CN103937715A - 含干酪乳杆菌的微生态益生菌制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于饲料微生物技术领域，涉及一种以豆粕、麸皮为基质，以益生菌干酪乳杆菌HM-09(Lactobacillus casei HM-09)进行固态发酵的应用技术，此技术可广泛应用于动物益生菌微生态等方面，一种益生菌固体制剂产品，由以下方法制得，固态发酵培养基上接种干酪乳杆菌HM-09种子液，再接种地衣芽孢杆菌BL-09，发酵结束后经干燥制备含有益生菌剂的固体培养物粉末；地衣芽孢杆菌BL-09（Bacillus licheniformis）保藏号为CGMCC No.5686，此制备方法生产成本低，可以提高经济效益并且操作简单。

Description

含干酪乳杆菌的微生态益生菌制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于饲料微生物技术领域，涉及一种以豆粕、麸皮为基质，以益生菌干酪乳杆菌HM-09(Lactobacillus casei HM-09)进行固态发酵的应用技术，此技术可广泛应用于动物益生菌微生态等方面。
背景技术
目前，益生菌制品多采用益生菌直接与液态牛乳和豆乳发酵，得到功能性的酸牛奶或者酸豆奶，其余则采用液态发酵，直接收集益生菌菌体，制作成益生菌粉剂、片剂或者胶囊。采用液态发酵会产生大量的废水，对环境污染较大，后处理比较困难，机器设备操作繁琐。因此本申请采用干酪乳杆菌HM-09(Lactobacillus casei HM-09)固态发酵豆粕、麸皮为基质，采用固态发酵，其生产成本低，投资的资金较少，在下游处理方便，污染小，设备结构简单、易操作。采用干酪乳杆菌HM-09进行固态发酵，可生产出一种具有酸香气味的发酵制品，改善动物饲料的适口性。其蛋白质被分解成小肽和游离氨基酸，有利于动物肠胃消化吸收。
中国专利CN103202391A公布了一种预防及改善牛乳房炎的复合微生态制剂，技术方案是：复合微生态制剂中干酪乳杆菌HM-09(L.casei HM-09)质量份数为10%，植物乳杆菌HM-10（L.plantarum HM-10）质量份数为10%，其余80%为沸石粉，同时复合微生态制剂中L.caseiHM-09活菌数量≥2.5×108cfu/g，L.plantarum HM-10活菌数量≥2.5×108cfu/g；所述干酪乳杆菌和植物乳杆菌已于2012年10月29日在地址为北京市大屯路，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，干酪乳杆菌HM-09(L.casei HM-09)保藏号：CGMCC No.6736；植物乳杆菌HM-10（L.plantarum HM-10）保藏号：CGMCC No.6741。
发明内容
本发明目的在于采用干酪乳杆菌HM-09进行固态发酵豆粕、玉米粉和麸皮，提供一种以豆粕、麸皮和玉米粉为基质可广泛应用于微生态领域的益生菌固体发酵技术，此方法可以生产出具有特殊酸香味，且豆粕、麸皮发酵产品的活菌数高，豆粕蛋白质的降解率高。此制备方法生产成本低，可以提高经济效益并且操作简单。
本发明是通过下述技术方案实现的。
一种以豆粕、麸皮和玉米粉为基质可广泛应用于微生态领域的益生菌固体发酵技术，包括干酪乳杆菌HM-09的培养及其固态发酵培养，得到益生菌的固态发酵产品。
所述干酪乳杆菌HM-09种子培养基和地衣芽孢杆菌BL-09种子培养基均为(g/L)：蛋白胨10-50，葡萄糖10-50，加水至1L，pH7.0-7.2。
所述地衣芽孢杆菌BL-09种子培养条件，放置于摇床上，转速为160-180r/min，温度为33-37℃，培养20-24h。
所述干酪乳杆菌HM-09的种子培养条件：干酪乳杆菌HM-09于恒温箱中30-37℃静置培养20-24h。
固态发酵培养基：质量比例组成为：豆粕：麸皮：玉米粉=10:8-10:0.5-1，水份含量控制在40-75%，pH7.0-7.2。
干酪乳杆菌HM-09进行发酵pH呈缓慢下降趋势，pH最小值为5.0。干酪乳杆菌HM-09发酵36h后，再接种地衣芽孢杆菌BL-09，再混菌发酵18h后，其游离氨基态氮含量为：260.7umol/g；发酵制品中干酪乳杆菌HM-09活菌数为3.95×109CFU/g，地衣芽孢杆菌的活菌数为2.16×109CFU/g。
所述固态发酵培养方法为：固态发酵培养基上接种干酪乳杆菌HM-09种子液，接种量为3-8%(v/w)，控制发酵温度34-38℃,湿度40-60%，发酵12-36h；再接种地衣芽孢杆菌BL-09，接种量为2-8%(v/w)，控制发酵温度30-33℃,湿度40-50%，混菌培养12-18h。发酵结束后经干燥制备含有益生菌剂的固体培养物粉末。
干酪乳杆菌HM-09于2012年10月29日保藏，保藏号为CGMCC No.6736。保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
地衣芽孢杆菌BL-09分类名称分别为Bacillus licheniformis BL-09、地衣芽孢杆菌BL-09于2011年12月31日保藏，保藏号为CGMCC No.5686。
地衣芽孢杆菌BL-09分离自内蒙古自治区呼和浩特市地区健康牛肠道样品中芽孢杆菌，属于兼性厌氧的、革兰氏阳性芽孢杆菌；菌体呈棒杆状，偶尔见长杆状，芽孢中生，呈椭圆形；最适生长温度为37±1℃，最适生长pH为7.0-7.4，固态发酵烘干产物常温储存6个月，芽孢损失率低于5%；营养琼脂平板培养12h左右，菌落不规则、边缘不光滑，菌落中央具有明显的凸起峰，培养至24-36h，菌落褶皱明显且褶皱内物质呈液体状，接种环挑取具有拉丝情况，镜检芽孢基本脱落，经过伯杰氏细菌手册（第9版）生理生化试验及细菌、菌落形态确定为地衣芽孢杆菌，命名为地衣芽孢杆菌BL-09。体外实验证实，该菌株具有良好的耐高温、耐酸、耐胆盐等生化特性地衣芽孢杆菌BL-09还具有高产蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等多种酶类及氨基酸、维生素、抗菌物质等多种生理活性物质，发酵后的固态培养基粘度很大，拉丝严重，培养器皿底部可见少量液体物质，证明其固态发酵中的保湿能力相对较强。
耐酸试验：
地衣芽孢杆菌BL-09于肉汤种子液中，37℃，180r/min培养24h，于4℃、4000r/min离心10min收集菌体，用0.85%无菌生理盐水漂洗一次后，悬浮于pH分别为2.0、3.0及4.0的缓冲溶液中，37℃培养1～3h，检测活菌数变化，结果显示地衣芽孢杆菌BL-09具有良好的耐酸性。
耐热试验：
地衣芽孢杆菌BL-09于肉汤种子液中，37℃，180r/min培养24h，于4℃、4000r/min离心10min收集菌体，用0.85%无菌生理盐水漂洗一次后，获得的菌体用适量无菌生理盐水稀释后于80℃水浴加热处理10min以获得芽孢，再分别于80℃、90℃和100℃下分别处理5～30min，检测活菌数变化，结果显示地衣芽孢杆菌BL-09具有良好的耐热性。
耐胆盐试验：
地衣芽孢杆菌BL-09于肉汤种子液中，37℃，180r/min培养24h，于4℃、4000r/min离心10min收集菌体，用0.85%无菌生理盐水漂洗一次后，悬浮于含胆盐浓度分别为0.03%、0.10%、0.30%的生理盐水中，37℃培养1～6h，检测活菌数变化，结果显示地衣芽孢杆菌BL-09具有良好的耐淡盐性。
[有益效果]
本发明的优点和积极效果：
本发明中采用干酪乳杆菌HM-09和地衣芽孢杆菌BL-09混合固态发酵豆粕。本发明采用固态发酵生产成本低，投资的资金较少，在下游处理方便，污染小，设备结构简单、易操作，可广泛应用于微生态领域的益生菌固体发酵技术；采用干酪乳杆菌HM-09进行发酵，可以产生乳酸及乙酸等酸味小分子物质，这些小分子物质赋予产品特有的酸香味、色泽和口感等感官特征的改善和多样化，豆粕和麸皮发酵产品提高动物适口性；采用干酪乳杆菌HM-09和地衣芽孢杆菌BL-09发酵豆粕和麸皮，可以使豆粕中的蛋白质被分解成小肽和游离氨基酸，利于动物肠胃的消化吸收。
使本发明产品中在饲料中添加使用时，此类产品用于奶牛饲喂时能有效提高饲料的利用效率16-26%。本发明产品在饲料中的添加量为20-50克/kg。
本发明产品使用后奶牛的受胎率提高了13%，经计算能提高奶牛的年产奶量230公斤以上。
具体实施方式
下面结合实例，对本发明进一步说明，下述实例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实例来限定本发明的保护范围。
干酪乳杆菌HM-09分类名称为Lactobacillus casei HM-09，干酪乳杆菌HM-09于2012年10月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心（国家专利局指定专利微生物保藏中心）保藏，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏号为CGMCC No.6736。
地衣芽孢杆菌BL-09分类名称为Bacillus licheniformis BL-09、地衣芽孢杆菌BL-09于2011年12月31日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心（国家专利局指定专利微生物保藏中心）保藏，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏号为CGMCC No.5686。
1.菌体的种子液制备
将干酪乳杆菌HM-09与地衣芽孢杆菌BL-09从冻藏的甘油管中接到装有液体种子的培养基中，所述地衣芽孢杆菌BL-09种子培养条件，放置于摇床上，转速为160-180r/min，温度为33-37℃，培养20-24h；所述干酪乳杆菌HM-09的种子培养条件：干酪乳杆菌HM-09于恒温箱中30-37℃静置培养20-24h。
所述干酪乳杆菌HM-09种子培养基和地衣芽孢杆菌BL-09种子培养基均(g/L)：蛋白胨10-50，葡萄糖10-50，加水至1L，pH7.0-7.2。
2.固态发酵
所述固态发酵培养方法为：固态发酵培养基上接种干酪乳杆菌HM-09种子液，接种量为3-8%(v/w)，控制发酵温度34-38℃,湿度40-60%，发酵12-36h；再接种地衣芽孢杆菌BL-09，接种量为2-8%(v/w)，控制发酵温度30-33℃,湿度40-50%，混菌培养12-18h。发酵结束后经干燥制备含有益生菌剂的固体培养物粉末。
固态发酵培养基为：质量比例组成为：豆粕：麸皮：玉米粉=10:8-10:0.5-1，水份含量控制在40-75%，pH7.0-7.2。115℃高压灭菌25min。
3.活菌数的测定
一般采用平板计数法，操作步骤为：称取制备好的豆粕发酵制品10g，置于90ml的无菌生理盐水中，放置到摇床上震荡30min，摇匀后用移液枪取1ml的菌液加进另一个9ml的无菌生理盐水中，进行稀释，按照国标方法，依次做十倍梯度稀释。稀释完后，用移液枪分别取合适的稀释度1ml打进平板，倒入培养基混匀，依次做三个平行，置于培养箱中在37℃静置培养48h。
4.pH值的测定
称取10g发酵后样品，放入三角瓶中，加入90ml的蒸馏水。用磁力搅拌器搅拌30min，静置10min后用精密pH计测定其pH值。
5.氨基态氮含量的测定
取10g发酵后样品，用匀浆器破碎，之后与90ml的蒸馏水混合，在4℃冰箱放置1天。样品离心7000r/min，离心15min。上清液0.8ml置于试管中，然后加3.2ml蒸馏水、2.0ml显色剂，混匀，放入沸水浴中加热15min，同时作空白对照。然后冷水冷却，加入5.0ml40%乙醇溶液混匀，放置15min后用1cm比色杯，以空白管调零于570nm处测定A值。
以下是对以豆粕为基质的益生菌发酵产品的生产方法的一些参数的确定，以及一些培养条件的优化。
实施例1：干酪乳杆菌HM-09固态发酵制备的益生菌制剂，其制备方法包括菌种培养及其固态发酵培养。
所述种子培养条件：地衣芽孢杆菌BL-09种子培养条件，放置于摇床上，转速为180r/min，温度为37℃，培养24h；干酪乳杆菌HM-09于恒温箱中37℃静置培养24h。
所述固态发酵培养方法为：固态发酵培养基上接种干酪乳杆菌HM-09种子液，接种量为8%(v/w)，控制发酵温度37℃,湿度50%，发酵24h；再接种地衣芽孢杆菌BL-09，接种量为5%(v/w)，控制发酵温度33℃,湿度50%，混菌培养12h。发酵结束后经干燥制备含有益生菌剂的固体培养物粉末。
所述种子培养基为(g/L)：蛋白胨20，葡萄糖50，加水至1L，pH7.0-7.2。
所述固态发酵培养基质量比例组成为：豆粕：麸皮：玉米粉=10:9:1，水份含量控制在60%。
测得干酪乳杆菌HM-09活菌数为3.01×109CFU/g，地衣芽孢杆菌的活菌数为1.21×109CFU/g，发酵结束后，游离氨基态氮含量达到221.7umol/g。
实施例2：干酪乳杆菌HM-09固态发酵制备的益生菌制剂，其制备方法包括菌种培养及其固态发酵培养。
所述种子培养条件：地衣芽孢杆菌BL-09种子培养条件，放置于摇床上，转速为180r/min，温度为37℃，培养24h；干酪乳杆菌HM-09于恒温箱中37℃静置培养24h。
所述固态发酵培养方法为：固态发酵培养基上接种干酪乳杆菌HM-09种子液，接种量为2%(v/w)，控制发酵温度37℃,湿度55%，发酵36h；再接种地衣芽孢杆菌BL-09，接种量为8%(v/w)，控制发酵温度30℃,湿度45%，混菌培养12h。发酵结束后经干燥制备含有益生菌剂的固体培养物粉末。
所述种子培养基为(g/L)：蛋白胨20，葡萄糖50，加水至1L，pH7.0-7.2。
所述固态发酵培养基质量比例组成为：豆粕：麸皮：玉米粉=10:8:1，水份含量控制在50%。
测得干酪乳杆菌HM-09活菌数为2.61×109CFU/g，地衣芽孢杆菌的活菌数为1.45×109CFU/g，发酵结束后，游离氨基态氮含量达到239.8umol/g。
实施例3：干酪乳杆菌HM-09固态发酵制备的益生菌制剂，其制备方法包括菌种培养及其固态发酵培养。
所述种子培养条件：地衣芽孢杆菌BL-09种子培养条件，放置于摇床上，转速为180r/min，温度为37℃，培养24h；干酪乳杆菌HM-09于恒温箱中37℃静置培养24h。
所述固态发酵培养方法为：固态发酵培养基上接种干酪乳杆菌HM-09种子液，接种量为8%(v/w)，控制发酵温度33℃,湿度50%，发酵36h；再接种地衣芽孢杆菌BL-09，接种量为5%(v/w)，控制发酵温度33℃,湿度50%，混菌培养18h。发酵结束后经干燥制备含有益生菌剂的固体培养物粉末。
所述种子培养基为(g/L)：蛋白胨20，葡萄糖50，加水至1L，pH7.0-7.2。
所述固态发酵培养基质量比例组成为：豆粕：麸皮：玉米粉=10:10:0.5，水份含量控制在65%。
测得干酪乳杆菌HM-09活菌数为3.47×109CFU/g，地衣芽孢杆菌的活菌数为2.06×109CFU/g，发酵结束后，游离氨基态氮含量达到257.0umol/g。
实施例4（最佳实施例）：干酪乳杆菌HM-09固态发酵制备的益生菌制剂，其制备方法包括菌种培养及其固态发酵培养。
所述种子培养条件：地衣芽孢杆菌BL-09种子培养条件，放置于摇床上，转速为180r/min，温度为37℃，培养24h；干酪乳杆菌HM-09于恒温箱中37℃静置培养24h。
所述固态发酵培养方法为：固态发酵培养基上接种干酪乳杆菌HM-09种子液，接种量为5%(v/w)，控制发酵温度37℃,湿度60%，发酵36h；再接种地衣芽孢杆菌BL-09，接种量为6%(v/w)，控制发酵温度37℃,湿度50%，混菌培养18h。发酵结束后经干燥制备含有益生菌剂的固体培养物粉末。
所述种子培养基为(g/L)：蛋白胨20，葡萄糖50，加水至1L，pH7.0-7.2。
所述固态发酵培养基质量比例组成为：豆粕：麸皮：玉米粉=10:10:0.5，水份含量控制在60%。
测得干酪乳杆菌HM-09活菌数为3.95×109CFU/g，地衣芽孢杆菌的活菌数为2.16×109CFU/g，发酵结束后，游离氨基态氮含量达到260.7umol/g。

Claims (5)

1.一种益生菌固体制剂产品，由以下方法制得，固态发酵培养基上接种干酪乳杆菌HM-09种子液，接种量为3-8%(v/w)，控制发酵温度34-38℃,湿度40-60%，发酵12-36h；再接种地衣芽孢杆菌BL-09，接种量为2-8%(v/w)，控制发酵温度30-33℃,湿度40-50%，混菌培养12-18h；发酵结束后经干燥制备含有益生菌剂的固体培养物粉末；地衣芽孢杆菌BL-09（Bacillus licheniformis）保藏号为CGMCC No.5686。 
2.一种如权利要求1所述益生菌固体制剂产品的制备方法，包括如下步骤：固态发酵培养基上接种干酪乳杆菌HM-09种子液，接种量为3-8%，控制发酵温度34-38℃,湿度40-60%，发酵12-36h；再接种地衣芽孢杆菌BL-09，接种量为2-8%(v/w)，控制发酵温度30-33℃,湿度40-50%，混菌培养12-18h；发酵结束后经干燥制备含有益生菌剂的固体培养物粉末。 
3.一种如权利要求2所述益生菌固体制剂产品的制备方法，所述固态发酵培养基质量比例组成为：豆粕：麸皮：玉米粉=10:8-10:0.5-1，水份含量控制在40-75%，pH7.0-7.2。 
4.一种如权利要求2和3所述益生菌固体制剂产品的制备方法，所述固态发酵培养基上接种干酪乳杆菌HM-09种子液，接种量为5%(v/w)，控制发酵温度37℃,湿度50%，发酵36h；再接种地衣芽孢杆菌BL-09，接种量为6%(v/w)，控制发酵温度3℃,湿度45%，混菌培养18h；发酵结束后经干燥制备含有益生菌剂的固体培养物粉末，其游离氨基态氮含量为：260.7umol/g。 
5.一种如权利要求2和3所述益生菌固体制剂产品在畜禽养殖中的应用。  
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