CN103981100A - 一种促进丛枝菌根真菌孢子萌发及菌丝衍生方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种促进丛枝菌根真菌孢子萌发及菌丝衍生方法，丛枝菌根真菌孢子的筛选，丛枝菌根真菌孢子的消毒，消过毒的孢子在显微镜下用无菌的枪头吸取转移到置于培养皿中的培养基上，每个培养皿接种50个孢子，置暗箱中培养，26℃条件下，培养20d完成培养过程。本发明的有益之处是采用RiT-DNA转基因胡萝卜根的根分泌液(50ml/L)，外加葡萄糖和适当的氮源促进Glomus intraradices孢子萌发和菌丝生长。本方法操作简便，材料廉价，环境友好。
Description
技术领域
本发明属于真菌萌发及菌丝衍生促进剂技术领域，涉及一种促进丛枝菌根真菌孢子萌发及菌丝衍生方法。
背景技术
丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)是在陆地上栖息的最普遍的、具有与最广泛植物种类存在地下共生关系的真菌。在土壤中和一个宿主植物形成共生关系之前，丛枝菌根真菌经历一个前共生阶段，包含孢子萌发、菌丝生长和形成分枝；当存在寄主根时，随着附着泡的形成，再入侵到根内并在细胞间延伸，形成丛枝状结构，然后外生菌丝生长，最后形成孢子。AM真菌的孢子是非常大的，并且包括许多细胞核，储存了大量的脂肪和糖类。储存如此大容量的基因信息和能量是该物种的选择优势，但是很清楚AM真菌的孢子不含有支持持续生长和完成生命循环的生物学因素，除非它们成为与寄主共生的一部分。这是因为在前共生阶段缺乏一种或者多种营养元素，包括缺乏合成脂肪酸的能力。于是，AM真菌必须依赖由萌发孢子或根外菌丝生成的萌发管侵染到植物根中，从而完成AM真菌的生命循环过程。
显然，AM真菌的孢子可以在不含任何矿质营养物质的水中萌发，AM真菌的孢子在萌发早期的一些生化反应，例如在Glomus mosseae的孢子中存在萘酚磷酸酯酶，这可能涉及激活孢子萌发且在生长菌丝中有细胞溶解的作用；在孢子萌发过程中也发现存在TCA循环、EMP糖降解途径和磷酸己糖支路途径。Glomus caledonius孢子中发生脂肪代谢、RNA和蛋白质的生物合成。此外，发现含硫的氨基酸可能促进萌发孢子菌丝的生长。
尽管孢子内储存着大量的C源，许多文献报道AM真菌孢子可以吸收乙酸、葡萄糖、果糖和CO2作为C源。AM真菌孢子储存的C源也被分解并且用来合成氨基酸(arginine，Arg和glutamine，Gln)。显然，AM孢子中氨基酸的生物合成需要内部存储的N或外源N。N是植物组织中最丰富的矿物质元素，在植物生长所需要的营养物质中，氮通常是受限制的元素。研究表明AM真菌菌丝从土壤中吸收不同形式的N并且运转到植物寄主中去。然而，在不同的土壤条件中AM真菌孢子萌发时也可以吸收和代谢利用不同形式N素。此外，在AM真菌前共生阶段时许多外界条件和因素(根际、根分泌液、黄酮类、土壤微生物和悬浮培养植物细胞)都能影响萌发率和促进无寄主菌丝的生长繁殖。例如，根分泌液可以增加AM真菌菌丝长度和菌丝分支。为了促进AM真菌孢子萌发及菌丝生长，在培养介质中加入根分泌液，同时也添加无机氮源和葡萄糖。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促进丛枝菌根真菌孢子萌发及菌丝衍生方法，本发明的有益之处是采用RiT-DNA转基因胡萝卜根的根分泌液(50ml/L)，外加葡萄糖和适当的氮源促进Glomus intraradices孢子萌发和菌丝生长。本方法操作简便，材料廉价，环境友好。
发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：
步骤1：丛枝菌根真菌孢子的筛选，称取含丛枝菌根真菌的沙子菌剂倒入杯中加水搅拌、用400目孔径的双层筛网筛洗，直到搪瓷杯中水清澈为止，随后自来水不断清洗筛网，收集下层400目筛网的孢子，筛出物放入培养皿中，用移液枪吸取孢子于干净的锥形瓶中备用；
步骤2：丛枝菌根真菌孢子的消毒，将上一步锥形瓶中收集的孢子倒入无菌的纱网中，用无菌水在超净台上先冲数遍，然后放于漏斗中，倒入配好消毒液冲洗1-2遍，用无菌皮塞塞住漏斗的低部，继续添加消毒液，震荡之后，去掉皮塞，用无菌水冲洗；
步骤3：将消过毒的孢子在显微镜下用无菌的枪头吸取转移到置于培养皿中的培养基上，每个培养皿接种50个孢子，置暗箱中培养，26℃条件下，培养20d完成培养过程。
进一步，步骤1中丛枝菌根真菌为根内球囊霉菌。
进一步，步骤2中的消毒液是：氯胺T+200mg/L链霉素+100mg/L庆大霉素消毒液+1％滴Tween20处理15min，所述的孢子的消毒液，均采用无菌过滤膜加注，存储应4℃冷藏。
进一步，步骤3中所述培养基为：NaNO3、NH4Cl、NH4NO3、Urea分别按4mmol/L分别加入到葡萄糖、根分泌液或琼脂中。
进一步，培养基为葡萄糖5g/L和尿素2mmol/L组成，以及50ml/L根分泌液和尿素2mmol/L组成对孢子萌发率最好；或培养基为葡萄糖5g/L和NH4NO34mmol/L组成，以及50ml/L根分泌液和NH4NO34mmol/L组成对菌丝长度最好。
附图说明
图1是本发明葡萄糖和不同氮源对孢子萌发的影响示意图；
图2是本发明葡萄糖和不同氮源对菌丝生长的影响示意图；
图3是本发明根分泌液和不同氮源对孢子萌发的影响示意图；
图4是本发明根分泌液和不同氮源对菌丝生长的影响示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明对照现有技术的有益效果是：材料设备简单，容易实施，成本小，环境友好。本技术促进丛枝菌根真菌孢子快速萌发及菌丝生长快速衍生，原有的孢子萌发的培养基，传统方法中用的是水琼脂，但是这不利于孢子在后期生长时因营养物质缺乏而影响其进一步和植物体共生，本实验提供了一种不但使孢子萌发时间周期短缩短，而且能提高萌发率和促进菌丝长度的增加的有利条件，孢子的高萌发率和较快菌丝生长速度保证了作为生物肥料在农业上的高效发挥。
本发明采用的技术方案步骤：
步骤1：丛枝菌根真菌孢子的筛选及提纯：丛枝菌根真菌孢子可以是AM真菌孢子即根内球囊霉菌，称取10gAM真菌(G.intraradices)的沙子菌剂倒入杯中，不断的加水搅拌、用400目孔径的双层筛网筛洗，直到搪瓷杯中水清澈为止，随后自来水不断清洗筛网，收集下层400目筛网的孢子，筛出物放入培养皿中，显微镜下，用移液枪吸取孢子于干净的锥形瓶中备用。
步骤2：AM真菌孢子的消毒：将上一步锥形瓶中收集的孢子倒入无菌的纱网中，用无菌水在超净台上先冲数遍，然后放于漏斗中，倒入配好消毒液冲洗1-2遍，然后，用无菌皮塞塞住漏斗的低端，在继续添加消毒液，震荡15min之后，去掉皮塞，用无菌水冲洗10遍，所述的孢子的消毒液，均采用无菌过滤膜加注，存储应4℃冷藏。
步骤3：孢子接种和培养：把消毒过的孢子放置到培养皿中，再将此培养皿放到显微镜下用无菌的枪头吸取孢子，每个培养皿接种50个孢子，置暗箱中培养，26℃，培养20d(天)。
所述培养基的配置，均按实验设计中所配置。
培养基的配制：
培养基为把NaNO3、NH4Cl、NH4NO3、Urea(尿素)分别按4mmol/L加入到葡萄糖、根分泌液中，相应的实验对照组为对照1:葡萄糖(5g/L)+0.8％琼脂，对照2：根分泌液(50ml/L)+0.8％琼脂,pH6.5，120℃灭菌25min。如表1。
表1培养基配制
琼脂粉优选(上海山浦化工有限公司生产)，葡萄糖优选(上海山浦化工有限公司生产)。
胡萝卜根分泌液的制备：将毛根农杆菌质粒DNA转化的胡萝卜根的培养在固体培养基的培养皿中(该固体培养基含有：硫酸镁720-740mg/L、硝酸钾70-90mg/L、氯化钾55-75mg/L、硝酸钙270-290mg/L、EDTA铁钠盐5-12mg/L、肌醇40-60mg/L、硫酸锰0.01-0.08mg/L、硫酸铜0.01-0.03mg/L、硼酸0.3-0.6mg/L、硫酸锌0.1-0.4mg/L、碘化钾0.01-0.03mg/L、钼酸钠0.01-0.03mg/L、氯化钴0.01-0.04mg/L、维生素B0.1-0.3mg/L、咇哆醇0.1-0.3mg/L、烟酸0.2-0.8mg/L、蔗糖7500-8500mg/L、葡萄糖4500-5500mg/L和植物胶3500-4500mg/L)，一个月后，小心将根移到含有3％蔗糖的液体培养基中(该液体培养基含有：硫酸镁720-740mg/L、硝酸钾70-90mg/L、氯化钾55-75mg/L、硝酸钙270-290mg/L、EDTA铁钠盐5-12mg/L、肌醇40-60mg/L、硫酸锰0.01-0.08mg/L、硫酸铜0.01-0.03mg/L、硼酸0.3-0.6mg/L、硫酸锌0.1-0.4mg/L、碘化钾0.01-0.03mg/L、钼酸钠0.01-0.03mg/L、氯化钴0.01-0.04mg/L、维生B0.1-0.3mg/L、咇哆醇0.1-0.3mg/L、烟酸0.2-0.8mg/L、葡萄糖4500-5500mg/L),24℃生长4周,无菌环境下用去离子水清洗2次,随后在无菌去离子水中24℃生长1周,收集根分泌液，即得到胡萝卜根分泌液。为了提高根分泌液的浓度，也可以用C18SEPAK柱子进一步纯化浓缩。具体步骤：加入柱子中100ml根分泌液，再用2ml35％乙腈洗脱，随后这些半纯化的根分泌液用3ml70％乙腈和1ml100％乙腈洗脱收集,用氮气吹干，溶解于0.5ml70％甲醇。这种根分泌浓缩液相当于488％的原根分泌液。
观察统计分析：分别以5天为间隔即(5d，10d，15d，20d)做统计，当孢子芽管菌丝生长的长度等于孢子的直径或者大于孢子的直径作萌发标准，统计萌发率，菌丝长度参照Ishii&Shrestha(1996)进行测量，其中被污染的孢子不在统计之内。用Spss17.0统计软件对实验数据进行方差分析。
不同外源氮分别和根分泌液、葡萄糖共同作用对AM真菌孢子的萌发和菌丝生长的影响，各种不同浓度配比下的培养基中孢子萌发生长的情况如下：
(1)图1为不同氮源和葡萄糖对Glomus intraradices孢子萌发率的影响示意图，
不同的外源氮加葡萄糖的培养基中，孢子的萌发率随培养时间的推移，萌发的趋势不同，萌发率都在提高，但最终的萌发率都不高。在起初培养时，葡萄糖+NH4NO3的萌发率最高，但是所有培养基之间的显著性差异不明显，培养10天时萌发率都有所增加，葡萄糖+NH4Cl增长率最小，其它差异不大，到了第15天，葡萄糖+尿素的萌发率最高，葡萄糖+NaNO3最低，葡萄糖+NH4Cl、葡萄糖+NH4NO3无明显差异。在第20天时四种培养基的萌发率都达到了最大值葡萄糖+NaNO3为39％，葡萄糖+NH4Cl为46.67％，葡萄糖+NH4NO3为50.67％，葡萄糖+Urea为57.33％，并且除了葡萄糖+尿素，其余都低于对照，对照组为：55.67％。由图1也可看出，葡萄糖+NaNO3和葡萄糖+NH4NO3在培养第10天时孢子萌发率逐步趋于缓慢，葡萄糖+NH4Cl在第15天趋于平缓，它们都属于先快后慢型，而葡萄糖+Urea在培养期间逐步增长。
(2)图2为不同氮源和葡萄糖对G.intraradices菌丝生长的影响示意图，
如图2所示，不同的培养时期，菌丝的长度有所增加，但各培养基中菌丝的生长情况不同。培养5-10天时，四种培养基中的菌丝都有增长，都超过了对照，葡萄糖+NH4Cl的增长速率最快，长度达到7mm/spore,另外三种培养基的菌丝长度无显著差异，在培养15天时，葡萄糖+Urea中的菌丝长度与葡萄糖+NH4Cl差异性不大，但和葡萄糖+NaNO3、葡萄糖+NH4NO3相比出现明显差异，到了第20天时，葡萄糖+NH4NO3和其它三种相比菌丝长度最长达到9.33mm/spore，葡萄糖+NaNO3、葡萄糖+NH4Cl、葡萄糖+尿素分别为6.57mm/spore、7.1mm/spore、7.4mm/spore,此时对照组为：6.67mm/spore。由图还可看出葡萄糖+NH4Cl的菌丝的生长趋势先快后慢，而葡萄糖+NaNO3、葡萄糖+NH4NO3、葡萄糖+尿素菌丝的生长趋势先慢后快。(3)图3为不同氮源和根分泌液对G.intraradices孢子萌发率的影响示意图，
如图3所示，不同氮源与根分泌液的培养基当中，较之不同氮源与葡萄糖的培养基当中，孢子的萌发率有很明显的提高，孢子的萌发率都随时间的增长而升高，在培养初期，四种培养基中，根分泌液+尿素的萌发率最低并且低于对照，其余三种差异性不大，在培养10天时，四种培养基中根分泌液+NaNO3低于对照组，其它三种之间出现较明显的差异，在培养后期，根分泌液+NaNO3、根分泌液+NH4Cl、根分泌液+NH4NO3三者之间并没有多大差异，萌发率分别为61％、65.7％、67％，此时对照组为72.7％，只有根分泌液+Urea的萌发率一直增长，并且达到最大值80.33％。
(4)图4为不同氮源和根分泌液对AM真菌菌丝生长的影响示意图，
在不同氮源加根分泌液中，菌丝长度增长及其显著，在培养初期四种培养基的菌丝长度并无明显差异，并且都低于对照，培养10天时，菌丝生长迅速，全部超过对照组，根分泌液+NH4NO3的菌丝长度最长，其它三种差异不大，第15天，各培养基中的菌丝长度延续第10天的状态，到了第20天根分泌液+NH4NO3的菌丝长度达到最长为15.15mm/spore，根分泌液+NH4Cl、根分泌液+尿素它们的菌丝长度分别为13.48cm/spore、14.57mm/spore并且这三种都大于对照，而根分泌液+NaNO3低于对照为10.33mm/spore,在整个菌丝生长期间，对照组和四种培养基中的菌丝生长趋势都是先快后慢型。
本发明，以葡萄糖、根分泌液以及不同氮源为基本营养物质，发现了不同氮源与葡萄糖、根分泌液相互作用，不同的培养基配比对丛枝菌根真菌的萌发影响不同，最优的培养基配比中，孢子的萌发率高，萌发趋势强，菌丝生长快速，更有利于孢子快速侵染植物根系，保证较高的侵染率和高效的发挥AM真菌自身的优势及功能。此方法操作简单，成本低廉，周期短，可为进一步有效利用丛枝菌根真菌提供便利条件。利用外界有机或无机营养元素，葡萄糖、根分泌液，无机氮源等，在特定的浓度下促进丛枝菌根真菌快速的萌发并生长出菌丝，为后期进行离体双重培养，或与活体植物共生，缩短共生体建立所需时间，提高使用效率，也为丛枝菌根在农业上作为生物肥料的高效发挥提供新方法。
Claims (5)
1.一种促进丛枝菌根真菌孢子萌发及菌丝衍生方法，其特征在于按照以下步骤进行：
步骤1：丛枝菌根真菌孢子的筛选，称取含丛枝菌根真菌的沙子菌剂倒入杯中加水搅拌、用400目孔径的双层筛网筛洗，直到搪瓷杯中水清澈为止，随后自来水不断清洗筛网，收集下层400目筛网的孢子，筛出物放入培养皿中，用移液枪吸取孢子于干净的锥形瓶中备用；
步骤2：丛枝菌根真菌孢子的消毒，将上一步锥形瓶中收集的孢子倒入无菌的纱网中，用无菌水在超净台上先冲数遍，然后放于漏斗中，倒入配好消毒液冲洗1-2遍，用无菌皮塞塞住漏斗的低部，继续添加消毒液，震荡之后，去掉皮塞，用无菌水冲洗；
步骤3：将消过毒的孢子在显微镜下用无菌的枪头吸取转移到置于培养皿中的培养基上，每个培养皿接种50个孢子，置暗箱中培养，26℃条件下，培养20d完成培养过程。
2.按照权利要求1所述一种促进丛枝菌根真菌孢子萌发及菌丝衍生方法，其特征在于：所述步骤1中丛枝菌根真菌为根内球囊霉菌。
3.按照权利要求1所述一种促进丛枝菌根真菌孢子萌发及菌丝衍生方法，其特征在于：所述步骤2中的消毒液是：氯胺T+200mg/L链霉素+100mg/L庆大霉素消毒液+1％滴Tween20处理15min，所述的孢子的消毒液，均采用无菌过滤膜加注，存储应4℃冷藏。
4.按照权利要求1所述一种促进丛枝菌根真菌孢子萌发及菌丝衍生方法，其特征在于：所述步骤3中所述培养基为：NaNO3、NH4Cl、NH4NO3、Urea分别按4mmol/L分别加入到葡萄糖、根分泌液或琼脂中。
5.按照权利要求1所述一种促进丛枝菌根真菌孢子萌发及菌丝衍生方法，其特征在于：所述培养基为葡萄糖5g/L和尿素2mmol/L组成，以及50ml/L根分泌液和尿素2mmol/L组成对孢子萌发率最好；或所述培养基为葡萄糖5g/L和NH4NO34mmol/L组成，以及50ml/L根分泌液和NH4NO34mmol/L组成对菌丝长度最好。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140813 |