CN103946376A - 耐受非蛋白质氨基酸的转基因植物 - Google Patents

耐受非蛋白质氨基酸的转基因植物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了耐受生物除草剂特别是植物毒性非蛋白质氨基酸包括间-酪氨酸(m-酪氨酸)氨基酸类似物和其盐的转基因植物。本发明还提供了用于制备该转基因植物的手段和方法。

Description

耐受非蛋白质氨基酸的转基因植物
发明领域
本发明涉及耐受生物除草剂特别是植物毒性非蛋白质氨基酸包括间-酪氨酸氨基酸类似物和其盐的转基因植物，并涉及用于制备该转基因植物的方法。
发明背景
“化感作用(allelopathy)”是指植物通过该植物向环境中释放的化学物质(化感物质(allelochemical))对周围的物种的影响(抑制或刺激)的术语。化感物质通常是可在任何植物部分被合成的并可对靶生物体具有有利(正向化感作用)或不利(负面化感作用)影响的次生代谢物。化感物质不是化感作用(耐受)植物的代谢(即生长、发育和繁殖)所需要的，而干扰非耐受物种的重要代谢途径，为耐受植物提供相对优势。化感作用效应在希腊时代已被意识到。数种广泛使用的作物植物诸如小麦、水稻和黄瓜的化感作用效应的优势是已知的并被使用。最近，在杂草管理方面实施这一现象的可能性的意识已出现。在其它观察到的化感物质中，显示有前景的植物毒性活性的间-酪氨酸，被提议作为可能的环境友好的杂草抑制剂(Bertin C.等人,2007.Proceedings of the National Academy ofSciences of U.S.A104,16964-16969)。
间-酪氨酸(m-Tyr)是天然存在的非蛋白质氨基酸。其可通过两种可能的合成途径被生产：通过多巴胺合成的通路或通过苯丙氨酸被活性氧(reactive oxygen species)的氧化。常见蛋白质氨基酸酪氨酸(对-酪氨酸)的异构体(isomer)m-Tyr，已在番樱桃大戟(Euphorbia myrsinites)(驴尾大戟)和一些羊茅草物种中被发现。源自植物的m-Tyr被发现对广泛的物种是有毒的。以低至2μM的浓度添加至琼脂介质的m-Tyr抑制拟南芥(Arabidopsis thaliana)根的生长的50％，且50μM的浓度完全阻止种子萌发(Bertin C.等人2007，同上)。
蛋白质中间-酪氨酸(m-Tyr)连同邻-酪氨酸(o-Tyr)和左旋多巴(L-dopa)的出现已被广泛用作针对蛋白质造成的氧化损伤的程度的指标。已证明，在真核细胞中，某些外源提供的氧化的氨基酸包括m-Tyr，可通过生物合成通路而不是经由化学反应掺入蛋白质。因此，在许多情况下，体内受损的氨基酸可用于蛋白质的从头合成是可能的。该理论被以下的发现支持：暴露于m-Tyr导致宽范围的植物物种包括商业上重要的单子叶和双子叶作物植物的生长抑制。已进一步表明，m-Tyr的植物毒性是通过在蛋白质合成期间其代替苯丙氨酸掺入蛋白质导致的。
苯丙氨酰-tRNA合成酶(PheRS)属于氨酰-tRNA合成酶(aaRS)家族，其在遗传密码的翻译中起关键作用。aaRS确保遗传密码翻译的保真度，将适当的氨基酸共价附着至相应的核酸接头分子(adaptormolecule)-tRNA。aaRS是众所周知的多样化酶家族，在一级序列、亚基大小和低聚组织方面显著不同。系统发生和结构分析揭示了PheRS的三种主要形式：a)异源四聚的(αβ)2细菌PheRS；b)异源四聚的(αβ)2古细菌/真核-细胞质PheRS；和c)单体线粒体PheRS。
由aaRS且特别是PheRS促进的氨酰化反应的精确度，基于氨基酸底物的精确识别。然而，由于由数个氨基酸共享立体化学相似性，发生识别错误。苯丙氨酸(Phe)和酪氨酸(Tyr)仅通过芳环的一个羟基基团被区分，并因此Phe和Tyr之间的区分并非总是被实现。PheRS以1:1000的错误率成功地区分这些氨基酸。通过PheRS连同其它aaRS的校正活性(editing activity)确保了蛋白质生物合成的总精确度的较高水平。校正活性与特异性位点相关，其中错酰化(misacylated)的tRNA被水解。
本发明的一些发明人及同事研究了不同来源包括细菌(嗜热栖热菌(Thermus thermophilus,Tt)和大肠杆菌(Escherichia coli,Ec))及人(细胞质(Hsct)和线粒体(Hsmt))来源的PheRS激活m-Tyr并将其附着至tRNAPhe的能力(Klipcan,L.,等人,2009.Proceedings of the National Academy ofSciences U.S.A106,11045-11048)。自由基损伤的(radical-damaged)氨基酸通过这些酶被激活，如通过ATP水解测定的。氨酰化的稳态动力学测量(由酸性凝胶电泳方法测定)未显示tRNAPhe与m-Tyr通过细菌PheRS的错载(mischarging)(图1)。该观察结果作为用于校正机制效率的指示。此外，当细菌PheRS与预装载的m-Tyr-tRNAPhe一起孵育时，m-Tyr从tRNA脱酰化，提供了所谓的反式校正活性(trans-editing activity)的证据(Ling,J.等人,2007.Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A104,72-77)。与此相反，线粒体酶可以稳定地合成m-Tyr-tRNAPhe。HsmtPheRS不包含校正结构域，并因此不能使非关联(cognate)氨基酸从tRNA脱酰化(Roy,H.等人,2005.The Journal of biological chemistry280,38186-38192；Kotik-Kogan,O.等人,2005.Structure13,1799-1807)，为这些残基掺入蛋白质多肽链提供路径。tRNAPhe氨酰化的动力学参数分析表明，通过HsmtPheRS附着的m-Tyr的催化效率(kcat/Km)只比正确的氨基酸低5倍，主要是由于较高的Km值。线粒体PheRS对m-Tyr的相对高的催化活性和缺乏校正活性可以解释m-Tyr具有对植物的极大的毒性作用。在植物中，超过150种蛋白质在线粒体和叶绿体中表达，且存在于植物细胞器中的单体苯丙氨酰-tRNA合成酶(PheRS)与人类线粒体PheRS非常相似。因此，m-Tyr代替Phe掺入至细胞器蛋白质导致大量损伤的蛋白质，因此降低细胞活力。m-Tyr对哺乳动物细胞的中等毒性可以通过在这些细胞中线粒体仅编码13种蛋白质的事实来解释。
减少除草剂的使用已成为保持可持续农业和景观管理中的显著目标。在发展用于杂草控制的可有效取代危险化学品的使用的生物和有机方法中存在不断的努力。与此同时，采取分子遗传学方法和/或采用天然产物努力实现用于保护作物植物免受植物毒性化合物损害的手段和方法。
例如，国际PCT申请公布号WO/2005/077171公开了用于通过用一种或多种氨基酸包衣或引发种子以赋予对除草剂的耐受性，保护植物免受除草剂伤害和损伤的方法，所述除草剂破坏了用除草剂处理的植物的氨基酸的生产。
m-Tyr对植物的显著毒性而对真菌、哺乳动物或细菌的降低的作用，导致其开发作为生物除草剂。美国专利申请公布号20080261815公开了使用来自羊茅草物种的间-酪氨酸化合物抑制杂草生长并增强非杂草植物的生长的方法，并且还公开了鉴定具有除草剂性质的植物的方法。使用间-酪氨酸作为生物除草剂的不足是，其不仅对杂草而且对作物植物都是有毒的。
对将高效实现用于产生耐受植物毒性化感物质例如非蛋白质氨基酸包括间-酪氨酸的转基因植物特别是作物植物或观赏植物的手段存在公认的需求。
发明概述
本发明提供了用于赋予转基因植物耐受植物生长介质中存在的植物毒性非蛋白质氨基酸的手段和方法。本发明还提供了耐受植物毒性非蛋白质氨基酸特别是间-酪氨酸(m-Tyr)和其盐的转基因植物。
本发明部分基于以下意外的发现：在植物细胞内表达细菌苯丙氨酰-tRNA合成酶(PheRS)，特别是当PheRS在线粒体和/或叶绿体中表达时，赋予了植物对间-酪氨酸的耐受性。该耐受性是由于引入的细菌PheRS水解错酰化的m-Tyr-tRNAPhe并阻止非蛋白质氨基酸掺入蛋白质的能力。
因此，根据一个方面，本发明提供了包含至少一种含有编码氨酰tRNA合成酶(aaRS)或其片段的至少一种外源多核苷酸的细胞的转基因植物，该aaRS或其片段包含能够水解被非蛋白质氨基酸类似物错酰化的tRNA的校正模块，其中该植物耐受非蛋白质氨基酸类似物和其盐。
在本发明的上下文中，术语“耐受非蛋白质氨基酸类似物”指的是转基因植物在以显著抑制相应非转基因植物生长的浓度包含非蛋白质氨基酸类似物的生长介质中生长的能力。根据某些实施方案，生长抑制表现为以下的至少一种：减小的根长、减小的根径(root radical)、减小的根质量、减小的植株高度、植物组织形态或颜色的异常变化、减小的植物芽(shoot)质量和/或芽数，和其任何组合。根据一些实施方案，分离的非蛋白质氨基酸类似物或包含其的组合物被添加至生长介质。根据其它实施方案，非蛋白质氨基酸类似物从产生其的植物分泌至生长介质。
根据某些实施方案，非蛋白质氨基酸类似物是间-酪氨酸(m-Tyr)化合物，且aaRS是苯丙氨酰-tRNA合成酶(PheRS)。
根据某些实施方案，m-Tyr化合物具有式I的结构式或其盐：
式I：
其中：
R1和R2独立地选自由以下构成的组：H、磺酸酯(sulfonate)、氨磺酰(sulfonamide)、膦酸酯(phosphonate)、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧羰基、糖类、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基，其中膦酸酯、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧羰基、糖类、环烷基、杂环烷基、芳基、和杂芳基的每一个都是取代的或未取代的；
R3选自由以下构成的组：H、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧羰基、糖类、环烷基、杂环烷基、芳基、和杂芳基，其中烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧羰基、糖类、环烷基、杂环烷基、芳基、和杂芳基的每一个都是取代的或未取代的；
X选自由O和N-Y构成的组，其中Y选自由以下构成的组：H、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧羰基、糖类、环烷基、杂环烷基、芳基、和杂芳基，其中烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧羰基、糖类、环烷基、杂环烷基、芳基、和杂芳基的每一个都是取代的或未取代的；
R4、R5、R6、和R7独立地选自由以下构成的组：H、羟基、卤素、氨基、和硝基；及
R8和R9独立地选自由以下构成的组：H、羟基、卤素、氨基、甲基和卤代甲基。
根据某些典型的实施方案，m-Tyr化合物具有式II的结构式：
根据某些现有典型的实施方案，PheRS是细菌PheRS。细菌PheRS已知是异源四聚体，包含两个α和两个β亚基。根据某些实施方案，α-亚基和β-亚基由单个多核苷酸编码。根据其它实施方案，α-亚基和β-亚基的每一个都由单独的多核苷酸编码。根据又另外的实施方案，细菌PheRS包含含有校正模块的至少一个β-亚基或其片段。
根据一些实施方案，细菌PheRS是异源四聚的细菌PheRS，选自由以下构成的组：大肠杆菌(E.coli)PheRS和嗜热栖热菌PheRS。
根据某些实施方案，大肠杆菌PheRS-α亚基由具有SEQ ID NO:1中列出的核酸序列的多核苷酸编码，且大肠杆菌PheRS-β亚基由具有SEQ IDNO:2中列出的核酸序列的多核苷酸编码。
根据其它实施方案，大肠杆菌PheRS-α亚基包含SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列，且大肠杆菌PheRS-β亚基包含SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列。
根据其它实施方案，嗜热栖热菌PheRS-α亚基包含SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列，且嗜热栖热菌PheRS-β亚基包含SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列。
根据某些实施方案，编码包含校正模块的aaRS或其片段的多核苷酸，还包含编码选自由以下构成的组的靶向肽的核酸序列：线粒体靶向肽和叶绿体靶向肽。线粒体和叶绿体靶向肽可以是相同的或不同的。典型地，多核苷酸被设计以使得编码的靶向肽被融合在编码的aaRS多肽的氨基末端(N-末端)。
根据某些实施方案，转基因植物包含编码氨酰tRNA合成酶(aaRS)或其片段的还包含编码线粒体靶向肽的核酸序列的外源多核苷酸，与编码aaRS或其片段的还包含编码叶绿体靶向肽的核酸序列的外源多核苷酸的组合。叶绿体靶向肽与线粒体靶向肽可以是相同的或不同的。
根据某些实施方案。线粒体和叶绿体靶向肽由SEQ ID NO:7中列出的核酸序列编码，并具有SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列。
根据又其它实施方案，本发明的多核苷酸被掺入使得其能够在植物细胞中表达的DNA构建体。根据一个实施方案，DNA构建体包括选自由以下构成的组的至少一种表达调控元件：启动子、增强子、复制起点、转录终止序列、多聚腺苷酸化信号等。
根据一些实施方案，DNA构建体包括启动子。启动子可以是如本领域已知的组成型、诱导型或组织特异性启动子。每一种可能性都代表本发明单独的实施方案。根据一些实施方案，启动子是在植物细胞中可操作的组成型启动子。根据其它实施方案，启动子是根特异性启动子。根据另外的实施方案，DNA构建体还包括转录终止和多聚腺苷酸化序列的信号。
任选地，DNA构建体还包括编码使能够方便选择转基因植物的检测标志物的核酸序列。根据某些现有典型的实施方案，检测标志物选自以下构成的组：编码赋予耐受抗生素的蛋白质的多核苷酸；编码赋予耐受除草剂的蛋白质的多核苷酸及其组合。
本发明还包括转基因植物的种子，其中从所述种子生长的植物耐受植物毒性非蛋白质氨基酸类似物特别是m-Tyr。本发明还包括转基因植物的果实、叶或任何部分，以及源自其的组织培养物和由其再生的植物。
根据又另一个方面，本发明提供了用于制备耐受植物毒性非蛋白质氨基酸类似物或其盐的转基因植物的方法，所述方法包括(a)用编码包含校正模块的氨酰tRNA合成酶(aaRS)或其片段的至少一种外源多核苷酸转化植物细胞，该校正模块能够水解非蛋白质氨酰化的tRNA；和(b)再生转化的细胞为耐受植物毒性非蛋白质氨基酸类似物或其盐的转基因植物。
根据本发明的教导，编码包含能够水解非蛋白质氨酰化的tRNA的校正模块的氨酰tRNA合成酶(aaRS)或其片段的外源多核苷酸，可以被引入DNA构建体以包括如上所述的转录和翻译必需的全部元件，以使得多肽在植物细胞内表达。
用多核苷酸或DNA构建体转化植物可通过如本领域技术人员已知的各种手段进行。常用的方法的实例为但不限制于，农杆菌(Agrobacterium)介导的转化、微粒轰击(microprojectile bombardment)、花粉介导的转移、植物RNA病毒介导的转化、脂质体介导的转化、直接的基因转移(例如，通过显微注射)和紧凑的胚性愈伤组织的电穿孔。根据一个实施方案，本发明的转基因植物使用农杆菌介导的转化产生。
根据本发明的教导，包含编码包括校正模块的aaRS或其片段的外源多核苷酸的转基因植物，可采用分子遗传学的标准方法被选择，如本领域普通技术人员已知的。根据某些实施方案，转基因植物根据其对抗生素或除草剂的耐受性被选择。根据一个实施方案，作为可选择的标志物的抗生素是由以下构成的组中的一种：头孢噻肟、万古霉素和卡那霉素。根据另一个实施方案，作为可选择的标志物的除草剂是非选择性除草剂草铵膦
根据又其它实施方案，本发明的转基因植物基于其对植物毒性非蛋白质氨基酸类似物或其盐的耐受性被选择。
任何植物都可被本发明的多核苷酸转化，以产生耐受植物生长介质中存在的植物毒性非蛋白质氨基酸类似物特别是m-Tyr或其盐的转基因植物。根据典型的实施方案，植物是作物植物或观赏植物。
从下文的描述和附图，本发明的其它的目的、特征和优势将变得清楚。
附图简述
图1显示了tRNAPhe与天然和非蛋白质氨基酸的氨酰化，及错载产物的特异性脱酰化。图1A：大肠杆菌tRNAPhe转录物(1.2μM)与Phe或m-Tyr通过人类线粒体(Hsmt)PheRS(210nM)或嗜热栖热菌(Tt)PheRS(24nM)的氨酰化，通过在酸性条件下(0.1M醋酸钠，pH5)的8％变性凝胶中电泳被分析。图1B：m-Tyr-tRNAPhe的特异性脱酰化。大肠杆菌tRNAPhe转录物(1.2μM)与Phe(25μM)、m-Tyr(125μM)或Tyr(1mM)通过HsmtPheRS(在与Phe和m-Tyr的实验中为250nM，或在与Tyr的实验中为500nM)氨酰化5min；然后加入(如箭头所示)TtPheRS(16nM)、大肠杆菌(Ec)PheRS(48nM)或HsctPheRS(32nM)后继续反应(获自Klipcan L.等人，2009，同上)。
图2显示拟南芥的野生型和转基因株系的表型。Wt(野生型)、Cyt(含有细胞质定位的细菌PheRS的转基因植物)和Dual(含有质体定位的细菌PheRS的转基因植物)的根的生长。上图：生长在含有20μM间-酪氨酸介质上的样品。下图：未处理的样品。
发明详述
本发明提供了耐受生长介质中存在的植物毒性非蛋白质氨基酸，使得耐受性植物的生长基本上不受植物毒性氨基酸的影响的转基因植物。本发明还提供了用于制备本发明的转基因植物的手段和方法。根据某些实施方案，植物毒性非蛋白质氨基酸是间-酪氨酸(m-Tyr)化合物或其盐。
定义
本文使用的术语“氨酰tRNA合成酶”或“aaRS”为背景技术中常见的。aaRS是催化特定氨基酸或其前体与所有其相容的关联tRNA之一酯化以形成氨酰-tRNA的酶。aaRS的校正模块已进化为修正非关联氨基酸错酰化至tRNA，其导致遗传密码的错译。校正模块能够水解非关联氨基酸与tRNA之间的酯键。当提及aaRS酶时使用的术语“其片段”，指的是保留其催化活性并还包含能够水解错酰化至tRNA的非蛋白质氨基酸的酶校正模块的酶片段。
术语“非蛋白质氨基酸”和“非蛋白质氨基酸类似物”在本文可互换使用，并指的是未被包括在如背景技术中常见的一组22个标准(canonical)氨基酸的氨基酸。
术语“植物”以其最广泛的意义在本文被使用。其包括，但不限于，木本、草本、多年生或一年生植物的任何物种。其还指很大程度上分化成植物发育的任何阶段存在的结构的多种植物细胞。这些结构包括，但不限于，根、茎、芽、叶、花、花瓣、果实、等。
如本文使用的，术语“生长介质”指的是可以被用于支持植物生长的任何介质，并且可以包括，但不限于，不同类型的土壤或植物营养介质。土壤的适合实例包括，但不限于，天然土壤和人工土壤。
术语“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核酸序列”、和“分离的多核苷酸”在本文中可互换使用。这些术语包括核苷酸序列，等等。多核苷酸可以是RNA或DNA的聚合物或其杂交体，其是单链或双链的、直链或支链的、并且其任选地包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。该术语还包括RNA/DNA杂交体。
如本文使用的，术语“构建体”指的是人工组装或分离的包含感兴趣的基因的核酸分子。通常，构建体可包含感兴趣的一个基因或多个基因、在某些情况下也可以是感兴趣的基因的标志物基因、及适合的调节序列。应领会的是，在构建体中包含调节序列是任选的，例如，在其中宿主细胞的调节序列待被使用的情况下，此类序列可以是不需要的。术语构建体包括载体，但不应被视为限于其。
术语“可操作地连接”是指核酸序列与单个核酸片段的缔合(association)，使得一个的功能被另一个调节。例如，启动子与编码序列可操作地连接，当其能够调节该编码序列的表达时(即，该编码序列在启动子的转录控制下)。编码序列可以呈有义或反义方向与调节序列可操作地连接。
如本文所用的术语“启动子元件”、“启动子”或“启动子序列”，指的是位于DNA聚合物的蛋白质编码区的5'末端(即，在其之前)的DNA序列。天然已知的大多数启动子的位置都在转录区之前。启动子起到基因表达的开关、激活基因表达的作用。如果基因被激活，其被称为被转录，或参与转录。转录涉及mRNA从基因的合成。因此，启动子作为转录调节元件，并且还提供用于基因转录成mRNA的起始位点。启动子可整体源自天然基因，或包括源自天然发现的不同启动子的不同元件，或甚至包括合成的DNA片段。被本领域技术人员理解的是，不同启动子可指导基因在不同组织或细胞类型中、或在发育的不同阶段、或响应不同的环境条件而表达。还被认识到的是，由于在大多数情况下调节序列的确切边界尚未被完全定义，因此一些变体的DNA片段可具有相同的启动子活性。造成基因在大多数时间的大多数细胞类型中表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。可用于植物细胞的新的多种类型的启动子不断被发现；许多实例可见于Okamuro J K和Goldberg R B(1989)Biochemistry ofPlants15:1-82。
如本文所用的，术语“增强子”是指可刺激启动子活性并且可以是启动子的固有元件或插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件的DNA序列。
如本文使用的，术语“表达”是指功能性终产物如mRNA或蛋白质的产生。
当提及植物或种子时使用的术语“转基因”(即，“转基因植物”或“转基因种子”)，是指在其一种或多种细胞中包含至少一种外源可转录的多核苷酸的植物或种子。术语“转基因植物材料”广泛地指在其至少一种细胞中包含至少一种外源多核苷酸的植物、植物结构、植物组织、植物种子或植物细胞。外源多核苷酸可以是与野生型情况相比，位于不同位点的或处于不同调节的植物内源多核苷酸、或是从不同的生物体中分离的异源多核苷酸。如本文所用的“转基因植物”和“相应的非转基因植物”是指包括至少一种包含外源可转录的多核苷酸的细胞的植物，并指缺乏所述外源可转录的多核苷酸的相同类型的植物。
术语“转化子”或“转化的细胞”包括初级转化的细胞和无论转移的数目而源自该细胞的培养物。由于有意或无意的突变，所有后代的DNA含量可能不是精确地相同。具有与针对最初转化的细胞筛选的相同的功能的突变体后代被包括在转化子的定义中。
细胞的转化可以是稳定的或瞬时的。术语“瞬时转化”或“瞬时转化的”是指在不存在整合外源多核苷酸进入宿主细胞基因组时，引入一种或多种外源多核苷酸至细胞中。瞬时转化可通过例如检测由一种或多种外源多核苷酸编码的多肽的存在的酶联免疫吸附试验(ELISA)被检测到。可选地，瞬时转化可通过检测由外源多核苷酸编码的蛋白质(例如，β-葡萄醣醛酸酶)的活性来检测。
术语“瞬时转化体”指的是已瞬时掺入一种或多种外源多核苷酸的细胞。相比之下，术语“稳定转化”或“稳定转化的”指的是将一种或多种外源多核苷酸引入并整合至细胞的基因组。细胞的稳定转化可以通过细胞的基因组DNA与能够结合到一种或多种外源多核苷酸的核酸序列的DNA印迹(Southern blot)杂交来检测。可选地，细胞的稳定转化也可以通过生长组织中整合的基因的酶活性检测，或通过细胞的基因组DNA的聚合酶链式反应以扩增外源多核苷酸序列来检测。术语“稳定转化子”是指已稳定整合一种或多种外源多核苷酸至基因组或细胞器DNA的细胞。被理解的是，用本发明的核酸、构建体和/或载体转化的植物或植物细胞可以是瞬时以及稳定转化的。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指的是氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一种或多种氨基酸残基是相应于天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。
数千种已知的非蛋白质氨基酸中，约300种是在植物中被发现的。其中许多在结构上类似于那些被认为是氨基酰tRNA合成酶(aaRS)的常规氨基酸底物。氨基酸侧链的修饰可以在体内通过活性氧(ROS)例如羟基自由基和超氧阴离子产生。修饰常常与苯丙氨酸和酪氨酸的芳环上的对位、间位或邻位位置中一个或多个羟基基团的产生相关。但是，考虑到aaRS的校正活性，ROS损伤的氨基酸掺入多肽链的通路仍不清楚。
本发明现表明，(i)线粒体和细胞质的苯丙氨酰-tRNA合成酶(分别定义为HsmtPheRS和HsctPheRS)催化m-Tyr与tRNAPhe的直接附着，从而为将错酰化的tRNA递送至核糖体并将m-Tyr掺入真核蛋白质开辟了道路；及(ii)细菌PheRS在线粒体和/或叶绿体中的存在诱导植物耐受m-Tyr。这些发现形成了用于开发非蛋白质氨基酸除草剂和耐受这些除草剂的植物的系统的基础。
根据一个方面，本发明提供了包含至少一种包含编码氨酰tRNA合成酶(aaRS)或其片段的至少一种外源多核苷酸的细胞的转基因植物，aaRS或其片段包含能够水解被非蛋白质氨基酸类似物错酰化的tRNA的校正模块，其中植物耐受非蛋白质氨基酸类似物和其盐。
本发明的教导通过产生表达细菌苯丙氨酰-tRNA合成酶(PheRS)的转基因植物被例证，所述转基因植物耐受m-Tyr化合物及其盐的植物毒性作用。然而，被明确理解的是，本发明的范围包括植物毒性非蛋白质氨基酸和氨酰tRNA合成酶(aaRS)或其片段的任何组合，只要aaRS或其片段包括能够水解来自tRNA的非蛋白质氨基酸的校正模块。
aaRS可以是具有有效校正活性的天然的酶，如本文例证的大肠杆菌PheRS。可选地，aaRS可以被基因修饰以诱导或增加校正活性。aaRS特别是PheRS的合成和校正位点的显著可塑性以及其立体化学组织中的细微变化，可被用于设计这些位点的结构以改变对小的配体的结合亲和力或以控制对错酰化的tRNA的水解活性(Kotik-Kogan,O.,Moor等人,2005.Structure13,1799-1807；Fishman,R.等人2001.Acta crystallographica57,1534-1544)。优选位于线粒体和叶绿体细胞器内的外源aaRS，可使用额外的校正活性通过野生型aaRS酶修复掺入蛋白质的错误，和/或螯合有害氨基酸类似物，并防止其掺入蛋白质。
编码aaRS的多核苷酸的克隆可通过如本领域技术人员已知的任何方法进行。各种DNA构建体可被用于在期望的植物中表达aaRS。
本发明提供了包括编码aaRS的多核苷酸的DNA构建体或表达载体，其还可包括调节元件，包括但不限于，启动子、增强子和终止信号。
在最常用的启动子中的是胭脂碱合酶(NOS)启动子(Ebert等人，1987Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:5745-5749)、章鱼碱合酶(OCS)启动子、花椰菜花叶病毒属启动子诸如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子(Lawton等人,1987Plant Mol Biol.9:315-324)、CaMV35S启动子(Odell等人,1985Nature313:810-812)、和玄参花叶病毒35S启动子、来自核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶的小亚基的光诱导型启动子、Adh启动子(Walker等人,1987Proc Natl Aca.Sci U.S.A.84:6624-66280)、蔗糖合酶启动子(Yang等人,1990Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:4144-4148)、R基因复合体启动子(Chandler等人,1989.Plant Cell1:1175-1183)、叶绿素a/b结合蛋白质基因启动子、等等。其它常用的启动子是马铃薯块茎ADPGPP基因启动子、蔗糖合酶启动子，颗粒结合型淀粉合酶启动子、谷蛋白基因启动子、玉米糯质基因启动子(maize waxy promoter)、脆基因启动子(Brittlegene promoter)、以及Shrunken2启动子、酸性几丁质酶基因启动子、和玉米基因启动子(15kD、16kD、19kD、22kD、和27kD；Perdersen等人1982Cell29:1015-1026)。很多启动子在国际专利申请公布号WO00/18963中描述。根据某些现有典型的实施方案，本发明的构建体包括组成型CaMV35S启动子。
“3’非编码序列”指的是位于编码序列下游的DNA序列，并包含多聚腺苷酸化识别序列以及编码能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的其他序列。多聚腺苷酸化信号通常特征在于影响多聚腺苷酸束添加至mRNA前体的3’末端。不同3’非编码序列的用途由Ingelbrecht I L.等人例证(1989.Plant Cell1:671-680)。
在本发明特定实施方案中，大肠杆菌PheRS亚基的4种克隆：EcPheRSα、mtp-EcPheRSα、EcPheRSβ和mtp-EcPheRSβ被制备受组成型启动子35S的调控并携带对非选择性除草剂草铵膦(EcPheRSα和mtp-EcPheRSα)或卡那霉素(EcPheRSβ，和mtp-EcPheRSβ)的耐受性。mtp-EcPheRSα和mtp-EcPheRSβ还包括双重(线粒体和叶绿体)靶向肽。克隆通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)被转化入拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株(哥伦比亚(Col-0)生态型)。
本领域技术人员将领会的是，本发明描述的核酸序列和转化载体的各种组件可操作地连接，以便引起所述核酸或核酸片段的表达。用于可操作地连接本发明的构建体和载体的组件的技术是本领域技术人员熟知的。此类技术包括接头诸如合成接头例如包括一种或多种限制性内切酶位点的使用。
根据又另一个方面，本发明提供了用于制备耐受植物毒性非蛋白质氨基酸类似物或其盐的转基因植物的方法，所述方法包括(a)用编码包含校正模块的氨酰tRNA合成酶(aaRS)或其片段的至少一种外源多核苷酸转化植物细胞，所述校正模块能够水解被非蛋白质氨酰化的tRNA；和(b)再生转化的细胞为耐受植物毒性非蛋白质氨基酸类似物或其盐的转基因植物。
用于用根据本发明的核酸序列转化植物细胞的方法是本领域已知的。如本文所用的，术语“转化(transformation)”或“转化(transforming)”描述外源DNA诸如DNA构建体借以进入并改变受体细胞为转化的、基因修饰的或转基因细胞的过程。转化可以是稳定的，其中核酸序列被整合到植物基因组中，且如此代表稳定和遗传的性状，或可以是瞬时的，其中核酸序列由转化的细胞表达，但不整合到基因组中，且如此代表瞬时的性状。根据典型的实施方案，本发明的核酸序列被稳定地转化到植物细胞中。
存在多种将外源基因引入单子叶植物和双子叶植物两者的方法(例如，Potrykus I.1991.Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol42:205-225；Shimamoto K.等人,1989.Nature338:274-276)。
外源DNA稳定整合至植物基因组DNA的主要方法包括两个主要途径：
农杆菌介导的基因转移：农杆菌介导的系统包括含有整合进植物基因组DNA的确定的DNA片段的质粒载体的使用。接种植物组织的方法根据植物物种和农杆菌递送系统而不同。广泛使用的途径是叶盘法(leaf-disc procedure)，其可以用提供引发全植株分化的好的来源的任何组织外植体进行(Horsch等人，1988.Plant Molecular Biology Manual A5,1-9,Kluwer Academic Publishers,Dordrecht)。补充途径采用农杆菌递送系统与真空渗透相结合。农杆菌系统在转基因双子叶植物的产生中特别有用。
DNA直接摄取：存在多种DNA直接转移至植物细胞的方法。在电穿孔中，原生质体短暂地暴露于强电场，开放小孔以允许DNA进入。在显微注射中，使用微量移液器将DNA机械地直接注射到细胞。在微粒轰击中，DNA被吸附在微子弹诸如硫酸镁晶体或钨粒子上，且微子弹被物理加速进入细胞或植物组织。
根据某些实施方案，将本发明的DNA构建体转化入植物细胞使用农杆菌系统来进行。
然后，转基因植物在适于一种或多种重组DNA构建体表达的条件下生长。一种或多种重组DNA构建体的表达减少植物对非蛋白质氨基酸类似物特别是对间-酪氨酸的敏感性。
植物从单个植物原生质体转化子或从各种转化的外植体的再生、发育和培养是本领域熟知的(Weissbach和Weissbach，In.:Methods for PlantMolecular Biology,(Eds.),1988Academic Press,Inc.,San Diego,CA)。这种再生和生长过程一般包括以下步骤：转化细胞的选择、培养那些个体化的细胞或组织直至(through)胚胎发育的通常阶段直至生根的小植株阶段。转基因胚胎和种子被相似地再生。所得转基因生根的幼株此后被种植在合适的植物生长介质诸如土壤中。
使用本领域普通技术人员已知的标准的分子遗传学方法，进行用本发明的核酸序列转化的转基因植物的选择，以提供包括外源的aaRS的转基因植物。根据某些实施方案，核酸序列还包括编码赋予对抗生素的耐受性的产物的核酸序列，并因此转基因植物根据其对抗生素的耐受性被选择。根据一些实施方案，作为可选择的标志物的抗生素是由巴龙霉素和卡那霉素构成的氨基糖苷类组中的一种。根据另外的实施方案，核酸序列还包括编码赋予对除草剂的耐受性包括但不限于对非选择性除草剂草铵膦的耐受性的产物的核酸序列。用于检测转基因植物中外源多核苷酸的存在和/或表达的方法也为本领域技术人员所知，并且包括例如PCR、RNA杂交和DNA杂交。如本文例证的，关于获得本发明的转基因植物的最终确认，通过在包含非蛋白质氨基酸的植物毒性浓度的介质中生长包含外源多核苷酸的转基因植物获得。只有表达活性的具有校正模块的aaRS或其片段的植物才可以在这些条件下正常生长。
从保持对非蛋白质氨基酸的植物毒性浓度的耐受性的转基因植物获得的种子或植物部分也在本发明的范围内。植物部分包括分化的和未分化的组织，包括但不限于根、茎、芽、叶、花粉、种子、肿瘤组织、和多种类型的细胞和培养物，诸如单细胞、原生质体、胚、和愈伤组织。植物组织可以在植物或器官中、可以是组织或细胞培养物。
以下实施例被展示以更充分地说明本发明的一些实施方案。然而，它们不应以任何方式被解释为限制本发明的宽广范围。本领域技术人员可以容易地设计出本文公开的原理的许多变化和修改而不偏离本发明的范围。
实施例
材料和方法
大肠杆菌PheRS亚基的4种克隆：EcPheRSα、mtp-EcPheRSα、EcPheRSβ、和mtp-EcPheRSβ被制备受组成型启动子35S的调控并携带对BASTA(EcPheRSα和mtp-EcPheRSα)或卡那霉素(EcPheRSβ，和mtp-EcPheRSβ)的耐受性。mtp-EcPheRSα和mtp-EcPheRSβ包含双重(线粒体和叶绿体)靶向肽。克隆通过根癌农杆菌被转化至拟南芥植株(哥伦比亚(Col-0)生态型)。
关于转化，植株在生长室的受控条件(温度22℃，8小时光照)下生长30天，且然后如下文所描述的转化。野生型和转化的种子被灭菌、冷处理、并在含有或没有抗生素的无菌MS培养基上萌发。萌发之后，植株被种植在花盆中并被转移到生长室(22℃，16小时光照)。
农杆菌渗透转化
含有二元载体pART27或pMLBart的根癌农杆菌菌株ABI被用于转化。两种载体都含有nptII基因作为可选择的标志物。小规模的农杆菌培养物在含有适当抗生素的液体LB培养基中于28℃过夜生长。随后，将小规模培养物在含有适当抗生素的LB培养基中稀释50倍用于大规模过夜培养。然后，通过在5000r.p.m(约3000g)下离心15min收集细胞，并重悬于渗透培养基中至OD600为0.8。
通过将植株的地上部分在300ml含有5％(w/v)蔗糖、10mM MgCl2、从200-ml过夜培养物重悬的农杆菌细胞、和0.05％的表面活性剂(SilwetL-77)的溶液中蘸30秒进行接种。接种后，将植株留在低光照或黑暗场所，并覆盖透明塑料圆顶(dome)以保持湿度；接种12至24h后，移除圆顶并将植物送回生长室。将转化的植株保持在温室中并当完全成熟时收获种子。
植物选择
在温室中，将种子在土壤中萌发且转基因植株通过喷洒0.1％的除草剂被选择。喷洒在萌发后一周进行，并以2天的间隔重复4次。在选择结束时，转基因植株容易被鉴定。当此类植株持续增长并保持绿色时，未转化的植株仍然很小，变成白色并在选择后两周死亡。关于选择含有卡那霉素耐受性的阳性植株，将种子在补充有50mg/ml卡那霉素的MS培养基中筛选。
杂交
在获得PheRS的各个(α-或β-)亚基的纯合体植株后，将它们经受杂交。用作雌株的植株被手工去雄(hand emasculated)。收集来自供体植株的新开放的花朵的花药，并通过使花药接触去雄植株的柱头进行授粉。授粉的花朵被标记，并去除来自相同植株的任何剩余的开放的或未开放的花朵，以避免在收集时的任何混淆。含有PheRS的两个亚基的阳性植株的选择是如在上文中“植物选择”部分所描述的进行。
m-Tyr耐受性
为了评价m-Tyr对拟南芥根生长的影响，将20μm的m-Tyr添加至MS培养基。拟南芥种子通过在30％漂白剂、0.3％吐温X-100中摇动10min，随后用无菌蒸馏水冲洗三次被灭菌。含有在琼脂培养基上的种子的培养皿在4℃下冷层积(cold stratified)72h，且随后垂直放置在23℃、16:8h光照/黑暗周期的温室。生长7天后，分析植株的根长。
实施例1：细菌PheRS表达对拟南芥耐受m-Tyr的影响
在上文“材料和方法”部分描述的细菌PheRS基因在组成型35SCaMV启动子的控制下表达。转运肽被附加到细菌酶的EcPheRS-α和EcPheRS-β亚基的N-末端，以指导它们进入拟南芥的线粒体和叶绿体。第二个构建体对包括缺乏转运肽的PheRS-α和PheRS-β。因此，四个不同的构建体被转化进入拟南芥并产生纯合体自花受粉植株，如上文描述的。将每个株系进一步杂交以创建包含定位于细胞质的具有校正活性的异源二聚EcPheRS(cyt-PheRS)和定位于植物线粒体和叶绿体(mtp-PheRS)的异源二聚EcPheRS的植株。获得数个独立的转基因株系，并且分析了它们对m-Tyr的耐受性。通过在含有20μm m-Tyr的生长培养基的培养皿中生长野生型、cyt-PheRS和mtp-PheRS拟南芥株系检查对m-Tyr的耐受性。生长在未经处理的培养基上的相同株系作为对照。在F2代已观察到对m-Tyr的耐受性。发现含有mtp-PheRS的株系大的多的耐受性(图2)。可以看出，在20μm m-Tyr下，野生型植株的根没有发育，而含有mtp-PheRS的株系的根发育直至未处理的植株的长度的一半。相比于含有mtp-PheRS的株系，表达cyt-PheRS的株系的根是较少发育的。注意的是，转基因拟南芥植株在正常条件下的生长没有受到细胞质或细胞器中存在细菌PheRS的显著影响(图2)。
上文描述的特定实施方案将充分揭示本发明的一般性质，以致其他人可以通过应用现有知识，容易修改和/或调整此类特定实施方案用于各种应用，而无需过度实验且不偏离一般概念，并因此，这种调整和修改应当且预期被包括在所公开的实施方案的等同物的意义和范围内。被理解的是，本文采用的措辞或术语是为了描述和而不是限制的目的。用于实施各种公开的功能的手段、材料和步骤可以采取多种替代形式而不偏离本发明。

Claims (31)

1.一种转基因植物，所述转基因植物包含至少一个包含编码氨酰tRNA合成酶(aaRS)或其片段的至少一种外源多核苷酸的细胞，所述aaRS或其片段包括能够水解被非蛋白质氨基酸类似物错酰化的tRNA的校正模块，其中所述植物耐受所述非蛋白质氨基酸类似物和其盐。
2.根据权利要求1所述的转基因植物，其中所述植物生长在以显著抑制相应的非转基因植物生长的浓度包含所述非蛋白质氨基酸或其盐的介质中。
3.根据权利要求3所述的转基因植物，其中生长抑制表现为以下的至少一种：减小的根长、减小的根径、减小的根质量、减小的植株高度、植物组织形态或颜色的异常变化、减小的植物芽质量、减小的植物芽数，和其任何组合。
4.根据权利要求1所述的转基因植物，其中所述非蛋白质氨基酸类似物是间-酪氨酸(m-Tyr)化合物，且所述aaRS是苯丙氨酰-tRNA合成酶(PheRS)。
5.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述m-Tyr化合物具有式I的结构式或其盐：
式I：
其中：
R1和R2独立地选自由以下构成的组：H、磺酸酯、氨磺酰、膦酸酯、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧羰基、糖类、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基，其中所述膦酸酯、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧羰基、糖类、环烷基、杂环烷基、芳基、和杂芳基的每一个都是取代的或未取代的；
R3选自由以下构成的组：H、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧羰基、糖类、环烷基、杂环烷基、芳基、和杂芳基，其中所述烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧羰基、糖类、环烷基、杂环烷基、芳基、和杂芳基的每一个都是取代的或未取代的；
X选自由O和N-Y构成的组，其中Y选自由以下构成的组：H、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧羰基、糖类、环烷基、杂环烷基、芳基、和杂芳基，其中所述烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧羰基、糖类、环烷基、杂环烷基、芳基、和杂芳基的每一个都是取代的或未取代的；
R4、R5、R6和R7独立地选自由以下构成的组：H、羟基、卤素、氨基、和硝基；及
R8和R9独立地选自由以下构成的组：H、羟基、卤素、氨基、甲基和卤代甲基。
6.根据权利要求5所述的转基因植物，其中所述m-Tyr化合物具有式II的结构式：
7.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述PheRS是包含2个PheRS-α和2个PheRS-β链的异源四聚的细菌PheRS。
8.根据权利要求7所述的转基因植物，其中所述细菌PheRS选自由以下构成的组：大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)PheRS和嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)PheRS。
9.根据权利要求8所述的转基因植物，其中所述大肠杆菌PheRS-α由具有SEQ ID NO:1中列出的核酸序列的多核苷酸编码，且所述大肠杆菌PheRS-β由具有SEQ ID NO:2中列出的核酸序列的多核苷酸编码。
10.根据权利要求8所述的转基因植物，其中所述大肠杆菌PheRS-α包含SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列，且所述大肠杆菌PheRS-β包含SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列。
11.根据权利要求8所述的转基因植物，其中所述嗜热栖热菌PheRS-α包含SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列，且所述嗜热栖热菌PheRS-β包含SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列。
12.根据权利要求1所述的转基因植物，其中编码所述aaRS或其片段的所述多核苷酸还包含编码选自由以下构成的组的靶向肽的核酸序列：线粒体靶向肽和叶绿体靶向肽。
13.根据权利要求1所述的转基因植物，所述植物包含编码所述aaRS或其片段的还包含编码线粒体靶向肽的所述核酸序列的所述多核苷酸，与编码所述aaRS或其片段的还包含编码叶绿体靶向肽的所述核酸序列的所述多核苷酸的组合。
14.根据权利要求12-13中任一项所述的转基因植物，其中所述线粒体靶向肽和所述叶绿体靶向肽的每一个都由具有SEQ ID NO:7中列出的核酸序列的多核苷酸编码。
15.根据权利要求14所述的转基因植物，其中所述线粒体靶向肽和所述叶绿体靶向肽的每一个都包括SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列。
16.一种由根据权利要求1所述的转基因植物产生的植物种子，其中所述种子用于培育包含编码具有校正模块的氨酰tRNA合成酶(aaRS)或其片段的至少一种外源多核苷酸的转基因植物，所述校正模块能够水解被非蛋白质氨基酸类似物错酰化的tRNA，其中所述转基因植物耐受所述非蛋白质氨基酸类似物和其盐。
17.一种组织培养物，包含根据权利要求1所述的植物的至少一个转基因细胞或源自其的原生质体。
18.根据权利要求17所述的组织培养物，其中所述组织培养物再生包含编码具有校正模块的氨酰tRNA合成酶(aaRS)或其片段的至少一种外源多核苷酸的转基因植物，所述校正模块能够水解被非蛋白质氨基酸类似物错酰化的tRNA，所述转基因植物耐受所述非蛋白氨基酸类似物和其盐。
19.一种用于生产耐受植物毒性非蛋白质氨基酸类似物或其盐的转基因植物的方法，所述方法包括(a)用编码包含校正模块的氨酰tRNA合成酶aaRS或其片段的至少一种外源多核苷酸转化植物细胞，所述校正模块能够水解非蛋白质氨酰化的tRNA；及(b)再生转化的细胞为耐受所述植物毒性非蛋白质氨基酸类似物或其盐的转基因植物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述非蛋白质氨基酸类似物是间-酪氨酸(m-Tyr)化合物，且所述aaRS是苯丙氨酰-tRNA合成酶(PheRS)。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述PheRS是包含2个PheRS-α和2个PheRS-β链的异源四聚的细菌PheRS。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述细菌PheRS选自由以下构成的组：大肠杆菌(E.coli)PheRS和嗜热栖热菌PheRS。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述大肠杆菌PheRS-α由具有SEQ ID NO:1中列出的核酸序列的多核苷酸编码，且所述大肠杆菌PheRS-β由具有SEQ ID NO:2中列出的核酸序列的多核苷酸编码。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述嗜热栖热菌PheRS-α包括SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列，且所述嗜热栖热菌PheRS-β包括SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列。
25.根据权利要求19所述的方法，其中编码所述aaRS或其片段的所述多核苷酸还包含编码选自由以下构成的组的靶向肽的核酸序列：线粒体靶向肽和叶绿体靶向肽。
26.根据权利要求19所述的方法，其中所述植物细胞被编码所述aaRS或其片段的还包含编码线粒体靶向肽的所述核酸序列的所述多核苷酸，与编码所述aaRS或其片段的还包含编码叶绿体靶向肽的所述核酸序列的所述多核苷酸的组合转化。
27.根据权利要求25-26中任一项所述的方法，其中所述线粒体靶向肽和所述叶绿体靶向肽的每一个都由具有SEQ ID NO:7中列出的核酸序列的多核苷酸编码。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述线粒体靶向肽和所述叶绿体靶向肽的每一个都包含SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列。
29.一种由根据权利要求19所述的方法产生的转基因植物，其中所述植物耐受所述植物毒性非蛋白质氨基酸。
30.根据权利要求29所述的转基因植物，其中所述植物生长在以显著抑制相应的非转基因植物生长的浓度含有所述非蛋白质氨基酸或其盐的介质中。
31.根据权利要求29所述的转基因植物，其中所述植物毒性非蛋白质氨基酸是间-酪氨酸(m-Tyr)化合物。
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