CN103936880A - 纳米级颗粒型辅料 - Google Patents

Abstract

本发明公开了纳米级颗粒及其制备方法，该方法包括，合成琥珀酰化葡聚糖；合成胺基化叶酸类似物；合成叶酸-葡聚糖缀合物；以及，将药物化合物混合入叶酸-葡聚糖缀合物中。本发明还公开了该纳米级颗粒在制备适用于脂溶性药物化合物、抗肿瘤和／或药物耐受性增强并且毒性降低的药物组合物中的应用等。

Description

纳米级颗粒型辅料

技术领域

本发明是中国专利申请第201210543504.9号分案的发明，享有2012年12月14日的申请日。

本发明属于药物制剂领域，具体而言，本发明涉及纳米级颗粒，除了其药物理化性质得以提升外，其中辅料和紫杉醇等药物化合物甚至可以协同起效，并能提高药物的耐受性。另外，本发明还涉及该纳米级颗粒在制备适用于脂溶性药物化合物、抗肿瘤和／或药物耐受性增强并且毒性降低的药物组合物中的应用以及该纳米级颗粒的制备方法等。

背景技术

目前临床使用的大多数抗癌药物，如紫杉醇，Docetaxel(多西他赛)，阿霉素等在生理盐水中的溶解度比较差，无法在临床上直接使用，需要一些辅料配合。例如，用聚氧乙烯蓖麻油和乙醇的混合物来配制紫杉醇，(泰索帝)用聚山梨酯和乙醇来配制，但是都会引起强烈的副作用，如过敏反应、肾脏毒性、神经和心脏毒性等；最近的使用血清白蛋白为载体来配制紫杉醇，毒副作用也明显降低，然而血清白蛋白无论是提取还是DNA重组获得，纯化难度大，造成成本居高不下，一个剂量就需US＄5，100，而一个疗程需要至少3剂，无法在我国推广。

日本专利JP2010126533A披露了，把紫杉醇与葡聚糖等共价缀合在一起，然后再通过非共价吸附在药物颗粒表面固定叶酸，以达到靶向抗肿瘤的目的，然而本发明人发现，紫杉醇作为药效活性化合物，与葡聚糖缀合，尤其是与葡聚糖上大量基团的副反应，由于化学结构的改变，会显著降低紫杉醇的药效，如果要消除结构相近的副产物，需要复杂的纯化过程(如层析过柱)，成本降不下来，而且叶酸吸附在表面，容易洗脱。中国专利20121002970.5公开了共价结合的叶酸-葡聚糖-氧化铁纳米颗粒，其具有体外靶向作用，其没有报道这种颗粒本身的抗肿瘤效果(实际基本没有)，而且本发明人发现其是先合成葡聚糖-氧化铁纳米颗粒，然后再进行叶酸缀合，合成效率低，且辅料对药物的适应性丧失。

为此，本发明人经过艰苦的研究，并结合一些运气，偶然发现通过一些连接基团将叶酸直接共价结合到葡聚糖上，虽然一定程度上丧失了叶酸对肿瘤的靶向性，目前其经测试体外没有抗肿瘤细胞的毒性(活性)，但是却能够很稳定地非共价地包裹住诸如紫杉醇等药物，复溶性和稳定性俱佳，且不必改变紫杉醇的化学结构，还无需使用复杂的纯化工艺(如，柱层析)。更令人意想不到的是，该辅料本身虽然没有体外抗肿瘤细胞的毒性，但是能够协同紫杉醇起效，提高体内的抗肿瘤的效果，并且能提高受试动物的药物耐受性，使得在临床使用中可以更大剂量地给药，从而进一步提高抗肿瘤效果。

发明内容

本发明的目的在于提供新的纳米级颗粒，其最终形成的药物组合物复溶性和稳定性俱佳，其制备无需复杂的纯化工艺，药物适应性良好，甚至其中的辅料能与紫杉醇等药物化合物协同起效，提高疗效以及药物耐受性。另外，本发明还提供了该纳米级颗粒在制备适用于脂溶性药物化合物、抗肿瘤和／或药物耐受性增强并且毒性降低的药物组合物中的应用以及该纳米级颗粒的制备方法等。

具体而言，在第1方面，本发明提供了纳米级颗粒，其由如下制备方法制备，该方法包括，

(1)按流程式I合成琥珀酰化葡聚糖

(2)按流程式II合成胺基化叶酸类似物

(3)按流程式III用步骤(1)和步骤(2)的产物合成叶酸-葡聚糖缀合物

(4)将药物化合物混合(优选用高速匀浆机混合)入含步骤(3)获得的叶酸-葡聚糖缀合物的溶液中，形成含纳米级颗粒的溶液，其中纳米级颗粒是粒径小于200nm(优选是小于180nm)的颗粒。

优选在本发明第I方面的纳米级颗粒中，药物化合物是脂溶性药物化合物，优选是紫杉醇。

优选在本发明第I方面的纳米级颗粒中，步骤(4)中的药物化合物和叶酸-葡聚糖缀合物的重量比为0.5～2∶1～10，优选为0.8～1.2∶3～6，如1∶4。

优选在本发明第I方面的纳米级颗粒中，步骤(1)中的葡聚糖的平均分子量为5～30KDa，优选为10～20KDa，如10KDa、15KDa或20KDa。

优选在本发明第1方面的纳米级颗粒中，所述方法包括，

(1)取平均分子量20KDa、Mw／Mn=1.3的葡聚糖10.0g溶于无水DMF中，搅拌20分钟形成澄清的溶液，然后加入1670mg琥珀酸酐和200.0mg4-二甲基氨基吡啶(DMAP)，快速搅拌至所有的固体溶解；置于室温下使得整个反应液反应24小时，之后将反应液放入截留分子量3,500的Spectra／Por3透析袋中，置于水中透析2天；然后将透析袋中的溶液冷冻干燥，得到白色的琥珀酰化葡聚糖；

(2)取3g叶酸溶于120mL DMSO中，向其中加入930mg DCC和770mgNHS，反应液在室温暗室处放置12小时，然后副产物DCU沉淀被过滤去除，再向反应液加入1000mL V：V=30∶70的丙酮／乙醚混合液并进行搅拌，收集黄色沉淀并用V：V=30∶70的丙酮／乙醚混合液洗涤后晾干；取2.78g晾干的黄色沉淀再溶于20mL DMSO中，取6.01g乙二胺快速加入到该溶液中，将两者混合后在室温暗室处放置12小时，加入50mL V：V=30∶70的丙酮／乙醚混合液并进行搅拌，收集黄色沉淀并在DMSO溶液中重结晶提纯，获得胺基化叶酸类似物：

(3)取步骤(1)制备的琥珀酰化葡聚糖2000mg溶于40ml无水DMF中，加入50mgDMAP和579.7mg DCC，在室温下放置12小时后，再加入2mL含300mg步骤(2)制备的胺基化叶酸类似物的EDC溶液，反应液在室温下搅拌12小时后，将反应液放入截留分子量3,500的Spectra／Por3透析袋中，置于水中透析2天；然后将透析袋中的溶液冷冻干燥，得到黄色的叶酸-葡聚糖缀合物；

(4)取1000mg步骤(3)制备的叶酸-葡聚糖缀合物，溶于100ml15mM的磷酸缓冲液(pH=7.4)中，溶解后，置于磁力搅拌器上以400rpm搅拌；在搅拌过程中，将250mg紫杉醇溶于5mL乙醇中，逐滴加入到搅拌的溶液中，加完后置于FS-1型高速匀浆机中，以最大功率匀浆6次，每次1分钟，停2分钟，之后将匀浆液放入截留分子量3,500的Spectra／Por3透析袋中，置于15mM pH=7.4的磷酸缓冲液中透析12小时以除去乙醇，然后加入2500mg甘露醇调节渗透压，并经过0.2μm滤膜除菌，即得叶酸-葡聚糖缀合物包裹的紫杉醇颗粒溶液。

在第II方面，本发明提供了本发明第I方面的纳米级颗粒的制备方法，其包括本发明第I方面中所述的制备步骤。

在第III方面，本发明提供了本发明第I方面的纳米级颗粒在制备含有脂溶性药物化合物(优选是紫杉醇)的药物组合物(优选是注射剂，更优选是冻干粉针剂)中的应用。

在第IV方面，本发明提供了本发明第I方面的纳米级颗粒在制备抗肿瘤药物组合物(优选是注射剂，更优选是冻干粉针剂)中的应用。

优选在本发明第IV方面的应用中，肿瘤是非小叶肺癌。

在第V方面，本发明提供了本发明第I方面的纳米级颗粒在制备药物耐受性增强并且毒性降低的药物组合物(优选是注射剂，更优选是冻干粉针剂)中的应用。

以上第I、II、III、IV和／或V方面的未详尽之处，可依据如下方面解释。

在第一方面，本发明提供了包裹药物化合物的方法，其包括，

(1)按流程式I由葡聚糖(优选其平均分子量为5～30KDa，更优选为10～20KDa，如10KDa、15KDa或20KDa)合成琥珀酰化葡聚糖

(2)按流程式II合成胺基化叶酸类似物

(3)按流程式III用步骤(1)和步骤(2)的产物合成叶酸-葡聚糖缀合物

(4)将药物化合物混合入含步骤(3)获得的叶酸-葡聚糖缀合物的溶液中，形成含纳米级颗粒的溶液；和，

(5)任选向步骤(4)的产物加入药学上可接受的辅料和／或进行干燥。

本发明第一方面的方法将合成主要辅料(叶酸-葡聚糖缀合物)的步骤和药物化合物包裹的步骤顺序进行，理论上药物化合物与辅料呈现非共价结合的形式，不改变药物化合物的分子结构，从而使得该方法针对各种不同的药物化合物的适应性强，尤其对于紫杉醇等药物化合物，能起到协同起效以提高疗效的作用，并能提高药物耐受性。优选本发明第一方面的方法中，药物化合物是脂溶性药物化合物，可以是在特定的pH下为脂溶性的药物化合物，更优选是紫杉醇。

本发明第一方面的方法各步骤的化学反应和物理过程设置合理，因而通过成本较低的过滤、结晶和／或透析等手段即可完成各步骤的纯化，使得最终产物仍旧能够达到药用级别的纯度。因此，优选本发明第一方面的方法中，不包括层析步骤。这样不必购买昂贵的层析设备和填料，也无需进行耗时而谨慎的层析柱平衡、洗脱和／或再生等过程，方便了整个包裹制备的过程。

在本发明第一方面的方法的步骤(4)中，优选将药物化合物用高速匀浆机混合入含步骤(3)获得的叶酸-葡聚糖缀合物的溶液中。通常，药物化合物和辅料的混合用药用搅拌器等来进行，而高速匀浆机通常用于生物物质的破碎，但是，仅本发明人研究发现，在本发明中使用市售的高速匀浆机，却使得紫杉醇等药物化合物和叶酸-葡聚糖缀合物这一辅料更容易混合并包裹成纳米级的颗粒，速度快，而且包裹效率高(使用较少的辅料就能包裹较多的药物化合物)。因而，优选本发明第一方面的方法中，步骤(4)中的纳米级颗粒是粒径小于200nm的颗粒，更优选是粒径小于180nm的颗粒；也优选本发明第一方面的方法中，步骤(4)中的药物化合物和叶酸-葡聚糖缀合物的重量比为0.5～2∶1～10，更优选为0.8～1.2∶3～6，如1∶4等。

本发明第一方面的方法最后可以进一步处理，以制备成药物制剂，例如注射剂(针剂)，优选是冻干粉针剂。因此，优选本发明第一方面的方法中，在步骤(5)中，可以向步骤(4)的产物加入其他药学上可接收的辅料，如甘露醇，从而可以制备成注射剂，进一步地，可以进行冷冻干燥，从而制备成冻干粉针剂。

在第二方面，本发明提供了用于包裹药物化合物的辅料的制备方法，其包括，

(1)合成琥珀酰化葡聚糖；

(2)合成胺基化叶酸类似物；

(3)用步骤(1)和步骤(2)的产物合成叶酸-葡聚糖缀合物。

优选本发明第二方面的方法包括，

(1)按流程式I由葡聚糖(优选其平均分子量为5～30KDa，更优选为10～20KDa，如10KDa、15KDa或20KDa)合成琥珀酰化葡聚糖

(2)按流程式II合成胺基化叶酸类似物

(3)按流程式III用步骤(1)和步骤(2)的产物合成叶酸-葡聚糖缀合物

本发明第二方面的方法的辅料可以包裹大量不同种类的药物化合物，不改变化合物的分子结构，适应性好，尤其对于紫杉醇等药物化合物能协同增效并能并能提高药物耐受性，因此优选用于包裹脂溶性药物化合物，更优选用于包裹紫杉醇。

本发明第二方面的方法各步骤的化学反应设置合理，因而通过成本较低的过滤、结晶和／或透析等手段即可完成各步骤的纯化，使得最终辅料仍旧能够达到药用级别的纯度。因此，优选本发明第二方面的方法中，不包括层析步骤。这样节约了成本，方便了制备流程。

另外，在第三方面，本发明还提供了用于包裹药物化合物的辅料，其由本发明第二方面的方法制备而得。该辅料纯度高，药物化合物适应性好，尤其对于紫杉醇等药物化合物能协同增效并能并能提高药物耐受性，而且包裹形成的药物组合物复溶性和稳定性俱佳。

因而，在第四方面，本发明进一步提供了本发明第三方面的辅料在制备含有脂溶性药物化合物(优选是紫杉醇)的药物组合物中的应用。优选其中，制备的方法是包裹药物化合物的方法，更优选是本发明第一方面的方法，尤其是由本发明第一方面的方法中步骤(4)和(5)组成的方法。

而且，在第五方面，本发明还进一步提供了本发明第三方面的辅料包裹药物化合物(优选是脂溶性药物化合物，如紫杉醇)而得的药物。优选其中，包裹药物化合物的方法是本发明第一方面的方法，例如是由本发明第一方面的方法中步骤(4)和(5)组成的方法。

本发明的有益效果在于，方法和辅料具备良好的药物适应性，无需复杂的纯化工艺，可以降低生产成本，从而能够生产中国人用得起的药；制备成药物组合物后，尤其与紫杉醇等药物化合物制备成抗肿瘤药物后，能协同起效从而提高疗效，并降低毒副作用从而提高药物耐受性，因而可以减少用药频次，从而进一步降低患者的治疗成本；另外，包裹形成的药物组合物复溶性和稳定性俱佳，因而便于储运，进一步降低成本，并且不会因为长时间储存后复溶而增加发生不良反应的几率。

为了便于理解，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，其全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们全文在本文中完整记载过一遍了。

以下将通过具体的实施例和附图对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。

附图说明

图1显示了用药后对肿瘤生长的抑制，其中图例由上至下依次表示为空载体、、本发明的冻干粉针剂125mg／kg、100mg／kg、75mg／kg和50mg／kg。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进行示例，其中所用试剂均可通过市场渠道购买，如有未尽之处，可以参考相应的有机化学合成手册和SFDA的实验指引。

实施例1：叶酸-葡聚糖缀合物的制备

1，琥珀酰化葡聚糖的合成

合成路线如下所示：

取10.0g葡聚糖(平均分子量20KDa，Mw／Mn=1.3，可购自上海阳光试剂有限公司)溶于无水二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌20分钟形成澄清的溶液，然后加入1670mg琥珀酸酐和200.0mg4-二甲基氨基吡啶(DMAP)，快速搅拌至所有的固体溶解。置于室温(25℃)下使得整个反应液反应24小时，之后将反应液放入Spectra／Por3透析袋(截留分子量3,500)中，置于水中透析2天。然后将透析袋中的溶液冷冻干燥，得到白色的琥珀酰化葡聚糖。核磁共振(NMR)结果如下：1H-NMR(d-DMSO)：2.8(-CH2CH2-，琥珀酰化葡聚糖)，3.2-3.6(葡聚糖)，4.4-5.8(葡聚糖)。

2，胺基化叶酸类似物的合成

合成路线如下所示：

取3g叶酸溶于120mL二甲基亚砜(DMSO)中，向其中加入930mg(4.5mmo1)N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)和770mg(6.7mmo1)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，反应液在室温(25℃)暗室处放置12小时，然后副产物DCU沉淀被过滤去除，再向反应液加入1000mL丙酮／乙醚混合液(V：V=30∶70)并进行搅拌，收集黄色沉淀并用丙酮／乙醚混合液(V：V=30∶70)洗涤后晾干。

取2.78g晾干的黄色沉淀再溶于20mL DMSO中，取6.01g乙二胺快速加入到该溶液中，将两者混合后在室温(25℃)暗室处放置12小时，加入50mL丙酮／乙醚混合液(V：V=30∶70)并进行搅拌，收集黄色沉淀并在DMSO溶液中重结晶提纯，获得胺基化叶酸类似物。

3，叶酸-葡聚糖缀合物的合成

合成路线如下所示：

取步骤1制备的琥珀酰化葡聚糖2000mg溶于40ml无水DMF中，加入50mg DMAP和579.7mg DCC，在室温(25℃)下放置12小时后，再加入2mL含300mg步骤2制备的胺基化叶酸类似物的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)溶液，反应液在室温(25℃)下搅拌12小时后，将反应液放入.Spectra／Por3透析袋(截留分子量3,500)中，置于水中透析2天。然后将透析袋中的溶液冷冻干燥，得到黄色的叶酸-葡聚糖缀合物。核磁共振(NMR)结果如下：1H-NMR(d-DMSO)：2.8(-CH2CH2-，琥珀酰化葡聚糖)，3.2-3.6(葡聚糖)，4.4-5.8(葡聚糖)，8.6(叶酸)。

实施例2：叶酸-葡聚糖缀合物包裹的紫杉醇的冻干粉针剂的制备和稳定性测试

取1000mg实施例1制备的叶酸-葡聚糖缀合物，溶于100ml15mM的磷酸缓冲液(pH=7.4)中，溶解后，置于磁力搅拌器上以400rpm搅拌。在搅拌过程中，将250mg紫杉醇溶于5mL乙醇中，逐滴加入到搅拌的溶液中，加完后置于FS-1型高速匀浆机(可购自金坛市中正仪器制造有限公司)中，以最大功率匀浆6次，每次1分钟，停2分钟，之后将匀浆液放入Spectra／Por3透析袋(截留分子量3,500)中，置于15mM的磷酸缓冲液(pH=7.4)中透析12小时以除去乙醇，然后加入2500mg甘露醇调节渗透压，并经过0.2μm滤膜除菌。经过粒度测试仪检测，水溶液中的颗粒的粒径<200纳米，即得叶酸-葡聚糖缀合物包裹的紫杉醇颗粒溶液。

将上述颗粒溶液置于Virtis AdVantage Plus冷冻干燥机(可购自上海旦鼎国际贸易有限公司)中冷冻干燥，本发明人优化的冷冻干燥步骤为：先冷冻至-40℃120min，再升温到-22℃90min，然后降温到-40℃保持6小时，整个过程持续9.5小时；然后升温至-11℃，持续抽气干燥48.6小时；最后在3小时内升至25℃，持续抽气干燥7小时。由此获得了冻干粉针剂，含水率不超过3.5％，密封保存。

取含25mg紫杉醇的该冻干粉针剂加注10ml注射用水后，可在3分钟内复溶，表明可溶性佳。复溶后的溶液为透明淡黄色透明液体，测得的pH为7.2，渗透压为291±2.4mOsm，用动态光散射法测得的颗粒的粒径小于120±20纳米，表明仍旧能够保持颗粒的小粒径。

将该冻干粉针剂在40℃下放置30天，进行加速稳定性测试，然后根据上述方法复溶鉴定，结果未发现显著变化，表明该制剂稳定性佳。

实施例3：叶酸-葡聚糖缀合物包裹的紫杉醇冻干粉针剂的药效学研究

对实施例2制备的冻干粉针剂进行了肿瘤细胞毒性试验，受试细胞为人源非小叶肺癌细胞。将不同浓度的冻干粉针剂加入到细胞培养基中，处理72小时后，计算IC50。结果表明，各种浓度的叶酸-葡聚糖缀合物包裹的紫杉醇的细胞毒性，与没有经过任何处理的相同浓度的紫杉醇相近，计算出的IC50均为，而单独使用叶酸-葡聚糖缀合物本身的细胞毒性则非常小，IC50>0.05mg／ml，可见体外细胞毒性主要来自于紫杉醇，而且叶酸-葡聚糖缀合物基本不影响紫杉醇细胞毒性作用的发挥。

使用不同浓度(以其中紫杉醇的含量计)的实施例2制备的冻干粉针剂和现有的对裸鼠进行药物耐受性测试，测定给药后裸鼠的体重，以不影响体重的最大剂量作为耐受极限，结果为最大耐受为80mg／kg紫杉醇量，而实施例2制备的冻干粉针剂的最大耐受达到125mg/kg紫杉醇量，表明叶酸-葡聚糖缀合物包裹紫杉醇后，能够增强受试动物的药物耐受性，毒性大大降低，从而可以增加紫杉醇用量。

以实施例2制备的冻干粉针剂进行动物实验，将不同剂量的冻干粉针剂(50、75、100和125mg/kg，以其中紫杉醇的含量计)分别静脉注射到移植了人非小叶肺癌细胞的裸鼠身上，同时以注射空载体(Vehicle，即磷酸缓冲液(PBS))和(80mg／kg，以其中紫杉醇的含量计)的作为对照组，观察肿瘤的抑制生长曲线。结果如图1所示，表明当本发明的冻干粉针剂的剂量达到75mg／kg时，药物对肿瘤细胞的生长抑制作用已经统计学上显著优于80mg／kg的(其于本发明的50mg／kg剂量的疗效在统计学上无显著差异)，可见作为辅料的叶酸-葡聚糖缀合物基本无细胞毒性；但是在包裹紫杉醇后，能够协同增强紫杉醇的抗肿瘤效果，加之可以增加紫杉醇用量，因此可以取得显著优异的抗肿瘤效果。

Claims (10)

1.纳米级颗粒，其由如下制备方法制备，该方法包括，

(1)按流程式I合成琥珀酰化葡聚糖

(2)按流程式II合成胺基化叶酸类似物

(3)按流程式III用步骤(1)和步骤(2)的产物合成叶酸-葡聚糖缀合物

(4)将药物化合物混合(优选用高速匀浆机混合)入含步骤(3)获得的叶酸-葡聚糖缀合物的溶液中，形成含纳米级颗粒的溶液，其中纳米级颗粒是粒径小于200nm(优选是小于180nm)的颗粒。

2.权利要求1所述的纳米级颗粒，其中药物化合物是脂溶性药物化合物，优选是紫杉醇。

3.权利要求1所述的纳米级颗粒，其中步骤(4)中的药物化合物和叶酸-葡聚糖缀合物的重量比为0.5～2∶1～10，优选为0.8～1.2∶3～6，如1∶4。

4.权利要求1所述的纳米级颗粒，其中步骤(1)中的葡聚糖的平均分子量为5～30KDa，优选为10～20KDa，如10KDa、15KDa或20KDa。

5.权利要求1所述的纳米级颗粒，其中所述方法包括，

(1)取平均分子量20KDa、Mw／Mn=1.3的葡聚糖10.0g溶于无水DMF中，搅拌20分钟形成澄清的溶液，然后加入1670mg琥珀酸酐和200.0mg4-二甲基氨基吡啶(DMAP)，快速搅拌至所有的固体溶解；置于室温下使得整个反应液反应24小时，之后将反应液放入截留分子量3,500的Spectra／Por3透析袋中，置于水中透析2天；然后将透析袋中的溶液冷冻干燥，得到白色的琥珀酰化葡聚糖；

(2)取3g叶酸溶于120mL DMSO中，向其中加入930mg DCC和770mgNHS，反应液在室温暗室处放置12小时，然后副产物DCU沉淀被过滤去除，再向反应液加入1000mL V：V=30∶70的丙酮／乙醚混合液并进行搅拌，收集黄色沉淀并用V：V=30∶70的丙酮／乙醚混合液洗涤后晾干；取2.78g晾干的黄色沉淀再溶于20mLDMSO中，取6.01g乙二胺快速加入到该溶液中，将两者混合后在室温暗室处放置12小时，加入50mL V：V=30∶70的丙酮／乙醚混合液并进行搅拌，收集黄色沉淀并在DMSO溶液中重结晶提纯，获得胺基化叶酸类似物；

(3)取步骤(1)制备的琥珀酰化葡聚糖2000mg溶于40m1无水DMF中，加入50mg DMAP和579.7mg DCC，在室温下放置12小时后，再加入2mL含300mg步骤(2)制备的胺基化叶酸类似物的EDC溶液，反应液在室温下搅拌12小时后，将反应液放入截留分子量3,500的Spectra／Por3透析袋中，置于水中透析2天；然后将透析袋中的溶液冷冻干燥，得到黄色的叶酸-葡聚糖缀合物；

(4)取1000mg步骤(3)制备的叶酸-葡聚糖缀合物，溶于100ml15mM的磷酸缓冲液(pH=7.4)中，溶解后，置于磁力搅拌器上以400rpm搅拌；在搅拌过程中，将250mg紫杉醇溶于5mL乙醇中，逐滴加入到搅拌的溶液中，加完后置于FS-1型高速匀浆机中，以最大功率匀浆6次，每次1分钟，停2分钟，之后将匀浆液放入截留分子量3,500的Spectra／Por3透析袋中，置于15mM pH=7.4的磷酸缓冲液中透析12小时以除去乙醇，然后加入2500mg甘露醇调节渗透压，并经过0.2μm滤膜除菌，即得叶酸-葡聚糖缀合物包裹的紫杉醇颗粒溶液。

6.权利要求1～5之任一所述的纳米级颗粒的制备方法，其包括权利要求1～5之任一中所述的制备步骤。

7.权利要求1～5之任一所述的纳米级颗粒在制备含有脂溶性药物化合物(优选是紫杉醇)的药物组合物(优选是注射剂，更优选是冻干粉针剂)中的应用。

8.权利要求1～5之任一所述的纳米级颗粒在制备抗肿瘤药物组合物(优选是注射剂，更优选是冻干粉针剂)中的应用。

9.权利要求8所述的应用，其中肿瘤是非小叶肺癌。

10.权利要求1～5之任一所述的纳米级颗粒在制备药物耐受性增强并且毒性降低的药物组合物(优选是注射剂，更优选是冻干粉针剂)中的应用。