CN103961376B - 一种防治皮肤瘢痕的药物组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种防治皮肤瘢痕增生的药物组合物及其制备方法，其中治疗增生性瘢痕中以青蒿琥酯和珍珠水解液为活性成分，然后用于制成的各类复方药剂。配方中的两种主要活性成分在治疗皮肤瘢痕的机制上具有协同作用，相对于现有技术仅使用青蒿琥酯、珍珠水解液、水蛭素等单方药剂能够更为明显地抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖促进其凋亡；抑制瘢痕组织中胶原蛋白合成；调节瘢痕组织内细胞因子和生长因子的表达和信号传导，从而对瘢痕的增殖起到抑制作用，对于增生性瘢痕具有良好的治疗或预防作用。同时，本发明制成各种医学上治疗和预防皮肤瘢痕增生的外用剂型能够直接作用于皮肤表面的瘢痕组织，治疗效果好、副作用小、生产成本低等特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种防治皮肤瘢痕的药物组合物及其制备方法，尤其涉及一种用于防治皮肤瘢痕的药物组合物及其制备方法。
背景技术
皮肤病理性瘢痕是人类特有的一种病理现象，在临床上可分为增生性瘢痕（hypertrophic scar，HS）和瘢痕疙瘩（keloid）两种类型。临床上主要表现为皮肤表面凹凸不平，颜色潮红，容易充血，质地坚硬且形状不规则。常有灼痛和瘙痒感。光镜下表现为从病理学角度看，病理性瘢痕的特征为大量成纤维细胞增生,胶原纤维在表皮下相当于真皮部位的大量沉积，细胞外基质中胶原、蛋白多糖、糖蛋白等过度沉积、胶原纤维增厚，排列不规则常呈旋涡形或缠绕成绳索状。最终给患者造成畸形、功能障碍、影响美观或奇痒等严重后果，而且烧伤及创伤后瘢痕的发生率也在不断增长。
皮肤病理性瘢痕一直是比较棘手的临床病症之一。皮肤作为人体最大的器官，具有保护和防御、调节体温、分泌和排泄、吸收、感觉、代谢及参与免疫等功能，承担着机体第一道屏障的作用。当外伤等各种因素导致其完整性遭受破坏，甚而累及真皮层时，作为创伤修复产物的瘢痕形成了。这种创伤修复和瘢痕形成与许多细胞的功能活动有关，其中，以成纤维细胞为主的修复细胞被认为是创伤愈合与瘢痕形成过程的决定性因素。
当前，市面上的中药类外用防治皮肤瘢痕药物多而杂，且作用也是多靶点、多环节、多层次，因而对于治疗瘢痕的作用机理研究尚不够深入，也有很大难度，且多为硅酮类制剂，虽然有一定的治疗效果，但可能带来导致皮疹、瘙痒等副作用，甚至见到使用后导致黑变病的病例报道。其他一些如放射治疗、中药制剂产品或配方疗效没有经过严格的实验检测实验、药理机制不明、毒副作用较大、治疗效果不明显。因而对于治疗瘢痕的作用机理研究尚不够深入，也有很大难度。
此外，现有技术的研究多集中在单味药物或是其提取物对瘢痕成纤维细胞的增殖、胶原合成等方面的作用，而对细胞间质、各类细胞因子和介质、细胞内信号转导等的影响和作用则报道很少，研究水平也停留在生化、细胞水平，较深层次的分子、基因水平的研究基本尚未开展，具体作用机理未能阐明清楚，药效和影响均有待于进一步探索，而且其治疗皮肤瘢痕的效果也并不尽如人意。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种防治皮肤瘢痕的药物组合物及其制备方法，以青蒿素衍生物——青蒿琥酯和珍珠水解液按照一定质量比的组分加入医学上的辅料，克服了现有技术中存在的上述缺点和不足，比单一药物对于瘢痕的防治效果更好，而且无明显毒副作用，解决了人们一直渴望解决但始终未能获得成功的技术难题。
本发明是通过以下技术方案实现：
所述药物组合物以100g计，由下列成分组成：
（1）青蒿琥酯0.48~1.92g；
（2）珍珠水解液0.3~6.0g，其中珍珠水解液的质控标准为：钙浓度：30～80mg/ml，蛋白浓度：1.5～3mg/ml,含氮量：0.3～0.5 mg/ml。
进一步的：该组合物中还包括常规药剂辅料。
本发明以100克该组合物计，优选下列成分：
（1）青蒿琥酯0.48~1.92g；
（2）珍珠水解液0.3~6.0g，其中珍珠水解液的质控标准应在下列范围内：钙浓度：30～80mg/ml，蛋白浓度：1.5～3mg/ml,含氮量：0.3～0.5 mg/ml；
（3）其余为常规药剂辅料。
制备该组合物的方法，所述步骤如下：
步骤①基质按常规方法制成药剂辅料基质。
步骤②制备青蒿琥酯含药培养液：将青蒿琥酯用质量百分比为5%的NaHCO3溶液溶解，稀释成药液备用。
步骤③在药剂辅料基质中加入青蒿琥酯药液和珍珠水解液这两种活性成分，同时均匀搅拌获得，按照上述的方法制备基质与活性成分混合后制成液体制剂或固体制剂。
本发明使用的青蒿琥酯、重量百分比为浓度5%的NaHCO3溶液（广西南药集团桂林制药厂生产）、珍珠水解液（北海宝珠林珍珠保健品有限公司）生产，其质控标准为：钙浓度：30～80mg/ml，蛋白浓度：1.5～3mg/ml,含氮量：0.3～0.5 mg/ml）。
本发明可以根据不同需要制成膏剂、胶剂、水剂、油剂或面膜或医学上所用的外用剂型。
制成各种剂型的辅料：
膏剂：包括白凡士林（基质）,十八醇（基质）,单硬脂酸甘油酯（基质）,十二烷硫酸钠（乳化剂），甘油（保湿剂）,对羟基苯甲酸乙酯（防腐剂）,蒸馏水。
水剂：包括月桂氮卓酮 (溶剂)，乙醇（溶剂）。
油剂：包括硬脂酸（基质）,单硬脂酸甘油酯（基质）,蜂蜡（基质）,白凡士林（基质）,地蜡（基质）,双硬脂酸铝（乳化剂）,氢氧化钙（乳化剂）,液状石蜡（防腐剂）,羟苯乙酯（防腐剂）,蒸馏水。
胶剂：包括羧甲基纤维素钠，甘油，稳定剂，防腐剂，蒸馏水。
面膜：包括高分子胶，水，酒精。
本发明具备以下的效果和优点：
1.疗效好、不良影响小。
2.成本低，配方简单，可配置成多种外用型复方剂型。
3.有较强的协同和增效作用，较单一的硅酮类药物、水蛭素、青蒿琥酯防治皮肤瘢痕的效果更为明显。
4.根据实验结果可以看出，该药物组合物以100g计，在活性成分青蒿琥酯0.96g，珍珠水解液3g的条件下，既能够有效防止皮肤瘢痕产生，并达到最佳疗效，毒副作用也小，以此作为复方药剂，解决了长期以来人们渴望解决的技术难题。
长期以来人们主要通过青蒿素及其衍生物结合辅料等进行皮肤瘢痕的治疗，效果并不比单独采用青蒿素及其衍生物的治疗效果要好，而本发明采用的技术方案，能够较单独采用青蒿素及其衍生物、珍珠水解液的技术方案要达到更为显著的治疗效果，因此不仅克服了技术偏见，还解决了长期以来人们渴望解决的技术难题，在治疗皮肤瘢痕上取得了显著的技术进步。
本发明药物组合物的协同作用和增效作用可以通过以下实验室药效研究和实验研究报告来说明。
一、药物作用机理研究
本发明的药理机制是，采用青蒿素（英文名：Arteannuin）衍生物——青蒿琥酯（拉丁文名：Artesunatum）、珍珠水解液两种药物作为防治皮肤瘢痕的外用药物组合物，青蒿素于1998年前后在治疗增生性瘢痕的疗效上已经有所报道，其衍生物青蒿琥酯同时，具有治疗皮肤瘢痕、抗皮肤组织纤维化等药物作用。
本发明采用青蒿素（英文名：Arteannuin）衍生物——青蒿琥酯（拉丁文名：Artesunatum）、珍珠水解液两种药物作为防治皮肤瘢痕的外用药物组合物。
20 世纪70 年代，我国学者从中药黄花蒿中分离出有效单体成分青蒿素。青蒿琥酯是青蒿素的水溶性衍生物,化学名为二氢青蒿素-10-α-丁二酸单酯，分子式为C19H28O8，分子量为384.43。
青蒿琥酯最初作为抗疟疾药物被研究开发，随着对青蒿素类药物药理作用的研究的不断深入，科研人员证实了青蒿素类药物还具有抗孕、抗纤维化、抗血吸虫、抗肿瘤等方面的效用。尤其在抗纤维化方面，已经证实青蒿琥酯具有诱导肝、肺成纤维细胞凋亡，抑制增生的作用。但未见公开文献报告青蒿琥酯能用于治疗皮肤瘢痕的内容。
珍珠，是一味古老而悠久的中医药材及营养补品，是珍珠贝类和珠母贝类软体动物内分泌而生成的含碳酸钙的矿物珠粒，是由大量微小的矿物晶体集合而成的。珍珠作为药物治病在我国已有悠久的历史，早在秦汉时期就被珠民用来治疗刀伤出血、疔疮溃烂、烧伤、烫伤等，内服则可清热解毒。明代的《本草纲目》中就有记载：“珍珠安神定魄、养颜、点目去翳、塞耳去聋、去腐生肌、催生死胎”，认为珍珠具有镇心安神、清热益阴、化痰明目等功效。
珍珠水解液是珍珠的水解液，主要成分为CaCO391.6%、H2O和有机质各4%、其他成分0.4%，其含有少量蛋白质、多种微量元素、维生素等。本实验所用的广西北海合浦珍珠，又被称为南珠，为自古以来中医入药之首选。含有丰富的碳酸钙、人体必需微量元素、微量有机质等，含全部8种人体必需氨基酸，以及十多种与代谢密切相关的其他氨基酸。
病理性瘢痕的典型的特征就是瘢痕增厚、挛缩，一种药物或者复合药物能否有效防治瘢痕，其简单可靠的反映指标是：瘢痕厚度、颜色、质地的变化本发明主要采取外用型药物的形式，其能够直接作用于人体皮肤表面，经皮肤或粘膜表面吸收后，药力直达病区，具有药效维持时间长、简便易行、毒副作用小、避免口服用药发生消化道灭活等优点。
青蒿琥酯联合珍珠水解液抑制瘢痕组织成纤维细胞的检测及相关机制原理
所选用的实验药剂和仪器：青蒿琥酯（桂林制药厂生产）、5%的NaHCO3溶液（桂林制药厂生产）、珍珠水解液（北海宝珠林珍珠保健品有限公司生产，钙浓度56mg/ml，蛋白浓度：2.45mg/ml,含氮量：0.39 mg/ml）、医用硅酮凝胶喷雾剂（疤复新，上海上大吉申科技开发有限公司生产）、Smad3鼠抗人单克隆抗体（美国Santa Cruz公司生产）、羊抗鼠抗兔通用型二抗（上海长岛公司）生产、TGF-β1鼠抗人单克隆抗体（福州迈新生物技术公司生产）、免疫组化试剂盒（福州迈新生物技术公司生产）、DAB试剂盒（北京中杉公司生产）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海Generay生物制品公司生产）、蛋白质提取试剂（上海捷瑞生物公司生产）、羊抗兔抗鼠lgG/碱性磷酸酶标记二抗（美国Santa Cruz公司生产）、鼠抗人GAPDH单克隆抗体（美国Santa Cruz公司生产）、DMR+Q550型病理图像分析仪（德国Leica公司生产）。
（一）人皮肤瘢痕成纤维细胞的体外原代培养
1.皮肤瘢痕组织来源
人体皮肤瘢痕组织标本供体均来自广西医科大学整形外科的患者，全部患者近期没有使用瘢痕抑制药物，不伴有肿瘤或其他严重疾病。取材前均经患者同意。
2.原代培养 在无菌条件下采取手术切除的皮肤瘢痕组织后立即放入含500U/ml青霉素和500mg/L链霉素的培养基中。于4 h内在超净工作台内取出标本。标本置于含青霉素100U/ml，链霉素100mg/L的D’hanks液中，无菌条件下用手术刀片和剪刀去除表皮和基底层，用D’hanks液将标本反复洗涤。将清洗干净的皮肤瘢痕组织剪成3×3×2mm大小的组织块。将组织块移入50ml培养瓶中，均匀地贴在瓶壁上，间距约1cm。瓶内加入含有15%胎牛血清，青霉素100U/ml，链霉素100mg/L，PH 7.2～7.4的DMEM培养基1.5ml，密闭瓶口。将培养瓶反转，令组织块在上，置37℃、含5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养4小时后，将培养瓶翻转，使培养基浸泡组织块。2d以后再补加3～5m1培养液，此后3～4d更换一次培养液。待成纤维细胞长满瓶底时以0.25%胰蛋白酶消化传代(1：3)培养。反复传代去除非成纤维细胞成分后，建立人皮肤瘢痕细胞系。取第3－4代的成纤维细胞做检测。
（二）人皮肤瘢痕成纤维细胞形态学观察
原代培养和传代过程中倒置显微镜观察细胞的形态。取3～4代培养的成纤维细胞，消化后将玻片放入细胞悬液中，待细胞贴附在玻片上生长后将玻片取出，稍晾干，用95%的乙醇固定5min进行HE染色，普通光镜观察。
（三）人皮肤瘢痕成纤维细胞的培养与鉴定
采用免疫细胞化学SP法，取对数生长期的细胞消化、调整细胞浓度，将处理后的盖玻片置于培养瓶中，培养24 h后，取出生长细胞后的盖玻片，用4%多聚甲醛固定，晾干后，PBS冲洗3次，每次5 min。0.3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，用Tritonx-100处理10min，热修复8min，自然冷却，血清封闭15min，加1：200 I抗（鼠抗人波形蛋白抗体）4℃过夜，于第二日拿出室温下孵育30分钟，PBS冲洗3次，每次5min，加Ⅱ抗，经PBS冲洗，加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，PBS冲洗，DAB显色6min，冲洗，苏木素核复染，中性树脂封片，在普通光学显微镜观察。
（四）以碳酸氢钠溶液、青蒿琥酯、珍珠水解液、青蒿琥酯结合珍珠水解液分组实验测定各组对人体皮肤瘢痕组织标本的影响
实验分组为①空白对照组、②1‰碳酸氢钠溶液组、③青蒿琥酯（240μg/ml）组、④珍珠水解液(以钙离子含量为计,10mg/ml)组、⑤青蒿琥酯（120μg/ml）+珍珠水解液(5mg/ml)组、⑥青蒿琥酯（240μg/ml）+珍珠水解液(5mg/ml)组、⑦青蒿琥酯（240μg/ml）+珍珠水解液(10mg/ml)组共七组，分别简称为control group，1‰ SB group，Art(240μg/ml)group，HPL(10mg/ml)group，Art(120μg/ml)+HPL (5mg/ml)group，Art(240μg/ml)+HPL(5mg/ml)group，Art(240μg/ ml)+HPL(10mg/ml)group。将各组溶液分别作用于第3～5代成纤维细胞24h后，以四唑盐比色法（MTT）检测青蒿琥酯联合珍珠水解液对人皮肤瘢痕成纤维细胞增殖作用的影响；以流式细胞仪检测细胞凋亡；以实时荧光定量PCR法检测药物作用后细胞因子IL-1β、INF-γmRNA的表达情况；以Werstern-Blot法检测药物作用后细胞因子IFN-γ、IL-1β蛋白表达。
（五）青蒿素和青蒿琥酯对人皮肤瘢痕成纤维细胞的作用
1. MTT法测定青蒿素对人皮肤瘢痕成纤维细胞的增殖影响作用
取前述实验分离的对数生长期的3－5代人皮肤瘢痕成纤维细胞，用0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液，调为0.5×105/ml，分别接种于96孔塑料培养板，密度为0.5×104个/孔，每孔加入100μl的细胞悬液和100μl的培养基，常规培养24小时后吸弃原培养液。青蒿素用无水乙醇溶解成3.3g/L，再用培养基稀释为0.206g/L，0.103g/L，0.052g/L，0.026g/L，0.013g/L 5种浓度。乙醇的浓度相对应为6.25%，3.13%，1.56%，0.78%，0.39%。实验分组：1、青蒿素组：加入已经配置的含青蒿素浓度为0.206g/L，0.103g/L，0.052g/L，0.026g/L，0.013g/L的培养基200μl；2、乙醇溶剂对照组：加入已经配置的含乙醇浓度为6.25%，3.13%，1.56%，0.78%，0.39%的培养基200μl。空白对照组：每孔只加200μl 的培养基。每孔设3个复孔。于37℃，5% CO2饱合湿度继续培养24小时后，加入20μl 5mg/ml MTT摇匀，继续培养4小时后吸弃上清，加入200μl DMSO，振荡20min，待结晶颗粒溶解后，采用酶标仪于490nm波长下测定吸光度(A)值。记录结果，计算药物对皮肤瘢痕成纤维细胞的抑制率。生长抑制率=(1－用药组A/对照组A)×100% 。
2.MTT法测定青蒿琥酯对人皮肤瘢痕成纤维细胞的增殖影响作用
取对数生长期的人皮肤瘢痕成纤维细胞3－5代，用0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液，调为1×105/ml，分别接种于96孔塑料培养板，密度为1×104个/孔，每孔加入100μl的细胞悬液和100μl的培养基，常规培养24小时后吸弃原培养液。将青蒿琥酯钠（桂林制药厂生产）用5%NaHCO3 溶解成24g/L，再用培养液稀释成30、60、120、240、480mg/L的含药培养液，碳酸氢钠在实验中的最终浓度为1‰ 。实验分组： 1、青蒿琥酯组：加入已经配置的含青蒿琥酯浓度为30、60、120、240、480mg/L的培养基200μl；2、碳酸氢钠溶剂对照组：将1‰浓度的碳酸氢钠的培养液200μl加入孔中；3、空白对照组：每孔只加200μl 的培养基。每孔设3个复孔。于37℃，5%CO2饱合湿度继续培养24小时后，加入20μl 5mg/ml MTT摇匀，继续培养4小时后吸弃上清，加入200μl DMSO，振荡20min，待结晶颗粒溶解后，采用酶标仪于490nm波长下测定吸光度(A)值。记录结果，计算药物对皮肤瘢痕成纤维细胞的抑制率。抑制率计算同上。
3.流式细胞仪检测细胞凋亡：本实验用凯基Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒，Annexin V作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标。将Annexin V进行荧光素（FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用流式细胞仪检测细胞凋亡的发生。用碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）与Annexin V匹配使用，将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。具体实验步骤：取对数生长期3－5代的成纤维细胞，用0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液，2×105个/孔密度接种于6孔塑料培养板，常规培养1天，待细胞贴壁生长后分别用0.206g/L的青蒿素，240mg/L、120 mg/L的青蒿琥酯作用于细胞，同时设立乙醇溶剂对照组、碳酸氢钠溶剂对照组和空白对照组，继续培养1d，将培养基吸出后放入离心管，然后用0.25%胰酶将贴壁的细胞消化后，用PBS洗涤细胞二次（离心1500rpm，5min）收集1～5×105 细胞待用。吸取500μL的 1×Binding Buffer加入细胞中，制备细胞悬液，用上述的悬浮细胞加入2μLAnnexin V-FITC混匀后加入5μL Propidium Iodide，然后混匀；避光室温反应5min后上流式细胞仪，用流式细胞仪检测（Ex=488 nm; Em=530 nm）细胞凋亡的情况。（绿色荧光通过FITC通道通常为FL2来检测；红色荧光通过PI通道通常为FL1来检测）流式细胞仪的激光波长488nm，以同种未经药物处理的细胞为标准样品校对仪器，调整仪器使其变异系数稳定在3%－5%之间。应用Multicycler for Windows分析软件，以同种未经药物处理的细胞为对照，进行双参数分析，可显示四类不同的细胞，即FITC－/PI－的活细胞、FITC＋/PI－的凋亡细胞、FITC＋/PI＋ 的继发坏死细胞、FITC－/PI＋的膜受损伤的活细胞。
（六）用药后细胞形态学观察
1.选生长良好的细胞，每种细胞均以每孔1×105个细胞接种于6孔板中的玻璃片上，分为青蒿琥酯组、青蒿素组、碳酸氢钠溶剂对照组和空白对照组，共4组。24h后青蒿琥酯组换浓度为240mg/L的含药培养液，碳酸氢钠溶剂对照组换浓度为0.1%的碳酸氢钠培养液，青蒿素组换浓度为0.206g/L的含药培养液,空白对照组仅加入等量的培养液，24h后直接将玻璃片取出，自然晾干，固定后行HE染色，在显微镜下观察形态学改变。
2.TUNEL法检测细胞凋亡和凋亡指数(AI)的计算：将对数生长期的成纤维细胞3－5代用0.25%的胰酶消化后，种植在6孔板上，每孔5×104个细胞，常规培养1天，待细胞贴壁生长后用珍珠液和水蛭素IC50的浓度作用于成纤维细胞。继续培养1d后将培养基吸出后放入离心管，然后用0.25%胰酶将贴壁的细胞消化后放入同一离心管，1000转，5分钟收集细胞，0.1%多聚赖氨酸处理玻片后，细胞涂片，室温下自然晾干。晾干后用PBS冲洗2次，40g/L多聚甲醛室温下固定10 min，PBS冲洗。加入用Tris缓冲盐溶液(TBS)新鲜稀释的蛋白酶K(比例为1：100)，37℃下作用10min。蒸馏水洗涤，加入含末端脱氧核苷酸转移酶TdT和地高辛标记的脱氧尿苷5 -三磷酸(dUTP)标记缓冲液20μl，37℃下放置2 h。TBS洗涤，加入封闭液50μl室温放置30 min，甩干；加Anti-DIG-Biotin。加SABC后，采用二氨基联苯胺（DAB）显色20 min，蒸馏水洗涤，苏木素复染，TBS洗涤、脱水、封固。将切片置于200倍光学显微镜下观察，细胞核中有棕色颗粒者为凋亡细胞。用病理图像分析仪在凋亡细胞密集区于400倍镜下连续计数5个视野的凋亡细胞及细胞总数，计算平均阳性细胞率即凋亡指数AI。
收集人皮肤增生性瘢痕，进行原代培养，所得细胞行HE染色及免疫细胞化学抗波形蛋白染色鉴定细胞为本实验所需成纤维细胞。实验分组为①空白对照组、②1‰碳酸氢钠溶液组、③青蒿琥酯（240μg/ml）组、④珍珠水解液(以钙离子含量为计,10mg/ml)组、⑤青蒿琥酯（120μg/ml）+珍珠水解液(5mg/ml)组、⑥青蒿琥酯（240μg/ml）+珍珠水解液(5mg/ml)组、⑦青蒿琥酯（240μg/ml）+珍珠水解液(10mg/ml)组共七组，分别简称为control group，1‰ SB group，Art(240μg/ml)group，HPL(10mg/ml)group，Art(120μg/ml)+HPL (5mg/ml)group，Art(240μg/ml)+HPL(5mg/ml) group，Art(240μg/ ml)+HPL(10mg/ml)group。将各组溶液分别作用于第3～5代成纤维细胞24h后，以四唑盐比色法（MTT）检测青蒿琥酯联合珍珠水解液对人皮肤瘢痕成纤维细胞增殖作用的影响；以流式细胞仪检测细胞凋亡；以实时荧光定量PCR法检测药物作用后细胞因子IL-1β、INF-γmRNA的表达情况；以Werstern-Blot法检测药物作用后细胞因子IFN-γ、IL-1β蛋白表达；对同法处理的成纤维细胞设立空白对照组及青蒿琥酯（240μg/ml）+珍珠水解液(10mg/ml)组，行透射电镜检测，观察药物作用后的成纤维细胞超微结构变化。
结果：
1、组织块培养5～7天可见周围有细小呈长梭状贴壁细胞爬出，逐渐长大、伸展，胞体为梭形、不规则形，胞质向外突出二至三个伪足，25～30天可长满25mm3培养瓶，5～7天传代一次，经传代2次后即可获得较纯的成纤维细胞。HE染色后可见细胞长梭形生长，排列不规则，胞核大，色蓝，位于细胞中央；胞浆丰富、色淡紫。抗波形蛋白抗体染色标本，所有细胞胞浆均呈棕色着色。抗角蛋白抗体染色，所有细胞胞浆、胞核均呈蓝染，胞浆未见棕黄色着色(见图1)。
2、经MTT法检测，各浓度青蒿琥酯联合珍珠水解液作用后，均能抑制成纤维细胞增殖，与空白对照组比较，有统计学差异（P＜0.05）；各浓度组间行两两比较，P＞0.05,差异无统计学意义（见表1、图2）。
表1 青蒿琥酯联合珍珠水解液对成纤维细胞存活的影响(±s)
| 组别（浓度） | A值 | 抑制率（%） | P 值 |
| 空白对照组 | 0.470±0.204 | 2.75±0.36 | --- |
| 1‰SB组 | 0.463±0.091 | 1.49±0.29 | 0.924 |
| HPL(10mg/ml)组 | 0.333±0.029 | 29.08±1.52 | 0.097 |
| Art(240μg/ml)组 | 0.250±0.024 | 46.74±2.2 | 0.012 |
| Art(120μg/ml)+ HPL(5mg/ml)组 | 0.229±0.036 | 51.21±3.8 | 0.007 |
| Art(240μg/ml)+ HPL(5mg/ml)组 | 0.206±0.046 | 56.09±2.7 | 0.003 |
| Art(240μg/ml)+ HPL(10mg/ml)组 | 0.192±0.068 | 59.21±4.6 | 0.002 |
注：各组A值与空白对照组A值比较，结果P值见上表。Art(240μg/ml)组，Art(120μg/ml)+ HPL(5mg/ml)组、Art(240μg/ml)+ HPL(5mg/ml)组及Art(240μg/ml)+ HPL(10mg/ml) 组，四组间行两两比较，P>0.05，差异无统计学意义。
3、经流式细胞术检测，各浓度青蒿琥酯联合珍珠水解液作用后，均能致成纤维细胞凋亡，与空白对照组比较，有统计学差异（P＜0.05）；且低浓度与高浓度组间、单方组与复方组间行两两比较，P＜0.05，差异有统计学意义（见表2、图3、4）。
表2 流式细胞仪检测青蒿琥酯联合珍珠水解液对成纤维细胞的凋亡诱导作用
注：P值为各组凋亡率与空白对照组凋亡率比较结果。各组间凋亡率行两两比较，①HPL(10mg/ml)组与Art(240μg/ml)组比较，P=0.003，P<0.01，差异有显著统计学意义；②Art(240μg/ml)组与Art(120μg/ml)+ HPL(5mg/ml)组比较，P=0.003，P<0.01，差异有显著统计学意义；③Art(120μg/ml)+HPL(5mg/ml)与Art(240μg/ml)+HPL(5mg/ml)组比较，P=0.000，P<0.01，差异有显著统计学意义；④Art(240μg/ml)+HPL(5mg/ml)组与Art(240μg/ml)+HPL(10mg/ml)组比较，P=0.005，P<0.01，差异有显著统计学意义；⑤Art(240μg/ml)组与Art(240μg/ml)+ HPL(5mg/ml)组、Art (240μg/ml)+ HPL(10mg/ml)组两两比较，P=0.000，P<0.01，差异有显著统计学意义；⑥HPL(10mg/ml)组与Art(240μg/ml)+HPL(10mg/ml)组比较，P=0.000，P<0.01，差异有显著统计学意义。
4、FQ-RT-PCR法检测，各浓度青蒿琥酯联合珍珠水解液作用后，IFN-γmRNA表达上调，与空白对照组比较有统计学差异（P＜0.05）；且低浓度与高浓度组间、单方组与复方组间行两两比较，P＜0.01，差异有显著统计学意义（见表3）。
表3 青蒿琥酯联合珍珠水解液对成纤维细胞IFN-γmRNA表达的影响(±s)
注：P值为各组RQ值与空白对照组RQ值比较结果。HPL(10mg/ml)组与Art(240μg/ml)组组比较，P=0.04，P＜0.05，差异有统计学意义；HPL(10mg/ml)组与Art(240μg/ml) +HPL(10mg/ml)组比较，P=0.000，P＜0.01，差异有显著统计学意义；③Art(240μg/ml)组与Art(120μg/ml)+HPL(5mg/ml)组比较，P=0.399，P＞0.05，差异无统计学意义；④Art(240μg/ml)组与Art(240μg/ml)+HPL(5mg/ml)组、Art(240μg/ml)+HPL(10mg/ml)组比较，P＜0.01，差异有显著统计学意义；⑤Art(120μg/ml)+ HPL(5mg/ml)组与Art(240μg/ml)+ HPL (5mg/ml)组比较，P=0.006，P＜0.01，差异有显著统计学意义；⑥Art(240μg/ml)+HPL(5mg/ml)组与Art(240μg/ml)+ HPL(10mg/ml)组比较，P=0.000，P＜0.01，差异有显著统计学意义。
5、FQ-RT-PCR法检测，各浓度青蒿琥酯联合珍珠水解液作用后， IL-1βmRNA表达上调，与空白对照组比较有统计学差异（P＜0.05）；且低浓度与高浓度组间、单方组与复方组间行两两比较，P＜0.01，差异有显著统计学意义（见表4、图7、8）。
表4 青蒿琥酯联合珍珠水解液对成纤维细胞IL-1βmRNA表达的影响(±s)
注：P值为各组RQ值与空白对照组RQ值比较结果。①HPL(10mg/ml)组与Art(240μg/ml)+ HPL(10mg/ml)组比较，P=0.002，P＜0.05，差异有统计学意义；②Art(240μg/ml)组与Art(240μg/ml)+ HPL(10 mg/ml)组比较，P=0.004，P＜0.01，差异有显著统计学意义；③Art(120μg/ml)+ HPL(5mg/ml)组与Art(240μg/ml)+ HPL(5mg/ml)组比较，P=0.09，P＞0.05，差异无统计学意义；④Art(120μg/ml)+HPL(5mg/ml)组与Art(240μg/ml)+HPL(10mg/ml)组比较，P=0.006，P＜0.01，差异有显著统计学意义；⑤Art(240μg/ml)+ HPL(5mg/ml)组与Art(240μg/ml)+ HPL(10mg/ml)组比较，P=0.173，P＞0.05,差异无统计学意义。
6. Western-Blot法检测药物作用后细胞因子IFN-γ及IL-1β的蛋白表达6.1.IFN-γ蛋白表达结果
以GAPDH蛋白条带作为内部参照，目的灰度值/内参灰度值为相对灰度值，各组药物对体外培养人皮肤瘢痕成纤维细胞IFN-γ蛋白的表达结果（见表5，图1-9）。
表5 青蒿琥酯联合珍珠水解液对成纤维细胞IFN-γ蛋白表达的影响(±s)
| 组别（浓度） | 相对灰度值 | P值 |
| 空白对照组 | 0.197±0.029 | ---- |
| 1‰SB组 | 0.202±0.049 | 0.874 |
| HPL(10mg/ml)组 | 0.215±0.029 | 0.510 |
| Art(240μg/ml)组 | 0.279±0.023 | 0.009 |
| Art(120μg/ml)+ HPL(5mg/ml)组 | 0.349±0.045 | 0.000 |
| Art(240μg/ml)+ HPL(5mg/ml)组 | 0.406±0.030 | 0.000 |
| Art(240μg/ml)+ HPL(10mg/ml)组 | 0.449±0.034 | 0.000 |
注：P值为各组相对灰度值与空白对照值比较结果。各组间行两两比较，①HPL(10mg/ml)组与Art(240μg/ml)+HPL(10mg/ml)组比较，P=0.000，P＜0.01，差异有显著统计学意义；②Art(240μg/ml)组与Art(240μg/ml)+HPL(10mg/ml)组比较，P=0.000，P＜0.01，差异有显著统计学意义；③Art(120μg/ml)+HPL(5mg/ml)组与Art(240μg/ml)+HPL(5mg/ml)组比较，P=0.053，P＞0.05，差异无统计学意义；④Art(120μg/ml)+HPL(5mg/ml)组与Art(240μg/ml)+HPL(10mg/ml)组比较，P=0.002，P＜0.01，差异有显著统计学意义；⑤Art(240μg/ml)+HPL(5mg/ml)组与Art(240μg/ml)+ HPL(10 mg/ml)组比较，P=0.126，P＞0.05，差异无统计学意义。Art（240μg/ml）组、Art（120μg/ml）+HPL(5mg/ml)组、Art（240μg/ml）+HPL(5mg/ml)组及Art（240μg/ml）+HPL(10mg/ml)组与空白对照组比较，差异有显著统计学意义﹙P＜0.01﹚； 1‰SB组及HPL(10mg/ml)组与空白对照组比较，差异无统计学意义﹙P＞0.05﹚。
β的蛋白表达结果：以GAPDH蛋白条带作为内部参照，目的灰度值/内参灰度值为相对灰度值，各组药物对体外培养人皮肤瘢痕成纤维细胞IL-1β蛋白的表达结果（见表6）。
表6 青蒿琥酯联合珍珠水解液对成纤维细胞IL-1β蛋白表达的影响(±s)
| 组别（浓度） | 相对灰度值 | P值 |
| 空白对照组 | 0.221±0.048 | ----- |
| 1‰SB组 | 0.213±0.042 | 0.722 |
| HPL(10mg/ml)组 | 0.252±0.028 | 0.176 |
| Art(240μg/ml)组 | 0.294±0.040 | 0.005 |
| Art(120μg/ml)+ HPL(5mg/ml)组 | 0.369±0.035 | 0.000 |
| Art(240μg/ml)+ HPL(5mg/ml)组 | 0.452±0.041 | 0.000 |
| Art(240μg/ml)+ HPL(10mg/ml)组 | 0.516±0.079 | 0.000 |
注：P值为各组与空白对照组相对灰度值比较结果。各组间行两两比较，①HPL(10mg/ml)组与Art(240μg/ml)+HPL(10mg/ml)组比较，P=0.000，P＜0.01，差异有显著统计学意义；②Art(240μg/ml)组与Art(240μg/ml)+HPL(10mg/ml)组比较，P=0.000，P＜0.01，差异有显著统计学意义；③Art(120μg/ml)+HPL(5mg/ml)组与Art(240μg/ml)+HPL(5mg/ml)组比较，P=0.002，P＜0.01，差异有显著统计学意义；④Art(240μg/ml)+HPL(5mg/ml)组与Art(240μg/ml)+HPL(10mg/ml)组比较，P=0.011，P＜0.05，差异有统计学意义。Art（240μg/ml）组、Art（120μg/ml）+HPL(5mg/ml)组、Art（240μg/ml）+HPL(5mg/ml)组及Art（240μg/ml）+HPL(10mg/ml)组与空白对照组比较，差异有显著统计学意义﹙P＜0.01﹚；1‰SB组和HPL(10mg/ml)与空白对照组比较，差异无统计学意义﹙P＞0.05﹚。
透射电镜观察药物作用后亚细胞结构的变化
在透射电镜下可见空白对照组成纤维细胞大部分呈梭形，细胞表面有多个较长而粗大的胞质突起为椭圆形，核仁明显，胞浆内内质网、核蛋白体丰富，大量椭圆形或圆形线粒体，还可见溶酶体、微丝、微管等，胞膜外侧可见均质分泌物，内侧大量分泌小泡。Art（240μg/ml）+HPL(10mg/ml)组作用于成纤维细胞24h后，电镜下见细胞胞体小，胞质突起较少，核小而核仁不明显；胞浆内内质网扩张明显，腔中内容物稀疏；线粒体数量明显减少，并出现肿胀和空泡化，基质增多；核周隙增大，溶酶体及髓鞘样结构增多。
二、药效学研究
成纤维细胞作为主要的创伤修复细胞，其生物学行为被看作是创伤愈合与瘢痕形成过程的决定性因素。阻止成纤维细胞增殖，促进其凋亡被认为是治疗和预防病理性瘢痕的有效手段。从细胞和分子水平上看，瘢痕的形成是细胞、细胞因子和细胞外基质相互作用的复杂的动态过程。其中，成纤维细胞作为创伤修复和瘢痕形成的主要参与细胞，具有合成和降解胶原的能力，胶原的代谢紊乱与成纤维细胞之间存在密切的关系。细胞因子是一类可由多种细胞分泌，能促进细胞DNA合成、促进细胞分裂、介导和调节免疫及炎症反应的小分子生物活性多肽。干扰素和白介素1被认为是瘢痕形成的负性调控因子，二者均能抑制病理性瘢痕中成纤维细胞的增殖，其表达量的增高预示成纤维细胞病理性增生得到有效抑制，故将其为验证青蒿琥酯联合珍珠水解液抗瘢痕增生的检测指标。我们通过荧光定量逆转录-聚合酶链反应法和免疫印迹法检测发现青蒿琥酯联合珍珠水解液作用于瘢痕成纤维细胞后，其IFN-γ，IL-1β及其mRNA表达均上调，提示青蒿琥酯联合珍珠水解液共同作用于人皮肤瘢痕成纤维细胞后，可导致IFN-γ和IL-1β表达增强，从而发挥抗瘢痕作用。所选用的实验药剂和仪器：青蒿琥酯（桂林制药厂）、5%NaHCO3溶液（桂林制药厂）、珍珠水解液（北海宝珠林珍珠保健品有限公司，钙浓度56mg/ml，蛋白浓度：2.45mg/ml,含氮量：0.39 mg/ml）、医用硅酮凝胶喷雾剂（疤复新，上海上大吉申科技开发有限公司）、Smad3鼠抗人单克隆抗体（美国Santa Cruz公司生产）、鼠抗人TGF-β1单克隆抗体（福州迈新生物技术公司）、鼠抗人IFN-γ单克隆抗体（美国PTG公司）、鼠抗人IL-1β单克隆抗体（美国PTG公司）、鼠抗人GAPDH单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）、羊抗兔抗鼠lgG/碱性磷酸酶标记二抗（美国Santa Cruz公司）、免疫组化试剂盒（福州迈新生物技术公司）、DAB试剂盒（北京中杉公司）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海Generay生物制品公司）、蛋白质提取试剂（上海捷瑞生物公司）、DMR+Q550型病理图像分析仪（德国Leica公司）、BS223S电子精密天平(北京赛多利斯公司)、DKB-501A恒温水浴槽(上海精宏实验设备公司)、NanoDrop 2000 超微量分光光度计（北京东方安诺生化科技公司）、PH计（瑞士梅特勒上海分公司）、TRIzol(美国Invitrigen公司)、逆转录试剂盒(美国Fermentas公司)、TaKaRa TaqTM(大连宝生物)、PCR引物(大连宝生物)、噻唑蓝（MTT）(美国sigma公司)。
病理性瘢痕的形成是由于成纤维细胞大量增殖和过度合成胶原蛋白所致。胶原蛋白合成于粗面内质网，氨基酸在粗面内质网内装配成多肽链，成纤维细胞粗面内质网上的多聚核蛋白体是胶原蛋白前体合成的场所，再由高尔基复合体运出细胞外。本发明科研人员发现，空白组瘢痕成纤维细胞功能活跃，合成胶原等细胞外基质增多；而珍珠水解液(5mg/ml)+青蒿琥酯(240μg/ml)实验组，用药后细胞形态变化显著，成纤维细胞胞体小，胞质突起较少，核小而核仁不明显，胞浆内粗面内质网明显减少，腔中内容物稀疏，线粒体肿胀及空泡化，并出现大量溶酶体和髓鞘样结构等细胞凋亡的特征性改变，说明在青蒿琥酯联合珍珠水解液作用于成纤维细胞后，能够诱导细胞凋亡，破坏细胞器结构，使胶原蛋白的合成场所明显减少，其合成受到不同程度的限制；另一方面，线粒体、内质网、高尔基复合体被破坏，使得维持细胞生命活动所需的代谢、蛋白的合成加工、运输、分泌等功能受损伤，使成纤维细胞的凋亡增加，细胞数量明显减少，从两方面抑制瘢痕增生，推测可能是青蒿琥酯联合珍珠水解液抑制瘢痕增殖的机制之一。
实验方法及结果：
1. 分离、培养、抗波形蛋白染色阳性鉴定人皮肤瘢痕组织来源的成纤维细胞。
2. 将青蒿琥酯、珍珠液和不同浓度青蒿琥酯联合珍珠液混合液作用于体外培养的第3~5代人皮肤瘢痕成纤维细胞，实验分组为①空白对照组、②1‰碳酸氢钠溶液组、③青蒿琥酯（240μg/ml）组、④珍珠水解液(以钙离子含量为计,10mg/ml)组、⑤青蒿琥酯（120μg/ml）+珍珠水解液(5mg/ml)组、⑥青蒿琥酯（240μg/ml）+珍珠水解液(5mg/ml)组、⑦青蒿琥酯（240μg/ml）+珍珠水解液(10mg/ml)组共七组。采用噻唑蓝比色分析法和流式细胞仪检测细胞凋亡，观察各组成纤维细胞增殖情况并计算增殖抑制率和凋亡指数。结果发现各浓度青蒿琥酯联合珍珠水解液作用于成纤维细胞后，可抑制细胞增殖、引起细胞凋亡。三个浓度的青蒿琥酯联合珍珠水解液组与空白对照组比较，P＜0.01，差异有显著统计学意义。在实验浓度范围内，①复方药物比单方药物能产生更高的抑制率或凋亡率，②高浓度药物比低浓度药物具有更高的抑制率或凋亡率。透射电镜下观察青蒿琥酯联合珍珠水解液组成纤维细胞超微结构变化，可见细胞线粒体数量明显减少，并出现肿胀和空泡化，核周隙增大，溶酶体及髓鞘样结构增多。提示青蒿琥酯联合珍珠水解液能抑制人皮肤瘢痕成纤维细胞增殖，并在一定浓度范围内具有浓度依赖性。荧光定量PCR法和免疫印迹法检测发现IFN-γ、IL-1β的mRNA计蛋白表达均上调，提示青蒿琥酯联合珍珠水解液共同作用于人皮肤瘢痕成纤维细胞后，可导致IFN-γ和IL-1β表达增强，可能是复方青珠瘢痕膏有效抑制皮肤瘢痕增生的机制之一。
三、药效学研究结论
通过MTT法和流式细胞术均提示青蒿琥酯联合珍珠水解液作用于成纤维细胞后，细胞凋亡增多，且随浓度增高，凋亡率增加；透射电镜下，空白组瘢痕成纤维细胞功能活跃，合成胶原等细胞外基质增多；而珍珠水解液(5mg/ml)+青蒿琥酯(240μg/ml)实验组，用药后细胞形态变化最为显著，出现细胞凋亡的特征性改变，以上均提示，青蒿琥酯联合珍珠水解液能抑制人皮肤瘢痕成纤维细胞增殖，并在一定浓度范围内具有浓度依赖性。IFN-γ和IL-1β作为瘢痕的负性调控因子，在本实验中发现两种因子随药物浓度增加表达增强。证实青蒿琥酯联合珍珠水解液作用于体外培养的人瘢痕成纤维细胞及兔耳瘢痕后，可使两种细胞因子高表达，促使胶原合成减少，胶原分解增加；认为青蒿琥酯联合珍珠水解液刺激成纤维细胞，产生IFN-γ和IL-1β增加，可能是抑制瘢痕形成的原因之一。因此，经过多组实验对比，珍珠水解液(10mg/ml)+青蒿琥酯(240μg/ml)实验组对于防治皮肤瘢痕具备最佳的效果。
采用不同浓度青蒿琥酯联合珍珠水解液的复方外用膏剂对兔耳动物模型瘢痕进行治疗，并于用药后28天后获取瘢痕标本，行HE染色及VG染色，光镜观察瘢痕区形态学改变，检测瘢痕组织的增生指数（HI）、成纤维细胞数密度（NA）及胶原纤维面积密度（AA）。结果：①大体观察显示：对照组的瘢痕凸出皮缘，质硬，色红，复方青珠膏低浓度、高浓度组略高出兔耳皮肤表面，触之质中等偏软，色泽白。复方青珠膏中浓度组较低浓度、高浓度组低平，质软，色接近兔耳正常肤色。②光镜下观察：不同浓度复方青珠膏组的成纤维细胞胞体变小，胶原纤维较稀疏，排列整齐。③不同浓度复方青珠膏组的瘢痕增生指数HI、成纤维细胞数密度NA及胶原纤维面积密度AA均小于对照组（P<0.01）。④ 免疫组织化学法及western-blot法检测不同组别的瘢痕TGF-β1、Smad3、IFN-γ及IL-1β蛋白的表达并进行统计学分析。结果发现不同浓度复方青珠膏作用后兔耳瘢痕组织TGF-β1及Smad3表达水平均低于对照组，以中浓度为最明显，相互间比较差异有显著性(P <0．05)。IFN-γ，IL-1β表达水平均高于对照组，以中浓度为最明显，相互间比较差异有显著性(P <0．05)。从而推测复方青珠瘢痕膏作用于兔耳瘢痕后，能下调TGF-β1、Smad3的表达，同时能上调瘢痕组织中IFN-γ和IL-1β的蛋白表达,且在一定浓度范围内，具有浓度依赖性， 从而发挥抑制病理性瘢痕增生的作用。
附图说明
图1各组药物对兔耳瘢痕增生指数的影响：1-空白对照组，2-膏体膏体基质对照组，3-复方青珠膏低浓度组（青蒿琥酯药物浓度0.48%，珍珠水解液0.3%），4-复方青珠膏中浓度组（青蒿琥酯药物浓度0.96% ，珍珠水解液3%），5-复方青珠膏高浓度组（青蒿琥酯药物浓度1.92%，珍珠水解液3%）；*-差异有统计学意义。
图2 各组药物对兔耳成纤维细胞数密度的影响：1-空白对照组，2-膏体膏体基质对照组，3-复方青珠膏低浓度组（青蒿琥酯药物浓度0.48%，珍珠水解液0.3%），4-复方青珠膏中浓度组（青蒿琥酯药物浓度0.96% ，珍珠水解液3%），5-复方青珠膏高浓度组（青蒿琥酯药物浓度1.92%，珍珠水解液3%）；*-差异有统计学意义。
图3 各组药物对兔耳胶原纤维的面密度的影响：1-空白对照组，2-膏体膏体基质对照组，3-复方青珠膏低浓度组（青蒿琥酯药物浓度0.48%，珍珠水解液0.3%），4-复方青珠膏中浓度组（青蒿琥酯药物浓度0.96% ，珍珠水解液3%），5-复方青珠膏高浓度组（青蒿琥酯药物浓度1.92%，珍珠水解液3%）；*-差异有统计学意义。
图4 免疫印记法检测各组药物对兔耳瘢痕组织中TGF-β1、Smad3的表达：图4中从左至右分别为1-空白对照组，2-膏体膏体基质对照组，3-复方青珠膏低浓度组（青蒿琥酯药物浓度0.48%，珍珠水解液0.3%），4-复方青珠膏中浓度组（青蒿琥酯药物浓度0.96% ，珍珠水解液3%），5-复方青珠膏高浓度组（青蒿琥酯药物浓度1.92%，珍珠水解液3%）
图5 免疫印记法检测各组药物对兔耳瘢痕组织中IFN-γ、IL-1β蛋白的表达：图5中从左至右分别为1-空白对照组，2-膏体膏体基质对照组，3-复方青珠膏低浓度组（青蒿琥酯药物浓度0.48%，珍珠水解液0.3%），4-复方青珠膏中浓度组（青蒿琥酯药物浓度0.96% ，珍珠水解液3%），5-复方青珠膏高浓度组（青蒿琥酯药物浓度1.92%，珍珠水解液3%）
图6 流式细胞仪检测青蒿琥酯联合珍珠水解液对成纤维的凋亡诱导作用：1—空白对照组；2—1‰碳酸氢钠对照组；3—珍珠水解液(10mg/ml)组；4—青蒿琥酯(240 μg／ml)组；5—青蒿琥酯(120μg／ml)+珍珠水解液(5mg/ml)组; 6—青蒿琥酯(240μg／ml)+珍珠水解液(5mg/ml)组; 7—青蒿琥酯(240μg／ml)+珍珠水解液(10mg/ml)组。*-差异有统计学意义。图7流式细胞仪检测青蒿琥酯联合珍珠水解液对成纤维的凋亡诱导作用：1—空白对照组；2—1‰碳酸氢钠对照组；3—珍珠水解液(10mg/ml)组；4—青蒿琥酯(240 μg／ml)组；5—青蒿琥酯(120μg／ml)+珍珠水解液(5mg/ml)组; 6—青蒿琥酯(240μg／ml)+珍珠水解液(5mg/ml)组; 7—青蒿琥酯(240μg／ml)+珍珠水解液(10mg/ml)组。*-差异有统计学意义。
图8实时荧光定量PCR法检测青蒿琥酯联合珍珠水解液对成纤维细胞IFN-γmRNA表达的影响：1—空白对照组；2—1‰碳酸氢钠对照组；3—珍珠水解液(10mg/ml)组；4—青蒿琥酯(240 μg／ml)组；5—青蒿琥酯(120μg／ml)+珍珠水解液(5mg/ml)组; 6—青蒿琥酯(240μg／ml)+珍珠水解液(5mg/ml)组; 7—青蒿琥酯(240μg／ml)+珍珠水解液(10mg/ml)组。*:差异有统计学意义。
图9实时荧光定量PCR法检测青蒿琥酯联合珍珠水解液对成纤维细胞IL-1βmRNA表达的影响：1—空白对照组；2—1‰碳酸氢钠对照组；3—珍珠水解液(10mg/ml)组；4—青蒿琥酯(240 μg／ml)组；5—青蒿琥酯(120μg／ml)+珍珠水解液(5mg/ml)组; 6—青蒿琥酯(240μg／ml)+珍珠水解液(5mg/ml)组; 7—青蒿琥酯(240μg／ml)+珍珠水解液(10mg/ml)组。*:差异有统计学意义。
具体实施方式
以下是该技术方案的具体实施方式：
实施例1
将活性成分结合水包油（O/W）剂型（软膏剂）：
处方：青蒿琥酯0.96克，珍珠水解液0.3克，白凡士林15克（基质）,十八醇8克（基质）,单硬脂酸甘油酯（基质）2克,十二烷硫酸钠1克（乳化剂），甘油7克（保湿剂）,对羟基苯甲酸乙酯0.2克（防腐剂）,蒸馏水65.54克。
制法：取油性材料白凡士林12克、十八醇8克、单硬脂酸甘油酯2克混合水浴上加热至80℃融化成油相，另将十二烷硫酸钠1克、甘油7克、对羟基苯甲酸乙酯0.2克溶于65.54蒸馏水中，加热至85℃，制成水相溶液；将水相缓慢加入油相中并搅拌均匀；稍降温后，将青蒿琥酯0.96克及珍珠水解液0.3克加入，边加边搅拌均匀，搅拌直至冷凝即得100克膏剂。
实施例2
将活性成分结合油包水（W/O）剂型：
处方：青蒿琥酯1.92克，珍珠水解液0.3克，硬脂酸1.25克（基质）,单硬脂酸甘油酯1.7克（基质）,蜂蜡0.5克（基质）,白凡士林6.7克（基质）,地蜡 7.5克（基质）,双硬脂酸铝1克（乳化剂）,氢氧化钙0.1克（乳化剂）,液状石蜡41克（防腐剂）,羟苯乙酯0.1克（防腐剂）,蒸馏水37.93克。
制法:取硬脂酸1.25克，单硬脂酸甘油酯1.7克、蜂蜡0.5克、地蜡7.5克，在70℃水浴上加热融化，再加入液状石蜡41克、白凡士林6.7克、双硬脂酸铝1克，加热至80℃融化成油相；另将氢氧化钙0.1克、羟苯乙酯0.1克溶于蒸馏水中，加热至80℃，制成水相溶液；将水相缓慢加入油相中搅拌；稍降温后，再将青蒿琥酯1.92克及珍珠水解液液0.3克加入，边加边搅拌，冷凝即得100克膏剂。
实施例3
将活性成分结合半固体剂型：
处方：青蒿琥酯1.92克，珍珠水解液1.5克，尼泊金乙酯粉末0.03克（抑菌剂），氯化钠 0.9克（等渗调节剂），三乙醇胺1克（PH调节剂），卡波姆-940粉末5克（基质），蒸馏水89.65克。
制法:取10克蒸馏水，边搅拌边将5克卡波姆-940粉末撒入，继续搅拌至卡波姆-940粉末完全分散到蒸馏水中，边搅拌边加入三乙醇胺1克，使成凝胶基质，备用。室温下将0.9克氯化钠溶于9.65克蒸馏水中，备用。边搅拌边将1.92克青蒿琥酯、1.5克珍珠水解液及尼泊金乙酯溶液0.03克加入凝胶基质中，加70克蒸馏水补足至100克，搅匀即可。
实施例4
将活性成分结合气体剂型：
处方：青蒿琥酯0.48克，珍珠水解液3克，乙醇29.65克(溶剂),氢氟烷烃 (抛射剂)66.87克,制成100克。
制法：先将青蒿琥酯0.48克、珍珠水解液3克溶于乙醇29.65克中，过滤，灌入已处理好的容器内，装上阀门，轧紧封帽，用压装法灌注氢氟烷烃补足至100克即得。
实施例5
将活性成分结合半固体剂型：
处方：青蒿琥酯1.28克，珍珠水解液0.8克，邻苯二甲酸二丁酯4克（防腐剂），聚乙烯醇缩甲乙醛15克(成膜材料)，乙醇、丙酮（1:3）混合溶剂（基质）78.92克，制成100克。
制法：将青蒿琥酯1.28克、珍珠水解液0.8克溶于78.92克乙醇、丙酮（1:3）混合溶剂中，再加入邻苯二甲酸二丁酯4克、聚乙烯醇缩甲乙醛15克搅拌均匀，最后再加入乙醇、丙酮（1:3）混合溶剂至100克，搅匀即可。
实施例6：
将活性成分结合液体剂型：
处方：青蒿琥酯0.75克，珍珠水解液6克，月桂氮卓酮60克(溶剂)，乙醇33.25克（溶剂），制成100克。
制法：取青蒿琥酯0.75克、珍珠水解液6克，溶于60克月桂氮卓酮中，加乙醇补足至100克，搅匀，即得。
临床观察数据
本发明科研人员在权利要求的数值范围内配制了以青蒿琥酯联合珍珠水解液为活性成分的低、中、高三种复合药物浓度的外用抗瘢痕膏剂，并通过建立的兔耳瘢痕动物模型，在给药前后的不同的时间点，观察瘢痕增生情况，通过临床观察数据来看，以青蒿琥酯联合珍珠水解液制成的膏剂对瘢痕增生的情况有较好的疗效，疗效较单独使用青蒿琥酯或者珍珠水解液要更好，取得了意想不到的的技术效果。各实验组用药前瘢痕均明显高出于兔耳正常皮肤，瘢痕表面色呈红色或棕红色，质地较硬。用药28天后空白对照组和膏体基质对照组瘢痕仍明显高出于兔耳皮肤表面，颜色较深红，质地硬。复方青珠膏中低浓度组、高浓度组略高出兔耳皮肤表面，触之质中等偏软，色泽白。中浓度组组较低、高浓度组低平，质软，色接近兔耳正常肤色；与阳性对照药物效果接近。用药后分析病理切片发现复方青珠瘢痕膏治疗组中皮肤瘢痕真皮层变薄，成纤维细胞数量逐渐减少、核变小，胶原纤维结构不清，致密程度下降，整体变稀疏，排列相对比较规则。我们还通过免疫组织化学法和免疫印迹法检测发现三组复方青珠瘢痕膏能下调兔耳瘢痕中的转化生长因子β1（Transforminggrowth factor beta 1, TGF-β1）、果蝇抗皮肤生长因子原体3（Mothers againstdecapentaplegic homolog 3, Smad3）、干扰素-γ（Interferon-gamma，IFN-γ）及白细胞介素1β（Interleukin-1 beta ，IL-1β）的表达。
综上，通过建立兔耳瘢痕动物模型，观察不同浓度青蒿琥酯联合珍珠水解液对增生性瘢痕的影响，发现其可明显抑制成纤维细胞的增殖和胶原的合成，降低TGF-β1及其Smad3信号的表达。其中复方青珠膏中浓度组效果最好、最明显。青蒿琥酯联合珍珠水解液抑制兔耳瘢痕生长推测其机理可能是抑制TGF-β1及Smad3的表达，导致由Smad3介导的TGF-β1与受体结合产生的信号从细胞质转导到核内的作用减弱，并上调抗瘢痕因子IFN-γ和IL-1β的表达，从而抑制病理性瘢痕的发展。
1. 实验方法
1.1 兔耳瘢痕动物模型的制备
新西兰大耳白兔30只，清洁级，兔龄3~4个月，雌雄不拘（不含孕兔），兔耳健全，体重1.8~2.5千克（由广西医科大学动物实验中心提供）。腹腔注射麻醉后，常规消毒铺巾，每侧兔耳腹侧用自制打孔器制作6个圆形创面。
1.2动物分组
手术后28天创面完全上皮化后，随机分成6个组分别设为：
A组：空白对照组
B组：膏体膏体基质对照组
C组：复方青珠膏低浓度组（青蒿琥酯药物浓度0.48%，珍珠水解液0.3%）
D组：复方青珠膏中浓度组（青蒿琥酯药物浓度0.96% ，珍珠水解液3%）
E组：复方青珠膏高浓度组（青蒿琥酯药物浓度1.92%，珍珠水解液3%）
F组：硅酮凝胶组（阳性对照组）
1.3 实验膏剂的制备
膏体基质对照组的膏剂制备：按实施例1中所述“水包油”法配制各组膏剂。
1.4 实验膏剂的检测
1.4.1 复方膏剂的性状
本制品为乳白色膏体，黏稠度合适，细腻均匀，不流淌，不融化，容易涂抹。
1.4.2 复方膏剂稳定性检测
（1）离心实验：(3000转/分)30分钟离心，未见分层现象，常温下放置2个月以上，未出现油水分离、变色、变硬现象。
（2）耐热耐寒实验：60摄氏度烘箱恒温6小时与- 15摄氏度冰箱内放置24小时，软膏无变硬、水析现象。
1.4.3 复方膏剂的pH值：本品pH值为7.7～8.5。
1.5 干预
于术后28天开始对各实验组在兔耳瘢痕部位外涂相应膏剂进行干预，并轻揉至药物吸收，每天3次，连续用药28天。
1.6 标本取材及处理
用药28天后，切取兔耳瘢痕标本。所有取下的标本经瘢痕中凸起最高点沿瘢痕最大径方向分切成两部分，一部分用4%的多聚甲醛固定，用于光镜观察及免疫组化；另一部分放置于-80摄氏度冰箱冻存用于免疫印迹（Western-Blot）法分析。
1.7 观察指标
1.7.1 大体观察兔耳瘢痕、苏木素-伊红染色（HE）染色苦味酸-酸性品红（VanGieson, VG）染色观察：
常规HE染色封片，镜下观察①瘢痕组织的成纤维细胞与胶原纤维排列情况；②瘢痕增生指数（Hypertrophic index,HI），低倍镜（×40）下用显微测量标尺测量HE染色切片，按公式HI=A'/B'计算瘢痕增生指数，其中A'为瘢痕最突起点距离兔耳软骨表面的垂直厚度，而B'为瘢痕周围的正常皮肤上界距离兔耳软骨表面的垂直厚度；③成纤维细胞数密度（Numerical density on area, NA），高倍光镜（×400）下观察瘢痕HE染色切片。VG染色为胶原纤维的特殊染色方法，镜下观察胶原纤维的面密度（Area density on area, AA）。
结果发现，术后20天左右兔耳可形成外观凸起的瘢痕组织，淡红色，触之质较硬，增生范围不超过原创缘；此后硬块不断高于皮肤表面，至术后第28天时瘢痕形成基本稳定。用药28天后大体及HE染色观察发现复方青珠膏组瘢痕变低平，变软，色接近兔耳正常肤色，中浓度组最明显。VG染色显示复方青珠膏低浓度、中浓度、高浓度组瘢痕组织胶原纤维较稀疏，排列比较规则，呈水平方向，其中复方青珠膏中浓度组胶原纤维最为稀疏。复方青珠膏组瘢痕增生指数、成纤维细胞数密度和胶原纤维的面密度均降低，以中浓度组最明显，差异有统计学意义(P<0.01)。
1.7.2 免疫组织化学检测各组TGF-β1、Smad3、IFN-γ及IL-1β蛋白的表达情况：
免疫组织化学SABC法检测TGF-β1蛋白的表达：一抗为鼠抗人TGF-β1抗体(1：100)；免疫组织化学SP法检测瘢痕组织中Smad3的表达：一抗为鼠抗人Smad3抗体（1：100）。免疫组织化学（ABC法）检测各组IFN-γ及IL-1β蛋白的表达：一抗为鼠抗兔IFN-γ抗体(1：100)、鼠抗兔IL-1β抗体(1：100)，滴加生物素标记二抗。具体操作严格照试剂盒操作说明，PBS代替一抗做空白对照。
TGF-β1阳性表达,为黄或棕黄色颗粒,主要主要分布在细胞质，定位于上皮基底层细胞和真皮层的成纤维细胞,小血管内皮细胞呈阳性至强阳性表达。Smad3的棕黄色或黄色阳性颗粒主要表达于瘢痕组织的成纤维细胞的细胞核与细胞浆。IFN-γ主要位于瘢痕组织成纤维细胞的细胞浆、间质细胞以及表皮细胞基底层呈棕黄色或黄色染色。IL-1β主要位于瘢痕组织成纤维细胞和间质细胞的细胞浆，呈棕黄色或黄色染色。
结果发现，镜下观察见复方青珠膏低、中、高浓度组TGF-β1、Smad3的表达较空白对照组和基质组明显减弱，以中浓度组最明显，差异有统计学意义。复方青珠膏低、中、高浓度组IFN-γ、IL-1β表达明显增强，以中浓度组最明显，差异有统计学意义。
1.7.3 Western blot法检测复方青珠瘢痕膏作用后，兔耳瘢痕组织中TGF-β1、Smad3、IFN-γ及IL-1β蛋白的表达情况：
取上述-80摄氏度冻存的兔耳瘢痕组织，加入适量蛋白提取液，4摄氏度离心(12000转/分)20分钟，100摄氏度水浴变性，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。各组蛋白加样总量一致为10微克。聚丙烯酰氨凝胶电泳，4摄氏度稳流下（200毫安）转膜。分别加入一抗（鼠抗人TGF-β1抗体（1：500），鼠抗人Smad3抗体（1：500）、鼠抗人IFN-γ（1:400）及鼠抗人IL-1β（1:400），4摄氏度过夜。充分洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温下孵育1小时。漂洗，显色，显影及定影，计算机扫描，应用Quantity One软件对条带进行灰度，分析处理。
结果发现，复方青珠膏低、中、高浓度组TGF-β1、Smad3的表达较空白对照组和基质组明显减弱，以中浓度组最明显，差异有统计学意义。复方青珠膏低、中、高浓度组IFN-γ、IL-1β表达明显增强，以中浓度组最明显，差异有统计学意义。
在本发明的实施过程中，本领域普通技术人员在不脱离本发明的范围和精神实质的基础上产生的各种实施方案和修饰是显而易见的并且是容易进行的，本发明不限于本文所述的特定的实施方案的范围，确实，本发明的各种修饰，除了已经叙述的那些是可以从前面的叙述中被本领域的技术人员理解的。通过下面的实施例来对本发明做进一步具体说明，但并不表示实施例对本发明的限制。
Claims (3)
1.一种防治皮肤瘢痕的药物组合物，其特征在于以100g该组合物计，由下列活性成分组成： （1）青蒿琥酯0.48g～1.92g；
（2）珍珠水解液0.3g～6g，其中所用珍珠水解液的质控标准：钙浓度：30～80mg/ml，蛋白浓度：1.5～3mg/ml，含氮量：0.3～0.5 mg/ml。
2.根据权利要求1所述的防治皮肤瘢痕的药物组合物，其特征在于：以100g该组合物计，由下列成分组成：
（1）青蒿琥酯0.48g～1.92g；
（2）珍珠水解液0.3g～6g，其中所用珍珠水解液的质控标准：钙浓度56mg/ml，蛋白浓度：2.45mg/ml,含氮量：0.39 mg/ml；
（3）其余为常规药剂辅料。
3.根据权利要求1所述的防治皮肤瘢痕的药物组合物的制备方法，其特征在于，所述步骤如下：
步骤①药剂辅料基质按常规方法制成；
步骤②制备青蒿琥酯药液：将青蒿琥酯用5%的NaHCO3溶液解配成备用溶液；
步骤③在药剂辅料基质中加入青蒿琥酯药液和珍珠水解液这两种活性成分，同时均匀混合获得，按照上述的方法制备基质与活性成分均匀混合后制成的制剂。
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