CN103936758A - 一种生物素标记的川芎嗪及其制备方法 - Google Patents

一种生物素标记的川芎嗪及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103936758A
CN103936758A CN201410066481.6A CN201410066481A CN103936758A CN 103936758 A CN103936758 A CN 103936758A CN 201410066481 A CN201410066481 A CN 201410066481A CN 103936758 A CN103936758 A CN 103936758A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ligustrazine
tfam
biotin labeled
lon
add
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201410066481.6A
Other languages
English (en)
Inventor
吕斌
张奕华
刘永章
艾勇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wenzhou Medical University
Original Assignee
Wenzhou Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wenzhou Medical University filed Critical Wenzhou Medical University
Priority to CN201410066481.6A priority Critical patent/CN103936758A/zh
Publication of CN103936758A publication Critical patent/CN103936758A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D495/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D495/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D495/04—Ortho-condensed systems

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种能靶向粒体TFAM结合物及对维持线粒体功能稳定的应用。本本发明生物素标记的川芎嗪分子设计，由于链霉亲和素与生物素之间具有较高亲和力，稳定的标记化探针-川芎嗪复合物，在临床监测和治疗发挥作用。发明是TFAM的靶向结合物，可以特异性与TFAM结合，保护TFAM不被Lon蛋白酶降解，通过保护TFAM来保护与之结合的线粒体DNA的稳定，以及减少细胞内ROS的水平和减少细胞凋亡，从而维持线粒体稳定。

Description

一种生物素标记的川芎嗪及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种靶向结合线粒体DNA上TFAM的化合物及维持线粒体功能稳定的应用。
背景技术
生物素(biotin，B)又称维生素H、辅酶R，是水溶性维生素，也属于维生素B族，分子量为244.31，基本结构为双环结构：I环为咪唑酮环，是与亲和素结合的部位；II为噻吩环，含一个戊酸侧链，其末端羧基可与生物大分子连接，形成生物素标记抗原、抗体、酶等。其化学结构中有咪唑酮环，可与亲和素(avidin，AV)和链酶亲和素(streptavidin，SA)特异性结合。生物素与亲和素之间结合的亲和力高、特异性强，各自均可以与各型大小分子结合，以及二者在结合反应时具有的多级放大作用等优越性，其相关技术被广泛应用在各种标记免疫分析技术领域中，尤其为标记免疫检测自动化分析做出了极大的贡献。
川芎嗪(Ligustrazine)是中药川芎中含有的一种有效成分，具有抗血小板聚集的作用，并有扩张血管、增加冠脉血流量、改善微循环及增加脑血流量作用。临床适用于治疗缺血性心脏血管疾病，如冠心病、脑供血不足、脑血栓形成等。
线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM)在维持线粒体功能稳定方面有着重要的作用。TFAM是由核DNA编码的25kD蛋白，TFAM蛋白包含了两个短串联的高迁移率族蛋白(high-mobility group，HMG)盒域(box domains)，两者之间以27个氨基酸残基连接，其后是一个25个残基的C末端尾巴。
TFAM是线粒体DNA的结合蛋白，在线粒体DNA的转录、复制和维护上处于中心地位，它在线粒体呼吸链氧化磷酸化产生ATP的过程中也是必不可少的。具体的说是TFAM通过结合在线粒体DNA轻链和重链启动子的上游来促进线粒体DNA的转录。线粒体启动子的起始由TFAM的量调节，所以TFAM可影响基因的表达和线粒体DNA的转录起始。越来越多的证据表明，TFAM在维护线粒体DNA稳定和调节它的拷贝数上发挥着重要的作用，大部分TFAM蛋白可维护线粒体DNA的高级结构。线粒体DNA的拷贝数与TFAM蛋白的量紧密相关，这也进一步表明，TFAM蛋白和线粒体DNA之间的相互关系是动态的，一种组分的存在会增加另一组分的稳定性，从调节上来说，这种相互作用或许是有益的，因为TFAM蛋白或线粒体DNA水平的微小改变可使二者快速调节到最佳比率。研究表明，只需单独增加TFAM蛋白的表达就足以增加线粒体DNA的水平，可导致线粒体DNA编码多肽的增加和呼吸链稳定。
ATP依赖的Lon蛋白酶是一种具有多种功能的酶，其分子量约为100kDa，它在进化过程中非常保守，从archaea(古生菌)到哺乳动物的线粒体都有Lon的类似物，这表明Lon对于维持线粒体体内平衡极为关键。Lon具有蛋白酶的功能，介导异常或损伤的蛋白和短暂调控蛋白的降解来维持细胞体内平衡，在蛋白质量控制和代谢调控中起着重要作用。哺乳动物Lon蛋白酶的内源性底物为TFAM，此外还包括氧化的线粒体顺乌头酸酶、类固醇合成快速调控蛋白(StAR)以及细胞色素C氧化酶(COX)等。
因此，迫切需要一种靶向结合在线粒体DNA上TFAM却不被Lon蛋白酶降解的化合物，进而维持线粒体的功能稳定，而且能够达到靶向监测治疗。但到目前为止，还没有关靶向线粒体DNA上的TFAM却不被Lon蛋白酶降解的物质报道。
发明内容
本发明目的是提供了靶向性结合线粒体DNA上的TFAM，却不被Lon蛋白酶降解的生物素标记的川芎嗪，具有维持线粒体的功能稳定，而且能够达到靶向监测治疗的作用。
本发明提供的技术方案之一是：生物素标记的川芎嗪及其制备方法。
具体的结构式为：
生物素标记的川芎嗪的制备：首先将川芎嗪氧化成2-羟基-3，5，6-三甲基吡嗪，与D-生物素、EDCI，和DMAP按照12∶29∶30∶1的质量比溶解于无水DMF中，60℃条件下搅拌反应72h，TLC监测反应完全，将反应液倒入到30mL的乙醚中，4℃搅拌4h，析出白色沉淀，过滤，乙醚洗涤，粗品经柱层析纯化后得生物素标记的川芎嗪，产率为78％左右。
(1)2-羟基-3，5，6-三甲基吡嗪的合成，即中间体
将6.8g，摩尔浓度为50mmoL的川芎嗪，即物质1、12mL冰醋酸和6mL质量浓度为30％的H2O2加入三颈瓶中，于70℃加热反应4h后，补充加入6mL质量浓度为30％H2O2，继续回流反应4h。TLC监测反应完全，冷却至室温，25％NaOH溶液调pH值至10，20mL×3CH2Cl2提取，合并有机层，用饱和食盐水洗，然后MgSO4干燥，过滤，蒸除得白色固体物，即中间体2。然后加入20mL醋酐，加热回流2h，TLC监测反应完全，减压蒸除过量醋酐，得黑色浆状物，即中间体3。冷却后加入25％NaOH溶液调pH值至12，20mL×3CH2Cl2萃取，无水MgSO4干燥，过滤，减压蒸除溶剂，所得固体经硅胶柱层析，石油醚(V)∶乙酸乙酯(V)＝6∶1，得淡黄色结晶，2.36g质量浓度为61％的2-羟基-3，5，6-三甲基吡嗪，即中间体4；mp88-89℃；1H NMR，300MHz，δ4.68(d，J＝2.7Hz，2H)，4.29(s，OH)，2.51(s，6H)，2.41(s，3H).ESI-MS m/z：153[M+H]+，175[M+Na]+；
(2)生物素标记的川芎嗪，即目标化合物的合成
将48mg，摩尔浓度为0.316mmoL的中间体4，115mg，摩尔浓度为0.471mmoL的D-生物素，120mg，摩尔浓度为0.628mmoL的EDCI，和4mg，摩尔浓度为0.032mmol的DMAP溶解到2.5mL无水DMF中，60℃条件下搅拌反应72h，TLC监测反应完全，将反应液倒入到30mL的乙醚中，4℃搅拌4h，析出白色沉淀，过滤，乙醚洗涤，粗品经柱层析，eluent：20％MeOH/EtOAc，纯化后得93mg，质量浓度为78％白色固体，即生物素标记的川芎嗪终物质5。mp128-129℃；1H NMR(300MHz)δ6.45(s，1H)，6.38(s，1H)，5.14(s，2H)，4.28-4.32(m，1H)，4.11-4.14(m，1H)，3.09(m，1H)，2.83(dd，J＝12.8Hz，4.9Hz，1H)，2.65(d，J＝14.7Hz，1H)，2.44(s，6H)，2.42(s，3H)，2.36(t，J＝7.4Hz，2H)，1.67-1.59(m，2H)，1.67-1.59(m，2H)，1.57-1.52(m，2H)，1.50-1.47(m，2H)；13C NMR(75MHz)δ172.5，162.7，150.7，148.3(2×C)，144.6，64.2，61.0，59.1，55.3，33.1，27.9(3×C)，24.5，21.1，20.9，20.0；ESI-MS m/z：379[M+H]+，401[M+Na]+，417[M+K]+；HRMS(EI+)calc.for[C18H26N4O3SNa]+401.1623，found401.1630。
生物素标记的川芎嗪物理特性为：白色固体，熔点为128～129℃。
本发明提供的技术方案之二是：提供一种靶向结合线粒体DNA上的TFAM，而且不被Lon蛋白酶降解的化合物。
本发明提供一种提供一种靶向结合线粒体DNA上的TFAM，而且不被Lon蛋白酶降解的化合物。
本发明通过细胞实验和体外实验来证实川芎嗪确实具有保护TFAM不被降解的作用，检测了川芎嗪对降解TFAM的Lon蛋白的ATP酶活性、肽酶活性和蛋白酶活性的影响，发现川芎嗪对Lon蛋白酶没有影响，生物素标记的川芎嗪通过免疫沉淀法(IP)证实川芎嗪作用的靶标是TFAM，并不被Lon蛋白酶降解。
本发明的有益效果：
1.本发明提供了一种生物素标记的川芎嗪及其制备方法，生物素标记的川芎嗪可以发挥强大的靶向监测和靶向治疗作用，对有效地维持线粒体稳定具有重大的应用前景。
2.本发明的TFAM靶向结合物，可以特异性与线粒体DNA上TFAM结合，保护TFAM不被Lon蛋白酶降解，保护线粒体DNA稳定，促进线粒体DNA恢复，减少细胞内活性氧自由基积累，减少细胞内ROS水平和减少细胞凋亡。
附图说明
图1.生物素标记的川芎嗪的合成路线。1：川芎嗪；2：中间体2；3：中间体3；4：2-羟基-3，5，6-三甲基吡嗪；5：生物素标记的川芎嗪。I：川芎嗪合成中间体2的步骤；II：中间体2合成到中间体3的步骤；III：中间体3合成2-羟基-3，5，6-三甲基吡嗪的步骤；IV：2-羟基-3，5，6-三甲基吡嗪合成生物素标记的川芎嗪的步骤；
图2.体外川芎嗪抑制TFAM降解的Western Blotting图。TMP：川芎嗪；Velcade：硼替佐米；Inhibitor：抑制剂；Lon：Lon蛋白酶；TFAM：线粒体转录因子A；
图3.川芎嗪促进Helaρlow细胞中TFAM恢复的Western Blotting图。TMP：川芎嗪；Lon：Lon蛋白酶；Actin：肌动蛋白；TFAM：线粒体转录因子A；EB：溴化乙锭；
图4.川芎嗪作用下TFAM的恢复与对照组对比图。TMP：川芎嗪；Relative expression ofTFAM protein：TFAM蛋白的相对表达量；
图5.Helaρlow细胞用不同浓度的川芎嗪促进TFAM恢复的Western Blotting图。TMP：川芎嗪；Lon：Lon蛋白酶；Actin：肌动蛋白；TFAM：线粒体转录因子A；
图6.Helaρlow细胞用川芎嗪作用不同的时间下促进TFAM恢复的Western Blotting图。TMP：川芎嗪；Lon：Lon蛋白酶；Actin：肌动蛋白；TFAM：线粒体转录因子A；
图7.川芎嗪对Lon蛋白ATP酶活性的影响。TMP：川芎嗪；Activity：活性；
图8.CDDO对Lon蛋白ATP酶活性的的影响。CDDO：2-氰基-3，12-二氧代齐墩果烷-1，9(11)-二烯-28-羧酸；Activity：活性；
图9.川芎嗪对Lon蛋白肽酶活性的影响。TMP：川芎嗪；Activity：活性；
图10.Velcade对Lon肽酶活性的影响。Velcade：硼替佐米；Activity：活性；
图11.纯化的Lon在不同条件下对casein降解的SDS-PAGE图。TMP：川芎嗪；Velcade：硼替佐米；Inhibitor：抑制剂；Lon：Lon蛋白酶；BSA：牛血清白蛋白；Casein：酪蛋白；
图12.Casein蛋白定量分析结果。TMP：川芎嗪；Velcade：硼替佐米；Inhibitor：抑制剂；Activity：活性；
图13.生物素标记的川芎嗪与Lon结合Western Blotting图。Input：细胞裂解液；Untreated：细胞裂解液加入上样缓冲液；SA-sepharose：链酶亲和素琼脂糖；TMPhiotin：生物素标记的川芎嗪；TMP：川芎嗪；Lon：Lon蛋白酶；
图14.HeLaρ+细胞中生物素标记的川芎嗪与TFAM结合Western Blotting图。Input：细胞裂解液；Untreated：细胞裂解液加入上样缓冲液；SA-sepharose：链酶亲和素琼脂糖；TMPbiotin：生物素标记的川芎嗪；TMP：川芎嗪；Lon：Lon蛋白酶；TFAM：线粒体转录因子A；
图15.人结肠癌细胞HCT116中生物素标记的川芎嗪与TFAM结合Western Blotting图。Input：细胞裂解液；Untreated：细胞裂解液加入上样缓冲液；SA-sepharose：链酶亲和素琼脂糖；TMPbiotin：生物素标记的川芎嗪；TMP：川芎嗪；Lon：Lon蛋白酶；TFAM：线粒体转录因子A；
图16.川芎嗪促进线粒体DNA恢复的柱状图。EB：溴化乙锭；DMSO：二甲基亚砜；TMP：川芎嗪；D-loop Target：线粒体D-loop环为目的基因；Relative D-loop level in HeLa cellsnormalized toβ-Actin：HeLa细胞线粒体DNA的D-loop相对β-Actin的量；
图17.川芎嗪的作用下线粒体DNA的恢复与对照组对比图。TMP：川芎嗪；RelativeD-loop level in HeLa cells normalized toβ-Actin：HeLa细胞线粒体DNA的D-loop相对β-Actin的量；
图18.川芎嗪对人肾上皮细胞293T细胞内活性氧自由基(ROS)的影响。DCFH：二氯荧光素；DMSO：二甲基亚砜；TMP：川芎嗪；
图19.川芎嗪对人肾上皮细胞293T细胞凋亡的影响。DMSO：二甲基亚砜；TMP：川芎嗪；The rate ofcell apoptosis：细胞凋亡率；
具体实施方式
实施例1生物素标记的川芎嗪的制备：首先将川芎嗪氧化成2-羟基-3，5，6-三甲基吡嗪，与D-生物素、EDCI，和DMAP按照12∶29∶30∶1的质量比溶解于无水DMF中，60℃条件下搅拌反应72h，TLC监测反应完全，将反应液倒入到30mL的乙醚中，4℃搅拌4h，析出白色沉淀，过滤，乙醚洗涤，粗品经柱层析纯化后得生物素标记的川芎嗪，产率为78％左右。
(1)2-羟基-3，5，6-三甲基吡嗪的合成，即中间体
将6.8g，摩尔浓度为50mmoL的川芎嗪，即物质1、12mL冰醋酸和6mL质量浓度为30％的H2O2加入三颈瓶中，于70℃加热反应4h后，补充加入6mL质量浓度为30％H2O2，继续回流反应4h。TLC监测反应完全，冷却至室温，25％NaOH溶液调pH值至10，20mL×3CH2Cl2提取，合并有机层，用饱和食盐水洗，然后MgSO4干燥，过滤，蒸除得白色固体物，即中间体2。然后加入20mL醋酐，加热回流2h，TLC监测反应完全，减压蒸除过量醋酐，得黑色浆状物，即中间体3。冷却后加入25％NaOH溶液调pH值至12，20mL×3CH2Cl2萃取，无水MgSO4干燥，过滤，减压蒸除溶剂，所得固体经硅胶柱层析，石油醚(V)∶乙酸乙酯(V)＝6∶1，得淡黄色结晶，2.36g质量浓度为61％的2-羟基-3，5，6-三甲基吡嗪，即中间体4；mp88-89℃；1H NMR，300MHz，δ4.68(d，J＝2.7Hz，2H)，4.29(s，OH)，2.51(s，6H)，2.41(s，3H).ESI-MS m/z：153[M+H]+，175[M+Na]+
(2)生物素标记的川芎嗪，即目标化合物的合成
将48mg，摩尔浓度为0.316mmoL的中间体4，115mg，摩尔浓度为0.471mmoL的D-生物素，120mg，摩尔浓度为0.628mmol的EDCI，和4mg，摩尔浓度为0.032mmol的DMAP溶解到2.5mL无水DMF中，60℃条件下搅拌反应72h，TLC监测反应完全，将反应液倒入到30mL的乙醚中，4℃搅拌4h，析出白色沉淀，过滤，乙醚洗涤，粗品经柱层析，eluent：20％MeOH/EtOAc，纯化后得93mg，质量浓度为78％白色固体，即生物素标记的川芎嗪终物质5。mp128-129℃；1H NMR(300MHz)δ6.45(s，1H)，6.38(s，1H)，5.14(s，2H)，4.28-4.32(m，1H)，4.11-4.14(m，1H)，3.09(m，1H)，2.83(dd，J＝12.8Hz，4.9Hz，1H)，2.65(d，J＝14.7Hz，1H)，2.44(s，6H)，2.42(s，3H)，2.36(t，J＝7.4Hz，2H)，1.67-1.59(m，2H)，1.67-1.59(m，2H)，1.57-1.52(m，2H)，1.50-1.47(m，2H)；13C NMR(75MHz)δ172.5，162.7，150.7，148.3(2×C)，144.6，64.2，61.0，59.1，55.3，33.1，27.9(3×C)，24.5，21.1，20.9，20.0；ESI-MS m/z：379[M+H]+，401[M+Na]+，417[M+K]+；HRMS(EI+)calc.for[C18H26N4O3SNa]+401.1623，found401.1630。
生物素标记的川芎嗪物理特性为：白色固体，熔点为128-129℃。
具体的结构式
实施例2体外川芎嗪抑制TFAM的降解
用20μM的硼替佐米(Velcade)作为阳性对照，DMSO作为阴性对照，将20μL的0.4mM的川芎嗪进行倍比稀释；取离心管进行标记，依次加入反应缓冲液，Lon，BSA，TMP(DMSO或Velcade)，充分混匀；置于37℃孵育1h；依次加入TFAM和ATP，使Lon，TFAM，BSA终浓度为300nM，150nM，0.1μg/μL，充分混匀，置于37℃孵育1h；在0，60min时间点，从各管中吸取20μL样品，加入5μL5X上样缓冲液；置于95℃加热5min，使蛋白充分变性；将8μl标准蛋白Maker和20μL变性的蛋白样品上样至12％SDS-PAGE，并进行蛋白印迹分析。
结果显示，在不加ATP条件下，反应1h后，TFAM保持稳定，不被Lon降解；在阳性对照组，可见Velcade抑制了Lon的活性，TFAM保持稳定；在不同浓度川芎嗪处理的反应管中，随着川芎嗪浓度的增加，TFAM信号逐渐增强，表明TFAM的降解受到抑制作用(图2)。
实施例3体内川芎嗪促进Helalow细胞中TFAM的恢复
1、用含浓度为50ng/mL的EB完全培养基培养HeLaρ+细胞8天后，去掉EB，将细胞分成两组，一组加10M的川芎嗪处理，一组加DMSO作为阴性对照，分别在1、3、4天时间点收细胞，提取蛋白，通过BCA法测定蛋白浓度后将蛋白浓度调至1g/μL，于95℃加热5min，将样品上样至12％的SDS-PAGE，进行蛋白印迹分析(图3，图4)。
2、利用不同浓度(2.5、5、10μM)的川芎嗪处理HeLaρlow细胞24h后，不加川芎嗪或加DMSO为阴性对照，提取蛋白，通过BCA法测定蛋白浓度后将蛋白浓度调至1μg/μL，于95℃加热5min，将样品上样至12％的SDS-PAGE，进行蛋白印迹分析。(图5)
3、利用浓度为2.5μM的川芎嗪处理HeLaρlow细胞，分别在0、24、48、72、96h的时间点收取细胞，提取蛋白，通过BCA法测定蛋白浓度后将蛋白浓度调至1μg/μL，于95℃加热5min，将样品上样至12％的SDS-PAGE，进行蛋白印迹分析(图6)。
结果显示，川芎嗪能显著促进TFAM在低水平下迅速恢复。
实施例4川芎嗪对Lon蛋白的作用
1、川芎嗪抑制Lon的ATP酶活性实验
将于-80℃储存的TMP于室温融化，用二甲基亚砜(DMSO)对TMP进行1∶4倍比稀释至20倍浓度的终浓度。相同条件操作倍比稀释2-氰基-3，12-二氧代齐墩果烷-1，9(11)-二烯-28-羧酸(CDDO)作为阳性对照；将于-80℃储存的Lon蛋白置于冰上融化，用反应缓冲液稀释到终浓度的1.18倍；用多孔加样器在96孔板中1排中加入42.5μl1.18X的Lon蛋白(别一排加入相同体积的反应缓冲液作为空白对照)和2.5μl20X的TMP溶液，充分混匀后于25℃孵育1h；在各孔中加入5μl10mM超纯ATP，充分混匀后于25℃孵育1h；用多孔加样器从各孔中吸取5μl至384孔板中，每个孔各有4个平行；于各孔中加入5μlADP-Glo反应终止液，于25℃孵育40min；于各孔中加入10μl KDR反应液，于25℃孵育1h；用酶标仪检测各孔的荧光值。
CDDO作为Lon蛋白的抑制剂，是通过抑制Lon的ATP酶活性进行作用的。本实验采用CDDO作为阳性对照，对川芎嗪是否抑制Lon的ATP酶活性进行检测，结果显示，随着CDDO浓度的增加，Lon蛋白的ATP酶活性明显降低；在200μMCDDO存在时，Lon蛋白的ATP酶活性降低至只有10％左右；反之，即使川芎嗪浓度增加到200μM时，Lon蛋白的ATP酶活性依旧没有明显受到抑制，这表明川芎嗪不通过抑制Lon蛋白的ATP酶活性进行作用(图7，图8)。
2、TMP抑制Lon的肽酶活性实验——Rho AA实验
用反应缓冲液将纯化的Lon蛋白酶稀释至1.6μM；将1mM RhoAA和400mM ATP配制成4X浓度分别为24μM和4mM的反应液；在384孔板A1-H5中加入10μl的反应缓冲液，将10μL1.6μM的Lon蛋白酶加至第一列A1-H1的孔中，从第一列中用枪吸取10μl至第二列中，依次倍比稀释，最后一列作为空白对照。每个浓度都有4个平行；分别加入5μL24μMRho AA和4mM ATP，轻轻摇晃几下；将384孔板放置在37℃培养箱中孵育3h；3小时后，取出384也培养板，酶标仪在485/535nm波长下读取数值。
本实验利用硼替佐米(Velcade)作为阳性对照，实验结果表明Velcade随着浓度的增加，Lon蛋白酶的活性逐渐受到抑制，在较高浓度的Velcade存在时，Lon的肽酶活性受到强烈抑制，酶活性只有自然条件下的10％左右，而TMP随着浓度的增加，Lon的肽酶活性没有受到抑制作用。因而，TMP对于Lon的肽酶活性没有明显抑制作用(图9，图10)。
3、TMP抑制Lon的蛋白酶活性实验——casein体外降解实验
将1μM纯化的重组蛋白Lon加入到2只含有50mM Hepes，150mM NaCl，10mM MgCl2的反应缓冲液的离心管中；将10μM底物Casein加入到反应液中并混匀，分别加入或不加入ATP(5mM)，于37℃反应1h；于0，15，30，60min时间点，取出20μL样品，加入5μl5X上样缓冲液，于95℃加热5min；将样品上样至12％的SDS-PAGE，用考马斯亮蓝染色后，脱色至条带清晰。
本实验利用Lon的蛋白底物casein检测TMP对Lon的蛋白酶活性的抑制作用。利用Velcade作为阳性对照，不加抑制剂作为阴性对照，结果显示，不加抑制剂的实验管中，casein被迅速降解；在加入Velcade的对照管中，casein的蛋白水平保持稳定，说明Velcade强烈抑制了Lon的蛋白酶活性；反之，在加入TMP的实验管中，即使TMP的浓度主1mM，casein仍然被迅速降解，说明TMP不抑制Lon对casein的降解。
结果显示川芎嗪对Lon蛋白基本没有作用(图11，图12)。
实施例5、免疫沉淀法(IP)分析川芎嗪作用底物
利用纯化的Lon蛋白、HeLaρ+或HCT116细胞裂解液和生物素标记的川芎嗪或者没有生物素标记的川芎嗪在4℃混合2h，然后将链霉亲和素琼脂糖珠子添加到反应混合物中，在4℃孵育2h后用冰浴的PBS洗4遍，将链霉亲和素琼脂糖珠子在RSB中重悬，这样目的蛋白就被拉下来，经过变性后通过免疫印迹分析。
结果显示，川芎嗪作用的靶标是TFAM，与TFAM结合形成复合物(图13，图14，图15)。
实施例6、川芎嗪促进线粒体DNA的恢复
用含浓度为50ng/mL的EB完全培养基培养HeLaρ+细胞8天后，去掉EB，将细胞分成两组，一组加10μM的川芎嗪处理，一组加DMSO作为阴性对照，分别在1、3、4天时间点收细胞，提取DNA，Actin为内参，D-Loop为目的基因，用QPCR检测线粒体DNA的水平。
结果显示，川芎嗪能显著促进线粒体DNA在低水平下的恢复，保护线粒体DNA(图16，图17)。
实施例7、川芎嗪减少细胞内活性氧自由基的积累
用含浓度为50ng/mL的EB完全培养基培养人肾上皮细胞293T细胞7天后，去掉EB，将细胞分成两组，一组加30μM的川芎嗪处理，一组加DMSO作为阴性对照处理1天，用荧光剂DCHF-DA检测细胞内活性氧自由基，活性氧自由基可以把DCHF-DA氧化成DCF，DCF的荧光较高，通过检测DCF的荧光强度来判断活性氧自由基的浓度。
结果显示，川芎嗪处理的细胞内活性氧自由基的含量少于对照组(图18)。
实施例8、川芎嗪减少细胞凋亡
用含浓度为50ng/mL的EB完全培养基培养人肾上皮细胞293T5天后，去掉EB，将细胞分成两组，一组加30μM的川芎嗪处理，一组加DMSO作为阴性对照处理1天，培养结束后收集细胞经Alexa Flour-A和Propidium Iodide(PI)细胞坏死指示剂室温处理20分钟后，用流式细胞仪计数30000次(图19)。

Claims (2)

1.一种生物素标记的川芎嗪及其制备方法，生物素标记的川芎嗪，结构式为：
2.一种生物素标记的川芎嗪及其制备方法，其特征在于：所述生物素标记的川芎嗪的制备方法如下：首先将川芎嗪氧化成2-羟基-3，5，6-三甲基吡嗪，与D-生物素、EDCI，和DMAP按照12∶29∶30∶1的质量比溶解于无水DMF中，60℃条件下搅拌反应72h，TLC监测反应完全，将反应液倒入到30mL的乙醚中，4℃搅拌4h，析出白色沉淀，过滤，乙醚洗涤，粗品经柱层析纯化后得生物素标记的川芎嗪，产率为78％左右。
(1)2-羟基-3，5，6-三甲基吡嗪的合成，即中间体
将6.8g，摩尔浓度为50mmoL的川芎嗪，即物质1、12mL冰醋酸和6mL质量浓度为30％的H2O2加入三颈瓶中，于70℃加热反应4h后，补充加入6mL质量浓度为30％H2O2，继续回流反应4h。TLC监测反应完全，冷却至室温，25％NaOH溶液调pH值至10，20mL×3CH2Cl2提取，合并有机层，用饱和食盐水洗，然后MgSO4干燥，过滤，蒸除得白色固体物，即中间体2。然后加入20mL醋酐，加热回流2h，TLC监测反应完全，减压蒸除过量醋酐，得黑色浆状物，即中间体3。冷却后加入25％NaOH溶液调pH值至12，20mL×3CH2Cl2萃取，无水MgSO4干燥，过滤，减压蒸除溶剂，所得固体经硅胶柱层析，石油醚(V)∶乙酸乙酯(V)＝6∶1，得淡黄色结晶，2.36g质量浓度为61％的2-羟基-3，5，6-三甲基吡嗪，即中间体4；mp88-89℃；1H NMR，300MHz，δ4.68(d，J＝2.7Hz，2H)，4.29(s，OH)，2.51(s，6H)，2.41(s，3H).ESI-MS m/z：153[M+H]+，175[M+Na]+；
(2)生物素标记的川芎嗪，即目标化合物的合成
将48mg，摩尔浓度为0.316mmoL的中间体4，115mg，摩尔浓度为0.471mmoL的D-生物素，120mg，摩尔浓度为0.628mmoL的EDCI，和4mg，摩尔浓度为0.032mmol的DMAP溶解到2.5mL无水DMF中，60℃条件下搅拌反应72h，TLC监测反应完全，将反应液倒入到30mL的乙醚中，4℃搅拌4h，析出白色沉淀，过滤，乙醚洗涤，粗品经柱层析，eluent：20％MeOH/EtOAc，纯化后得93mg，质量浓度为78％白色固体，即生物素标记的川芎嗪终物质5。mp128-129℃；1HNMR(300MHz)δ6.45(s，1H)，6.38(s，1H)，5.14(s，2H)，4.28-4.32(m，1H)，4.11-4.14(m，1H)，3.09(m，1H)，2.83(dd，J＝12.8Hz，4.9Hz，1H)，2.65(d，J＝14.7Hz，1H)，2.44(s，6H)，2.42(s，3H)，2.36(t，J＝7.4Hz，2H)，1.67-1.59(m，2H)，1.67-1.59(m，2H)，1.57-1.52(m，2H)，1.50-1.47(m，2H)；13C NMR(75MHz)δ172.5，162.7，150.7，148.3(2×C)，144.6，64.2，61.0，59.1，55.3，33.1，27.9(3×C)，24.5，21.1，20.9，20.0；ESI-MS m/z：379[M+H]+，401[M+Na]+，417[M+K]+；HRMS(EI+)calc.for[C18H26N4O3SNa]+401.1623，found401.1630。
CN201410066481.6A 2014-02-21 2014-02-21 一种生物素标记的川芎嗪及其制备方法 Pending CN103936758A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410066481.6A CN103936758A (zh) 2014-02-21 2014-02-21 一种生物素标记的川芎嗪及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410066481.6A CN103936758A (zh) 2014-02-21 2014-02-21 一种生物素标记的川芎嗪及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103936758A true CN103936758A (zh) 2014-07-23

Family

ID=51184665

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410066481.6A Pending CN103936758A (zh) 2014-02-21 2014-02-21 一种生物素标记的川芎嗪及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103936758A (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1424313A (zh) * 2002-12-20 2003-06-18 山东大学 川芎醇酯类衍生物及其制备方法和含有川芎醇酯类衍生物的药物组合物与应用
CN101786992A (zh) * 2010-03-10 2010-07-28 天津市汉康医药生物技术有限公司 2-羟甲基-3,5,6-三甲基吡嗪衍生物、其制备方法和用途
CN102311396A (zh) * 2010-07-05 2012-01-11 暨南大学 一种吡嗪类衍生物和其制备方法及在制药中的应用
WO2013171535A2 (en) * 2012-02-09 2013-11-21 Kao Corporation Agent for inhibiting odor of pyrazine derivatives

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1424313A (zh) * 2002-12-20 2003-06-18 山东大学 川芎醇酯类衍生物及其制备方法和含有川芎醇酯类衍生物的药物组合物与应用
CN101786992A (zh) * 2010-03-10 2010-07-28 天津市汉康医药生物技术有限公司 2-羟甲基-3,5,6-三甲基吡嗪衍生物、其制备方法和用途
CN102311396A (zh) * 2010-07-05 2012-01-11 暨南大学 一种吡嗪类衍生物和其制备方法及在制药中的应用
WO2013171535A2 (en) * 2012-02-09 2013-11-21 Kao Corporation Agent for inhibiting odor of pyrazine derivatives

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BJÖRN BOHMAN，等: "Discovery of Tetrasubstituted Pyrazines As Semiochemicals in a Sexually Deceptive Orchid", 《JOURNAL OF NATURAL PRODUCTS》 *
薛鹏，等: "川芎嗪哌嗪衍生物的合成与表征", 《化学试剂》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Williams et al. Solid‐phase Thiol–Ene lipidation of peptides for the synthesis of a potent CGRP receptor antagonist
Pang et al. A fluorescence assay for the trace detection of protamine and heparin
CN104181221B (zh) 一种药物靶标捕获方法
Li et al. Discovering novel chemical inhibitors of human cyclophilin A: virtual screening, synthesis, and bioassay
Zidane et al. The folded and disordered domains of human ribosomal protein SA have both idiosyncratic and shared functions as membrane receptors
CN109507435A (zh) Grp78蛋白双抗夹心elisa法检测试剂盒及其检测方法
Sahoo et al. Selective fluorescence sensing and quantification of uric acid by naphthyridine-based receptor in biological sample
CN107011324A (zh) 二肽基肽酶iv酶近红外荧光探针底物及其制备方法与应用
Colucci et al. 20 years of Hepcidin: How far we have come
Day et al. Photoinduced reconfiguration to control the protein-binding affinity of azobenzene-cyclized peptides
Wei et al. Fluorescent coumarin-based probe for cysteine and homocysteine with live cell application
Chambrey et al. Evidence for an amiloride-insensitive Na+/H+ exchanger in rat renal cortical tubules
US9958434B2 (en) Fluorescent probe sensing tyrosine kinase and use thereof
Shang et al. Development and cytotoxicity of Schiff base derivative as a fluorescence probe for the detection of l-Arginine
CN114621310A (zh) 基于雷公藤红素的靶向Prdx2降解剂及其制备方法与医药用途
CN108048407B (zh) 杂交瘤细胞株及抗人ctrp3的单克隆抗体和其应用
Guo et al. Serial measurement of serum basic fibroblast growth factor in patients with acute cerebral infarction
Suzuki Development of a fluorescent peptide for the highly sensitive and selective detection of oxytocin
CN103864815A (zh) 一种靶向结合线粒体dna上tfam的化合物及其应用
KR102313314B1 (ko) 신경퇴행성 질환 및 통증의 예방 및 치료에 사용하기 위한 화합물
JP6473519B2 (ja) ３−ヒドロキシピリジン化合物、その製造方法及び医薬品製造における使用
CN103936758A (zh) 一种生物素标记的川芎嗪及其制备方法
CN104808001A (zh) 血清sH2a含量的时间分辨免疫荧光分析法及检测试剂盒
CN115850338A (zh) 一种含有双吖丙啶核苷类化合物及制备方法和应用
WO2022194225A1 (zh) FXIa抑制剂化合物杂质及其制备方法和用途FXIa抑制剂化合物杂质及其制备方法和用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20140723