CN103941012A - 李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条，具有衬板，以及在衬板上依次排列的样品垫、金标垫、NC膜和吸收垫，其特征在于：其中，由保藏号为CGMCCNo.8002的杂交瘤细胞株6D4H7C8B6产生的单克隆抗体作为金标抗体偶联胶体金，以及由保藏号为CGMCCNo.8765的杂交瘤细胞株1B4E7A6C9产生的单克隆抗体作为检测抗体，金标抗体偶联胶体金后喷涂于金标垫上，检测抗体喷涂于NC膜上形成检测线。本发明对李斯特菌的检测特异性和灵敏性均较高。

Description

李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条
技术领域
本发明属于微生物检测领域。具体而言，本发明涉及一种李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条。
背景技术
李斯特菌(Listeriaspp.)是一种短小的革兰氏阳性无芽胞兼性厌氧杆菌，共有单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytohenes)、绵羊李斯特菌(Listeria iuanuii)、英诺克李斯特菌(Listeria innocua)、威尔斯李斯特菌(Listeria welshimeri)、西尔李斯特菌(Listeria seeligeri)、格氏李斯特菌(Listeria grayi)、默氏李斯特菌(Listeriamurrayi)七个菌株，其中单核细胞增生李斯特菌是李斯特菌属中致病力最强的细菌，也是唯一对人致病的、典型的胞内寄生菌，可以导致严重的人畜共患传染病，如脑膜炎、败血症、流产和单核细胞增多等症状。1988年，世界卫生组织(WorldHealth Organization，WHO)发表“食源性李斯特菌病劝告书”，指导全世界各国如何预防李斯特菌污染和中毒。自此，LM成为新的重要的食源性疾病病原菌，WHO将其与E.coliO157、沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌并列为20世纪90年代四大食源性致病菌。该菌主要污染牛奶及乳制品、乳酪制品、肉制品香肠、加工禽类、生肉、鱼、虾、烟熏鱼、生蔬菜。
目前李斯特菌的检测主要依赖于国标所规定的生化鉴定，其缺点是操作繁琐、检测周期较长，无法适应大量的样品筛查。免疫学检测是近年来出现的最快速、准确、稳定的快速检测手段，但是检测产品全部依赖进口，我国目前尚无拥有完全自主知识产权，且可运用于检测实践的快速检测产品，该专利以李斯特菌为检测靶标，所要求保护的技术涉及李斯特菌快速检测产品。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条。
一种李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条，具有衬板，以及在衬板上依次排列的样品垫、金标垫、NC膜和吸收垫，其特征在于：
其中，由保藏号为CGMCCNo.8002的杂交瘤细胞株6D4H7C8B6产生的单克隆抗体作为金标抗体偶联胶体金，由保藏号为CGMCCNo.8765的杂交瘤细胞株1B4E7A6C9产生的单克隆抗体作为检测抗体，金标抗体偶联胶体金后喷涂于金标垫上，检测抗体喷涂于NC膜上形成检测线。
另外，本发明还提供了李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条在检测食品中的李斯特菌中的应用。
发明作用与效果
根据本发明的李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条，由于采用了配对单克隆抗体分别喷涂金标垫和检测线，实验结果对李斯特菌的检测特异性和灵敏性均较高。
附图说明
图1是本发明实施例中单克隆抗体纯度测定的结果；
图2是本发明实施例中李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条的各抗体偶联胶体金的最佳pH的检测结果；
图3是本发明实施例中李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条的各抗体偶联胶体金的最佳结合量的检测结果；
图4是本发明李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条的结构示意图；
图5是本发明李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条的各抗体组合配对结果；
图6是本发明李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条的灵敏度测定结果；
图7是本发明李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条的交叉反应结果；以及
图8是本发明实施例中李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条的模拟带菌实验结果。
保藏信息
1.产生抗单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株6D4H7C8B6于2013年07月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京市)，保藏号为CGMCCNo.8002。
2.抗单核细胞增生李斯特菌杂交瘤细胞1B4E7A6C9于2014年01月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京市)，保藏号为CGMCCNo.8765。
具体实施方式
本发明人的研究表明，以单核细胞增生性李斯特菌作为免疫原，免疫Balb/c小鼠，分离纯化得到抗李斯特菌单克隆抗体1B4E7A6C9和6D4H7C8B6，其抗体效价可达到1:100000，其能够特异性、高效地与李斯特菌结合，与猪霍乱沙门、鼠伤寒沙门、肠炎沙门、福氏志贺、宋内氏志贺、鲍氏志贺、副溶血弧菌、阪崎肠杆菌、阪崎肠杆菌、小肠耶尔森氏菌、肺炎链球菌、蜡样芽孢杆菌等均无交叉反应。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中的条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明中所使用的菌株，除提供保藏编号的两株外，其它菌株均可以通过商业渠道获得。
一、抗李斯特菌单克隆抗体的制备及鉴定
1.免疫原和阳性标准品的准备
单核细胞增生性李斯特菌(ATCCNo.43251)接种于李氏增菌肉汤37℃、150r/min振荡培养17h，计数，加入0.3％甲醛溶液室温灭活1天。用生理盐水调整单核细胞增生性李斯特菌(ATCC No.43251)浓度至5×109cfu/ml作为免疫原；用生理盐水调整浓度为108cfu/ml作为阳性对照标准品，李氏增菌肉汤为阴性对照标准品。
2.单克隆抗体的制备过程
(1)实验动物：选3只8周龄，体重20g左右、雌性Balb/c小鼠为实验动物。
(2)免疫方法:每只小鼠腹腔注射0.2ml免疫原，每间隔2周用同样剂量加强注射一次。
(3)采血：3次加强免疫后从尾部静脉采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价。待效价不再上升，腹腔注射同样量免疫原，3天后按照常规方法进行细胞融合。
(4)细胞融合：取免疫小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50％PEG作用下常规融合，分别接种于96孔培养板，置于37℃、5％CO2培养箱培养。
(5)杂交瘤细胞筛选:采用间接非竞争酶联免疫法，筛选强阳性孔的杂交瘤细胞，将其转移至24孔培养板。
(6)克隆培养及抗体制备：用有限稀释法进行克隆化培养。当细胞生长至铺满孔底1/10时，再用同样方法检测，将强阳性孔再克隆，如此反复3－4次，直至阳性率达到100％。将杂交瘤细胞扩大培养，注射于经石蜡油预处理的Balb/c小鼠腹腔，每只2×106个杂交瘤细胞，7～10天小鼠腹部隆起，活体穿刺抽取腹水。
3.单克隆抗体纯化及鉴定
腹水先用辛酸-硫酸铵法粗提后，再用Protein G Sepharose亲和层析法纯化，将制备纯化所得抗体D3、E7、B9通过Nanodrop2000C测定仪测得浓度如表1，1B4E7A6C9浓度为4.5mg/ml，6D4H7C8B6浓度为3.8mg/ml，该浓度适于抗体的使用与保存，不需再进行浓缩或稀释。
纯化后的抗体经倍比稀释后用间接ELISA法测定效价，结果见表2；再用SDS-PAGE分析纯度，5％积层胶，10％分离胶，120V电压，电泳至胶底部，凝胶用考马斯亮蓝法染色，脱色后凝胶成像分析系统观察结果，结果如图1所示。图1中第1泳道是1B4E7A6C9，第二泳道是:6D4H7C8B6。
表1单克隆抗体的浓度
抗体编号 1B4E7A6C9 6D4H7C8B6
浓度(mg/mL) 4.5 3.8
单克隆抗体效价测定的步骤如下：
(1)将饱和培养细菌抗原连同培养基在对应的孔中加入100μL，4℃过夜(约包板36h)。
(2)倒空液体并拍干残留液体，用250μL洗涤液清洗3次。
(3)每个孔中加100μL1％BSA，37℃封闭1h。
(4)倒空液体并拍干残留液体，用250μL洗涤液清洗3次。
(5)每个孔中加100μL血清，37℃孵育1h。
(6)倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加250μLPBST洗涤液洗涤3次。
(7)每个孔中50μL的HRP标记的二抗(sigma)，室温孵育1h。
(8)用洗涤液浸泡5min，倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加250μLPBST洗涤液洗涤3次。
(9)每个孔中加100μL底物，显色30min，加终止液100μL并立即在OD450读数。
表2.单克隆抗体效价测定结果
4.单克隆抗体亚类鉴定
(1)抗原包被:用0.01MPBS包被山羊抗鼠二抗IgG+A+M，每孔50μL，4℃包被过夜，次日弃去孔内液体，洗板3遍。
(2)封闭:每孔加入1％BSA200μL，4℃封闭过夜。次日拍干板子不洗板。
(3)加入单克隆抗体杂交瘤细胞上清，每个样品8个微孔，每孔50μL。37℃，孵育1h。
(4)洗板4遍后，分别加入特异结合的兔抗鼠IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA，IgM，κ，λ，37℃孵育1h。
(5)洗板4遍后，每孔加入已稀释好的辣根过氧化物酶标记抗兔二抗IgG(H+L)，37℃，孵育30min。
(6)洗板4遍后，加入100μL底物显色液，37℃，避光显色10min。于450nm波长下读取结果。由表3可得，6D4H7C8B6亚类为IgG1，轻链亚型为κ；1B4E7A6C9亚类为IgG2b，轻链亚型为κ；
表3.两株单克隆抗体亚类鉴定结果
5.单克隆抗体交叉反应测试
(1)抗原包被：将78种108cfu/ml菌液浓度的致病菌加入到酶标板中，每个致病菌加3个孔，每孔100μl，4℃，包被过夜。
(2)封闭：洗板3遍后，每孔加入3％BSA200μl，37℃孵育2h。
(3)洗板3遍。每孔加入稀释好的单克隆抗体100μl，37摄氏度孵育1h。
(4)洗板3遍。加入已稀释好的山羊抗鼠二抗到所有微孔中，每孔100μl，37摄氏度孵育1h。
(5)洗板4遍。加入底物显色液，37℃，避光显色15min。于450nm波长下读取结果。结果如表4所示。
表4单克隆抗体的交叉反应实验
由表3可知单克隆抗体6D4H7C8B6和1B4E7A6C9对表中除了李斯特菌之外的细菌均无交叉反应。
二、李斯特菌胶体金快速检测试纸条抗体最优组合的确定
1.各抗体偶联胶体金的最佳pH的确定
分别取100μL胶体金溶液于96孔板8个孔中，并调节pH至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，每孔加入10μL浓度为1mg/mL的单克隆抗体。反应5min，各孔加入10μL10％NaCl溶液，反应5min，观察溶液颜色变化，重复三次。
图2中各组从左到右的孔中pH值依次为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。由图2得知，A组为不同pH值下单克隆抗体6D4H7C8B6胶体金标记的结果，当pH为7.5-8.0时，孔中胶体金颜色最红，且无聚沉、无褪色或变色现象，即6D4H7C8B6单抗偶联胶体金最佳pH范围为7.5-8.0；B组为不同Ph值下单克隆抗体1B4E7A6C9胶体金标记结果，当pH为7.5时，胶体金颜色最红，且无聚沉、无褪色或变色现象，即1B4E7A6C9偶联胶体金最佳pH为7.5。
2.各抗体偶联胶体金的最佳结合量的确定
调节胶体金溶液pH至上文得到的各抗体偶联的最佳pH值，各取100μL于96孔板中，按表5加入各抗体，反应5min，各孔加入10μL10％NaCl溶液，反应5min，观察溶液颜色变化，重复三次，结果如图3所示。取颜色最红且抗体用量最少的为最小结合量xμg/mL，为保证胶体金完全与抗体结合，则以x+x×20％为最佳结合量。
表5抗体与胶体金偶联最佳结合量
编号 1 2 3 4 5 6 7
胶体金溶液(μL) 100 50 100 100 100 100 100
抗体质量/金溶液体积(μg/mL) 0 0 5 10 15 20 25
10％NaCl(μL) 10 0 10 10 10 10 10
由图3得知，抗体质量/金溶液体积为0μg/mL时，加入10％NaCl后各组孔1中胶体金均出现聚沉，颜色由红色变灰，最后变为无色；各组孔2为50μL胶体金原液作对照。当抗体质量/金溶液体积由5μg/mL增加至25μg/mL时，各组孔中胶体金颜色依次变红变深，其中，A组单克隆抗体6D4H7C8B6的添加量≥10μg/mL时，颜色保持红色基本不变，且均红于孔3，即单克隆抗体6D4H7C8B6的最小结合量为10μg/mL，则其最佳结合量为12μg/mL；B组单克隆抗体1B4E7A6C9的添加量≥20μg/mL时，颜色变化较小，且均红于孔3、4、5，即F10最佳结合量为24μg/mL。
3.抗体的纳米金标记
将胶体金的pH调节至最佳pH值，按上文中确定的最佳结合量吸取抗体以40μL/min的速度滴加到胶体金溶液中，同时在磁力搅拌器上搅拌，待抗体加完后继续搅拌30min，加入金溶液1/10体积的含10％BSA的PBS溶液，搅拌1h，移入离心管4000rpm离心10min，小心吸取上清至新离心管，将上清13000rpm离心25min，弃上清，沉淀用重悬液以原胶体金溶液1/10体积的量重悬，混合均匀后4℃保存备用。以原胶体金溶液1/10体积的量重悬，混合均匀后4℃保存备用，如需保存较长时间，可加入0.3％叠氮化钠。
4.免疫胶体金检测试纸条的组装及测定
图4是本发明李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条的结构示意图。
如图4所示，李斯特菌的免疫胶体金检测试纸条10包括：样品垫14、金标垫13、检测线16，质控线15以及吸水垫11，在吸水垫11与样品垫14的中间采用硝酸纤维素膜12，硝酸纤维素膜也称NC膜。硝酸纤维素膜12上具有质控线15和检测线16，检测线16靠近样品垫一侧。另外李斯特菌的免疫胶体金检测试纸条10还具有背衬17，用于承载上述的样品垫14等结构。
将制备好的金标抗体分别喷涂于多个检测试纸条的金标垫上，记为6D4H7C8B6-Au-pad、1B4E7A6C9-Au-pad，将各抗体均稀释至1mg/mL，分别包被硝酸纤维素膜12上作为Testline，即检测线，也称T线。包被方法采用常规实验方法。以羊抗鼠作为金标单抗试纸条的Controlline，即控制线，也称C线。以羊抗兔作为金标多抗试纸条的Controlline。按表6中的组合方式对金标垫和检测线喷涂抗体，组装试纸条，将培养好的菌液用生理盐水稀释至108、107、106CFU/mL进行测定，无菌生理盐水作阴性对照，选择最优的抗体组合。表6中的6D4H7C8B6-Au-pad一列代表将杂交瘤6D4H7C8B6产生的单克隆抗体作为金标抗体与胶体金结合并喷涂于胶体金试纸条的金标垫上，将杂交瘤1B4E7A6C9产生的单克隆抗体喷涂于NC膜上形成检测线。1B4E7A6C9-Au-pad一列代表将杂交瘤1B4E7A6C9产生的单克隆抗体作为金标抗体与胶体金结合并喷涂于胶体金试纸条的金标垫上，将杂交瘤6D4H7C8B6产生的单克隆抗体喷涂于NC膜上作为检测线。
表6抗体不同配对组装试纸条
图5是本发明李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条的各抗体组合配对结果。如图5所示，其中，A为6D4H7C8B6-1B4E7A6C9组合结果；B为1B4E7A6C9-6D4H7C8B6组合结果。
图5中各组试纸条中从左至右分别为采用108、107、106、105CFU/mL单核细胞增生性李斯特菌的菌液进行测试的结果，由图5可知，A组合灵敏度可达106CFU/mL，且无假阳性，效果较好；B组合灵敏度可达107CFU/mL，且无假阳性，但其T、C线显色均较A组浅，综上，选用抗体组合效果较好的A组，即6D4H7C8B6偶联胶体金作为金标抗体喷涂于金标垫，1B4E7A6C9喷涂于NC膜作T线来制作本发明的李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条。
5.李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条的灵敏度测定
将培养好的菌液用生理盐水依次稀释至108、107、106、105CFU/mL，不同浓度菌液均取35μL分别滴加至使用A组单抗组合制作的试纸条的样品垫上进行检测，使用无菌生理盐水为阴性对照，并重复三次。
结果如图6所示，滴加浓度为108、107、106CFU/mL菌液后，试纸条T线显色，滴加105CFU/mL菌液T线无显色，说明试纸条检测灵敏度可达106CFU/mL，三次重复结果均为106CFU/mL，灵敏度稳定性较好。
6.试纸条交叉反应实验
利用以下食源性致病菌对制备的试纸条进行交叉反应实验：金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus(ATCC29213、ATCC27660)、大肠杆菌O157:H7Escherichiacoli O157:H7(ATCC43895、ATCC43889)、单核细胞增生李斯特菌Listeriamonocytogenes(ATCC43251ATCC19115)、猪霍乱沙门氏菌Salmonellacholeraesuis(CICC21493)、鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhiumukriunm(CICC22956、ATCC14028)、肠炎沙门氏菌Salmonella enteritidis(ATCC13076)、福氏志贺氏菌Shigella flexneri(ATCC12022)、宋内氏志贺氏菌Shigella sonnei(ATCC25931)、痢疾志贺氏菌Shigella dysenteriae(野生分离株)、鲍氏志贺氏菌Shigella boydii(ATCC9207)、小肠结肠炎耶尔森氏菌Yersinia enterocolitica(ATCC23715、CMCC52207)、副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus(ATCC17802)、坂崎肠杆菌Enterobacter sakazakii(ATCC29004、ATCC29554)、空肠弯曲菌Campylobacter jejuni enteritis(CICC22937)、乙型溶血性链球菌Streptococcus Hemolyticsβ(ATCC10373)、幽门螺旋杆菌Helicobacter Pylor(ATCC43504)、阴沟肠杆菌(CMCC(B)45301)、粪肠球菌(ATCC29212)、大肠埃希氏菌(ATCC8739、ATCC25922、CMCC(B)44102)。用制备好的试纸条检测27株培养至108CFU/mL的细菌并观察结果。图7是本发明实施例中李斯特菌的免疫胶体金检测试纸条的胶体金试纸条交叉反应结果。由图可知，35μL浓度为108CFU/mL的单核细胞增生性李斯特菌(ATCC43251、ATCC19115)菌液滴加到样品垫后，T线均显色，其他25株细菌相同浓度相同体积加样后，T线均未显色，结果表明，该试纸条可以专一检测李斯特菌，而和其它食源性致病菌无交叉反应，且试纸条性能稳定，是一种较好的李斯特菌快速检测产品。
三、免疫胶体金试纸条模拟带菌实验
为了进一步验证本发明的李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条的实际检测性能，培养单核细胞增生性李斯特菌浓度至108CFU/mL，用生理盐水梯度稀释至103CFU/mL后各取100μL分别加入到25g(mL)的市售面包、果冻及牛奶中，按照国标GB4789.10-2010分别向各样品中加入225mLBHI培养基，36℃培养22h，期间每隔1h各取10mL样品待检，分别取各样品各时间段培养物40μL滴加至样品垫进行检测。实验结果在图8中依次左至右排列，用蒸馏水作为阴性对照，每组排列在最后一个。
如图8所示，A组为面包样品组，B组为果冻样品组，C组为牛奶样品组，A组面包样品增菌2-5h时，试纸条T线无显色，增菌6-12h时，T线显色，检测结果呈阳性，说明含有约200CFU单核细胞增生性李斯特菌的面包样品在增菌液中增菌6h即可被检出；B组牛奶样品增菌2-6h时，T线无显色，增菌7-12h时，T线显色，检测结果呈阳性，说明含有约200CFU单核细胞增生性李斯特菌的牛奶样品在增菌液中增菌7h可被检出；C组果冻样品增菌2-7h时，T线无显色，增菌8-12h，T线显色，检测结果呈阳性，说明含有约200CFU单核细胞增生性李斯特菌的果冻样品在增菌液中增菌8h可被检出，三组模拟带菌检测中作为阴性对照的蒸馏水均未显色。以上结果说明本发明的李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条对实际样品具有很好的检测能力。
此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (2)

1.一种李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条，具有衬板，以及在衬板上依次排列的样品垫、金标垫、NC膜和吸收垫，其特征在于：
其中，由保藏号为CGMCCNo.8002的杂交瘤细胞株6D4H7C8B6产生的单克隆抗体作为金标抗体偶联胶体金，由保藏号为CGMCCNo.8765的杂交瘤细胞株1B4E7A6C9产生的单克隆抗体作为检测抗体，所述金标抗体偶联胶体金后喷涂于所述金标垫上，所述检测抗体喷涂于所述NC膜上形成检测线。
2.如权利要求1所述的李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条在检测食品中的李斯特菌中的应用。
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