CN103974976A

CN103974976A - 用于治疗炎性病症的il17c拮抗剂

Info

Publication number: CN103974976A
Application number: CN201280051378.3A
Authority: CN
Inventors: 安德里亚斯·布尔特曼; 罗伯特·米尔鲍尔; 特里萨·加西亚; 雷金纳德·克里斯多夫·泽维尔·布莱斯; 卢克·尼尔斯; 卡杰·康拉斯
Original assignee: Galapagos NV; Morphosys AG
Current assignee: Galapagos NV; Morphosys AG
Priority date: 2011-10-19
Filing date: 2012-10-19
Publication date: 2014-08-06
Also published as: EP3360897A1; ES2669984T3; HUE037087T2; LT2768859T; MX360710B; RS57209B1; CA2852145A1; PL2768859T3; SG11201401202YA; PT2768859T; AU2012324895B2; SI2768859T1; DK2768859T3; EP2768859B1; TR201807056T4; EP2768859A1; WO2013057241A1; HRP20180776T1; CA2852145C; AU2012324895A1

Abstract

本发明提供了用于在治疗炎性病症中使用的IL17C拮抗剂。

Description

用于治疗炎性病症的IL17C拮抗剂

相关申请的交叉引用

本申请要求于2011年10月19日提交的美国临时专利申请号61/548,744的权益，其全文通过引用结合在此。

发明领域

本申请涉及用于对如关节炎等炎性病症进行治疗的IL17C拮抗剂。示例性的IL17C拮抗剂是IL17C特异性抗体或其片段，如人抗IL17C抗体。

背景

IL17C是IL17蛋白质家族的一种分泌型二硫键连接的同型二聚体。已经显示，IL17C在体内刺激单核细胞系THP-1释放TNF-α和IL-1β（Li等人（2000）《美国科学院院刊》（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）97，773-8）。IL17C可诱导炎性细胞因子，如IL-1β、IL-6和IL-23在腹腔渗出细胞（PECS）和3T3细胞系中的mRNA表达（Yamaguchi等人（2007）《免疫学杂志》（J.Immunol）179，7128-36。在体内，IL17C转导的CD4+T细胞可加重小鼠的胶原诱导性关节炎（CIA），并且IL17C转导的骨髓细胞重建的小鼠可遭受严重的胶原诱导性关节炎。据报告，IL17C可与IL-17受体E（IL17RE/Fc）结合，并且似乎可激活NF-κB（Calhoun（2007）本科毕业论文：概念分子的证明的产生：中和IL17C的单克隆抗体；美国俄勒冈州立大学，大学荣誉学院；Gaffen（2009）《免疫学自然评论》（NatRev Immunol）9，556-67），并且还有报告在IL17C缺陷型小鼠中可影响核IkappaB家族成员——IkBζ对Th17细胞的激活。（Chang等人（2011）《免疫学杂志》（Immunity）35，1-11）。IL17C在正常组织中的表达似乎受到成人和胎儿肾脏地限制。IL17C在CIA小鼠的关节爪中的mRNA表达大大上升的。Hwang等人对类风湿关节炎患者的滑液和周围血液的单核细胞中的IL17C表达进行了描述（Hwang和Kim（2005）《分子与细胞》（Mol Cells）19，180-184）。

WO99/060127对IL17C的克隆进行了说明（PRO1122）。WO99/060127将某些病症与IL17C松散地相关联，这些病症包括关节炎（例如骨关节炎、类风湿关节炎、银屑病关节炎）、脓毒病、溃疡性结肠炎、银屑病、多发性硬化症、I型糖尿病、巨细胞动脉炎、系统性红斑性狼疮和修格兰氏综合征。在此考虑，WO99/060127的化合物可被用于治疗多种病情，包括以在此明确的疾病相关基因的过量表达和/或激活为特征的病情。然而，对IL17C的推测的功能还没有实验证明。对于WO2005/065711，也是如此。

本发明首次说明了，在体内实验中，IL17C拮抗剂在炎性病症的治疗中非常有效。

发明内容

本发明提供了用于治疗炎性病症的IL17C拮抗剂。

用本发明的拮抗剂进行治疗的炎性病症可以是任何选自于下述疾病的炎性病症，即：关节炎（如类风湿关节炎）、哮喘、脓毒病、自身免疫性疾病（如炎症性肠病）、COPD（慢性阻塞性肺病）、系统性红斑性狼疮（SLE）和结节病。在具体实施例中，所述炎性病症是关节炎。

本发明的IL17C拮抗剂可以是任何拮抗剂。优选的是，所述拮抗剂是一种抗体或抗体片段，如单克隆抗体。所述抗体可以是一种IL17C特异性抗体或其片段或一种IL17C受体特异性抗体或其片段。

图例

图1A显示了一种受体相互作用分析的测定设定。在Multi-384孔板上包被IL17受体的ECD融合蛋白。加入生物素酰化的小鼠IL17C，并通过链亲和素进行检测。

图1B显示了如图1A所示的受体相互作用测定的结果。清楚地看到，IL17C是结合到小鼠IL17RE/Fc上的，但是不结合到小鼠IL-17RB或另一种不相关的受体上。

图1C显示了如图1A所示的受体相互作用测定的结果。三种现有技术抗体均不能抑制小鼠IL17C与小鼠IL17RE/Fc的结合。

图2显示了基于尺寸排阻色谱法（SEC）的质量控制结果。

图3显示了ELISA中的EC₅₀的确定结果。以100nM作为起始浓度，将所有纯化的嵌合的人-小鼠嵌合IgG2a抗体滴定到小鼠IL17C上。

图4显示了抗IL17C抗体的单价亲和力。通过溶液平衡滴定法（SET），使用Fab片段对亲和力进行确定。

图5显示了在实例11中所描述的IL-17受体E抑制试验中所确定的IC₅₀值。

图6显示了小鼠血清稳定性测定的结果。在小鼠血清孵育24h之后，11种纯化IgG显示出具有可接受的产量并且与小鼠IL17C的特异性结合。

图7显示了MOR12743和MOR12762给药对于小鼠CIA模型的治疗方案的临床评分与载体（依那西普）以及与对照抗体（MOR03207）相比较的结果。

图8显示了MOR12743和MOR12762给药对于小鼠CIA模型的治疗方案的AUC临床评分与载体（依那西普）以及与对照抗体（MOR03207）相比较的结果。

图9显示了MOR12762给药对于小鼠CIA模型的预防方案的Larsen评分与对照抗体（MOR03207）相比较的结果。

图10显示了在急性肺中性白细胞增多症小鼠模型中，MOR12762或MOR12743给药对于炎性细胞进入BALF的募集反应与对照抗体（MOR03207）相比较的结果。

图11显示了使用qRT-PCR的IL17C表达谱的结果。与对照样品的IL17C表达水平相比较，在来源于诊断为炎性呼吸道疾病的供体的肺组织样品中检测到增加的IL17C表达水平。对每组的5个单独的供体样品进行分析。

图12显示了在咪喹莫特（IMQ）银屑病样小鼠模型中，MOR1243中和抗体对于表皮厚度的效应。

图13A显示了在单用培养基、IL-1（10ng/mL）、TNF（10ng/mL）、IL-17A（250ng/mL）或这些引发剂的组合进行处理2h、6h、24h或48h的人表皮角化细胞中的IL17C mRNA表达的定量RT-PCR分析的结果。

图13B显示了单用培养基或多种TLR配体：TLR4配体LPS（1μg/mL）、TLR5配体鞭毛蛋白（1μg/mL）、TLR7配体保卫性喹莫（guardiquimod）（4μg/mL）、TLR7/8配体CL097（10μg/mL）与TLR9配体CpG ODN2116（10μM）进行处理2h、6h或24h的人表皮角化细胞中的IL-17C mRNA表达的定量RT-PCR分析的结果。

本发明的详细说明

本发明说明，IL17C是一种炎性病症治疗的有效靶标。在这方面，在一方面，本发明提供了在炎性病症治疗中使用IL17C拮抗剂的预防或治疗益处。

本发明提供了治疗方法，这些方法包括对需要这种治疗的受试者给予治疗有效量的IL17C拮抗剂。在此所用的“治疗有效量”或“有效量”是指引发理想的生物反应所必需的IL17C拮抗剂的用量。根据本发明，治疗有效量是治疗和/或预防炎性病症所必需的IL17C拮抗剂的用量。

术语“炎性病症（inflammatory disorder）”或“炎性疾病（inflammatorydisease）”可互换使用，并且在此所用是指任何与炎症相关联的异常。与炎症相关联的疾病的实例包括寻常痤疮、关节炎、如类风湿关节炎、哮喘、自身免疫性疾病、慢性前列腺炎、COPD（慢性阻塞性肺病）、肾小球肾炎、超敏反应、炎症性肠病、盆腔炎、再灌注损伤、结节病、移植排斥、血管炎、间质性膀胱炎和脓毒病。炎性病症可以是慢性的或者是急性的。自身免疫性疾病的实例包括强直性脊柱炎、克罗恩氏病（Crohn’sDisease）、II型糖尿病、胃炎、格-巴二氏综合征（Guillain-Barré syndrome）、特发性血小板减少性紫癜、红斑狼疮、多发性硬化症、银屑病、银屑病关节炎、下肢不宁综合征、类风湿关节炎、结节病、硬皮病、系统性红斑性狼疮和溃疡性结肠炎。

关节炎可以表现为其自身是疾病的主要形式。这是例如在骨关节炎、类风湿关节炎、脓毒性关节炎、痛风和假痛风、幼年型特发性关节炎、斯蒂尔病和强直性脊柱炎的情况下。其他形式的关节炎是继发于其他疾病的，例如埃勒斯-当洛斯综合征、结节病、过敏性紫癜、银屑病关节炎、反应性关节炎、血色素沉着症、肝炎、韦格纳氏肉芽肿病（Wegener'sgranulomatosis）（以及其他血管炎综合征）、莱姆病（Lyme disease）、家族性地中海热、伴有回归热的高免疫球蛋白血症D、TNF受体相关性周期性综合症和炎症性肠病（包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎）。

术语“肺部炎症”包括任何炎症性肺部疾病、急慢性支气管炎、慢性阻塞性肺疾病、肺纤维化、古德帕斯彻氏综合征（Goodpasture's syndrome）和其他白细胞起作用的肺部病症，包括但不限于特发性肺纤维化和任何其他自身免疫性肺部疾病。

术语“IL17C”是指一种已知为白细胞介素17C的蛋白质（在HUGO基因命名委员会（HGNC）中以ID5983进行标明，在小鼠基因组信息学（MGI）数据库中以ID2446486进行标明）。IL17C在某些较老的出版物中是指CX2或IL-21，然而，它不能与IL-21细胞因子相混淆，IL-21细胞因子是在活化CD4⁺T细胞中特异性表达的，而不在大多数其他组织中表达（Parrish-Novak等人（2000），《自然杂志》（Nature）408（6808）：57–63）。人IL-21位于4号染色体上，可在HGNC数据库中被ID6005识别。人IL17C位于16号染色体上，具有氨基酸序列（UniProt Q9P0M4）如下：

MTLLPGLLFLTWLHTCLAHHDPSLRGHPHSHGTPHCYSAEELPLGQAPPHLLARGAKWGQALPVALVSSLEAASHRGRHERPSATTQCPVLRPEEVLEADTHQRSISPWRYRVDTDEDRYPQKLAFAECLCRGCIDARTGRETAALNSVRLLQSLLVLRRRPCSRDGSGLPTPGAFAFHTEFIHVPVGCTCVLPRSV（SEQ ID No.:181）

术语“IL17RA”是指一种已知为白细胞介素17受体A的蛋白质。人IL17RA的氨基酸序列（UniProt Q96F46）如下：

MGAARSPPSAVPGPLLGLLLLLLGVLAPGGASLRLLDHRALVCSQPGLNCTVKNSTCLDDSWIHPRNLTPSSPKDLQIQLHFAHTQQGDLFPVAHIEWTLQTDASILYLEGAELSVLQLNTNERLCVRFEFLSKLRHHHRRWRFTFSHFVVDPDQEYEVTVHHLPKPIPDGDPNHQSKNFLVPDCEHARMKVTTPCMSSGSLWDPNITVETLEAHQLRVSFTLWNESTHYQILLTSFPHMENHSCFEHMHHIPAPRPEEFHQRSNVTLTLRNLKGCCRHQVQIQPFFSSCLNDCLRHSATVSCPEMPDTPEPIPDYMPLWVYWFITGISILLVGSVILLIVCMTWRLAGPGSEKYSDDTKYTDGLPAADLIPPPLKPRKVWIIYSADHPLYVDVVLKFAQFLLTACGTEVALDLLEEQAISEAGVMTWVGRQKQEMVESNSKIIVLCSRGTRAKWQALLGRGAPVRLRCDHGKPVGDLFTAAMNMILPDFKRPACFGTYVVCYFSEVSCDGDVPDLFGAAPRYPLMDRFEEVYFRIQDLEMFQPGRMHRVGELSGDNYLRSPGGRQLRAALDRFRDWQVRCPDWFECENLYSADDQDAPSLDEEVFEEPLLPPGTGIVKRAPLVREPGSQACLAIDPLVGEEGGAAVAKLEPHLQPRGQPAPQPLHTLVLAAEEGALVAAVEPGPLADGAAVRLALAGEGEACPLLGSPGAGRNSVLFLPVDPEDSPLGSSTPMASPDLLPEDVREHLEGLMLSLFEQSLSCQAQGGCSRPAMVLTDPHTPYEEEQRQSVQSDQGYISRSSPQPPEGLTEMEEEEEEEQDPGKPALPLSPEDLESLRSLQRQLLFRQLQKNSGWDTMGSESEGPSA（SEQ ID No.:182）

术语“IL17RE”是指一种已知为白细胞介素17受体E的蛋白质。人IL17RE的氨基酸序列（UniProt Q8NFR9）如下：

MGSSRLAALLLPLLLIVIDLSDSAGIGFRHLPHWNTRCPLASHTDDSFTGSSAYIPCRTWWALFSTKPWCVRVWHCSRCLCQHLLSGGSGLQRGLFHLLVQKSKKSSTFKFYRRHKMPAPAQRKLLPRRHLSEKSHHISIPSPDISHKGLRSKRTQPSDPETWESLPRLDSQRHGGPEFSFDLLPEARAIRVTISSGPEVSVRLCHQWALECEELSSPYDVQKIVSGGHTVELPYEFLLPCLCIEASYLQEDTVRRKKCPFQSWPEAYGSDFWKSVHFTDYSQHTQMVMALTLRCPLKLEAALCQRHDWHTLCKDLPNATARESDGWYVLEKVDLHPQLCFKFSFGNSSHVECPHQTGSLTSWNVSMDTQAQQLILHFSSRMHATFSAAWSLPGLGQDTLVPPVYTVSQARGSSPVSLDLIIPFLRPGCCVLVWRSDVQFAWKHLLCPDVSYRHLGLLILALLALLTLLGVVLALTCRRPQSGPGPARPVLLLHAADSEAQRRLVGALAELLRAALGGGRDVIVDLWEGRHVARVGPLPWLWAARTRVAREQGTVLLLWSGADLRPVSGPDPRAAPLLALLHAAPRPLLLLAYFSRLCAKGDIPPPLRALPRYRLLRDLPRLLRALDARPFAEATSWGRLGARQRRQSRLELCSRLEREAARLADLG（SEQ ID No.:183）

在此所用的“IL17C拮抗剂（antagonist of IL17C）”和“IL17C拮抗剂（IL17C antagonist）”是指广义上的IL17C拮抗剂。包括任何抑制IL17C的活性或功能的分子或以任何其他方式对IL17C产生效应的分子。术语IL17C拮抗剂包括但不限于与IL17C特异性结合的抗体或抗体片段、IL17C特异性抑制性核酸或IL17C特异性有机小分子。在术语IL17C拮抗剂的意义范围内还包括与IL17C受体特异性结合的抗体或抗体片段、IL17C受体特异性抑制性核酸或IL17C受体特异性有机小分子。术语IL17C拮抗剂还指非抗体骨架分子，如纤维连接蛋白骨架、锚蛋白、maxybodies/avimers、A蛋白源分子、anticalins、人泛素（affilins）、蛋白表位模拟物（PEMs）等等。

抑制性核酸包括但不限于反义DNA、三链形成寡核苷酸、外部指导序列、siRNA和microRNA。有用的抑制性核酸包括与对照相比可减少编码IL17C的RNA的表达至少20、30、40、50、60、70、80、90或95%的那些。抑制性核酸及其生成方法是本领域众所周知的。siRNA设计软件可供使用。

通过天然产物筛选或化学品文库筛选，可鉴定IL17C或IL17C受体特异性有机小分子（SMOLs）。典型地，SMOL的分子量低于500道尔顿，更典型地是从160到480道尔顿。SMOL的其他典型特性包括下述的一种或多种：

●分配系数log P的范围是从-0.4到+5.6

●摩尔折射率是从40到130

●原子数是从20到70

其评论见Ghose等人（1999）《组合化学杂志》（J Combin Chem）：1，55-68以及Lipinski等人（1997）《先进药物递送评论》（Adv.Drug Del.Rev.）：23，3-25。

优选的是，用于本发明的IL17C拮抗剂是一种IL17C特异性抗体或IL17C受体特异性抗体。这种抗体可以是任何类型的，如鼠类、大鼠、嵌合体、人源化或人源抗体。“人源”抗体或功能性人源抗体片段在此定义是一种非嵌合体的（例如不是“人源化的”）抗体，并且不是来自于（全部或部分地）一种非人物种。人源抗体或功能性抗体片段可来源于人类，可者可以是一种合成人源抗体。“合成人源抗体”在此定义为，是一种具有经由电脑模拟地全部或部分地来源于基于已知的人源抗体序列分析的合成序列的抗体。可通过对人源抗体或抗体片段序列数据库进行分析并且利用从其得到的数据对多肽序列进行设计，而达到人源抗体序列或其片段的电脑模拟设计。人源抗体或功能性抗体片段的另一个实例是由人类起源的抗体序列文库中分离出来的一种核酸所编码的抗体或抗体片段（即这种文库基于从人类天然来源中采离的抗体）。

“人源化抗体”或功能性人源化抗体片段在此定义为，是一种（i）来源于一种非人类来源（例如带有异源性免疫系统的转基因小鼠）的抗体，这种抗体是基于人类种系序列的；或（ii）嵌合的抗体，其中可变域来源于一种非人类来源，并且恒定域来源于一种人类来源，或（iii）CDR-移植抗体，其中可变域的CDR来源于非人类来源，而可变域的一个或多个构架是人类来源的，恒定域（如果有）是人类来源的。

术语“嵌合的抗体”或功能性嵌合的抗体片段在此定义为，是一种具有恒定抗体区域和可变抗体区域的抗体分子，该恒定抗体区域是来源于或对应于在一种物种中发现的序列，该可变抗体区域来源于另一种物种。优选的是，恒定抗体区域是来源于或对应于在人类中，例如在人类种系或体细胞中，发现的序列，可变抗体区域（例如VH、VL、CDR或FR区域）来源于在非人类动物中，例如在小鼠、大鼠、兔或仓鼠中，发现的序列。

一方面，可通过一个完整抗体的“片段”来进行抗原结合。在抗体的术语“抗体片段”中包括的结合片段的实例包括：Fab片段，是一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，是一种包含由二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；由VH结构域组成的单域抗体（dAb）片段（Ward等人,（1989）《自然杂志》（Nature）341：544-546）；以及分离的互补性决定区（CDR）。

“单链片段（scFv）”是一种蛋白质单链，其中VL和VH区域配对形成了单价分子（已知为单链Fv（scFv）；参见，例如Bird等人，（1988）《科学杂志》（Science）242：423-426；以及Huston等人，（1988）《美国科学院院刊》（Proc.Natl.Acad.Sci.）85：5879-5883）。尽管VL和VH这两个结构域是用单独的基因进行编码的，它们可以用重组方法或用人工肽连接子进行连接，使它们可以一个蛋白质单链来制成。这类单链抗体包括一种或多种抗原结合部分。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常规方法获得，并且对这些片段采用与完整抗体相同的方式进行有用性筛。

术语“分离的”是指一种可以是如抗体或抗体片段化合物，基本上不含其他的具有不同的抗原特异性的抗体或抗体片段。此外，分离的抗体或抗体片段可以是基本上不含其他细胞材料和/或化学品的。

如在此使用的术语“单克隆抗体”是指具有单一分子构成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物展示了一个对于特定表位的具有独特的结合特异性和亲和力的独特的结合位点。

如在此所用的，一种“特异性结合到（binds specifically to）”、“特异性结合到（specifically binds to）”的抗体，是对于一种抗原“具有特异性”或对其“特异性识别”（在这里是IL17C，或者是IL17C受体），如果这种抗体能够区别这种抗原与一种或多种参考抗原，因为结合特异性不是一种绝对的，而是一种相对的特性。这类参考抗原可能是一种或多种密切相关的抗原，其可用作参考点，例如IL17A或IL17B。在其最常用的形式中（并且当未提及定义的参考），“特异性结合”是指该抗体可区别感兴趣的抗原与无关抗原的能力，如所确定的，例如，根据下述方法中的一种。这类方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-检验和肽扫描方法。例如，可以进行标准ELISA检验。通过标准显色可进行评分（例如带有辣根过氧化物酶的第二抗体，以及带有过氧化氢的四甲基联苯胺）。通过光密度，例如在450nm，对某些孔内的反应进行评分。典型背景（=阴性反应）可以是0.1OD；典型的阳性反应可以是1OD。意思是阳性/阴性差可以超过10倍。典型地，可以使用一组大约三到五种非相关抗原，如奶粉、BSA、转铁蛋白等等，而不是一种单一的参考抗原，来确定结合特异性。另外地，“特异性结合”可以涉及抗体对其靶抗原的不同部分（例如IL17C或IL17C受体的不同的结构域或区域）之间进行区别的能力，或抗体对IL17C或IL17C受体的一种或多种关键氨基酸残基或氨基酸残基的延伸片段之间进行区别的能力。

“交叉竞争”的意思是在标准竞争结合测定中，一种抗体、抗体片段或其他抗原-结合部分对干扰其他抗体、抗体片段或抗原-结合部分与特异性抗原的结合的能力。可采用标准竞争结合测定来确定一种抗体、抗体片段或其他抗原-结合部分能够干扰另一种抗体、抗体片段或其他抗原-结合部分与特异性抗原的结合并由此根据本发明进行交叉竞争的能力或程度。一种合适的测定包括应用Biacore技术（例如通过使用BIAcore3000仪器（Biacore，乌普萨拉，瑞典）），该技术可采用表面等离振子共振技术对相互作用的程度进行测量。另一种用于对交叉竞争进行测量的测定是使用基于ELISA的方法。在国际专利申请号WO2003/48731中描述了一种用于“表位结合”抗体的基于其交叉竞争的高通量方法。如果接受研究的抗体或抗体片段可将如表1中所述的抗体之一与IL17C的结合减少60%或以上，具体地说是减少70%或以上，更具体地说是减少80%或以上，并且如果如表1中所述的抗体之一将所述抗体或抗体片段与IL17C的结合减少60%或以上，具体地说是减少70%或以上，更具体地说是减少80%或以上，则存在交叉竞争。

术语“表位”包括任何可被免疫球蛋白或T-细胞受体特异性识别的或以另外的方式与一种分子相互作用的蛋白质的区域。通常，表位是如氨基酸或碳水化合物或糖侧链等的分子的化学活性表面组群，并且通常可具有特异性的三维结构特征以及特异性电荷特征。本领域的普通技术人员会赞同，事实上抗体可特异性结合的几乎任何东西都是表位。表位可包括与抗体结合的残基，并且可以是“线性的”或“构象的”。术语“线性表位”指的是在表位中，蛋白与相互作用分子（如抗体）之间的所有相互作用点是沿着该蛋白的初级氨基酸序列而线性发生的（连续的）。术语“构象表位”是指在表位中，不连续的氨基酸在三维构象中聚在一起。在构象表位中，相互作用点发生在蛋白上的彼此分离的氨基酸残基上。

“将相同的表位结合作为”意思是抗体、抗体片段或其他抗原-结合部位与特异性抗原相结合并将相同的表位作为示例抗体的能力。可使用表位作图技术对示例抗体及其他抗体的表位进行确定。表位作图技术是在本领域中所熟知的。例如，通过确定氨基酸的空间构象易于鉴定构象表位，例如通过如氢-氘交换、x射线的结晶以及二维核磁共振。

还有，如在此所用的，“免疫球蛋白”（Ig）在此是定义为一种属于IgG、IgM、IgE、IgA或IgD（或其任何亚类）类的蛋白质，并且包括所有常规的已知的抗体及其功能片段。抗体/免疫球蛋白的“功能片段”由此被定义为是一种保留了抗原结合区的抗体/免疫球蛋白的片段（例如一种IgG的可变区）。典型地，可在抗体的一种或多种高变区中，即在CDR-1、CDR-2和/或–CDR-3区中，发现抗体的“抗原结合区”；然而，可变“构架”区也在抗原结合中起到了重要的作用，如通过为CDR提供骨架。优选的是，“抗原结合区”包括可变轻链（VL）的至少氨基酸残基4至103和可变重链（VH）的5至109，更优选的是VL的3至107和VH的4至111，特别优选的是完全VL和VH链（VL的氨基酸位置1至109和VH的1至113；根据WO97/08320确定其数目）。在本发明中所用的优选的免疫球蛋白类是IgG。本发明的“功能片段”包括F(ab')2片段、Fab片段、scFv或包含单一免疫球蛋白可变结构域或单一结构域抗体多肽的构建体的结构域，例如单一重链可变结构域或单一轻链可变结构域。F(ab')2或Fab可被工程化而使在CH1与CL结构域之间发生的分子间二硫化物的相互作用可被最小化或完全除去。

本发明的抗体可来源于基于被电脑模拟设计的并且由合成生成的核酸所编码的氨基酸序列的重组抗体文库。例如通过对人源序列数据库进行分析并且利用从其得到的数据对多肽序列进行设计，可得到抗体序列的电脑模拟设计。对设计并得到电脑模拟生成的序列的方法进行了描述，例如，Knappik等人，《分子生物学杂志》（J.Mol.Biol.）（2000）296：57；Krebs等人，《免疫学方法杂志》（J.Immunol.Methods）（2001）254：67，Rothe等人，《分子生物学杂志》（J.Mol.Biol.）（2008）376：1182；以及由Knappik等人等人发布的美国专利号6,300,064，将其通过引用以其全文结合在此。

本发明可使用任何IL17C特异性抗体。示例性的抗体包括本领域中的抗体，如

A：大鼠IgG_2A单克隆抗小鼠IL17C抗体（安迪生物科技公司（R&DSystems）；克隆311522，#MAB23061），

B：大鼠IgG_2A单克隆抗小鼠IL17C抗体（安迪生物科技公司（R&DSystems）；克隆311523，#MAB2306），以及

C：大鼠抗小鼠IL17C（美国US Biological公司；克隆：8B28，#I8439-20R3）（实例4接受）。

其他可用于实践本发明的抗体包括Abnova供应的抗IL17C抗体（Walnut，CA，USA；目录#H00027189-B01P、#H00027189-D01和#H00027189-D01P）以及antibodies-online GmbH供应的抗IL17C抗体（亚琛（Aachen），德国；目录#ABIN525892、#ABIN327411、#ABIN525893、#ABIN221340、#ABIN221341、#ABIN221342和#ABIN525891）。本发明可使用的其他IL17C特异性抗体是本发明自身所分离并描述的，即表1中所列的抗体。

本发明的组合物可用于治疗或预防应用。本发明因此包括一种药物组合物，该药物组合物包含一种本发明的抗体（或功能性抗体片段）的以及一种药理学上可接受的载体或其赋形剂。在相关的方面中，本发明提供了一种用于治疗炎性病症的方法。这种方法含有以下步骤：给予需要的受试者一种有效量的含有在此所述的或设计的本发明的抗体的药物组合物。

在某些方面中，本发明提供了用于治疗受试者的炎性病症的方法，所述方法包括以下步骤：对所述受试者给予一种IL17C拮抗剂。“受试者”，如在此上下文中所用的，是指任何哺乳动物，包括啮齿类，如小鼠或大鼠，以及灵长类，如食蟹猴（Macaca fascicularis），罗猴（Macaca mulatta）或人类（Homo sapiens）。优选地受试者是一种灵长类，最优选的是人类。

在某些方面中，本发明提供了用于治疗炎性病症的方法，所述方法包括以下步骤：向受试者给予一种IL17C拮抗剂，其中所述IL17C拮抗剂可与IL17C相结合，其亲和力是大约小于100nM，更优选的是小于大约60nM，并且仍更优选的是小于大约30nM。更优选的是可与IL17C相结合的抗体或抗体片段，其亲和力小于大约10nM，并且更优选的是小于大约3nM。

在某些方面中，所述的IL17C拮抗剂是一种IL17C特异性抗体或抗体片段，并且所述抗体或抗体片段与另一物种的IL17C（如从小鼠、大鼠、罗猴和/或食蟹猴的IL17C）可交叉反应。在某些方面中，所述IL17C抗体或抗体片段是一种IL17C特异性分离抗体或抗体片段。在另一个实施例中，所述的IL17C特异性分离抗体或抗体片段是一种单克隆抗体或抗体片段。在一个另外的实施例中，所述的分离单克隆抗体或抗体片段是一种对包含SEQ ID No.:181的氨基酸序列的多肽具有特异性的分离单克隆抗体。在一个另外的实施例中，所述的分离单克隆抗体或抗体片段是一种对由SEQ ID No.:181的氨基酸序列组成的多肽具有特异性的分离单克隆抗体。在一个另外的实施例中，所述的分离单克隆抗体或抗体片段与另一物种的IL17C（小鼠、大鼠、罗猴和/或食蟹猴的IL17C）可交叉反应。

在某些方面中，所述的IL17C特异性抗体或抗体片段是人源、人源化或嵌合的抗体。在某些方面中，所述的IL17C特异性抗体或抗体片段是一种人源合成抗体。在某些方面中，本发明提供了一种对于包含SEQ IDNo.:181的氨基酸序列的多肽具有特异性的分离单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段是人源的、人源化的或嵌合的抗体。在某些方面中，本发明提供了一种对于由SEQ ID No.:181的氨基酸序列所组成的多肽具有特异性的分离单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段是人源的、人源化的或嵌合的抗体。在某些方面中，所述的对由SEQ ID No.:181的氨基酸序列所组成的多肽具有特异性的抗体或抗体片段是一种人源合成抗体或抗体片段。

在一个特定的方面中，本发明提供了一种组合物，该组合物包括一种能够拮抗炎性病症中的IL17C的IL17C拮抗剂，所述组合物进一步包括一种或多种药理学上可接受的载体和/或稀释剂。在某些方面中，IL17C拮抗剂，如IL17C特异性抗体，可拮抗任何IL17C在炎性病症中的作用。

在另一个方面中，本发明提供了一种用于对受试者的炎性病症进行预防的方法，所述包括对所述受试者给予一种IL17C拮抗剂。在此上下文中所用的“预防”是指以预防疾病的发生或延缓疾病的发生为目的的方法。

在某些方面中，本发明提供了一种包括有用于对炎性病症的治疗的IL17C拮抗剂的组合物，所述组合物进一步包括一种或多种药理学上可接受的载体和/或稀释剂。

在某些方面中，本发明提供了用于治疗炎性病症的IL17C拮抗剂。

在其他方面中，本发明提供了IL17C拮抗剂在制备用于治疗炎性病症的药物中的应用。

在其他方面中，本发明提供了一种用于治疗受试者的炎性病症的方法，该方法包括向受试者给予一种IL17C拮抗剂。

在特定的方面中，本发明的IL17C拮抗剂可皮下给药。在其他方面中，本发明的IL17C拮抗剂可静脉内给药、动脉内给药或椎管内给药。

本发明的组合物优选的是包括一种IL17C拮抗剂以及一种药理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的用于治疗炎性病症的药物组合物。这类载体、稀释剂和赋形剂是本领域所熟知的，并且熟练的业内人士会发现采用本发明的IL17C拮抗剂对受试者的最适合的制剂及给药途径。

在某些方面中，本发明提供了一种用于治疗或预防受试者的炎性病症的方法，该方法包括以下步骤：对受试者给予一种有效量的IL17C拮抗剂。在某些方面中，所述受试者是人类。在另外替代的方面中，所述受试者是啮齿类，如大鼠或小鼠。

在某些方面中，所述IL17C拮抗剂是一种IL17C特异性抗体或抗体片段。在某些方面中，所述拮抗剂是一种对于包含SEQ ID No.:181的氨基酸序列的多肽具有特异性的抗体或抗体片段。在另外替代的方面中，所述IL17C拮抗剂是一种IL17C受体特异性的抗体或抗体片段。

在某些方面中，所述的IL17C特异性抗体或抗体片段可阻断IL17C与IL17C受体的结合。在另外替代的方面中，所述的IL17C受体特异性抗体或抗体片段阻断了IL17C与IL17C受体的结合。

在某些方面中，所述的IL17C特异性抗体或抗体片段阻断了IL17C与IL17受体的结合，其中所述受体是IL17RE。在另外替代的方面中，所述的IL17C受体特异性抗体或抗体片段阻断了IL17C与IL17RE的结合。

在某些方面中，所述的IL17C特异性抗体或抗体片段阻断了IL17C与IL17RE的结合，其IC₅₀浓度小于100nM、90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、100pM、90pM、80pM、70pM、60pM、50pM、40pM、30pM、20pM、10pM、9pM、8pM、7pM、6pM、5pM、4pM、3pM、2pM或1pM。在某些方面中，可通过ELISA、SET、FACS或MSD（Meso Scale Discovery）对IC₅₀浓度进行确定。

在某些方面中，所述的IL17C特异性抗体或抗体片段阻断了IL17C与一种或多种IL17C受体的结合。在另外替代的方面中，所述的IL17C受体特异性抗体或抗体片段阻断了IL17C与IL17C受体的结合，其中IL17受体包括IL17RE和IL17RA。在另外替代的方面中，所述的IL17C受体特异性抗体或抗体片段阻断了IL17C与IL17RE和IL17RA的结合。

在某些方面中，本发明提供了一种用于对炎性病症进行治疗或预防的IL17C拮抗剂。在某些方面中，所述治疗或预防包括以下步骤：对受试者给予一种有效量的IL17C拮抗剂。在某些方面中，所述受试者是人类。在另外替代的方面中，所述受试者是啮齿类，如大鼠或小鼠。

在另一个方面中，本披露是关于与表1中所述的抗体交叉竞争的分离单克隆抗体或其片段。在某个实施例中，本披露是关于一种分离单克隆抗体或其片段，该分离单克隆抗体或其片段与一种抗体交叉竞争，该抗体包含如表1中所述的抗体中之一的6个CDR。在某个实施例中，本披露是关于一种分离单克隆抗体或其片段，该分离单克隆抗体或其片段与在表1中所述的一种抗体交叉竞争，并且在基于ELISA的交叉竞争中可将表1所述的抗体之一的特异性结合减少至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。在某个实施例中，本披露是关于一种分离单克隆抗体或其片段，该分离单克隆抗体或其片段与一种在表1中所述的抗体交叉竞争，并在基于ELISA的交叉竞争中将表1所述的抗体之一与IL17C的特异性结合减少至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。

在另一个方面中，本披露是关于一种分离单克隆抗体或其片段，该分离单克隆抗体或其片段与表1中所述的抗体相同的表位有相互作用（例如通过结合、稳定化、空间分布）。

在一个方面中，本披露是关于一种分离单克隆抗体或其片段，该分离单克隆抗体或其片段包含由表1中的任何抗体的卡巴特（Kabat）所定义的6个CDR。在另一个方面中，本披露是关于一种分离单克隆抗体或其片段，该分离单克隆抗体或其片段包含由表1中的各抗体的卡巴特所定义的6个CDR。

在一个方面中，本披露是关于一种分离单克隆抗体或其片段，该分离单克隆抗体或其片段包含表1中所述的任何抗体的VH和VL。

在另一个方面中，本披露是关于一种核酸，该核酸编码一种分离单克隆抗体或其片段，其中该核酸包含表1中所述的任何抗体的VH和VL。

在另一个方面中，本披露是关于一种核酸，该核酸编码一种分离单克隆抗体或其片段，该分离单克隆抗体或其片段与表1中所述的核酸具有至少75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%的序列一致性。

本领域的普通技术人员将赞同，在此描述的本发明易受不同于具体所述的变化和修改的那些变化和修改的影响。应理解的是，本发明包括所有这类变化和修改。本发明还包括在本说明书中参考的或指出的所有的步骤、特征、组合物和化合物，单独地或共同地，以及任何或所有所述步骤或特征中的任何两个或多个的组合。

表1：

实例1：小鼠IL17C

小鼠IL17C购自于安迪生物科技公司（R&D Systems）（#2306-ML/CF；安迪生物科技公司（R&D Systems），明尼亚波利斯，美国）。采用ECLTM生物素酰化模制备生物素酰化的小鼠IL17C（通用电气医疗集团（GEHealthcare）；#1061918）。在生物素酰化之后，采用ZebaTM脱盐离心柱（Pierce；#89889）纯化产物。

使用动态光散射（DLS）、尺寸排阻色谱法（SEC）和SDS-PAGE，对生物素酰化的IL17C进行质量控制。如预期的，SDS-PAGE显示，在还原条件下表观分子量是大约22kDa以及在非还原条件下是大约40kDa。此外，没有检测到高分子量种类或聚集物。在SEC中确认抗原的预测大小，其中生物素酰化的小鼠IL17C可见是分子量大约43kDa的一个峰。在DLS中，没有检测到聚集物。此外，定量确认小鼠IL17C是生物素酰化的。

只有通过了质量控制的材料才能用于淘选和结合测定。

实例2：小鼠IL17受体E

将小鼠IL-17受体E的细胞外结构域（ECD）（基因编号：57890，同种型1）作为C端Fc融合蛋白来进行克隆（是指“IL17RE/Fc”）。在HKB11细胞中瞬间表达含有vκ-Leader的构建体随后是小鼠IL17C的ECD（Cho等人（2002）《生物材料科学杂志》（J.Biomed Sci.）十一-十二月刊；9（6Pt2）：631-8）。通过A蛋白亲和色谱法对产物进行纯化。在变性还原和变性非还原条件下，在SDS-PAGE中以及在自然状态下通过高压SEC和DLS对纯度进行分析。

实例3：IL17C-IL17受体E的相互作用的测定

为了对小鼠IL17与其推定受体IL17受体E的结合进行检验，设定一种相互作用测定。在图1A中对测定设定进行了说明。简言之，将IL17受体B和E包被在Multi-的384孔板标准板上（Meso ScaleDiscovery；#L21XA-4），并加入生物素酰化的小鼠IL17C。经由在MSDSector^TM成像仪6000（Meso Scale Discovery，盖瑟斯堡，MD，美国）中的链亲和素的结合，对小鼠IL17C与其受体的结合进行测定。

结果见图1B。清楚地看到，IL17C是结合到小鼠IL17RE/Fc上的，但是不结合到小鼠IL-17RB或另一种不相关的受体上。而且，无关的生物素酰化配体显示不与这三种所检验的受体中的任何一种相结合。这种相互作用测定因此是高度特异性的，并且非常适用于对IL17C-IL17受体E的相互作用的分析。

实例4：现有技术抗体对于IL17C-IL17受体E的相互作用的效应

对三种现有技术抗体，在实例3的相互作用分析中，检验其抑制小鼠IL17C与小鼠IL17RE/Fc的结合的能力。对下述抗体进行检验：

A：大鼠IgG_2A单克隆抗小鼠IL17C抗体（安迪生物科技公司（R&DSystems）；克隆311522，#MAB23061）

B：大鼠IgG_2A单克隆抗小鼠IL17C抗体（安迪生物科技公司（R&DSystems）；克隆311523，#MAB2306）

C：大鼠抗小鼠IL17C（美国US Biological公司；克隆：8B28，#I8439-20R3）

用生物素酰化的小鼠IL17C对抗体进行预孵育，并且将预形成的络合物加入到包被的小鼠IL17RE/Fc中。

结果见图1C。现有技术的抗小鼠IL17C抗体显示均对小鼠IL17C与其受体IL17RE/Fc的结合没有任何影响。

实例5：淘选策略

使用HuCAL文库来选择对于小鼠IL17C的特异性Fab片段。这个噬菌粒文库是基于由Knappik等人所披露的概念（Knappik等人（2000）《分子生物学杂志》（J.Mol.Biol.）296：57-86），并且采用技术用于显示在噬菌体表面上的Fab（Lohning等人，WO2001/05950）。

进行不同的淘选策略，包括不同的成熟策略的溶液淘选、以及常规的固相淘选。对于固相淘选，在MaxisorpTM Immuno板上直接包被小鼠IL17C（Nunc；#442404）。对固相淘选总共进行三轮淘选。进行三轮选择，各轮逐渐增加洗涤严格性并降低抗原浓度。对于溶液淘选，将生物素酰化抗原暴露于以溶液形式存在的噬菌体文库，随后在链亲和素珠上捕获噬菌体-抗原络合物。再次进行三轮选择，各轮逐渐增加洗涤严格性并降低抗原浓度。使用链亲和素偶联磁珠（英杰公司（Invitrogen），#112-05D）分离噬菌体。为了选择高亲和力性抗体，在第二轮选择生生成HCDR2和LCDR3文库（平均文库大小是～110⁸），随后进行另外两轮选择，其严格性进一步增加，抗原浓度进一步降低。

实例6：通过ELISA的淘选输出的初步表征

为了便于可溶性Fab片段在粗细菌裂解液中的快速表达，如选前所描述的方法制备周质提取物（Rauchenberger等人（2003）《生物化学杂志》（J.Biol.Chem.）278.40：38194-205）。在首次ELISA筛选中使用含有Fab的大肠杆菌（E.coli）裂解液。

通过在直接包被抗原或生物素酰化抗原上进行的ELISA筛选，对结合物的特异性进行研究。对于在直接包被抗原上进行的ELISA筛选，将Maxisorp^TM384孔板（Nunc；#460518）用2.5μg/mL小鼠IL17C的PBS溶液进行包被。在使用5%脱脂奶粉的PBS溶液对板进行封闭后，加入含有Fab的大肠杆菌（E.coli）裂解液。使用Attophos荧光底物（罗氏公司（Roche）：#11681982001），通过与碱性磷酸酯酶结合的F(ab）₂特异性山羊抗人IgG（稀释1:5000）对Fabs的结合进行检测。记录在535nm的荧光发射，在430nm激发。对于在生物素酰化抗原上进行的ELISA筛选，使用在PBS中按1:1000稀释的Fd片段特异性绵羊抗人IgG（结合位点，#PC075）对Maxisorp^TM384孔板进行包被。在用PBS中的5%脱脂奶粉进行封闭后，加入含有Fab的大肠杆菌（E.coli）裂解液。随后，被捕获的-Fab片段可与1μg/ml生物素酰化的小鼠IL17C相结合，通过和与碱性磷酸酯酶结合的链亲和素一起孵育并随后加入AttoPhos荧光底物（罗氏公司（Roche）：#11681982001）对其进行检测。记录在535nm的荧光发射，在430nm激发。对从淘选过程中分离出来的差不多9000个Fab片段在这些ELISA测定中进行检验，并且大约2900个在所有ELISA测定中是阳性的。

实例7：通过IL17C-IL17受体E的相互作用测定对结合物进行表征

为了对用于以高通量筛选方式中和活性的含有Fab的粗细菌裂解液进行检验，使用在实例3中描绘的略微改良过的测定。用30μL小鼠IL17RE/Fc在PBS中的0.6μg/mL溶液来包被Maxisorp^TM384孔MSD板（Nunc；#460518），在4℃下过夜。第二天，将20μL含有Fab的大肠杆菌（E.coli）裂解液在RT下与等体积的2nM生物素酰化小鼠IL17C一起预孵30min。在用5%的BSA的PBS溶液封闭板1h之后，加入预成抗体–配体络合物进行1h来包被IL17RE/Fc，并且使用MSD Sector^TM成像仪6000（Meso Scale Discovery，盖瑟斯堡，MD，美国）通过链亲和素-ECL来对受体结合进行检测。

为了在mIL-17RE相互作用测定中对纯化抗IL17C人-小鼠嵌合IgG2a的抑制活性进行测定，用30μL小鼠IL17RE/Fc在PBS中的75ng/mL溶液对Maxisorp^TM384孔MSD板进行包被，在4℃下过夜。第二天，将25μL的一系列抗体稀释液（浓度从0.001至100nM）与等体积的0.125nM生物素酰化小鼠IL17C一起在RT下预孵育30min。在用2.5%的BSA的PBST溶液封闭板1h之后，加入预成抗体–配体络合物进行1h来包被IL17RE/Fc，并且使用MSD Sector^TM成像仪通过链亲和素-ECL来对受体结合进行检测。

在所有的ELISA阳性结合物中，IL17C-IL17受体E的相互作用测定，随后的阳性克隆的测序，揭示了只有141种序列独特性克隆属于33种不同的HCDR3家族。随着在ELISA以及小鼠IL17RE/Fc抑制测定中的确证筛选，这个数字再次减少。为了选出具有最佳抑制活性的候选者，将BEL裂解液进行最高1:500的预稀释，用于在IL17RE/Fc抑制测定中使用。最后，属于8种不同的HCDR3家族的18种序列独特性克隆可被鉴定，它们在IL17C-IL17受体E的相互作用测定中始终并重复地是阳性。

实例8：多克隆IgG转变

通过将Fab片段多克隆克隆成为所需的IgG格式，将Fab片段转变成为IgG格式。使用人-小鼠嵌合IgG格式，可在野生小鼠概念研究的体内验证中避免针对给予的抗小鼠IL17C抗体的免疫原性反应。使用两种不同的恒定区——IgG2a和IgG1同种型。通过使用QuickChange II位点定向诱变试剂盒（Stratagene；#0200524）的位点定向诱变，除去可能的N-连接的糖基化位点。在表1中描述了在此过程中回收的所有的IgG的序列多样性。

实例9：IgG的探究性级别的生产

从如实例8中所述的过程中回收的所有IgG是在HKB11细胞中以探究性级别产生的（Cho等人（2002）《生物材料科学杂志》（J.Biomed Sci.）十一-十二月刊；9（6Pt2）：631-8），以人/小鼠嵌合IgG2a和人/小鼠嵌合IgG1同种型的格式，用于对具有两种不同的恒定区的抗体的产量和单体部分进行评定。人/小鼠嵌合IgG2a格式可产生最高量。这种格式还可成功通过SEC质量控制（>90%单体含量）。因此，选择人/小鼠嵌合IgG2a格式用于进一步的功能性检验。在SEC中确定的纯化产量和单体部分见图2。

实例10：亲和性确定

以100nM作为起始浓度，在ELISA中将所有的纯化的人-小鼠嵌合IgG2a抗体以小鼠IL17C进行滴定用于EC₅₀确定。小鼠IL17C的EC₅₀值是在1至3个独立实验中进行确定的。结果见图3。

EC₅₀值的范围是在200与1200pM之间，最高EC₅₀值是在300pM左右。用纯化IgG2a不能对4种IgG（MOR12755、MOR12756、12757和12758）的结合活性进行确定，因此可从进一步的表征中排除这些IgG。这些抗体均显示与人IL17C（序列一致性77%）、与小鼠IL-17B（序列一致性30%）或与阴性对照抗原溶菌酶无交叉反应性。

通过溶液平衡滴定法（SET），使用Fab片段对抗IL17C抗体的单价亲和力进行测定。如在文献（Friquet等人，（1985）《免疫法杂志》（J.Immunol.Meth.）77：305-19）中所述的方法，基本上完成对溶液中的亲和力的确定。为了改进SET方法的敏感性和准确性，将经典ELISA改成基于ECL的技术（Haenel等人（2005）《分析生物化学》（Anal Biochem.）339.1：182-84）。结合物是以Fab_FH格式进行表达和纯化。某些Fabs在SET中不结合或不显示S形曲线，因此只能对10个候选物的亲和力进行确定。单价亲和力的范围是在48与4100pM之间，Fabs的最大KD值是在低pM范围内（≤100pM错误！参考源未找到。）。结果见图4。

实例11：在用IgG格式的结合物中的IL17C–IL17受体E的相互作用测定

为了对人/小鼠IgG2a格式中的抗体进行更详细的表征，在如上在此所述的最多4个独立实验的IL-17受体E抑制测定中，对各候选物的IC₅₀值进行测定。

在图5中对结果进行描述。12种IgG中的11种显示了抑制活性，平均IC₅₀值的范围是在9与8442pM之间。这11种抑制性IgG中的9种的IC₅₀值甚至在低皮摩尔范围内。最佳候选物属于不同的HCDR3家族，并且具有不同的VL亚型（卡帕（kappa）或兰布达（lambda））。

实例12：在小鼠血清中的稳定性

为了分析所选的抗小鼠IL17C抗体是否适于小鼠的体内给药，对显示出可接受的产量和与小鼠IL17C的特异性结合的亚组的11种纯化IgG在小鼠血清中的稳定性进行确定（见如上所述的）。

用抗生物素蛋白的浓度1μg/ml的PBS溶液对96孔Maxisorp板（Nunc；#442404）进行包被，在4℃下过夜。第二天，在小鼠血清中孵育抗IL17嵌合IgG2a，在37℃下以最终浓度100μg/mL孵育24h。在孵育步骤之后，将抗体在LowCross缓冲液（Candor Bioscience；#100500）中按1:100进行稀释。作为参照，将相同组的抗体在LowCross缓冲液+1%小鼠血清中新鲜稀释，并且在RT下孵育30min。将抗生物素蛋白包被板与封闭缓冲液（Superblock封闭缓冲液，来自于Pierce，#37515）一起孵育，随后加入100μL的生物素-IL17C在LowCross缓冲液中的0.1μg/mL溶液来封闭这些孔。在洗涤步骤之后，加入用血清孵育并新鲜稀释的IgG的系列稀释液。使用TMB单组分HRP作为底物，通过与检测抗体结合的抗小鼠IgG2a POD（在LowCross缓冲液中按1:5000进行稀释）对IgG的结合进行检测。通过加入1M HCl来停止反应，并且在450nm处测定吸光度。

除了展现出只有中度血清稳定性的一种IgG候选物（MOR12760）以外，所有的其他抗体显示，在37℃下孵育24h之后，在小鼠血清中的非常好的稳定性（变动系数≤20%）。在图6中对结果进行描述。

实例13：用于概念研究的体内验证的结合物的选择

基于其在IL-17RE受体抑制测定中以及在基于细胞的NFkB报告基因测定中的生产性、稳定性、结合性和功能活性的良好性质，选择MOR12743和MOR12762作为用于概念研究的体内验证的候选物。

实例14：体内CIA模型

14.1材料

完全弗氏佐剂（CFA）和不完全弗氏佐剂（IFA）购自于Difco（MI，美国）。II型牛胶原蛋白（CII）、脂多糖（LPS）和依那西普分别是从MDBiosciences（德国）、Sigma（P4252，L’Isle d’Abeau，法国）与Whyett（25mg可注射注射器，法国）得到的。所使用的其他所有试剂都是试剂级的，所有的溶剂都是分析级的。

14.2动物

DBA1/J小鼠（雄性，6-7周龄，大约20克）是从Centre d’ElevageRegional Janvier（Laval，法国）得到的。小鼠保持在一个12hr的光/暗循环（0700-1900）。将温度保持在22℃，自由进食进水。

14.3胶原诱导性关节炎（CIA）

实验前一天，用0.05M乙酸制备CII溶液（2mg/mL），并储存在4℃下。刚好在免疫之前，用匀浆器在预冷玻璃瓶中在冰水浴中将等体积的佐剂（IFA）与CII进行混合。如果没有形成乳液，需要另外的佐剂并延长匀浆。在第1天，在各小鼠尾部皮内注射0.1mL的乳液，在第21天进行第二次加强皮内注射（CII溶液在CFA中的浓度是2mg/mL，0.1mL的乳液）。这种免疫方法是由已公布的方法而改良的（Brand等人，2007，胶原诱导性关节炎。《自然研究步骤期刊》（Nature Protocols）；vol2（5）：1269-1275；Lin等人，2007，体内组蛋白脱乙酰酶（HDAC）抑制剂在啮齿类动物的胶原诱导性关节炎中的抗关节炎活性。《英国药理学杂志》（BrJ Pharmacol.）四月号；150(7):829-31）。

14.4研究设计

14.4.1治疗方案

在小鼠CIA模型中对抗体的治疗效果进行检验。将小鼠随机分为数量相同的组，各组包含10只小鼠。在第1天对所有小鼠进行免疫，并且在第21天进行增强。从第31天至第46天保持治疗剂量。用载体（PBS）对阴性对照组进行治疗，并且用依那西普（10mg/kg，3每周，腹腔注射）对阳性对照组进行治疗。对感兴趣的抗体进行检验，10mg/kg，腹腔注射，每周3次。

因此，使用了五个不同的治疗组，其中各组是由十只小鼠组成的。

第1组：载体（PBS）

第2组：依那西普10mg/kg/3每周，腹腔注射

第3组：MOR0320710mg/kg/3每周，腹腔注射

第4组：MOR1274310mg/kg/3每周，腹腔注射

第5组：MOR1276210mg/kg/3每周，腹腔注射

给予抗IL17C抗体，腹腔注射，一周三次，10mg/kg。在第31天和第46天取血样（大约250μL）进行药物代谢动力学分析。

14.4.2预防方案

在小鼠CIA模型中对抗体的预防效果进行检验。将小鼠随机分为相等的各包括20只小鼠的两组。在第1天对所有小鼠进行免疫，并且在第21天进行增强。从第21天至第46天保持预防剂量。用阴性抗体（MOR03207，10mg/kg，3每周，腹腔注射）对阴性对照组进行治疗。对感兴趣的抗体（MOR12762）进行检验，10mg/kg，3每周，腹腔注射。

因此，使用了两个不同的治疗组，其中各组是由二十只小鼠组成的。

第1组：MOR0320710mg/kg/3每周，腹腔注射

第2组：MOR1276210mg/kg/3每周，腹腔注射

给予抗IL17C抗体，腹腔注射，一周三次，10mg/kg。在第21天、第36天和第46天取血样（大约250μL）进行药物代谢动力学分析。

14.5关节炎的临床评价

根据Khachigian2006（胶原诱发性关节炎。（2006）《自然研究步骤期刊》（Nature Protocols）1，2512-6），Lin等人，2007（supra）；Nishida等人，2004（组蛋白脱乙酰酶抑制剂在小鼠中通过对p16INK4a和p21（WAF1/Cip1）表达的调控对于自身抗体介导性关节炎的抑制。《关节炎与风湿病》（Arthritis Rheum.）10：3365-76）；以及Brand等人，2007（增刊））中的方法对关节炎进行评分。采用关节评分对四只爪子中的每只爪子的肿胀进行评级，如下：0-无症状；1-一种类型的关节（如踝关节或腰关节）中的轻度但明确的红肿，或明显的红肿局限在单个趾，与受到影响的趾的数量无关；2-在两种或更多种类型的关节中的中度红肿；3-包括各趾的整个爪的严重红肿；4-最大程度的肢体炎症，累及多个关节（最大程度的累积临床关节炎评分，每只动物16分）（Nishida等人，2004（增刊））。

如果需要，允许进行多个治疗研究的荟萃分析，临床评分值规范化，如下：

AUC临床评分（AUC评分）：

对各动物计算从31（21）天至第46天的曲线下面积（AUC）。将各动物的AUC除以平均AUC，该平均AUC是在研究中从载体得到的，从中得到动物的数据乘以100（即AUC是以各研究的平均载体AUC的百分值来表示的）。

临床评分从第21天至第46天（终点评分）是升高的：

各动物的临床分数差值除以平均临床分数差值，该平均临床分数差值是在研究中从载体得到的，在研究中得到动物的数据乘以100（即该差值是由各研究的载体的平均临床分数差值的百分数来表示的）。

14.6放射学（Larsen评分）

取各动物的后爪的X射线片。对各片分配随机盲法识别编号，用放射Larsen评分系统由三种单独的评分对骨侵蚀的严重性进行评级，如下：0-正常，具有完整的骨轮廓和正常的关节间隙；1-轻微异常，任何一个或两个外跖骨显示有轻度的骨侵蚀；2-明确的早期异常，任何三个至五个外跖骨显示有骨侵蚀；3-中度破坏性异常，所有外跖骨以及任何一个或两个内跖骨显示有明确的骨侵蚀；4-严重破坏性异常，所有跖骨显示出骨侵蚀，并且内跖关节中的至少一个被完全侵蚀，部分地保留一些骨关节轮廓；5-毁损性异常，无骨轮廓。该评分系统是以对如下描述的改良，即：Salvemini等人，2001（一种类超氧化物歧化酶M40403对胶原诱发性关节炎大鼠模型的关节疾病的缓解。《关节炎与风湿病》（ArthritisRheum.）44：2909-21）；Bush等人，2002（通过用白细胞介素-17受体IgG1Fc融合蛋白进行治疗来减少大鼠佐剂性关节炎的关节炎症和骨侵蚀。《关节炎与风湿病》（Arthritis Rheum.）46：802-5）；Sims等人，2004，（唑来膦酸靶向破骨细胞预防胶原诱发性关节炎的骨破坏。《关节炎与风湿病》（Arthritis Rheum.），50：2338-46）以及Jou等人，2005（血小板反应蛋白1在胶原诱发性关节炎中作为一种有效的基因治疗策略。《关节炎与风湿病》（Arthritis Rheum.）52：339-44）。

14.7結果

在治疗模型中，通过临床评分和Larsen评分来对治疗进行评估。在图7和图8中对结果进行描述。明显地，两种检验的抗IL17C抗体（MOR12743和MOR12762）均证实具有显著的炎症抑制作用。阴性对照抗体MOR03207不能抑制炎症，而阳性对照依那西普不能抑制疾病的进展。

在预防模型中，通过临床评分和Larsen评分来对治疗进行评估。在图9中对结果进行描述。明显地，所检验的抗IL17C抗体（MOR12762）证实具有显著的对炎症与骨退化的抑制作用。阴性对照抗体MOR03207不抑制炎症和骨侵蚀。

14.8稳态PK

以前剂量，在第31天和第46天（治疗方案）或第21天、第36天和第46天（预防方案），在眶后窦采集血样，用肝素锂作为抗凝剂。将全血样品离心，将得到的血浆样品储存在-20℃下等分析。

实例15-烟草烟雾暴露模型

将小鼠（C57BL/6J，Charles River）每日暴露于烟草烟雾（TS）连续11天，导致肺部炎症，其指征是与进行相似治疗的空气暴露组相比较的在最后暴露之后24h时在支气管肺泡灌洗（BAL）中回收的细胞总数的升高。其反应包括在BAL中回收的巨噬细胞、上皮细胞、嗜中性细胞和淋巴细胞的明显升高。

在暴露的第1天、第4天、第7天和第10天，在TS暴露之前1h，通过腹膜内的途径（腹腔注射）给予MOR12743。这导致了对从BAL中回收的细胞的总数的明显的抑制，尤其是上皮细胞和嗜中性细胞的数量。

在暴露的第1天、第4天、第7天和第10天，在TS暴露之前1h，通过腹膜内的途径（腹腔注射（i.p.））给予MOR03207。这不会导致在BAL中的细胞总数或任何明确鉴定的细胞类型的任何明显的抑制。

给予罗氟司特（ChemPharmaServe Ltd.Ref.0010206），5mg/kg，口服（p.o.），在每次TS暴露之前1h。这明显地抑制了从BAL中回收的细胞的总数，尤其是上皮细胞嗜中性细胞和淋巴细胞的数量。

所有的TS暴露组均显示了某些体重减轻，但是在第12天与空气暴露组相比，这不会太明显。

15.1材料

用于腹腔注射给药的载体：D-PBS pH7.4（PAA产品参考号（PAA ProductRef.）H15-002，批号H00208-2353）

用于口服给药的载体：PEG200/注射用水（60%/40%v/v）

磷酸盐缓冲生理盐水（PBS），用于支气管肺泡灌洗（BAL），购自于Gibco公司。Euthatal（戊巴比妥钠）购自于梅里亚动物健康公司（MerialAnimal Health Ltd.）。

使用“万宝路100（Marlboro100）”产生烟草烟雾，烟草购自于一个商业供应商。

配制：

将MOR12743和MOR03207进行冰冻，1mg/mL。在给药之前，将两种检验底物在4℃下过夜进行解冻。

通过将预先称量好的量置于灰研砵中并轻轻研磨，同时逐滴加入载体（PEG200/水，60%/40%v/v）而将罗氟司特配制以形成悬浮液。在给药之前，将悬浮液漩涡搅匀。

15.2方法

先前的研究已经确立：从BAL中回收的细胞的总数量在11天每日TS暴露的最后一次之后24h显著升高。在这项研究中，最后一次空气或TS暴露之后的24h的时间点用于分析。

在研究的第1天、第4天、第7天和第10天的TS暴露之前1h，腹腔注射给予载体（PBS）、MOR12743和MOR03207。在各次TS暴露之前1h口服给予罗氟司特。

15.2.1连续11天的动物每日TS暴露

在这项暴露方案中，将小鼠以各组5只在透明聚碳酸酯箱（27cm16cm12cm）中进行暴露。‘万宝路100（Marlboro100）’香烟产生的TS可进入暴露箱，流量为100mL/min。为了将反复暴露于高水平TS可能导致的问题降至最小，在研究开始（第1天）增加TS暴露期，从最初的25分钟至第3天的最多45分钟。在这项研究中所用的暴露时间表如下：

第1天：25min暴露（～5只香烟）。

第2天：35min暴露（～7只香烟）。

第3-11天：45min暴露（～9只香烟）。

在10min以后和之后的每5min将暴露箱通风。

将另一个小鼠组每日以相等的时间长度暴露于空气中，作为对照组（无TS暴露）。

15.2.2支气管肺泡灌洗和细胞离心涂片器分析

支气管肺泡灌洗是如下进行的：

使用10mm长的鲁尔配件不锈钢管进行气管插管。使用磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）作为灌洗液。使用1mL注射器将0.4mL的容量轻轻注入并回抽3次，然后放在微量离心管（Eppendorf）中并在下次测定之前放在冰上。

进行全细胞计数，如下：

通过离心（6min，3400rpm，RCF=3070g-‘Eppendorf Mini Spin’）将灌洗液与细胞分离，滗析上清液，冷冻用于可能的后期分析。将细胞团在已知体积的PBS中重新悬浮，并且通过在血球计数器的显微镜下对染色的（Turks染料）等分部分进行计数来计算细胞总数。

进行分类细胞计数，如下：

将余下的细胞团稀释到每升大约105个细胞。将体积500μl放入细胞离心涂片器玻片的漏斗中，并在800rpm、RCF=72.26x g（珊顿细胞离心涂片器3（Shandon Cytospin3））下离心8min。将玻片风干，如所有权的指导使用维特/吉姆萨（Wrights/Giemsa）染液进行染色。当干燥和覆盖滑片时，使用光学显微镜法进行分类细胞计数。每个玻片计数大约400个细胞。使用标准形态测量技术对细胞进行鉴别。

15.3治疗方案

在这项研究中，4组小鼠经受了每日TS暴露，共11天，并且在第12天最后一次TS暴露后24h处死。在研究的第1天、第4天、第7天和第10天的TS暴露之前1h，三组小鼠接受了载体（D-PBS）、MOR12743或MOR03207腹腔注射。一组小鼠在每次TS暴露前1h接受口服罗氟司特。将另外的一个组暴露于空气中，连续11天，并且在第12天最后一次TS暴露后24h处死。在研究的第1天、第4天、第7天和第10天的暴露之前1h，这组小鼠接受了腹腔注射载体（D-PBS）。对于所有的组，n=10。

15.4取样过程

在第12天，在最后一次空气或TS暴露之后24h，通过腹膜内注射过量巴比妥酸盐麻醉剂杀死所有小鼠。从锁骨下静脉用肝素取血样，并且通过离心分离血浆，并保存在-40℃下。使用0.4mL磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）进行BAL。从BAL中回收的细胞可被用于全细胞计数或分类细胞计数。将BAL上清液和余下的细胞团分别储存在-40℃与-80℃下，用于可能的进一步的分析。在BAL之后，将插管打结留在原处。在轻轻打开胸腔并切下胸骨和肋骨的一侧后，移除心脏和肺。将左叶打结、取下、速冻、并保存在-80℃下。用10%磷酸盐缓冲福尔马林（PBF）充起右叶至PBF压力为18cm，持续20分钟。然后在插管下方结扎气管，并且将气管移除。将心、肺和气管浸泡在PBF中。

15.5数据测量和统计分析

对于各动物以单独的数据点展示其结果，并且对于各组计算其平均值。

因此，开始要对数据进行方差检验的单向分析（ANOVA），随后进行多重比较的邦费罗尼校正（Bonferroni correction），为了在治疗组之间对统计显著性差异进行检验。认为“p”值<0.05具有统计学意义。

使用下述公式计算抑制百分比：

15.6結果

15.6.1肺部炎症，由从BAL中回收的细胞数的升高所指征，由TS每日暴露诱发

一组每日暴露于TS，共11天，并且在研究的第1天、第4天、第7天和第10天的TS暴露之前1h接受载体（D-PBS）腹腔注射。当与接受相似治疗的空气暴露组相比较时，小鼠显示出肺部炎症，其表现是在第12天（最后一次TS暴露之后24h）被处死时，从BAL中回收的细胞的总数的显著增加（p<0.001）。与空气暴露组（对照组）动物相比较，这种炎症包括巨噬细胞、上皮细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞的显著增加（均p<0.001）（表2）。

表2：TS暴露11天对于小鼠的肺部炎症性反应的影响的总结

*当与空气暴露对照组在相同的时间点进行比较时。

对数据进行ANOVA。认为“p”值<0.05具有统计学意义。ns=不具有统计显着性。

15.6.2腹腔注射给予MOR12743对于肺部炎症的影响，这种肺部炎症以从BAL中回收的细胞数量的升高为指征，是由每日TS暴露所诱发的

在第1天、第4天、第7天和第10天的TS暴露之前1h腹腔注射给予MOR127435mg/kg，可明显抑制从BAL中回收的细胞总数（26%，p<0.001），特别是上皮细胞（52%，p<0.001）和嗜中性粒细胞（48%，p<0.001）。在表3中对抑制的程度和显著性进行了总结。

15.6.3腹腔注射给予MOR03207对于肺部炎症的影响，这种肺部炎症以从BAL中回收的细胞数量的升高为指征，是由每日TS暴露所诱发的

在第1天、第4天、第7天和第10天的TS暴露之前1h腹腔注射给予MOR127435mg/kg，没有对从BAL中回收的细胞总数或具体鉴定的在TS暴露之后升高的细胞类型产生明显的抑制。在表3中对数据进行了总结。

15.6.4口服给予罗氟司特对于肺部炎症的影响，这种肺部炎症以从BAL中回收的细胞数量的升高为指征，是由每日TS暴露所诱发的

在每次TS暴露暴露之前1h口服给予罗氟司特5mg/kg，明显抑制了从BAL中回收的细胞总数（32%p<0.001），尤其是上皮细胞（50%p<0.001）、嗜中性粒细胞（56%p<0.001）和淋巴细胞（54%p<0.01）。

在表3中对抑制的程度和显著性进行了总结。

表3：MOR12743、MOR03207和罗氟司特对于小鼠的TS诱发性炎症性反应的效应的总结。

为了在治疗组之间对显著性差异进行检验，对所有的数据进行ANOVA检验用于比较。认为“p”值<0.05具有统计学意义。ns=不具有统计显著性。

15.6.5在TS每日暴露的11天整个期间，治疗对小鼠体重的影响

为了在暴露方案的整个期间对小鼠的健康进行监测，在研究开始、第6天、以及第12天被处死之间对小鼠进行称重。在研究的12天中，对照暴露的小鼠显示体重略有变化或无变化。所有的TS暴露组显示，在这期间体重有些降低，但这些降低没有统计显著性。

15.7结论

在第1天、第4天、第7天和第10天腹腔注射给予MOR12743（5mg/kg），可显著抑制从BAL中回收的细胞的总数，尤其是上皮细胞和嗜中性粒细胞。以相同的方式给予MOR03207（5mg/kg），对于从BAL中回收的细胞的总数或对于任何明确鉴定的细胞类型的数量均无影响。

在每次TS暴露之前1h口服给予参比化合物罗氟司特（5mg/kg），可明显抑制从BAL中回收的细胞的总数，尤其是上皮细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞。这种反应类似于在先前的研究中所见到的反应。

所有的TS暴露组均显示出在12天的研究期间中有某些体重减轻，但在任何治疗组之间没有显著差异。

实例16-LPS鼻内滴注：急性肺嗜中性粒细胞增多症的小鼠模型

进行了两项单独研究，在急性肺嗜中性粒细胞增多症小鼠模型的脂多糖（LPS）鼻内滴注中具有一项阴性mAb和两项阳性mAbs，这种模型可模拟COPD（慢性阻塞性肺病）的某些相关方面。通过支气管肺泡灌洗（BAL）炎性细胞计数来测量这些效应。

16.1研究组

多组的小鼠用不同抗体和地塞米松进行治疗，并与只经受LPS的小鼠进行比较。在表4中提供了各组的总结。

表4

16.2材料

●脂多糖（LPS）：从大肠杆菌（Escherichia coli）中得到，055：B5，ref：L4524-25MG，由亲和色谱法进行纯化，批号：018K4077-西格玛（Sigma）公司。通过鼻内滴注按体积计来制备LPS：50μL/小鼠（10μg/50μL）

●盐溶液：氯化钠0.9%，批号9F0191（无内毒素，Lavoisier公司）

●氯胺酮：Imalgene MERIAL1000，10mL

●甲苯噻嗪：伦品拜耳制药（Rompun BAYER PHARMA）2%，25mL

●异氟醚：异氟烷（Aerrane），批次10E28A35

●甲基纤维素（MC）：VWR，ref AX021233批次M1395

●地塞米松（DEX）制剂：30mg/kg，10mL/kg，0.2mL/小鼠，口服

●将抗体冷冻，1mg/mL。在给药之前，将检验底物在4℃下过夜进行解冻。所有抗体在使用前解冻（或临时稀释）。

16.3动物

在研究中使用BALB/c雌性小鼠，购自于哈兰（Harlan）公司（法国）。小鼠体重是20g左右。

16.4实验过程

鼻内给药

通过异氟烷（isoflurane）吸入法将小鼠麻醉，在呼吸过程中，鼻内滴注LPS。在24h之后，腹膜内（IP）麻醉小鼠，并进行支气管肺泡灌洗操作。通过注射每10g小鼠重量0.1mL的麻醉剂溶液，将小鼠麻醉。麻醉剂溶液是由18ml的0.9%NaCl、0.5mL的甲苯噻嗪（5mg/Kg）和1.5mL的氯胺酮（75mg/Kg）构成的。

支气管肺泡灌洗（BAL）

通过中线切开暴露气管，并进行插管（用小鼠插管）。使用1mL无菌PBS缓冲液进行BAL两次。除去灌洗液，在4℃下在1500rpm下离心10min。在200μL的PBS缓冲液中将细胞团重悬浮。使用细胞计数器（Vet abc公司，法国）对细胞进行计数。将灌洗液上清液置于-20℃，用于炎症介质给药。

16.5研究设计

地塞米松：在LPS滴注之前第24小时、第16小时和第1小时以及在LPS给药后6小时进行地塞米松治疗。

抗体：在LPS滴注前24小时，用mAb（MOR03207、MOR12762或MOR12743）中的一种对小鼠进行治疗。

对于所有的组，在LPS给药后24小时进行BAL，并测定细胞计数。

结果

采用学生t检验对结果进行分析。将经过抗体或地塞米松治疗的小鼠的BAL的细胞计数与只经受LPS的小鼠的细胞计数进行比较。确认在各组中的小鼠的平均+/-sem细胞计数。结果见图10。

结论

MOR03207抗体（阴性对照）5mg/kg的单一治疗不明显抑制（ns趋势）炎性细胞募集进入BALF中。同时，MOR12762或MOR12743的5mg/kg的单一治疗可明显抑制炎性细胞募集进入BALF中。这表明，IL17C可调节急性嗜中性粒细胞增多症，并且是如COPD的肺部疾病的一个治疗标靶。

因此第一次证明了，IL17C拮抗剂，例如IL17C抗体，可有效治疗炎性病症和疾病。

实例17-人呼吸道组织中的IL17C表达谱

在这项研究中，通过实时定量PCR（qRT-PCR），在对照样品和病变样品的不同的人呼吸道组织类型（三级支气管、四级支气管和肺动脉）中对IL17C表达进行测定。对照样品来源于从非吸烟及吸烟供体，而病变样品则来源于COPD患者、急性/慢性支气管炎患者以及具有肺气肿的患者。

17.1.RNA纯化与QC

采用标准方法，根据供应商的方案或内部适应，从冷冻组织中分离总RNA。

QC指标（数据未显示）是：

18S核糖体RNA的存在

对照基因mRNA转录的最小拷贝数，采用qRT-PCR进行确定，如下：

●β-肌动蛋白（扩增子长度295bp）>3,800转录拷贝/100ng总RNA

●甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH，扩增子长度71bp）>10,000转录拷贝/100ng总RNA

●无DNA污染

17.2用DNase对RNA样品的处理

用无RNase的DNase I对总RNA进行处理，去除残余的基因组DNA（gDNA）。为了检验是否将DNA从RNA样品中成功去除，完成qPCR，无先前的逆转录。扩增信号的缺失确认了，RNA样品是无DNA的。

17.3引物探针组

用于qRT-PCR的引物探针组显示如下：

IL17C扩增子的大小：72bp

正向引物：5’-ATGAGGACCGCTATCCACAGA-3’（SEQ ID No.:184）

反向引物：5’-CCCGTCCGTGCATCGA-3’（SEQ ID No.:185）

探针：5’-TGGCCTTCGCCGAGTGCCTG-3’（SEQ ID No.:186）

用6-羧基荧光素（FAM）标记探针的5’端，用6-羧基-四甲基-罗丹明（TAMRA）标记3’端。

17.4cDNA合成

将DNase化的RNA与用于β（beta）1、β2、β3和GAPDH的反向引物一起在逆转录缓冲液中进行孵育，将样品加热至72℃（用于去除二级结构），然后冷却至55℃（用于将引物退火）。加入MuLV逆转录酶和核苷酸，将反应混合物在37℃下孵育30分钟，使得发生cDNA合成。将样品加热至90℃，持续5分钟，使逆转录酶失活。

17.5qRT-PCR

采用使用多路方法的qRT-PCR用于同时测量感兴趣的基因以及GAPDH的mRNA水平。在各分析管中同时测量GAPDH可提供一种用于成功逆转录和qRT-PCR的QC检验。用来源于50ng总RNA的cDNA来进行反应。将各标靶和GAPDH的正向和反向引物和探针与核苷酸、缓冲液和AmpliTaq GoldTM Taq聚合酶一起加入到反应混合物中。PCR条件如下：94℃，12分钟（酶活化步骤），随后是94℃15秒（变形步骤）和60℃30秒（用于退火和延伸），40个循环。在敏感性检验之后，将用于β3的初始PCR温度升高至97℃。

结果

在此展示的数据显示，IL17C促炎性细胞因子白细胞介素17家族的一个成员在人肺中是组成性地表达的。此外，在来源于被诊断为炎性呼吸疾病（如COPD、支气管肺炎或肺气肿）的供体的肺组织样品中观察到，与对照样品相比，IL17C表达水平增加（图11）。

实例18-咪喹莫特（IMQ）银屑病样小鼠模型

在非感染性皮肤炎症银屑病小鼠模型中，对IL17C在皮肤中的促炎性功能进行了检查，其中局部的TLR7-TLR8激动剂咪喹莫特可诱发银屑病样皮肤损伤，以表皮增生和白细胞浸润为特征，其依赖于病理性TH17细胞因子（Van der Fits等人，《免疫学杂志》（J of Immunol.）2009年5月1日；182(9):5836-45）。最近对IL17C在这种特定模型中的作用有记录（Ramirez-Carrozzi等人，《自然免疫学》（Nat Immunol.）201112(12）：1159-66），并且IL17C^-/-小鼠提供了对于IL17C在疾病模型中的作用的令人信服的基因学证据。使用相同的银屑病–样模型来进一步研究在皮肤中的IL17C对于IMQ的反应并且鉴定生成IL17C的细胞。

18.1试剂

使用凡士林（Vaseline officinale，Cooper）和咪喹莫特乳膏（Aldara，5%乳膏，MEDA）。所用的抗体是抗小鼠IL17A/F（R&D System公司，克隆50104，ref MAB421）和抗小鼠IL23p40（eBioscience噶，克隆C17.8，ref16-7123-85）。

18.2动物

Balb/c N小鼠（雌性，18-20gr，大约10周龄），来自于CERJ或Halan（法国）。小鼠经过一个12hr的光/暗循环（0700-1900）。将温度保持在22℃，自由进食进水。

18.3实验过程

为了诱发银屑病样反应，在剃光毛的背部以及右耳处每日局部剂量为62.5mg的咪喹莫特乳膏，连续5天（D0-D4），转换是每日剂量为3.13mg的活性化合物。对照组是由接受相同量的凡士林乳膏的小鼠组成的。每天观察皮肤炎症的严重性（炎症、结痂和增厚）。每日记录体重。在尸体剖检中及在指明的日子中，用千分尺（三丰公司（Mitutoyo））测量耳部和背部皮肤的厚度。采集背部和耳部皮肤的样品，用于组织学和基因表达。测量脾和胸腺的重量。

18.4研究设计

将小鼠随机分为相等的组（n=10）。IMQ组接受在剃光毛的背部以及耳朵处每日局部剂量为62.5mg的咪喹莫特乳膏，连续5天（D0-D4），转换是每日剂量为3.13mg的活性化合物。对照组是由接受相同量的凡士林的对照小鼠组成的。在PBS中制备抗体，以10mg/kg（200ug/小鼠）进行检验，并且在实验前3天以及实验开始时（D0）腹腔注射给药，因此使用6个不同的治疗组：

●对照（凡士林）

●IMQ（艾达乐（Aldara）5%乳膏）

●IMQ+MOR03207_h/m10mg/kg腹腔注射（阴性对照Ab）

●IMQ+MOR12743_h/m10mg/kg腹腔注射

●抗小鼠IL17A/F10mg/kg i.p

●抗小鼠IL23p4010mg/kg i.p

18.5结果

使用生物素酰化MOR12743抗体和IHC对IL17C蛋白表达进行检测。在对照组和在IMQ治疗组中，IL17C在真皮的肥大细胞中表达（数据未示出）。在对IMQ的反应中，从D2至D4-，IL17C表达在表皮的角化细胞中增加，在D3-中以及在真皮和组织层中的某些更小的炎性细胞中观察到了更高的表达。MOR03207（同种型对照）显示，在任何条件下都没有染色。

这种观察结果符合IL17C的基因表达。未测得IL17A和IL17F的基础水平，IL17C和IL23p19的基础水平较低。在96h小时之后，在背部皮肤中的IL17A和IL17F因IMQ而最大程度地增加，而IL23p19和IL17C的增加较早，在48h最大。IL17RA和IL17RE对IMQ的反应具有良好的表达，具有非常适度的表达变化。

与通路相关的或IL17C特异性的中和抗体对于IMQ诱发性银屑病的效应，通过表皮厚度的组织学测量来进行评估。IL-17A和IL-23p40抗体显示出部分的预防效果符合本领域的公知常识。MOR1243中和抗体的效应明显，由此证明，IL17C中和作用可明显地预防在小鼠耳部皮肤中的由IMQ诱发的表皮厚度（图12）。

实例19-在原代人表皮角化细胞中的IL17C的表达与功能

为了进一步地探讨IL17C在银屑病中的功能，我们集中在IL17C在原代人表皮角化细胞中的表达和功能。

19.1成人正常人表皮角化细胞（NHEK-Ad）培养物

冷冻保存的来自于成人的原代正常人表皮角化细胞是从龙沙公司（Lonza）得到的，并角化细胞生长培养基-金（KGM-Gold^TM）中培养，该培养基是由不同的SingleQuots^TM的生长因子添加物对角化细胞生长培养基-金（KBM-Gold^TM）进行补充而得到的，这些生长因子添加物包括牛脑垂体提取物、皮质醇、hEGF、肾上腺素、转铁蛋白、胰岛素以及GA-1000（培养基和补充物均来自于龙沙公司）。将培养2代以上的细胞种在KGM-Gold^TM的96孔板中（25000c/孔）。过夜培养之后，除去培养基，在加入不同的细胞因子引发剂之前改成KGM-Gold^TMw/o皮质醇。在不同的时间点提取总RNA，并且通过定量RT-PCR对IL-17RE、IL17C和β-防御素-2（DEF4B）的表达进行确定。收获细胞上清液，保持在-20℃，直至采用ELISA对分泌型β-防御素-2（hBD2）的水平进行分析。重组人IL17C是来自于诺维斯生物公司（Novus Biologicals）。重组人IL-1β和TNFα是来自于派普泰克公司（PeproTech）。重组人IL-17A和IL-22是来自于安迪生物科技公司（R&D Systems）。下述Toll样受体（TLR）激动剂是来自于InvivoGen公司：从鼠伤寒沙门菌（S.typhimurium）纯化得到的鞭毛蛋白（FLA）（TLR5激动剂）、保卫性喹莫（TLR7激动剂）、CL097（TLR7/8激动剂）和CpG寡核苷酸ODN2611（TLR9激动剂）。TLR4激动剂脂多糖（LPS，来自于大肠杆菌（E.Coli）血清型026：B6）是从西格玛公司得到的。

19.2定量RT-PCR

使用RNeasy迷你试剂盒（RNeasy Mini Kit）乾基公司（Qiagen）从细胞中提取总RNA，并使用逆转录试剂（应用生物系统公司（Applied Biosystems））将其逆转录。使用通用PCR预混合液/NoUNG以及预先设计的即时测定基因表达引物/探针组（均由应用生物系统公司提供），制备二十五μl PCR反应。在ABI7000（由应用生物系统公司提供）上进行qPCR。将基因表达标准化成为管家基因GAPDH，并且以ΔCt值表示，ΔCt=Ct基因-Ct(GAPDH），或者以如使用2-ΔCt方法而得到的特异性基因表达的相对mRNA水平来表示。

19.3hBD2ELISA

开发了下述方案，并经验证来使用从派普泰克公司（catno.900-K172）得到的捕获和检测抗体对hBD2水平进行测量。用40μL的抗hBD2捕获抗体溶液（0.5μg/mL，在PBS中）来对White Lumitrac600384孔板（Greiner公司）进行包被。在4℃过夜孵育之后，用PBST（PBS+0.05%吐温-20（西格玛公司））洗板一次，用PBS洗板一次，并且用100uL/孔的封闭缓冲液（PBS+1%BSA+1%蔗糖+0.05%NaN₃）通过在室温下孵育4hr来进行封闭。将板倒置并在吸水纸上轻敲来去除封闭缓冲液。用100μL PBST和100μL PBS洗板，加入hBD2标准品或样品。在4℃下孵育过夜之后，用PBST洗板两次，用PBS洗板一次。随后，加入35uL的生物素酰化抗hBD2检测抗体溶液（在PBS中0.1μg/mL，含有1%BSA）。在室温下孵育2hr之后，如上所述进行洗板，并且与在PBS+1%BSA中按1/2000进行稀释的35μL链亲和素-HRP结合物（英杰公司（Invitrogen），分类编号SNN2004）一起进行孵育。45min之后，如上所述进行洗板，并且在室温下与50μL/孔的BM Chem ELISA底物（罗氏公司（Roche））一起孵育5min。在Luminoscan Ascent光度计（实验室系统公司（Labsystems））上读数，测量时间是100msec。

19.4结果

虽然IL-17RA是被泛表达的，IL-17RE的表达是更严格的，并且其表达在上皮源细胞中尤其高。我们对IL-17RE mRNA在原代人表皮角化细胞上的表达进行了分析，并观察到IL-17RE在这些细胞中的高表达，ΔCT（IL-17RE，GAPDH）～4-6。IL-17RE的表达不会受到被检验的任何炎症性引发剂的调节（未显示数据）。

我们进一步扩展了这些初步发现，并且还对IL-17A对在角化细胞中的IL17C表达的调节进行了分析，IL-17A是一种由Th17细胞生成的细胞因子并且已知在银屑病起到了重要作用。得到的数据确认了，IL17C mRNA可由IL-1和TLR5激动剂鞭毛蛋白来诱导（图13A和13B）。其他TLR配体（TLR4、TLR7、TLR8或TLR9）不会明显地诱导IL17C mRNA。动力学分析显示，IL-1或鞭毛蛋白对IL17C mRNA的诱导是快速的和短暂的。感兴趣的是，虽然IL-17A本身没有明显诱导IL17C mRNA，当与促炎性细胞因子TNF或IL-1结合时，它可随时间协同地促进并维持IL17C的表达（图13A）。

当角化细胞表达高水平的IL-17RE时，对IL17C在这些细胞中的功能进行进一步的检查。尽管人原代角化细胞对单独IL17C没有反应，但是IL17C协同其他被检验的促炎性基因，即IL-1β、TNFα和IL-22，刺激β-防御素-2的表达。在mRNA和蛋白水平，对β-防御素-2mRNA表达的协同刺激进行了观察。

19.5总结

总之，数据表明，在角化细胞中由促炎症反应细胞因子产生的IL17C可在一种正向前馈回路中起作用，该正向前馈回路可放大并维持在角化细胞中促成银屑病皮肤炎症的炎性基因表达。

实例20：基于ELISA的交叉竞争检验

可使用ELISA分析，根据下述标准过程，对一种抗IL17C抗体或另一种IL17C结合剂的交叉竞争进行检测。同样的，可对一种抗IL17C抗体或另一种IL17C结合剂的交叉竞争进行检测。

ELISA测定的一般原则涉及将抗IL17C抗体包被到ELISA板的孔上。然后在溶液中加入过量的第二种可能的交叉竞争的抗IL17C抗体（即不与ELISA板结合）。随后，向孔中加入有限量的IL17C-Fc。

在孔上包被的抗体与溶液中的抗体会与有限量的IL17C分子竞争结合。然后洗板来除去未与包被抗体结合的IL17C分子，并且还除去该溶液相的第二抗体以及溶液相的第二抗体与IL17C之间形成的任何络合物。使用合适的IL17C检测试剂对结合IL17C的量进行测量。因此，IL17C可与一种例如Fc、Flag等的标记融合，，这种标记可通过合适的标记特异性抗体来进行检测。

溶液中的与包被抗体交叉竞争的抗体能够导致：相对于在无溶液相第二抗体存在的条件下可与包被抗体结合的IL17C分子的数量，可与包被抗体结合的IL17C分子数量的减少。

在下面进一步对命名为Ab-X和Ab-Y的抗体进行了更详细的描述。当Ab-X被选择成为固定化抗体时，将它包被到ELISA板的孔上，之后将板用合适的封闭液进行封闭，来使其后加入的试剂的非特异性结合可被最小化。然后向ELISA板中加入过量的Ab-Y，这样使得在ELISA板的包被过程中，每孔的Ab-Y IL17C结合位点的摩尔数高于所用的每孔的Ab-X IL17C结合位点的摩尔数的10倍。然后加入IL17C，这样使得每孔加入的IL17C的摩尔数低于用于包被各孔的Ab-X IL17C结合位点的摩尔数至少25倍。在合适的孵育期之后，对ELISA板进行洗板，加入IL17C检测试剂，用于对与被包被抗IL17C抗体（在这种情况下Ab-X）特异性结合的IL17C分子的量进行测量。测定的背景信号可被定义为是在具有包被的抗体（在这种情况下是Ab-X）、溶液相第二抗体（在这种情况下是Ab-Y），仅缓冲液（即无IL17C）以及IL17C检测试剂的孔中所获得的信号。用于测定的阳性对照信号被定义为是在具有包被抗体（在这种情况下是Ab-X）、溶液相第二抗体、仅缓冲液（即无溶液相第二抗体）、IL17C检测试剂的孔中所获得的信号。ELISA测定需要在这种方式下运行，这样阳性对照信号可是背景信号的至少6倍。

为了避免由选择何种抗体用作包被抗体以及何种抗体用作第二（竞争）抗体而产生假象（例如b-X与Ab-Y之间对IL17C的显著不同的亲和力），需要以两种格式运行交叉封闭测定：1）格式1，其中Ab-X是被包被到ELISA板上的抗体，Ab-Y是在溶液中的竞争抗体；2）格式2，其中Ab-Y是被包被到ELISA板上的抗体，Ab-X是溶液中的竞争抗体。

Claims

1.一种用于在治疗炎性病症中使用的IL17C特异性分离抗体或抗体片段。

2.根据权利要求1所述的分离抗体或抗体片段，其中IL17C包括SEQ.ID No181的氨基酸。

3.根据权利要求1或2所述的分离抗体或抗体片段，其中所述治疗是对关节炎、哮喘、脓毒病、自身免疫性疾病、肺部炎症、银屑病、炎症性肠病、类风湿关节炎、COPD（慢性阻塞性肺病）、系统性红斑性狼疮和/或结节病的治疗。

4.根据权利要求1-3所述的分离抗体或抗体片段，其中所述抗体阻断了IL17C与IL17RE的结合。

5.根据权利要求1-4中之一所述的分离抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段与包含由表1中的任何抗体的卡巴特所定义的6个CDR的一种抗体或抗体片段具有交叉竞争。

6.根据权利要求1-5中之一所述的分离抗体或抗体片段，其中所述抗体或其片段是一种单克隆抗体。

7.根据权利要求6所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段是一种人源的、人源化的或嵌合的抗体或抗体片段。

8.根据权利要求6所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含一个人重链恒定区以及一个人轻链恒定区。

9.根据权利要求6所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体是IgG同种型。

10.根据权利要求6所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体片段选自由以下各项组成的组：Fab、F（ab2）’、F（ab）2’、scFV。