CN1039899A

CN1039899A - 一种用碘标记检测肿瘤的方法

Info

Publication number: CN1039899A
Application number: CN 88105555
Authority: CN
Inventors: 路德元; 王瑾瑛; 叶仲贤
Original assignee: Navy Medicine Research Institute of PLA
Current assignee: Navy Medicine Research Institute of PLA
Priority date: 1988-07-23
Filing date: 1988-07-23
Publication date: 1990-02-21

Abstract

本发明提供了一种对各类肿瘤广谱适用的用¹²⁵碘(¹²⁵I)标记物测血清脱氧核糖核酸聚合酶(DNA-P)活性来检测肿瘤的方法，此法适用于肿瘤的辅助诊断、临床预后观察和肿瘤普查。本方法由¹²⁵I-脱氧尿嘧啶核苷(¹²⁵I-UDR)参与合成DNA，用乙基苯基聚乙二醇(NP-40)克服血清蛋白对DNA活性的抑制作用，并公开了制备高比度(接近无载体)¹²⁵I-UDR标记物的步骤。本方法对肝癌、肺癌、胃癌等16种肿瘤诊断符合率为73.6％，临床应用符合率为80.9-86.6％。并具有肿瘤早期诊断的价值。

Description

本发明述及人类医学卫生，特别是一种用碘标记物检验样品血清来检测肿瘤的方法。

肿瘤是危害人体健康的主要疾病之一，已引起世界各国的重视。目前已从组织形态学、免疫学、放射学以及生物化学等方面对肿瘤的诊断、治疗进行了广泛的研究。对于肿瘤的检测诊断已取得了可喜的进展。据文献报道有效的肿瘤标记物有80多种，但特异性强、较满意的少。特别是缺少对各类肿瘤广谱适用的标记物。故进行肿瘤普查时，往往要进行多项指标的检测，还只能检查有限几种肿瘤，尚远远不能适应普查的需要。

本发明的目的在于提供一种对各类肿瘤广谱适用的用¹²⁵碘标记物测定血清脱氧核糖核酸聚合酶活性来检测肿瘤的方法，适合于肿瘤的辅助诊断、临床予后观察和肿瘤普查。

本发明基于这样的基本原理，人的血清即脱氧核糖核酸聚合酶（DNA-P）加入脱氧腺嘌呤核苷三磷酸（dATP）、脱氧胞嘧啶核苷三磷酸（dCTP）、脱氧鸟嘌呤核苷三磷酸（dGTP）、含¹²⁵碘脱氧尿嘧啶标记物（¹²⁵Ⅰ-UdR）后，在摄氏37度下温育3小时，生成含¹²⁵碘脱氧核糖核酸（¹²⁵Ⅰ-DNA），可在分离纯化后测其放射性，即：

当反应条件严格控制一定时，测得的¹²⁵Ⅰ-DNA放射性与DNA-P活性成线性关系，所以放射性即可代表DNA-P活性。

具体操作方法如下：

1、配底物：按每个样品dATP、dCTP、dGTP、Mg⁺⁺溶液（0.32M MgCL₂-0.96MNH₄CL）各10微升，三羟甲基氨甲烷（Tris）缓冲液60微升，¹²⁵Ⅰ-UdR1微升的用量混合，使0.1毫升底物放射性为40-50万脉冲/分。

2、取0.1毫升样品血清，加20微升乙基苯基聚乙二醇（NP-40）溶液和0.1毫升底物，37℃水溶中温育3小时。

3、取出试管，加2毫升5%三氯醋酸（TCA）溶液，沉淀¹²⁵Ⅰ-DNA，4000转/分、离心5分钟，弃清液。

4、每管加入一颗玻璃珠（直径4-6毫米）和0.2毫升5%TCA溶液，将试管置于涡旋混匀器上混匀一分钟。

5、加2毫升5%TCA溶液洗沉淀，4000转/分离心5分钟，弃清液。

6、重复本操作方法步骤4、5，洗涤沉淀3次，共洗涤沉淀4次。

7、测沉淀的放射性，凡放射性等于或超过诊断限度者为阳性，低于则为阴性。

下面介绍诊断限的决定：取5份正常血清，按样品同样的方法与样品同时操作，测定放射平均值X，计算标准差SD，取X+2SD为诊断限。

下面介绍¹²⁵Ⅰ-UdR标记物的制备：

1、称取5毫克生化纯的脱氧尿嘧啶核苷（UdR），加0.5毫升2克当量浓度的HNO₃溶液溶解。

2、取100微升碘放射性（¹²⁵Ⅰ，2-3毫居里）溶液及100微升的本步骤1所述的溶液置于安瓿瓶中，封口，于摄氏80-120度在水浴中反应1小时。

3、打开安瓿瓶，加浓氨水调至酸度值PH9，加入季胺型Dowex1阴离子交换树脂柱（1×20厘米），分别用80毫升0.5M NH₄AC-0.05M NH₄OH缓冲液，50毫升0.5M NH₄AC-0.05M NH₄OH缓冲液和120毫升水进行流洗，以0.2N HAC解吸，解吸液转入活性炭柱（1×2厘米），然后用60毫升70%乙醇-氨水解吸活性炭柱，赶尽解吸液中氨，即得高比度（接近无载体）的¹²⁵Ⅰ-UdR标记物。

本发明有如下优点及积极效果：

1、本方法由¹²⁵Ⅰ-UdR参与合成DNA，由NP-40克服血清蛋白对DNA-P活性的抑制作用，并成功地研究了制备高比度（接近无载体）¹²⁵Ⅰ-UdR标记物的步骤。经实验研究表明，对肝癌、肺癌、胃癌等16种肿瘤诊断符合率为73.6%，临床应用符合率为80.9-86.6%，并对各类肿瘤广谱适用。

2、初步肿瘤普查研究表明，比甲胎蛋白（AFP）和癌胚抗原（CEA）更敏感，具有早期诊断价值。

3、本发明的发明人设计了¹²⁵I标记物检测肿瘤药盒组成如下：

（1）¹²⁵标记物（20微居里）冻干品1瓶

（2）dATP冻干品1瓶

（3）dCTP冻干品1瓶

（4）dGTP冻干品1瓶

（5）Mg⁺⁺溶液1瓶

（6）Tris缓冲液1瓶

（7）NP-40溶液1瓶

利用该药盒对31例AFP阴性病例（其中原发性肝癌9例）进行测定，本药盒测定14例阳性，其中原发性肝癌8例，肝血管瘤4例，肝脓肿1例，胆结石1例。表明本药盒对AFP阴性的原发性肝癌检出率高（8/9），对提高肝癌的检出率具有重要意义。本方法和本药盒很适用于肿瘤的辅助诊断、临床予后观察和肿瘤的普查。

Claims

1、一种用碘标记物检验样品血清来检测肿瘤的方法，其中包括：

(1，1)按下列配方配制底物，每0.1毫升底物的放射性为40-50万脉冲/分：

(1，1，1)脱氧腺嘌呤核苷三磷酸(dATP)10微升。

(1，1，2)脱氧胞嘧啶核苷三磷酸(dCTP)10微升。

(1，1，3)脱氧鸟嘌呤核苷三磷酸(dGTP)10微升。

(1，1，4)Mg⁺⁺溶液(0.32M MgCL₂-0.96M NH₄CL)10微升。

(1，1，5)三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液60微升。

其特征在于：

(1，1，6)含¹²⁵碘-脱氧尿嘧啶核苷(¹²⁵I-UdR)标记物1微升。

(1，2)取0.1毫升血清(含DNA-P)样品，加入乙基苯基聚乙二醇(NP-40)溶液20微升和(1，1)中所述底物0.1毫升，置于试管中在摄氏37度水浴中温育3小时。

(1，3)取出试管，加2毫升5%三氯醋酸(TCA)溶液，沉淀含¹²³碘脱氧核糖核酸(²³I-DNA)，在4000转/分离心操作5分钟，弃清液。

(1，4)每管加入一颗玻璃珠(直径4-6毫米)，0.2毫升5%TCA溶液，将试管置于涡旋混匀器上进行1分钟混匀。

(1，5)加入2毫升5%TCA溶液洗沉淀，4000转/分离心操作5分钟，弃清液。

(1，6)重复本方法步骤(1，4)、(1，5)，洗涤沉淀3次，共洗涤沉淀4次。

(1，7)测定沉淀物放射性，凡放射性等于或超过诊断限者为阳性，低于则为阴性。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的（1，1，6）项中含¹²⁵碘脱氧尿嘧啶核苷标记物（¹²⁵Ⅰ-UdR）的制备方法是：

（2，1）称取5毫克生化纯的脱氧尿嘧啶核苷（UdR），加入5毫升2克当量浓度的硝酸（HNO₃）溶解，

（2，2）取100微升碘放射性溶液（¹²⁵Ⅰ，2-3毫居里）及100微升（2，1）项中所述溶液置于安瓿瓶中，封口，于摄氏80-120度水浴反应1小时，

（2，3）打开安瓿瓶，加浓氨水调至酸度PH9，加入季胺型阴离子交换树脂柱（1×20厘米），分别用80毫升0.25M NH₄AC-0.05M NH₄OH缓冲液，50毫升0.5M NH₄AC-0.05M NH₄OH缓冲液和120毫升水进行流洗，以0.2克当量浓度的HAC解吸，解吸液转入活性炭柱（1×2厘米），然后用60毫升70%乙醇-氨水解吸活性炭柱，赶尽解吸液中氨，即得高比度（接近无载体）的¹²⁵Ⅰ-UdR标记物。

3、权利要求1所述的方法，其特征在于所述的（1，7）项中的诊断限是这样决定的：取5份正常血清，按权利要求1所述的样品血清同样的步骤与样品同时操作，测定放射性平均值 X，计算标准差SD，取 X+2SD为诊断限。