CN103951682A

CN103951682A - 一种电化学探针及其合成方法

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Publication number: CN103951682A
Application number: CN201410196436.2A
Authority: CN
Inventors: 王卫; 罗细亮; 柳士霞
Original assignee: Qingdao University of Science and Technology
Current assignee: Qingdao University of Science and Technology
Priority date: 2014-05-12
Filing date: 2014-05-12
Publication date: 2014-07-30
Anticipated expiration: 2034-05-12
Also published as: CN103951682B

Abstract

本发明提供了一种可用于检测生物活性巯基物的电化学探针及其合成方法。本发明首次将四硫富瓦烯集团(TTF)与具有巯基反应活性的集团融合在一起，提出一种新的电化学探针，其名称为：2-[4,5-双(丙基硫烷基)-1,3-二硫杂环戊烯基-2-亚基][1,3]二硫杂环戊烯并[4,5-f]-2,1,3-苯并硒二唑。该探针的特点是：在其分子结构中同时含有灵敏的巯基反应活性集团及TTF集团，不但具有灵敏的电化学信号，而且还能够与巯基物发生特异性反应。因此，利用该探针，能够实现对巯基物的高灵敏、高选择性检测。它为电分析化学在生物学及临床医学、癌症的早期诊断、治疗等生命科学的进一步应用提供了新的途径和手段。

Description

一种电化学探针及其合成方法

技术领域

本发明属于生物医学及生命科学领域，具体涉及一种检测巯基物的电化学探针及其合成方法。

背景技术

具有生物活性的巯基物广泛存在于生物体内各种组织、细胞及体液中,如L-半胱氨酸(L-Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽等，它们作为机体内重要的抗氧化物质，能够参与多种生化反应，对细胞生长及功能调控发挥了重要作用。还原型谷胱甘肽(GSH)作为动、植物细胞内含量最为丰富的非蛋白巯基物，自1921年被首次发现以来，其在人体组织及细胞中的含量以及与各种疾病的关系备受关注，得到广泛的研究。研究表明，生物体内细胞及组织当中谷胱甘肽及相关巯基化合物浓度的改变与多种疾病的产生及发展密切相关，如老年痴呆症、帕金森综合征、糖尿病、酒精肝中毒、白内障、心血管疾病、动脉粥样硬化、关节炎、癫痫、衰老以及多种类型的癌症等。目前，GSH等巯基化合物的检测日益成为临床医学及生命科学研究中关于疾病发生、发展及治疗监测方面氧化应激的重要指标之一，同时，也用于人类各种疾病如肝癌等癌症的常规诊断和监控。但直到目前，癌细胞中GSH等巯基化合物的检测还缺少国家标准测定方法。因此，建立快速、稳定、灵敏、经济的测定方法，对于疾病的早期诊断、预防及有效治疗具有重要的意义。

巯基化合物的传统检测方法包括紫外/可见分光光度法、荧光法、质谱法、电化学法、高效液相色谱法等多种方法，它们在灵敏度、选择性、稳定性、检测时间、仪器成本等方面各有优缺点，普遍存在操作步骤繁琐、仪器成本较高、样品处理耗时等问题。由于电化学法具有灵敏、快捷、低成本、便于微型化、可便携等显著特点，因此，成为极具潜力的巯基物分析检测方法。

然而，早期文献报道的电化学方法存在诸如过电位教高、毒性、修饰电极缺乏稳定性及重现性等问题，限制了电化学法的广泛应用。因此，建立一种经济、灵敏、迅速及高选择性的新的电化学测定方法用于GSH的检测迫在眉睫。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，同时，也为了更加有效地利用电化学法的显著优点，针对检测巯基化合物的电化学探针分子少有报道，因此，本发明的第一目的：构建并合成一种新型的可用于检测巯基物的电化学探针，首次将具有独特的电化学性质的四硫富瓦烯集团与具有巯基反应活性的集团融合在一起，使该探针不但具有灵敏的电化学活性，而且能够与具有生物活性的巯基化合物发生灵敏的特异反应；本发明的第二目的：提供一种该电化学探针的制备方法。将本发明提出的电化学探针用于巯基物的电化学检测，有效克服了现有技术操作复杂、繁琐等不足，无需电极修饰及样品衍生处理，实现了巯基化合物高选择性、高灵敏度、方便、低成本的快速检测。

本发明的电化学探针名称为：2-[4,5-双(丙基硫烷基)-1,3-二硫杂环戊烯基-2-亚基][1,3]二硫杂环戊烯并[4,5-f]-2,1,3-苯并硒二唑，结构式如下:

本发明电化学探针的合成方法包括以下步骤:

a.在容器中加入3.0-5.0g邻苯二胺、11.0-20.0g硫氰酸钾、150-400mL甲醇，在干冰丙酮低温浴条件下加入溴的甲醇溶液，反应完毕后，室温搅拌1.5-3h，抽滤，将滤液倒入300-500mL水中，抽滤后在滤液中加入25-40mL氨水，抽滤、水洗、干燥，得到中间体(I)：4,5-双(异硫氰基)-1,2-邻苯二胺，其结构式如下:

所述的溴的甲醇溶液为3～5mLBr₂溶解于50～80mL甲醇；

b.称取上述中间体(I)3.0～4.0g、硫化钠5.5～7.5g，加入150～200mL水，70℃油浴加热0.5～1h，冰水浴条件下加入1.5～2.5mL的二硫化碳，反应完成后，50℃油浴加热1～2h，冷却至室温，将固体物分离并干燥，采用硅胶柱层析分离纯化，以乙酸乙酯和二氯甲烷的混合溶剂作为洗脱剂进行洗脱，得到中间体(II)：5,6-二氨基-1,3-苯并二硫杂环戊烯-2-硫酮，其结构式如下:

所述的洗脱剂采用乙酸乙酯：二氯甲烷＝2:1～4:1(v/v)；

c.取上述中间体(II)适量于研钵中，按计量比1:1～1:1.5加入二氧化硒，室温，研磨1～2h，可加入适量环己烷，采用硅胶柱层析分离纯化，以二氯甲烷和己烷的混合溶剂作为洗脱剂进行洗脱，得到橘红色中间体(III)，[1,3]二硫杂环戊烯并[4,5-f]-2,1,3-苯并硒二唑-6-硫酮，其结构式如下:

所述的洗脱剂采用二氯甲烷：己烷＝2:1～4:1(v/v)；

d.在Ar气保护下，将适量亚磷酸三乙酯加入到含有上述中间体(III)和4,5-双(丙硫基)-1,3-二硫杂环戊烯-2-酮的甲苯溶液中，混合物在120℃回流，保持2～3h，冷却至室温，过滤，用甲醇洗涤沉淀，采用硅胶柱层析分离纯化，以二氯甲烷和己烷的混合溶剂作为洗脱剂进行洗脱，得到暗红色固体，即电化学探针分子纯品2-[4,5-双(丙基硫烷基)-1,3-二硫杂环戊烯基-2-亚基][1,3]二硫杂环戊烯并[4,5-f]-2,1,3-苯并硒二唑；

所述的含有中间体(III)和4,5-双(丙硫基)-1,3-二硫杂环戊烯-2-酮的甲苯溶液为中间体(III)：4,5-双(丙硫基)-1,3-二硫杂环戊烯-2-酮＝1:1～1:3的计量比的甲苯溶液；

所述的洗脱剂采用二氯甲烷：己烷＝1:1～3.5:1(v/v)。

合成路线如下所示：

本发明的电化学探针可用于生物医药及生命科学领域中GSH及相关巯基化合物的检测、生物组织和细胞内GSH及相关巯基化合物的检测，以及临床医学中涉及多种重大疾病的早期诊断及治疗的GSH及相关巯基化合物的检测。

本发明的有益效果：本发明提出的电化学探针分子中含有灵敏的巯基反应集团，该活性集团不但具有灵敏的电化学信号，而且还能够与巯基化合物发生特异性反应，对GSH等生物活性巯基化合物具有很好的选择性。利用该电化学探针分子，能够实现对巯基化合物高灵敏、高选择性的检测。本发明的电化学探针分子结构简单，稳定性好，电化学信号灵敏，对巯基物响应迅速灵敏，同时，不受其它常见干扰物质影响，具有良好的选择性，可应用于生物体系中巯基化合物的电化学检测。实验结果表明，探针分子的电化学信号与GSH在1.0×10^-10～1.0×10^-9M浓度范围内呈线性关系，表现出电化学探针分子优良的性能，在生物医学、生命科学等领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1.电化学探针(25.2μM)(a)，电化学探针(25.2μM)+不同浓度GSH(5.0×10^-10；1.0×10^-9；5.0×10^-9M)在0.2MBR缓冲溶液中(pH2.0)反应20min后的循环伏安曲线(b→d)。

具体实施方式

下面通过实施例具体地说明本发明，但本发明不受下述实施例的限定。

实施例1：电化学探针的合成步骤：

a.在容器中加入3.5g邻苯二胺、13.0g硫氰酸钾、200mL甲醇，在干冰丙酮低温浴条件下加入溴的甲醇溶液，反应完毕后，室温搅拌1.5h，抽滤，将滤液倒入400mL水中，抽滤后在滤液中加入25mL氨水，抽滤、水洗、干燥，得到黄色中间体(I)：4,5-双(异硫氰基)-1,2-邻苯二胺，其结构式如下:

所述的溴的甲醇溶液为3mLBr₂溶解于50mL甲醇。

b.称取上述中间体(I)3.0g、硫化钠5.5g，加入150mL水，70℃油浴加热0.5h，冰水浴条件下加入1.5mL的二硫化碳，反应完成后，50℃油浴加热1h，冷却至室温，将固体物分离并干燥，采用硅胶柱层析分离纯化，以乙酸乙酯和二氯甲烷的混合溶剂作为洗脱剂进行洗脱，得到橘黄色中间体(II)：5,6-二氨基-1,3-苯并二硫杂环戊烯-2-硫酮，其结构式如下:

所述的洗脱剂采用乙酸乙酯：二氯甲烷＝2:1(v/v)。

c.取上述中间体(II)适量于研钵中，按1:1.2计量比加入二氧化硒，室温，研磨2h，可加入适量环己烷，采用硅胶柱层析分离纯化，以二氯甲烷和己烷的混合溶剂作为洗脱剂进行洗脱，得到橘红色中间体(III)，[1,3]二硫杂环戊二烯[4,5-f]-2,1,3-苯并硒二唑-6-硫酮，其结构式如下:

所述的洗脱剂采用二氯甲烷：己烷＝2:1(v/v)。

d.将8mL亚磷酸三乙酯加入到含有上述中间体(III)145mg和4,5-双(丙硫基)-1,3-二硫杂环戊烯-2-酮333mg(计量比为1:2.5)的甲苯溶液中，混合物在120℃回流，保持3h，冷却至室温，过滤，用甲醇洗涤沉淀，采用硅胶柱层析分离纯化，以二氯甲烷和己烷的混合溶剂作为洗脱剂进行洗脱，得到暗红色固体，即电化学探针分子纯品2-[4,5-双(丙基硫烷基)-1,3-二硫杂环戊烯基-2-亚基][1,3]二硫杂环戊烯并[4,5-f]-2,1,3-苯并硒二唑；

所述的洗脱剂采用二氯甲烷：己烷＝1:1(v/v)。

电化学探针的基本数据:

暗红色固体，m.p.:146-147℃；

IR(KBr):＝3436,2958,1636,1457,1418,1347,1266,1072,886,837,773,749,730cm^-1；

¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆):δ＝8.04(s,2H),2.85-2.90(t,4H),1.56-1.64(m,4H),0.95-1.00(t,6H)；

¹³CNMR(75MHz,DMSO-d₆):δ＝158.8,143.4,127.8,116.7,112.9,107.8,38.3,23.1,13.1ppm；

HRMS(ESI:C₁₆H₁₆N₂S₆Se):m/z，计算值:507.8803；测定值:507.8870.

实施例2:电化学探针的电化学性能

仪器与试剂

CHI832B电化学分析仪(上海辰华仪器厂)；所有电化学实验均使用三电极系统，以铂丝为辅助电极，Ag/AgCl(饱和KCl)电极为参比电极，裸金电极为工作电极(直径：2.0mm)。微分脉冲伏安实验在室温下传统电化学池中进行。采用PHS-3DpH酸度计(复合饱和甘汞电极，上海雷磁仪器厂)检测溶液pH值。

GSH溶液的配制：准确称取3.07mgGSH于烧杯中，用少量水溶解后转移到10mL容量瓶中，用二次水定容，得到1.0×10^-3MGSH溶液。

电化学探针溶液的配制：准确称取3.2mg电化学探针于烧杯中，用少量丙酮溶解后转移到50mL容量瓶中，用丙酮和水定容，得到1.26×10^-4M电化学探针溶液，置于冰箱中冷藏保存，用时稀释即可。

循环伏安实验：在电位范围0.5V～-0.4V，首先测定了25.2μM电化学探针溶液的循环伏安曲线(图1，曲线a)，随后测定了加入不同浓度GSH(5.0×10^-10；1.0×10^-9；5.0×10^-9M)在0.2MBR缓冲溶液中(pH2.0)反应20min后的循环伏安图(图1，曲线b→d)，扫速:100mV/s。由图1可以看出：在-0.247V电位附近出现一个峰型良好的电化学信号(曲线a)，该信号为本发明所述的电化学探针的还原峰信号。当加入GSH后，该探针的电化学信号显著降低，且随GSH浓度的增加，电化学信号逐渐降低。实验结果表明，本发明所述的电化学探针具有灵敏的电化学活性，能够产生峰型良好的电化学信号，当加入GSH后，该探针的电化学信号显著降低，且随GSH浓度的增加，电化学信号逐渐降低，说明电化学探针与GSH发生了特异性反应，根据这一现象，可以实现GSH的检测。

Claims

1.一种电化学探针，其特征在于：该电化学探针的分子结构中含有四硫富瓦烯集团。

2.一种电化学探针，其特征在于：该电化学探针的结构式为:

3.根据权利要求1或2所述的电化学探针的合成方法，其特征在于包括以下步骤:

(1)在容器中加入3.0～5.0g邻苯二胺、11.0～20.0g硫氰酸钾、150～400mL甲醇，在干冰丙酮低温浴条件下加入溴的甲醇溶液，反应完毕后，室温搅拌1.5～3h，抽滤，将滤液倒入300～500mL水中，抽滤后在滤液中加入25～40mL氨水，抽滤、水洗、干燥，得到中间体(I)：4,5-双(异硫氰基)-1,2-邻苯二胺；

(2)称取上述中间体(I)3.0～4.0g、硫化钠5.5～7.5g，加入150～200mL水，70℃油浴加热0.5～1h，冰水浴条件下加入1.5～2.5mL二硫化碳，反应完成后，50℃油浴加热1～2h，冷却至室温，将固体物分离并干燥，采用硅胶柱层析分离纯化，以乙酸乙酯和二氯甲烷的混合溶剂作为洗脱剂进行洗脱，得到中间体(II)：5,6-二氨基-1,3-苯并二硫杂环戊烯-2-硫酮；

(3)取上述中间体(II)适量于研钵中，按1:1～1:1.5计量比加入二氧化硒，室温，研磨1～2h，可加入适量环己烷，采用硅胶柱层析分离纯化，以二氯甲烷和己烷的混合溶剂作为洗脱剂进行洗脱，得到橘红色中间体(III)：[1,3]-二硫杂环戊烯并[4,5-f]-2,1,3-苯并硒二唑-6-硫酮；

(4)在Ar气保护下，将适量亚磷酸三乙酯加入到含有上述中间体(III)和4,5-双(丙硫基)-1,3-二硫杂环戊烯-2-酮的甲苯溶液中，混合物在120℃回流，保持2～3h，冷却至室温，过滤，用甲醇洗涤沉淀，采用硅胶柱层析分离纯化，以二氯甲烷和己烷的混合溶剂作为洗脱剂进行洗脱，得到暗红色固体，即电化学探针分子纯品2-[4,5-双(丙基硫烷基)-1,3-二硫杂环戊烯基-2-亚基][1,3]二硫杂环戊烯并[4,5-f]-2,1,3-苯并硒二唑。

4.根据权利要求3所述的电化学探针的合成方法，其特征在于步骤(1)中所述的溴的甲醇溶液为3～5mLBr₂溶解于50～80mL甲醇。

5.根据权利要求3所述的电化学探针的合成方法，其特征在于步骤(2)中所述的洗脱剂采用乙酸乙酯：二氯甲烷＝2:1～4:1(v/v)。

6.根据权利要求3所述的电化学探针的合成方法，其特征在于：步骤(3)中所述的洗脱剂采用二氯甲烷：己烷＝2:1～4:1(v/v)。

7.根据权利要求3所述的电化学探针的合成方法，其特征在于：步骤(4)中所述的含有中间体(III)和4,5-双(丙硫基)-1,3-二硫杂环戊烯-2-酮的甲苯溶液为中间体(III)：4,5-双(丙硫基)-1,3-二硫杂环戊烯-2-酮＝1:1～1:3的计量比的甲苯溶液。

8.根据权利要求3所述的电化学探针的合成方法，其特征在于：步骤(4)中所述的洗脱剂采用二氯甲烷：己烷＝1:1～3.5:1(v/v)。