CN103990112B - 重组Tat-Cygb融合蛋白的抗炎、创伤愈合及抗肝纤维化作用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学技术领域，涉及重组融合Tat-Cygb蛋白的新用途，实验研究证明：所述Tat-Cygb可以治疗炎症、愈合创伤以及抗肝纤维化，促进肝纤维化的逆转，有望为临床提供重组融合Tat人源细胞球蛋白的新治疗手段。

Description

重组Tat-Cygb融合蛋白的抗炎、创伤愈合及抗肝纤维化作用

技术领域：

本发明属于生物医学技术领域，涉及重组融合蛋白在抗炎、创伤愈合及抗肝纤维化中的应用。

背景技术：

炎症(inflammation)：是具有血管系统的活体组织对损伤因子发生的防御反应，是感染及其许多疾病的最基本病理过程。炎症的发生发展过程一般分为三期：毛细血管扩张、通透性亢进；血小板吸附及白细胞游走；肉芽组织增生。炎症是临床常见的病理过程，可以发生于机体各组织和器官。急性炎症具有红、肿、热、痛等变化，同时常伴有发热、白细胞增多等全身反应。致炎因子作用于机体后，一方面引发细胞损伤坏死；另一方面，刺激机体抗病机能增加，使机体的内坏境及内境界和外坏境之间达到新的均衡。

创伤愈合(wound healing)：是机体遭受外力作用后，皮肤等组织出现离断或缺损后的愈合恢复过程，包括各种组织的再生和肉芽组织增生、瘢痕组织形成等。

皮肤创伤愈合的基本过程主要包括：急性炎症期、细胞增生期、瘢痕形成期、表皮及其它组织再生期。根据创伤的严重程度分为三种情况：创伤仅限于皮肤表皮层；稍重者皮肤和皮下组织断裂并出现伤口；严重的创伤可有肌肉、肌腱、神经的断裂。

创伤愈合可分为一般愈合、二期愈合、痂下愈合三种类型。

1)一般愈合(healing by first intention)：一般愈合的时间短，形成瘢痕较少。多见于如手术切口等组织缺损少、创缘整齐、无感染、经粘合或缝合后创面对合严密的伤口，伤口中只有少量血凝块，炎症反应轻微，表皮再生在24～48小时内便可覆盖伤口。肉芽组织在第3天就可从伤口边缘长出并很快将伤口填满，5～6天胶原纤维形成，约2～3周完全愈合。

2)二期愈合(healing by second intention)：见于组织缺损较大、创缘不整、无法整齐对合，或伴有感染的伤口。与一期愈合相比，主要有如下不同：①由于坏死组织多，或由于感染，继续引起局部组织变性、坏死，炎症反应明显。只有控制感染，清除坏死组织，再生才能开始。②伤口大，且伤口收缩明显，从伤口底部及边缘长出肉芽组织将伤口填平。③愈合的时间较长，形成的瘢痕较大。

3)痂下愈合(healing under scab)：伤口表面的血液、渗出液及坏死物质干燥后形成黑褐色硬痂，在痂下进行愈合。待上皮再生完成后，痂皮即脱落。如果痂下渗出物较多，如果有细菌感染，痂皮阻碍渗出物排出，不利于愈合。此种愈合所需时间长于无痂者，因这种情况下表皮再生必须首先将痂皮溶解，然后才能生长。

所以，创伤愈合用药原则应该包括缩小创面、防止再损伤和促进组织再生。损伤的程度及组织的再生能力决定修复的方式、愈合的时间及瘢痕的大小。组织的再生能力主要在进化过程中获得，但仍受全身及局部条件的影响。全身因素(如年龄、营养)及局部因素(如感染与异物感染、局部血液循环、神经支配、电离辐射等)两方面都会影响再生修复的进展。

肝纤维化(Hepatic fibrosis,HF)：是多种慢性肝脏疾病的共有病理阶段，肝纤维化持续发展可转变为肝硬化甚至肝癌，且肝病的中晚期都会发生致命的并发症。我国是一个肝病大国，高发病率和高死亡率是肝脏疾病的最大特点。肝纤维化是肝脏应对不同病因(炎症、酒精、寄生虫、化学毒物、免疫、营养代谢障碍、血液循环障碍、慢性病毒感染、胆管阻塞等)损伤刺激的自我修复反应；损伤的肝细胞分泌多种细胞因子，伴随肝窦内皮细胞、血小板分泌的细胞因子和某些化学介质共同激活肝星状细胞，使其转化为肝肌成纤维细胞(myofibroblasts,MFB)，MFB通过旁分泌和自分泌作用，产生大量以胶原为主要成分的细胞外基质(extra cellular matrix,ECM)，ECM的过渡沉积，合成与降解失衡，导致肝纤维化的发生、发展。研究证明，肝纤维化是可逆的，而一旦发展为肝硬化甚至肝癌，人们将束手无策。肝纤维化是肝硬化的早期阶段和必经阶段，在一定情况下可以逆转，但若病因持续存在,肝纤维化逐渐加重，肝小叶及血管等逐渐被改建,肝脏的正常结构遭到破坏，中心静脉区和汇管区出现间隔、假小叶形成，即发展为不可逆转的肝硬化。

积极探索肝纤维化发病机制，寻求有效治疗措施，对降低肝硬化发病率和死亡率具有重要意义。目前，肝纤维化治疗研究主要集中在以下几个方面：1)保护肝细胞，抑制HSC激活，2)抑制ECM合成，促进其降解，3)抑制细胞因子活性，调节信号通路。

细胞球蛋白(Cytoglobin,Cygb)，是近几年来在脊椎动物中发现的六配位血红素球蛋白(hxHb)超家族中的新成员，在多种生物及组织中表达。研究表明，细胞球蛋白Cygb可能与癌症的发生有关。食管癌、肺癌及结肠癌等恶性肿瘤中，Cygb的表达常常是被抑制的,通过基因治疗的方法表达Cygb，能够抑制肺癌细胞的正常生长。

细胞穿膜肽，即CPPs，又称为蛋白转导域或膜转导肽，是一种由30个或者更少氨基酸组成的能够穿透细胞膜的多肽，能够运载生物活性物质如肽、蛋白、反义核苷酸和脂质体等许多物质。细胞穿膜肽的出现，解决了因药物无法进入细胞而导致药效严重削弱的难题。Tat是近年研究较深入的细胞穿膜肽，通过与生物大分子(如核酸或蛋白质)的融合，能够使融合蛋白转导真核细胞膜并进入细胞内。

本发明所述重组融合Tat-Cygb人源细胞球蛋白的抗炎、创伤愈合及抗肝纤维化作用，迄今为止，尚未见有国内外的相关报道。

发明内容：

本发明提供了重组融合Tat人源细胞球蛋白在抗炎症中的应用。

本发明提供了重组融合Tat人源细胞球蛋白在创伤愈合中的应用。

本发明提供了重组融合Tat人源细胞球蛋白在抗肝纤维化中的应用。

Tat‐Cygb抗炎症实验结果显示：通过模型组与各给药组的对比可以看出，各给药组均可不同程度地缓解小鼠的耳廓肿胀，高剂量TAT‐Cygb组和地塞米松组与模型组相比，均具有显著性差异(p<0.01)，其中高剂量TAT‐Cygb的抗炎效果略逊色于地塞米松组，但二者之间无显著性差异(p>0.05)，而低剂量TAT‐Cygb组小鼠的耳廓肿胀程度较地塞米松组和高剂量组高，与模型组相比无显著性差异(p<0.05)。

Tat‐Cygb创伤愈合实验结果显示：TAT‐Cygb和Cygb均可促进伤口愈合，推测二者均因具有过氧化物酶活性而具有抗炎症作用，从而促进伤口愈合。此外，由于TAT‐Cygb带有TAT穿膜肽的功能，能穿透皮肤细胞，在细胞内作用，促进皮肤细胞生长，因此效果较Cygb更明显。

Tat‐Cygb抗肝纤维化实验结果显示：

利用CCI₄致小鼠肝纤维化模型，通过观察小鼠的生长状态和肝组织外观、测定血清及组织中各项肝功能指标含量以及病理切片分析验证，治疗组肝脏恢复了血色和光泽，肝脏内胶原纤维含量明显减少；在肝功能检测中，治疗组血清ALT和AST含量均不同程度地降低，接近正常组，与模型组相比有显著差异；纤维化血清标志物检测中，HA、LN、C-III、C-IV等含量变化证明TAT-Cygb可减少肝细胞外基质(ECM)的含量；肝组织指标含量变化显示，TAT-Cygb治疗组可减轻超氧化物歧化酶的消耗，使SOD含量恢复正常水平，同时可降低脂质过氧化产物MDA的含量和胶原纤维的亚氨基成分Hyp，综上可知，通过尾静脉注射TAT-Cygb融合蛋白，可以促进CCl₄导致的小鼠肝纤维化逆转。

本发明提供了以重组融合Tat-Cygb蛋白为活性成分组成的药物组合物在抗炎症中的应用。

本发明提供了以重组融合Tat-Cygb蛋白为活性成分组成的药物组合物在创伤愈合中的应用。

本发明还提供了以重组融合Tat-Cygb蛋白为活性成分组成的药物组合物在抗肝纤维化中的应用。

附图说明：

图1重组TAT-Cygb对小鼠耳廓肿胀急性炎症的影响

其中：1--模型组；2--地塞米松组；3--低剂量组；4--高剂量组

图2大鼠创伤模型构建

图3皮肤创伤愈合情况

图4大鼠皮肤创伤组织切片HE染色(第16天，×100)

其中：(a)-正常皮肤；(b)-对照组；(c)--红药水组；(d)-低剂量组；(e)-高剂量Cygb组；(f)-低剂量TAT-Cygb组；(g)-高剂量TAT-Cygb组

图5各组小鼠肝脏外观

其中：(a)-正常组；(b)-刚造模完小鼠；(c)-模型组；(d)-低剂量TAT-Cygb组；(e)-高剂量TAT-Cygb组

图6各组小鼠肝脏HE染色(40倍)

其中：(a)-正常组；(b)-刚造模完小鼠；(c)-模型组；(d)-低剂量TAT-Cygb组；(e)-高剂量TAT-Cygb组

图7各组小鼠肝脏天狼猩红染色(40倍)

其中：(a)‐正常组；(b)‐刚造模完小鼠；(c)‐模型组；(d)‐低剂量TAT‐Cygb组；(e)‐高剂量TAT‐Cygb组

图8各组小鼠肝脏Masson三色染色(40倍)

其中：(a)-正常组；(b)-刚造模完小鼠；(c)-模型组；(d)-低剂量TAT-Cygb组；(e)高剂量TAT-Cygb组

图9TAT-Cygb融合蛋白对各组小鼠血清ALT和AST的影响

其中：1-刚造模完的小鼠；2-正常组；3-模型组；4-高剂量TAT-Cygb组；5-低剂量TAT-Cygb组；*p<0.05vs模型组；**p<0.01vs模型组

图10TAT-Cygb融合蛋白对各组小鼠血清HA、LN、C-III、C-IV的影响

其中：1-刚造模完的小鼠；2-正常组；3-模型组；4-高剂量TAT-Cygb组；5-低剂量TAT-Cygb组；*p<0.05vs模型组；**p<0.01vs模型组

图11TAT-Cygb融合蛋白对各组小鼠肝组织SOD、MDA、Hyp的影响

其中：1‐刚造模完的小鼠；2‐正常组；3‐模型组；4‐高剂量TAT‐Cygb组；5‐低剂量TAT‐Cygb组；*p<0.05vs模型组；**p<0.01vs模型组

实施方案：

以下实施例仅为帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

《实施例1》重组Tat-Cygb抗炎症功能验证

按照专利号201010202986.2所述方法，制备重组融合Tat-Cygb蛋白。

1)二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验：将40只25g雌雄对半的KM小白鼠，按每组5只雄鼠和5只雌鼠，随机分为5组，分别为高剂量TAT-Cygb组、低剂量TAT-Cygb组、阳性对照组、模型组；

2)在每只小白鼠左耳廓内均匀涂30μL的二甲苯，引发急性的耳廓肿胀炎症，可见小白鼠左耳红肿胀大；

3)30min后，给小白鼠左耳廓均匀涂药，对照组为右耳廓。高剂量TAT‐Cygb组(500μg/只)，低剂量TAT‐Cygb(100μg/只)，阳性对照组(地塞米松软膏)，模型组(生理盐水)；

4)1h后，脱颈椎处死小鼠，用棉签轻擦去小白鼠左耳廓上残余的药，用眼科剪剪下左右耳；

5)用打孔器(直径8mm)打下两只耳朵相同的部位，得到两个圆形耳片，分别置于分析天平上称重，记录。

结果显示，各实验组小鼠的耳廓肿胀率(图1)，通过模型组与各给药组的对比可以看出，各给药组均可不同程度地缓解小鼠的耳廓肿胀，高剂量TAT‐Cygb组和地塞米松组与模型组相比，均具有显著性差异(p<0.01)，其中高剂量TAT‐Cygb的抗炎效果略逊色于地塞米松组，但二者之间无显著性差异(p>0.05)，而低剂量TAT‐Cygb组小鼠的耳廓肿胀程度较地塞米松组和高剂量组高，与模型组相比无显著性差异(p<0.05)。实验结果表明，低剂量的TAT‐Cygb抗炎效果较弱，而高剂量的TAT‐Cygb具有较好的抗炎效果。

《实施例2》皮肤创伤愈合动物模型验证

1)正常饲养10只(200g±20g)雄性KM大白鼠7d，开始造模；

2)腹腔注射3％戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉大鼠，该剂量可使大鼠维持昏迷状态2h～3h；

3)用眼科弯剪剪去大鼠背部的大部分毛，涂上适量脱毛膏；

4)10min～15min后，用医用棉花擦去残余的脱毛膏和毛，再用温水擦干净，注意不要让大鼠受凉；

5)用75％酒精消毒大鼠背部皮肤，然后用直径12mm的圆形打孔器在大鼠背部均匀切6个相同的圆形创面，医用棉花止血，造模完成；

促进创伤愈合治疗：

1)在每次给药前腹腔注射3％戊巴比妥钠(15mg/kg)麻醉大鼠；

2)右前部创面为高剂量TAT‐Cygb组，每天涂抹无菌TAT‐Cygb(80μg/次)，一日两次；

3)左前部创面为低剂量TAT‐Cygb组，每天涂抹无菌TAT‐Cygb(30μg/次)，一日两次；

4)右中部创面为高剂量Cygb组，每天涂抹无菌TAT‐Cygb(80μg/次)，一日两次；

5)左中部创面为低剂量Cygb组，每天涂抹无菌TAT‐Cygb(30μg/次)，一日两次；

6)右后部创面为阳性对照组，每天涂抹红药水(100μL/次)，一日两次；

7)左后部创面为阴性对照组，每天涂抹无菌生理盐水(100μL/次)，一日两次。

8)每天观察伤口创面表皮肉芽组织的生长情况，以及上皮组织的生长愈合情况，并拍照记录。在给药后包上伤口敷料，避免感染。

皮肤组织切片的制备与染色：

给药15d后，取创伤愈合处皮肤组织固定，做皮肤组织石蜡切片，观察伤口愈合后疤痕组织的大小。

TAT‐Cygb对大鼠皮肤创伤愈合的影响：

于正常条件下饲养KM大白鼠10只，7d后造模。利用12mm的皮肤打孔器在脱毛后的大鼠背部按顺序均匀打6个孔。分别代表高剂量TAT‐Cygb组(160μg/d)、低剂量TAT‐Cygb组(60μg/d)、高剂量Cygb组(160μg/d)、低剂量Cygb组(60μg/d)、阳性对照组(红药水，200μL/d)、阴性对照组(无菌生理盐水，200μL/d)(图2)。每天用药前，肉眼观察大鼠伤口创面表皮肉芽组织的成长情况，以及上皮组织的生长愈合速度，拍照记录。

通过每天用药后的跟踪观察可发现，各剂量的TAT‐Cygb和Cygb组与红药水组、对照组的伤口创面修复程度与愈合方式有较显著的差别(图3)。造模第一天，各组创面差别不大，伤口面积大小相同，表面比较湿润；用药第四天，可见高低剂量的TAT‐Cygb组、Cygb组以及红药水组的创面已长出肉芽组织，带少量渗出液，局部已经长出薄层或点状上皮，而对照组伤口已形成褐色结痂，这是由伤口表面的血液、坏死物质以及渗出液干燥后形成的；用药后第七天，伤口面积缩小，高低剂量的TAT‐Cygb组和高剂量Cygb组伤口皮肤创缘明显收缩，肉芽组织生长完好，伤口红润，而低剂量Cygb组和红药水组伤口形成痂皮，与对照组相似，这种于痂下愈合的方式一般比无痂伤口愈合慢，虽然同样是在创缘增生表皮基底细胞，但其在痂下进行，必须在溶解部分痂皮后，才能不断由外围向创面中心移动再生表皮，直至表皮再生完成，痂皮才能脱落，因此这种愈合方式耗时较长；用药后第十天，伤口面积继续缩小，高低剂量TAT‐Cygb组伤口趋于愈合，高剂量Cygb组伤口肉芽组织生长完好，低剂量Cygb组、红药水组和对照组仍有痂皮，部分再生表皮上的痂皮脱落。用药后第十三天，高低剂量TAT‐Cygb组和高剂量Cygb组创面已愈合，但仍需要时日待表皮完全上皮化，低剂量Cygb组痂皮脱落，伤口肉芽组织生长完好，红药水组和对照组仍见小块痂皮，愈合程度欠佳。

实验结果表明，TAT‐Cygb和Cygb均可促进伤口愈合，推测二者均因具有过氧化物酶活性而具有抗炎症作用，从而促进伤口愈合。此外，由于TAT‐Cygb带有TAT穿膜肽的功能，能穿透皮肤细胞，在细胞内作用，促进皮肤细胞生长，因此效果较Cygb更明显。

正常皮肤由表皮、真皮和皮下组织构成，真皮层中可见大量结蹄组织和皮肤附属器，如汗腺、皮脂腺和毛囊等。而全层皮肤切除的大鼠，其皮肤附属器被完全破坏，愈合过程中，肉芽组织增生，通过改建成熟后，形成由胶原纤维和弹性纤维组成的纤维结缔组织，即瘢痕组织。

将用药16d后的大鼠创伤皮肤组织切片，可观察每组大鼠创伤处瘢痕修复区域的大小。如(图4)所示，对照组B大鼠皮肤创伤处在100倍镜下的一个视野内仅能看到玻璃样变的瘢痕组织，周围的毛囊、汗腺和皮脂腺等皮肤附属器在视野之外；同样，红药水组C大鼠皮肤创伤由于痂下愈合较慢，一个视野内看不到正常皮肤构造；低剂量Cygb组D，在100倍镜的一个视野内已能看到部分皮肤附属器；高剂量Cygb组E、低剂量TAT‐Cygb组F和高剂量TAT‐Cygb组G可见周围的皮肤附属器向中心靠拢，瘢痕修复区域依次减小。推测TAT‐Cygb和Cygb因其可改善细胞氧化应激，防止成纤维细胞过度增殖迁移和细胞外基质过度积聚，使得瘢痕组织比对照组和红药水组的小，另一反面，TAT‐Cygb和Cygb均通过抗炎症作用促进创伤较快愈合，上皮形成较快，其中TAT‐Cygb组比Cygb组效果更明显，而对照组和红药水组由于痂下愈合较慢，同时在愈合过程中大鼠的运动加剧了伤口的反复感染，使肉芽组织过度增生，导致瘢痕组织较大。

《实施例3》：Tat-Cygb融合蛋白治疗小鼠肝纤维化

肝纤维化小鼠模型的构建及治疗：

1)实验分组：模型组、TAT‐Cygb高剂量组、TAT‐Cygb低剂量组、正常组，每7只小白鼠一组，共28只小白鼠。

2)肝纤维化小鼠模型构建：正常饲养25g的KM小白鼠一周，开始造模。模型组、高剂量TAT‐Cygb组和低剂量TAT‐Cygb组的小白鼠以1mL/100g体重腹腔注射CCl₄溶液，每隔两天腹腔注射一次，共注射16次，造模历时46天。前3次使用15％的CCl₄溶液，中间10次使用25％的CCl₄溶液，最后3次使用30％的CCl₄溶液。正常组小白鼠腹腔注射相同体积的生理盐水。所有小白鼠均用足量的鼠粮和水饲养。

3)TAT‐Cygb治疗：待46天造模完成，立即开始治疗。高剂量TAT‐Cygb组以120μg/(次·只)尾静脉注射TAT‐Cygb融合蛋白，低剂量TAT‐Cygb组以60μg/(次·只)尾静脉注射TAT‐Cygb融合蛋白，模型组和正常组小白鼠以200μL/(次·只)尾静脉注射生理盐水。每隔一天尾静脉注射一次，共注射15次，历时四周。

造模46d中，小鼠精神萎靡不振，皮毛不干净，肚子胀大，活动减少，嗜睡，进食量和饮水减少，尿液黄，说明小鼠肝脏因CCl₄受损，进而影响到小鼠的健康生长。而正常组皮毛顺滑，体重恒定，较活跃，进食量和饮水均正常。

在给药的一个月内，高剂量TAT‐Cygb组小鼠逐渐活跃起来，皮毛变得顺滑，进食量和饮水趋于正常。低剂量TAT‐Cygb组小鼠比模型组稍好，活动较活跃，但皮毛不顺滑。而模型组小鼠仍然有皮毛不干净、嗜睡、进食量和饮水较少的症状。小鼠肝脏外观：

在给药1个月后，解剖小鼠，肉眼观察肝脏外观，并拍照记录。

如(图5)，可以明显看出各组小鼠肝脏外观的区别及变化。正常组小鼠肝脏质地软，光泽度高，表面光滑，边缘锐利整齐，整个肝脏呈暗红色，见(图5a)；模型组小鼠肝脏质地硬光泽度低，表面粗糙有颗粒状，边缘较钝，整个肝脏发黄，趋向于肝硬化，个别肝脏部分与膈膜和周围器官粘连，如(图5b)；一个月后的模型组小鼠肝脏质地仍较硬，光泽度低，表面粗糙有颗粒状，边缘比刚造模完的肝脏有所好转，整个肝脏仍较黄，见(图5c)；低剂量TAT‐Cygb组小鼠肝脏质地比模型组软，但仍比正常组硬，光泽度低，表面有模糊颗粒，边缘较锐利，肝脏颜色稍黄，见(图5d)；高剂量TAT‐Cygb组小鼠肝脏质地软，光泽度明显增加，表面较光滑，边缘锐利整齐，肝脏呈暗红色，见图5e。

肝脏切片HE染色(图6)显示：

正常组小鼠肝组织的肝小叶结构正常，有完整的网状纤维支架，分布规律，肝细胞索以中央静脉为中心朝四周放射排列，肝索细胞排列紧凑，形态正常，见(图6a)；模型组小鼠肝组织肝小叶结构紊乱，汇管区纤维化并扩大，胶原沉积于其周围，汇管之间有纤维间隔形成，肝细胞体积增大，伴随大片炎性细胞浸润，表明严重的损伤性病理改变，见(图6b)；一个月后的模型组小鼠肝组织有稍微的恢复，但仍有严重的损伤性病理改变，如(图6c)；低剂量TAT‐Cygb组小鼠肝组织肝小叶结构正常，中央静脉周围仍有胶原沉积，偶见汇管区纤维化和汇管之间的纤维间隔，肝索细胞排列紧凑，形态正常，见(图6d)；高剂量TAT‐Cygb组小鼠肝组织的肝小叶结构正常，肝细胞索呈放射排列，无炎性细胞，个别偶见汇管区纤维化，与低剂量TAT‐Cygb组和模型组对比明显好转，如(图6e)。HE染色结果可初步说明TAT‐Cygb对CCI₄导致的肝纤维化有剂量依赖的治疗作用。

肝脏切片苦味酸天狼猩红染色

采用苦味酸天狼猩红染色法以更好地识别胶原纤维。染色结果可见(图7)，正常组小鼠肝组织肝小叶完整，结构正常，只在中央静脉、门管区、肝门静脉和肝动脉边缘有少量胶原着色，无纤维化，如(图7a)；模型组小鼠肝组织汇管区周围大量胶原沉积、纤维化，伴随炎性细胞浸润，汇管之间以及汇管和中央静脉之间形成纤维间隔，使肝小叶结构紊乱，并形成假小叶，如(图7b)；低剂量TAT‐Cygb组小鼠肝组织小叶结构完整，纤维化程度较轻，汇管区纤维化，纤维间隔减少，胶原着色比模型组浅，如(图7c)；高剂量TAT‐Cygb组小鼠肝组织小叶完整，结构正常，偶见小叶内小纤维瘢痕，汇管区胶原着色浅，纤维化程度低，如(图7d)。苦味酸天狼猩红染色表明TAT‐Cygb可显著降低小鼠肝脏中的胶原含量，减轻肝纤维化程度。

肝脏切片Masson三色染色：

采用Masson三色染色(图8)以区分组织中的胶原纤维和肌纤维。如图8a，正常组小鼠肝组织肝小叶结构正常，有完整的网状纤维支架，肝细胞索以中央静脉为中心朝四周放射排列，仅肝动脉、肝门静脉和少量中央静脉边缘存在少量胶原，无纤维化存在；模型组小鼠肝组织肝小叶紊乱，汇管区有大量胶原沉积，汇管之间以及汇管和中央静脉之间形成胶原纤维间隔，假小叶形成，伴随炎性细胞浸润，如(图8b)；低剂量TAT‐Cygb组小鼠肝组织纤维化程度降低，肝小叶结构完整，汇管区纤维化较轻，但门管区周围仍有较多胶原存在，如(图8c)；高剂量TAT‐Cygb组小鼠肝组织肝小叶结构完整，肝细胞索排列有序，汇管区及门管区胶原含量明显降低，纤维化程度轻，较接近正常组，如(图8d)。Masson三色染色结果同样表明TAT‐Cygb可显著降低小鼠肝脏中的胶原含量，减轻肝纤维化程度。肝功能检测(ALT、AST)：

谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)主要存在于肝细胞中，是检测肝损伤中较灵敏的指标，通过检测其含量可反映TAT‐Cygb对肝细胞的治疗作用。

如(图9)，刚造模完的小鼠血清中ALT含量是正常组的3倍多，AST含量是正常组的2倍多，说明肝脏受到了很大的损伤，1个月后的模型组虽然恢复了很多，但其ALT含量仍显著高于正常组小鼠，说明造模较成功，而高剂量TAT‐Cygb组小鼠血清ALT和AST含量均显著降低，与模型组相比有显著性差异，其中低剂量TAT‐Cygb组小鼠血清ALT含量也显著低于模型组。

纤维化血清标志物检测(HA、LN、C‐III、C‐IV)：

透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、C‐III胶原、C‐IV均是肝细胞外基质(ECM)的主要成分，通过测其含量变化，可指示肝纤维化的程度。如(图10)，刚造模完的小鼠血清中HA、LN、C‐III和C‐IV含量均明显高于正常组，1个月后的模型组含量降低，但仍与正常组相比具有显著性差异，其中高剂量TAT‐Cygb组小鼠血清中的LN、C‐III、C‐IV含量显著低于模型组，低剂量TAT‐Cygb组血清中C‐IV显著低于模型组。

肝组织指标检测(SOD、MDA、Hyp)：

在肝组织中，超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的变化可指示机体内活性氧和其衍生物含量的高低。作为胶原纤维的亚氨基酸成分，Hyp可间接指示肝内的胶原纤维水平。如(图11)，刚造模完的小鼠和模型组因肝中的氧化应激导致SOD消耗增加，超氧化物歧化酶含量显著低于正常组(p<0.05)，脂质过氧化反应的终产物MDA含量显著高于正常组(p<0.01)，可促进激活肝星状细胞，并合成胶原；Hyp含量显著高于正常组(p<0.01)，指示胶原纤维含量的增加。在高剂量TAT-Cygb作用下，SOD含量显著增加，MDA和Hyp含量显著降低，低剂量TAT-Cygb作用下，MDA含量与模型组相比也具有显著性差异(p<0.05)。

利用CCI₄致小鼠肝纤维化模型，通过观察小鼠的生长状态和肝组织外观、测定血清及组织中各项肝功能指标含量以及病理切片分析，研究了TAT-Cygb融合蛋白对肝纤维化的作用。从肝脏外观和病理切片上观察，治疗组肝脏恢复了血色和光泽，肝脏内胶原纤维含量明显减少，表明TAT-Cygb可促进CCI₄诱导的小鼠肝纤维化逆转；在肝功能检测中，治疗组血清中ALT和AST含量均不同程度地降低，接近正常组，与模型组相比有显著差异；纤维化血清标志物检测中，HA、LN、C-III、C-IV等含量变化证明TAT-Cygb可减少肝细胞外基质(ECM)的含量；肝组织指标含量变化显示，TAT-Cygb治疗组可减轻超氧化物歧化酶的消耗，使SOD含量恢复正常水平，同时可降低脂质过氧化产物MDA的含量和胶原纤维的亚氨基成分Hyp。综上可知，通过尾静脉注射TAT-Cygb融合蛋白，可以促进CCl₄导致的小鼠肝纤维化逆转。

Claims (2)

1.重组融合Tat-Cygb人源细胞球蛋白在制备创伤愈合药物中的应用。

2.重组融合Tat-Cygb人源细胞球蛋白为活性成分组成的药物组合物在制备创伤愈合药物中的应用。