化后的CDK4的基因表达量的分布图。
图9是表示实施例1中各样品的以18SrRNA表达量标准化后的EPHB3的基因表达量的分布图。
图10是表示实施例1中各样品的以18SrRNA表达量标准化后的C-KIT的基因表达量的分布图。
图11是表示实施例1中各样品的以18SrRNA表达量标准化后的GPX2的基因表达量的分布图。
图12是实施例1中样品的ACF病变部的HE染色及免疫组织化学(GLUT1)染色的图像。
图13是实施例2中通过GLUT1荧光探针对人大肠外科切除标本进行荧光染色,使用显微镜拍摄的疑似ACF病变的部位的荧光观察图像。
图14是实施例2中通过GLUT1荧光探针对人大肠外科切除标本进行荧光染色,使用显微镜拍摄的大肠癌病变的荧光观察图像。
图15是表示实施例2中由通过GLUT1荧光探针对人大肠外科切除标本进行荧光染色的荧光观察图像比较疑似ACF病变部的部位与正常区域中的荧光强度的结果的图。
具体实施方式
在本发明及本申请说明书中,ACF特异性表达上调分子是指在同一个体中的大肠组织中,与周边的正常组织相比在ACF中基因表达水平上调的分子。
此外,在本发明及本申请说明书中,大肠表示包括盲肠、结肠、直肠、及肛门管的区域,大肠组织表示包括大肠粘膜及大肠上皮的组织。
在本发明及本申请说明书中,在该区域为圆形或椭圆形的情况下,区域的直径是指直径(椭圆形的情况下为长径),在该区域为圆形或椭圆形以外的情况下,区域的直径是指将该区域近似为圆形时的近似圆的直径、或将该区域近似为椭圆形时的近似椭圆的长径。
本发明的ACF检测方法的特征在于,使用选自由SLC2a1及SLC7a7组成的组中的1种以上的ACF特异性表达上调分子作为ACF检测用标记物,检测大肠组织的待测区域中的上述ACF检测用标记物。上述2种ACF特异性表达上调分子均为在微小ACF、具体而言在直径为1mm以下的ACF或由50个以下隐窝构成的ACF中,与周边正常组织相比表达量增大的分子。因此,上述2种ACF特异性表达上调分子均为用于ACF检测、特别是微小ACF检测的临床上有用的标记物分子,通过将这些ACF特异性表达上调分子的表达量作为指标(作为ACF检测用标记物使用),不仅可以以良好的精度检测比较大的ACF(即,形态异常发展的ACF),也可以以良好的精度检测早期的微小的ACF。
在本发明的ACF检测方法中,只要检测上述2种ACF特异性表达上调分子中的至少1种分子即可,也可以对一个待测区域检测两种分子。
检测ACF特异性表达上调分子的表达量(ACF检测用标记物)的待测区域只要是大肠组织中的区域就没有特别限定,但优选为包括疑似为ACF的区域(可疑ACF区域)的区域。作为可疑ACF区域,例如,有大肠组织中的被亚甲基蓝浓染的区域。在亚甲基蓝染色中,ACF以外的区域也被染色,但在本发明的ACF检测方法中,通过将ACF特异性表达上调分子的表达量作为指标,与亚甲基蓝染色相比能够以良好的精度检测ACF。作为可疑ACF区域,除此以外,可列举出通过内窥镜观察、显微镜观察或图像分析等观察到形态异常的区域等。
本发明的ACF检测方法中的待测区域的大小没有特别限定,例如,可以考虑可疑ACF区域的大小等来适当决定,但优选可疑ACF区域在待测区域中所占的比例较高。正常组织区域在待测区域中所占的比例过高的情况下,即使在该可疑ACF区域实际上为ACF的情况下,该待测区域中的ACF特异性表达上调分子量与正常组织中的ACF特异性表达上调分子量的差异也变得难以检测。例如,包括直径为1mm以下的可疑ACF区域时,待测区域的直径优选为1mm以下,更优选低于1mm,进一步优选为0.5mm以下。此外,包括由50个以下隐窝构成的可疑ACF区域时,待测区域的大小优选为50个以下隐窝,更优选低于50个隐窝,进一步优选为25个以下隐窝。
另外,本发明中作为检测对象的2种ACF特异性表达上调分子均为在ACF中与正常组织相比基因表达水平上调的分子,与直径为1mm以下的微小ACF同样地,比较大的ACF、例如由100~150个隐窝构成的ACF也可以良好地进行检测。
本发明的ACF检测方法中被检测的ACF特异性表达上调分子只要是反映基因表达量的分子即可,可以是mRNA,也可以是蛋白质。即,本发明的ACF检测方法通过在RNA水平或蛋白质水平获取待测区域中的ACF特异性表达上调分子的信息,能够检测该待测区域的ACF。
各ACF特异性表达上调分子的检测方法只要是检测结果依赖于待测区域中的各分子的量、浓度的方法即可,可以从用于样本中的mRNA或蛋白质的检测的公知的方法中适当选择使用。其中,优选通过表达分析中使用的方法来进行。各方法可以通过常规方法来进行。
在待测区域中包含ACF的情况下,待测区域中的ACF特异性表达上调分子的量与大肠组织内的正常组织中相比变多。因此,通过将待测区域中的ACF特异性表达上调分子的量与大肠组织内的正常组织中的ACF特异性表达上调分子的量进行比较,能够检测待测区域中的ACF。即,在待测区域中的ACF特异性表达上调分子的量与正常组织中相比较多的情况下,可以判断该待测区域中包含ACF,在与正常组织中大致相同或为其以下的情况下,可以判断该待测区域中不包含ACF。待测区域与正常组织区域中的ACF特异性表达上调分子的量的比较可以以各区域的每单位表面面积或单位体积来进行,也可以以各区域中包含的每单位核酸量或单位蛋白质量来进行。
在本发明中,优选在同一个体的大肠组织中,将待测区域与其周边的正常组织进行比较。各ACF特异性表达上调分子的表达量虽然存在个体差异,但通过在同一个体中进行比较,能够抑制因个体差异而产生的影响。
根据所使用的检测方法的种类或灵敏度,有时在正常组织中没有检测到ACF特异性表达上调分子,仅在ACF中检测到。这种情况下,在待测区域中检测到该ACF特异性表达上调分子的情况下,判断该待测区域中包含ACF,在没有检测到该ACF特异性表达上调分子的情况下,判断该待测区域中不包含ACF。
当ACF检测用标记物为mRNA时,即,在RNA水平求出ACF特异性表达上调分子的表达量时,作为各ACF特异性表达上调分子的检测方法,可列举出利用使用了对各分子特异性的引物的核酸扩增反应的方法、或利用使用了对各分子特异性的探针的杂交的方法等。作为利用核酸扩增反应的方法,可列举出例如通过由待测区域中包含的RNA通过逆转录反应合成cDNA后,以所得到的cDNA作为模板进行RT-PCR等核酸扩增反应,来检测待测区域中的ACF特异性表达上调分子,或在可以与正常组织区域中的量比较的程度下定量地进行测定的方法。从待测区域中的RNA的提取、逆转录反应、RT-PCR等核酸扩增反应可以从该技术领域中公知的方法中适当选择来进行。
在利用核酸扩增反应的方法中,可以通过使用被荧光性嵌入剂、或荧光物质标记的引物等,对所扩增的ACF特异性表达上调分子进行荧光标记来定量地进行检测。另一方面,在利用杂交的方法中,通过使用被荧光物质标记的探针、或按照在杂交的情况下才发出荧光的方式修饰的探针,对待测区域中的ACF特异性表达上调分子进行荧光标记来定量地进行检测。
当ACF检测用标记物为蛋白质时,即,在蛋白质水平求出ACF特异性表达上调分子的表达量时,各ACF特异性表达上调分子可以通过例如使用了特异性地识别各分子的抗体(特异性抗体)的免疫学方法来检测。具体而言,可以使通过标记物质标记的各分子的特异性抗体与待测区域中的该分子结合后,通过测定来自该标记物质的信号,从而对待测区域中的ACF特异性表达上调分子进行荧光标记来定量地进行检测。利用标记物质的标记可以使标记物质直接与各分子的特异性抗体结合,也可以结合到与该特异性抗体特异性地结合的第二抗体上。作为标记物质,可以从在抗原抗体反应、或检测2个分子的结合的有无时通常使用的标记物质中适当选择使用。作为这样的标记物质,可列举出例如荧光物质、磁性体、放射性同位素等。从高灵敏度、且安全性高的方面出发,优选使用荧光物质作为标记物质。抗原抗体反应可以通过常规方法来进行。除了免疫学方法以外,例如也可以通过使用显示ACF特异性表达上调分子活性的特异性的探针并检测该探针,从而检测作为蛋白质的ACF特异性表达上调分子。
ACF特异性表达上调分子的检测可以针对从生物体中采集的样本进行。例如,可以在显微镜下从将生物体的大肠组织的部分区域外科切除而采集的大肠组织切除样品采集包含可疑ACF区域的待测区域的样品。此时,根据需要,从同一大肠组织切除样品中采集正常组织区域、优选待测区域的周边的正常组织的样品。此外,通过预先将生物体内的大肠组织进行亚甲基蓝染色,并外科切除包括被浓染的区域的待测区域,由此可以从生物体中直接采集待测区域的样品(活组织检查样品)。与大肠组织切除样品的情况同样地,待测区域的周边的正常组织的样品也可以从生物体中采集。将这样操作所采集的待测区域或正常组织区域的样品供于ACF特异性表达上调分子的检测。生物体内的大肠组织的亚甲基蓝染色可以通过常规方法来进行。
ACF特异性表达上调分子的检测也可以在生物体内进行。例如,通过将对ACF特异性表达上调分子特异性的带有标记的探针、带有直接或间接的标记的ACF特异性表达上调分子的特异性抗体、显示ACF特异性表达上调分子的活性的带有特异性标记的探针涂布或喷雾到生物体的大肠内的包括待测区域的区域中,使存在于该区域中的ACF特异性表达上调分子与该探针或特异性抗体结合而对其进行标记后,检测该标记,由此可以检测ACF特异性表达上调分子。
在生物体内进行ACF特异性表达上调分子的检测的情况下,优选对ACF特异性表达上调分子进行荧光标记来检测。具体而言,首先,使用被荧光物质标记的探针或特异性抗体对待测区域中的ACF特异性表达上调分子进行荧光标记。之后,使用能够进行分光检测的能够对大肠内进行可视检测的装置(内窥镜或消化道视频示波器等)在光学上检测由该标记发出的荧光,得到荧光图像。通过分析所得到的荧光图像,可以高灵敏度且定量地检测ACF特异性表达上调分子。
生物体内的ACF特异性表达上调分子的检测可以通过使用荧光内窥镜更简便且有效地进行。更具体而言,可以使用例如内窥镜系统来进行,所述内窥镜系统为至少部分插入生物体的体腔内从而获取该体腔内的摄影对象的图像的内窥镜系统,并且该内窥镜系统具备将与上述摄影对象内部的特定的物质结合或反应的感受性荧光试剂或蓄积在该摄影对象内部的荧光试剂向上述摄影对象喷出的试剂喷出单元、控制该试剂喷出单元的喷出控制单元、发出用于激发上述荧光试剂的激发光及分光特性与该激发光不同的照射光的光源部、将来自该光源部的上述激发光及照射光向上述摄影对象传播的光学系统、和设置在插入上述体腔内的部位并且能够摄影因上述激发光而从上述摄影对象辐射的荧光及因上述照射光而从上述摄影对象辐射的与该荧光不同的波长频段的光的拍摄单元(参照日本特开2007-229054号公报。)。作为荧光试剂,使用将对ACF特异性表达上调分子特异性的探针或特异性抗体用荧光物质标记而得到的物质即可。
在本发明的ACF检测方法中,供于ACF特异性表达上调分子的检测的试样只要来自动物的大肠即可,可以是来自鱼类、鸟类、爬虫类、及哺乳类中的任一种动物的试样。在本发明中,优选为来自哺乳类的试样,特别优选为来自人的大肠的试样。也可以是来自小鼠、大鼠、豚鼠、兔等啮齿类、狗、猫、牛、马、羊、猪、猴等人以外的动物的大肠的试样。此外,可以是从动物直接通过外科切除而采集的大肠组织,也可以是从生物体采集的大肠组织或在生物体外培养构成其的细胞而得到的试样。
待测区域中的ACF特异性表达上调分子的量是否比正常组织中的量多的信息在判断待测区域中是否存在ACF时是有用的。因而,通过本发明的ACF检测方法而得到的检测结果作为用于提供给ACF诊断的信息是有用的。
此外,由于ACF将来向结肠直肠癌发展的可能性高,所以通过本发明的ACF检测方法而得到的检测结果是在结肠直肠癌的存在风险的判断、或在早期低损地评价将来的结肠直肠癌发病风险时非常有效的信息。例如,根据本发明的ACF检测方法,在待测者的大肠组织中,在待测区域中的ACF特异性表达上调分子的量比周边的正常组织区域中多、且在该待测区域中检测到ACF的情况下,可以评价为该待测者将来发生结肠直肠癌或结肠直肠腺瘤的风险高。相反,在待测区域中的ACF特异性表达上调分子的量与周边的正常组织区域中相同或少、且在该待测区域中未检测到ACF的情况下,可以评价为该待测者将来发生结肠直肠癌或结肠直肠腺瘤的风险低。
实施例
接着示出实施例对本发明进一步详细地进行说明,但本发明并不限定于以下的实施例。
[实施例1]
对SLC2a1、SLC7a7、TRIM29、SLC2a4、CD24、ADAM17、PTGER2、CDK4(cyclin-dependent kinase IV,周期蛋白依赖性激酶IV)、EPHB3、C-KIT(v-kit Hardy-Zuckerman4feline sarcoma viral oncogene homolog,磷酸化原癌基因c-kit抗体)、及GPX2这全部11种候选分子,比较同一个体中的周边正常组织和可疑ACF区域中的基因表达水平,鉴定这些候选分子组中基因表达水平在ACF中特异性上调的分子。
具体而言,调制由从接受下部内窥镜检查的9名患者中采集的大肠活检样品仅采集在显微镜下确认为ACF部位的区域的样品、和从该患者制备在下部内窥镜下采集的正常组织样品,测定各样品中的各分子的表达量并进行比较。下面更详细地示出。
在显微镜下观察所采集的直肠部的大肠粘膜组织,仅将确认为ACF部位的部位切除作为ACF样品。此时,使用市售的最小尺寸的活检器具(直径:1mm),选择直径为1mm以下的大小的微小ACF进行采集。另一方面,采集在放大内窥镜观察下认为正常的部位作为对照样品。另外,每一名患者采集2份ACF样品、1份对照样品。
为了防止核酸分解,将ACF样品及对照样品活检后立即浸渍到RNAlater(QIAGEN公司制)中。然后,使用MagnaLyser(Roche公司制)及QIAGENRNase mini kit(QIAGEN公司制)提取总RNA后,通过DNase(Invitrogen公司制)处理消化残存的DNA。在添加了使用生物分析仪(Agilent公司制)确认RIN为6以上的RNA的反应溶液中,在37℃下进行60分钟的RT反应,合成cDNA。作为预扩增反应,以所得到的cDNA作为模板,使用用于扩增各候选分子的引物组,进行循环数少的预扩增反应。引物组分别使用表1中记载的市售的物质(Applied Biosystems Inc.制)。具体而言,分别添加7μL的RT反应后的反应溶液、事先混合了各引物组的溶液12.5μL、25μL的核酸扩增试剂(Taqman Gene Expression Master Mix、Applied Biosystems Inc.制)、5.5μL的超纯水,调制最终体积为50μL的反应溶液。将各反应溶液安放到PCR装置(Eppendorf Corp.制)中,在95℃下进行10分钟的热处理后,将95℃下15秒钟、60℃下4分钟的热反应进行14次循环。反应后,将反应液稀释至20倍,将得到的溶液作为样品供于实时PCR。
表1
候选分子 | 产品名 |
SLC2a1 | Hs00892681_m1 |
SLC7a7 | Hs00909952_m1 |
TRIM29 | Hs00232590_m1 |
SLC2a4 | Hs00168966_m1 |
CD24 | Hs00273561_s1 |
ADAM17 | Hs01041915_m1 |
PTGER2 | Hs00168754_m1 |
CDK4 | Hs00175935_m1 |
EPHB3 | Hs00177903_m1 |
C-KIT | Hs00174029_m1 |
GPX2 | Hs01591589_m1 |
以进行了预扩增的cDNA作为模板,实施实时PCR,进行各候选分子的表达产物(mRNA)的检测。具体而言,向0.2mL的96孔板中,分别注入预扩增反应后的各cDNA各5μL后,向各孔中添加4μL的超纯水和10μL的核酸扩增试剂(Taqman Gene Expression Master Mix、Applied Biosystems Inc.制)、1μL的引物探针组,调制PCR反应溶液。将该96孔板安放到实时PCR装置(AppliedBiosystems Inc.制)中,进行50℃下2分钟、95℃下10分钟的热处理后,将95℃下15秒钟、60℃下1分钟的热反应进行40次循环,经时地测定荧光强度。
分析荧光强度的测量结果,算出由各样品回收的RNA中的候选分子的基因表达量。各基因表达量以18S rRNA的表达量标准化。将各候选分子的各样品的标准化后的基因表达量的分布结果分别示于图1~11中。各图中,“CON”为对照样品的结果,“ACF”为ACF样品的结果。其中,在图1~11的分布图中,示出对照样品的全部9份样品中除去最大值及最小值的数据的7份样品的数据,示出ACF样品的全部18份样品中除去最大值及最小值的数据的16份样品的数据。
将同一个体中的正常组织中的表达量与ACF中的表达量进行比较,结果是SLC2a1、SLC7a7、及TRIM29这3种分子在ACF病变(ACF样品)中,与周边正常组织(对照样品)相比较,在统计学上表达量显著增大。即,可知这3种分子ACF特异性地基因表达水平上调,作为用于检测ACF的标记物是有用的。进而,由于SLC2a1、SLC7a7、及TRIM29在直径为1mm以下的微小的ACF中,在ACF病变与周边正常组织中在基因表达量上没有确认到差异,所以表示这些分子的表达上调可以成为检测直径为1mm以下的大小或由50个以下隐窝构成的微小ACF时的指标。另一方面,就剩余的8种分子而言,在ACF样品和对照样品中,在表达量上没有确认到统计学上的显著差异。
此外,通过免疫染色确认从接受下部内窥镜检查的患者采集的大肠活检样品的ACF病变中的GLUT1蛋白质表达。具体而言,进行HE染色、和使用了对GLUT1蛋白质为特异性的抗体的免疫组织化学染色(第一抗体:α-GLUT1兔多克隆抗体(产品编号:ab115730、abcam公司制)、第二抗体:过氧化物酶标记抗兔Ig山羊多克隆抗体(产品名:Envision Detection Reagent、产品编号:K5027、Dako公司制))。其结果是,如图12所示的那样,在ACF病变部中,确认到GLUT1蛋白质表达。
[实施例2]
根据实施例1的结果,在人大肠ACF中,在mRNA水平和蛋白质水平这两方面见到GLUT1的高表达。因此,使用非专利文献10中记载的市售品GLUT1荧光探针(2-NBDG),研究人大肠外科切除标本中的探针反应。
具体而言,对人大肠外科切除标本中喷洒GLUT1荧光探针溶液后,在显微镜下观察ACF病变部的荧光。更详细而言,首先,对诊断为大肠癌或溃疡性大肠炎、且接受摘出手术的患者,在术前实施下部内窥镜检查,通过亚甲基蓝染色确认ACF病变部的位置。接着,将刚进行摘出手术后的外科切除标本用温PBS洗涤,沿纵向切开后,喷洒GLUT1荧光探针溶液,在37℃下、暗室状态下反应20分钟。探针反应后,用温PBS洗涤组织,用显微镜进行ACF病变部及大肠癌病变部荧光的观察·评价。关于显微镜,在实体显微镜MVX10(奥林巴斯株式会社)中,组合460~490nm的带通滤波器作为EX(激发)滤波器、组合510~550nm的带通滤波器作为EM(吸收)滤波器来使用。
将通过显微镜图像拍摄的ACF病变的荧光图像示于图13中。图13中,用白色箭头表示的部位为被亚甲基蓝染色的部位,为疑似ACF病变的部位。此外,将通过显微镜图像拍摄的大肠癌病变部的荧光图像示于图14中。如图13及14所示的那样,与正常区域相比在ACF及大肠癌病变部中,与周边正常区域相比荧光强度上调,确认到强的探针反应。
进而,将通过图像分析调查ACF病变部和正常区域中的荧光强度的结果示于图15中。其结果是,在同一患者的ACF病变部中检测到的荧光强度与在正常区域中检测到的荧光强度相比,在显微镜下相对值达到2.4。由该结果也可确认在人大肠组织的ACF病变部中,GLUT1荧光探针被优先摄入。
由这些结果明确,通过使用GLUT1荧光探针,可以利用显微镜成像来进行ACF病变部的检测。此外,由于通过GLUT1荧光探针,可以以通过显微镜观察进行判别所需的充分的荧光强度和对比度对ACF病变部进行荧光标记,所以暗示了通过使用了内窥镜等的生物体内的观察,也可以通过使用GLUT1荧光探针来检测ACF病变部。
产业上的可利用性
根据本发明的ACF检测方法,由于可以通过分子生物学的方法以良好的精度检测ACF,所以本发明的ACF检测方法不仅可以利用于学术研究,在用于结肠直肠癌·结肠直肠腺瘤诊断的临床检查等领域中也可以利用。
Claims (10)
1.一种ACF检测方法,其是检测ACF(畸变隐窝灶)的方法,
使用选自由SLC2a1及SLC7a7组成的组中的1种以上的ACF特异性表达上调分子作为ACF检测用标记物,
检测大肠组织的待测区域中的所述ACF检测用标记物。
2.根据权利要求1所述的ACF检测方法,其中,所述待测区域包括疑似为ACF的区域。
3.根据权利要求2所述的ACF检测方法,其中,将所述待测区域中的所述ACF检测用标记物的量与和所述待测区域位于同一大肠组织内的正常组织区域中的该ACF检测用标记物的量进行比较。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的ACF检测方法,其中,所述待测区域为从生物体中采集的样本。
5.根据权利要求1~3中任一项所述的ACF检测方法,其中,在生物体内进行所述ACF检测用标记物的检测。
6.根据权利要求1~6中任一项所述的ACF检测方法,其中,通过对所述ACF检测用标记物进行荧光标记来检测。
7.根据权利要求1~6中任一项所述的ACF检测方法,其中,所述ACF检测用标记物为mRNA或蛋白质。
8.根据权利要求1~7中任一项所述的ACF检测方法,其中,使用被荧光物质标记的探针或特异性抗体将所述待测区域中的所述ACF检测用标记物进行荧光标记后,使用能够进行分光检测的内窥镜或消化道视频示波器进行检测。
9.一种ACF检测用标记物,其是用于检测ACF的标记物,其是SLC2a1或SLC7a7。
10.一种方法,其使用权利要求1~8中任一项所述的ACF检测方法,基于待测者的大肠组织的待测区域中的ACF的检测结果来评价该待测者的结肠直肠癌及结肠直肠腺瘤的风险。
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