CN103994963A - 一种用于检测褶牡蛎嗜酸性和嗜碱性粒细胞吞噬力的方法 - Google Patents

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林听听
周凯
张东
来琦芳
么宗利
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Abstract

本发明涉及一种用于检测褶牡蛎嗜酸性和嗜碱性粒细胞吞噬力的方法，包括：(1)褶牡蛎血细胞悬液制备；(2)荧光微球吞噬；(3)中性红染色；(4)碘化丙啶衬染；(5)镜检。本发明具有操作简单、快速、准确、特异性强、重复性高等优点。

Description

一种用于检测褶牡蛎嗜酸性和嗜碱性粒细胞吞噬力的方法
技术领域
本发明属于褶牡蛎细胞免疫学领域，特别涉及一种用于检测褶牡蛎嗜酸性和嗜碱性粒细胞吞噬力的方法。
背景技术
褶牡蛎(Ostrea plicatula)是我国南北沿海主要的养殖对象，近些年随着养殖规模的加剧以及养殖环境的恶化，渐趋出现了抗逆力减弱、免疫力下降、易发病等问题。这些问题目前尚无可行的解决办法，其主要原因是对贝类免疫防御机制的认知还不是十分清晰透彻。因此，亟需深入开展贝类免疫学相关的基础研究。
由于缺乏由免疫球蛋白介导的特异性免疫，贝类的免疫防御机制主要依赖于非特性免疫。血细胞是非特异免疫的主要执行者。血细胞通过聚集、吞噬、包囊、节结、氧化杀伤、黑化等一系列免疫过程达到识别、包裹和清除外来异物的目的。吞噬是血细胞最古老、最基本、最有效的防卫行为，也是最被认可的可用于评价贝类免疫力强弱的指标之一。贝类血细胞根据胞质颗粒有无可分为透明细胞和颗粒细胞，研究表明颗粒细胞较透明细胞更具吞噬力。颗粒细胞又可根据胞质酸碱性分为嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞，尽管在少数贝类中也发现了嗜中性粒细胞的存在。关于嗜酸性和嗜碱性粒细胞的研究，目前多集中于形态和染色亲和性方面，至于免疫功能特别是吞噬力方面，报道甚少。
关于这两类粒细胞吞噬力研究缓慢的原因主要受限于适宜研究方法的缺乏。目前用于分析细胞吞噬力的方法常见的有两种：一是以荧光微球为吞噬介质的流式细胞仪检测法，二是以细菌/酵母为吞噬介质的吉姆萨染色镜检法。虽然荧光微球具有粒径均一，特异性强，稳定性高等特点；流式细胞仪具操作简单快速、结果可靠等特点，但考虑到贝类嗜酸性和嗜碱性粒细胞往往具相近的细胞大小(cell size，FSC)和胞质颗粒度(cytoplasmic granularity，SSC)，使得在流式散点图中很难将这两类粒细胞清晰地区分开来，即流式细胞仪在检测这两类粒细胞的吞噬力方面存在局限性。吉姆萨染色法虽然可以清晰地区分嗜酸性(胞质红色)和嗜碱性(胞质蓝色)粒细胞，但胞质中吞噬的细菌也极易上色，造成与胞质颗粒的混肴，特异性差；另需培养灭活细菌，耗时长，重复性低。
中性红(Neutral red)是一种对细胞无毒害的活体染料，只有活细胞才能着色。中性红通过离子扩散渗入到活体细胞质中，遇酸性物质变红，遇中性或弱碱性物质不变色或变淡黄色，即染色后无论是嗜酸性粒细胞还是嗜碱性粒细胞，其细胞核因核酸缘故都会变红；而胞质方面，嗜酸性粒细胞变淡黄色，而嗜碱性粒细胞变红。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测褶牡蛎嗜酸性和嗜碱性粒细胞吞噬力的方法，该方法具有操作简单、快速、准确、特异性强、重复性高等优点。
本发明的一种用于检测褶牡蛎嗜酸性和嗜碱性粒细胞吞噬力的方法，包括：
(1)取褶牡蛎，从闭壳肌中抽取血淋巴与抗凝剂混匀，离心后PBS重悬血细胞沉淀，并调节细胞浓度，得到褶牡蛎血细胞悬液；
(2)将步骤(1)的血细胞悬液与荧光微球处理液混匀，35～40℃避光孵育1～2h；离心、洗涤、重悬，得到吞噬后的血细胞悬液；
(3)将步骤(2)的血细胞悬液与中性红染液混匀，室温避光染色30～40min；离心、洗涤、重悬，得到中性红染色后的血细胞悬液；
(4)将步骤(3)的血细胞悬液与丙酮混匀，室温固定5～10min；离心，去除上清液，血细胞沉淀用碘化丙啶溶液重悬，室温孵育15～20min；离心、洗涤、重悬，得到碘化丙啶衬染的血细胞悬液；
(5)取步骤(4)的血细胞悬液滴加于载玻片上，分别观察吞噬细胞和吞噬微球，拍照，统计吞噬细胞数和吞噬微球数分析褶牡蛎嗜酸性和嗜碱性粒细胞的吞噬力。
所述步骤(1)中的抗凝剂的组成为葡萄糖20.8g，柠檬酸钠8.0g，EDTA3.36g，氯化钠22.3g，蒸馏水1000ml，pH7.2。
所述步骤(2)中的荧光微球处理液的制备方法为：荧光微球悬液与3.0％牛血清白蛋白溶液按体积比1:100混匀，室温避光超声处理15～20min。
所述步骤(3)中的中性红染液的制备方法为：用磷酸盐缓冲液PBS将中性红按质量比100:1溶解，经滤纸过滤后即得中性红储备液；使用时，将储备液用PBS作10倍稀释。
所述步骤(2)、(3)和(4)中的洗涤和重悬采用PBS。
所述步骤(4)中的碘化丙啶溶液浓度为0.5mg/ml。
所述步骤(5)中的拍照是通过原位拍摄明视野和荧光视野，其中荧光视野是通过将蓝色和绿色荧光视野的照片叠加而成。
有益效果
本发明具有操作简单、快速、准确、特异性强、重复性高等优点；本发明不仅可为其他贝类研究嗜酸性和嗜碱性粒细胞吞噬力差异提供一个参考案例；也可为研究褶牡蛎嗜酸性和嗜碱性粒细胞其他免疫指标(如活性氧释放量)差异提供一个方法模型。
附图说明
图1为本发明的褶牡蛎血细胞显微镜观察的结果；其中，B-G：嗜碱性粒细胞，E-G：嗜酸性粒细胞，bar＝10μm；
图2为本发明嗜酸性和嗜碱性粒细胞的吞噬率和吞噬指数结果；“*”表示嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞存在显著差异。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)中性红染液制备：用pH为7.0的磷酸盐缓冲液(PBS：氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，磷酸二氢钾0.2g，蒸馏水1000ml，用HCl或NaOH调节pH值至7.0)将市售中性红粉末(上海试剂三厂)按质量比100:1溶解，经滤纸过滤后即得中性红储备液，于棕色瓶中4℃保存。使用时，将储备液用PBS作10倍稀释，现用现配。
(2)褶牡蛎血细胞悬液制备：取褶牡蛎，用5ml内含2ml预冷抗凝剂(葡萄糖20.8g，柠檬酸钠8.0g，EDTA3.36g，氯化钠22.3g，蒸馏水1000ml，pH7.2)的注射器从闭壳肌中抽取血淋巴，每只2ml。抽取的血淋巴经3000r/min，4℃离心10min，所得血细胞沉淀用PBS重悬。血球计数板调节细胞浓度为106cells/ml。
(3)荧光微球处理：市售荧光微球悬液(直径1.75μm，Polysciences,Inc.)与3.0％牛血清白蛋白(Sigma)溶液按体积比1:100于10ml离心管中混匀。混匀液在频率为27kHz的超声条件下室温避光超声15min，使微球游离状，微球浓度为107cells/ml。
(4)荧光微球吞噬：取1ml血细胞悬液与1ml荧光微球处理液于24孔细胞培养板孔(Costar)中混匀，37℃避光孵育1h；之后于微板离心机(Effendorf)2000r/min，4℃离心5min，去除上清液，血细胞沉淀用PBS重悬、相同离心条件洗涤3遍去除多余微球；洗涤结束后用1ml PBS重悬。
(5)中性红染色：往1ml吞噬后的血细胞悬液中加入1ml中性红染液，于24孔细胞培养板孔中混匀，不时轻微吹打，室温避光染色30min；之后于微板离心机离心(2000r/min，4℃，5min)，PBS洗涤3遍去除多余染液；洗涤结束后用1ml PBS重悬。
(6)碘化丙啶衬染：往1ml中性红染色后的血细胞悬液中加入1ml丙酮，于24孔细胞培养板孔中混匀，室温固定5min；之后于微板离心机离心(2000r/min，4℃，5min)，去除上清液，血细胞沉淀用1ml0.5mg/ml的碘化丙啶溶液重悬，室温孵育15min；之后于微板离心机离心(2000r/min，4℃，5min)，PBS洗涤3遍去除多余衬染液；洗涤结束后用1ml PBS重悬。衬染目的是为了在荧光暗视野中定位血细胞。
(7)镜检：取一滴衬染后的血细胞悬液滴加于干净的载玻片上，盖上盖玻片，用多功能显微镜(Olympus)在明视野下观察中性红染色，在荧光暗视野下用蓝色激发光观察荧光微球(黄绿色)，绿色激发光观察吞噬细胞(红色)，通过Image-Pro Express图像软件将蓝色和绿色激发光的荧光暗视野照片叠加。每个褶牡蛎随机拍摄50个原位的明暗视野，统计吞噬细胞数和吞噬微球数来分析嗜酸性和嗜碱性粒细胞的吞噬力。吞噬力分别用吞噬率(phagocytic rate，PR)和吞噬指数(phagocytic index，PI)来衡量，其中PR＝(吞噬荧光微球的细胞数/统计细胞数)×100％；PI＝(吞噬的荧光微球数/统计细胞数)×100％。检测结果如图1、图2所示：经中性红染色后，嗜酸性粒细胞(E-G)和嗜碱性粒细胞(B-G)的细胞核均变红，其中嗜酸性粒细胞的细胞质为黄色，而嗜碱性粒细胞的细胞质为红色。E-G的PR和PI分别为70.91±7.25％和1.03±0.16，均有显著高于B-G的PR(53.09±7.25％)和PI(0.74±0.08)，表明嗜酸性粒细胞在褶牡蛎免疫防御过程中可能比嗜碱性粒细胞更发挥着作用。

Claims (7)

1.一种用于检测褶牡蛎嗜酸性和嗜碱性粒细胞吞噬力的方法，包括：
(1)取褶牡蛎，从闭壳肌中抽取血淋巴与抗凝剂混匀，离心后PBS重悬血细胞沉淀，并调节细胞浓度，得到褶牡蛎血细胞悬液；
(2)将步骤(1)的血细胞悬液与荧光微球处理液混匀，35～40℃避光孵育1～2h；离心、洗涤、重悬，得到吞噬后的血细胞悬液；
(3)将步骤(2)的血细胞悬液与中性红染液混匀，室温避光染色30～40min；离心、洗涤、重悬，得到中性红染色后的血细胞悬液；
(4)将步骤(3)的血细胞悬液与丙酮混匀，室温固定5～10min；离心，去除上清液，血细胞沉淀用碘化丙啶溶液重悬，室温孵育15～20min；离心、洗涤、重悬，得到碘化丙啶衬染的血细胞悬液；
(5)取步骤(4)的血细胞悬液滴加于载玻片上，分别观察吞噬细胞和吞噬微球，拍照，统计吞噬细胞数和吞噬微球数分析褶牡蛎嗜酸性和嗜碱性粒细胞的吞噬力。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测褶牡蛎嗜酸性和嗜碱性粒细胞吞噬力的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的抗凝剂的组成为葡萄糖20.8g，柠檬酸钠8.0g，EDTA3.36g，氯化钠22.3g，蒸馏水1000ml，pH7.2。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测褶牡蛎嗜酸性和嗜碱性粒细胞吞噬力的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的荧光微球处理液的制备方法为：荧光微球悬液与3.0％牛血清白蛋白溶液按体积比1:100混匀，室温避光超声处理15～20min。
4.根据权利要求1所述的一种用于检测褶牡蛎嗜酸性和嗜碱性粒细胞吞噬力的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的中性红染液的制备方法为：用PBS将中性红按质量比100:1溶解，经滤纸过滤后即得中性红储备液；使用时，将储备液用PBS作10倍稀释。
5.根据权利要求1所述的一种用于检测褶牡蛎嗜酸性和嗜碱性粒细胞吞噬力的方法，其特征在于：所述步骤(2)、(3)和(4)中的洗涤和重悬采用PBS。
6.根据权利要求1所述的一种用于检测褶牡蛎嗜酸性和嗜碱性粒细胞吞噬力的方法，其特征在于：所述步骤(4)中的碘化丙啶溶液浓度为0.5mg/ml。
7.根据权利要求1所述的一种用于检测褶牡蛎嗜酸性和嗜碱性粒细胞吞噬力的方法，其特征在于：所述步骤(5)中的拍照是通过原位拍摄明视野和荧光视野，其中荧光视野是通过将蓝色和绿色荧光视野的照片叠加而成。
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