CN103923479A

CN103923479A - 久洛尼定母核的氟离子荧光染料及其应用

Info

Publication number: CN103923479A
Application number: CN201410155971.3A
Authority: CN
Inventors: 彭孝军; 张世玲; 樊江莉; 王静云; 杜健军; 张双喆; 仉华
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2014-04-18
Filing date: 2014-04-18
Publication date: 2014-07-16
Anticipated expiration: 2034-04-18
Also published as: CN103923479B

Abstract

本发明公开一类久洛尼定母核的氟离子荧光染料及其应用，所述的荧光染料结构包括由C₁-C₄烷基在含N杂环部分任意取代的久洛尼定母核；a苯环上的取代基R_x（i）和R_y（ii）。本发明所述的久洛尼定母核的氟离子荧光染料可以特征性地识别氟离子，高效灵敏专一的检测氟离子，并且可应用于生物体系中氟离子检测的可应用性。所述荧光染料可被制备为试纸，该试纸可用于检测纯水环境或水相为主的生物环境中的氟离子浓度，检测限可达到1微摩尔每升。

Description

久洛尼定母核的氟离子荧光染料及其应用

技术领域

本发明涉及一类检测氟离子的荧光染料，涉及该类荧光染料试纸检测水溶液中的氟离子浓度的应用。另外，还涉及该类荧光染料化合物在细胞成像中的应用。

背景技术

阴离子在很多化学和生物进程中扮演着重要的角色，因此，近来年阴离子的识别和检测受到了极大的关注。其中，氟离子的识别和检测尤为重要。氟是人体必需的微量元素，适量的氟化物可以预防龋齿，治疗骨质疏松症。但高浓度的氟对人体的危害很大，轻则影响牙齿和骨骼的发育，出现氟化骨症、氟斑牙等慢性氟中毒，重则会引起恶心、呕吐、心律不齐等急性氟中毒。过量的氟对蛋白质和DNA的合成有抑制作用，使免疫系统代谢紊乱，最终使机体免疫能力下降。过量的氟还会导致动物血压下降甚至贫血，影响动物的生长发育。

随着分子生物学技术方法的成熟和发展，大量的检测氟离子的荧光探针被报道。其检测机理主要有；（1）利用氟离子的去质子能力，设计出一系列可以与氟离子形成氢键的染料分子；（2）利用路易斯酸碱作用来检测，例如含硼原子的染料分子；（3）利用氟离子可以诱导硅氧键断裂来检测；（4）利用氟离子诱导硅炔键断裂来检测；（5）利用氟离子的亲核反应来检测；（6）利用分子内成环反应来检测，例如硅氧键断裂诱发的分子内成环反应。目前大部分检测氟离子的荧光探针还面临着以下几个难点：只能检测有机相中的氟离子，不能检测水溶液中的氟离子浓度；检测氟离子的响应时间太长；由于探针的细胞毒性限制了其生物体系中检测氟离子。针对以上几个难点，本发明的发明人根据氟与硅的强亲和力以及亲核反应原理，设计合成了一例以硅氧键为识别基团的off-on型荧光探针。加入氟离子可诱导硅氧键断裂，进而氧负离子进行亲核进攻发生分子内成环反应，使得探针从完全没有荧光到发出很强的荧光。本探针对氟离子响应较快，加入后立刻有荧光增强，10分钟达到饱和。本探针做成试纸以后可检测水溶液（100%水）中的氟离子，并且能达到1uM的检测限。另外，本探针还可以用于检测活细胞中的氟离子。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一类久洛尼定母核的氟离子荧光染料。

本发明所述的久洛尼定母核的氟离子荧光染料，包括：

a.由C₁-C₄烷基在含N杂环部分任意取代的久洛尼定母核；

b.连接于a苯环上的R_x，所述R_x具有通式i的结构：

通式i中，R₁和R₂各自独立地选自-CN和-COOEt；

c.连接于a苯环上的R_y，所述R_y具有通式ii的结构：

通式ii中：R₃、R₄和R₅各自独立地选自C₁-C₆烷基、未取代芳基和C₁-C₆烷基任意取代的芳基；

d.连接于a苯环上的R₆，所述R₆选自氢、羟基、卤素和C₁-C₆烷基。

该化合物的特征在于，硅氧键是氟离子的专一性识别基团，-CN或者-COOEt是发生亲核反应的被进攻对象。当加入氟离子以后，氟离子诱导硅氧键断裂，形成氧负离子，而氧负离子进攻-CN或者-COOEt，发生亲核反应，同时分子内成环，形成一个强的电子推拉体系，探针发射出很强的荧光信号，达到检测氟离子的目的。以本发明系列化合物中的某些类别为例，示意反应机理如下：

鉴于反应得以顺利发生所需的条件，具体实施方式中，优选所述的b和c两个取代基取代于a苯环上的相邻位置。

更为优选的具体的实施方式中，本发明的久洛尼定母核的氟离子荧光染料化合物中，所述的R₁和R₂相同，即同时为-CN或同时为-COOEt；最为优选的是R₁和R₂均为-CN。

另一具体的实施方式中，本发明的久洛尼定母核的氟离子荧光染料化合物中，所述的R₃、R₄和R₅各自独立地选自C₁-C₄烷基和未取代芳基；其中的芳基优选苯基。更为具体地，所述R₃、R₄和R₅各自独立地选自甲基、乙基、异丙基、叔丁基或苯基。

上述久洛尼定母核的氟离子荧光染料的技术方案中，所述的R₆优选氢或羟基。

本发明的久洛尼定母核的氟离子荧光染料中，具体的实施方式中，所述的基团a是未取代久洛尼定母核或1和/或7位单取代或多取代的久洛尼定母核；

优选的a是未取代久洛尼定母核或甲基在上述位置进行取代的久洛尼定母核。

更为优选的，所述的a是未取代久洛尼定母核或1,1,7,7-四甲基久洛尼定母核。

其中最优选未取代久洛尼定母核化合物。

更进一步具体的实施方案中，本法所述化合物是通式I的化合物或通式II的化合物：

其中各个取代基的选择及优选，如上文所详述。

最为优选的，本发明所述的化合物具有如下结构式：

本发明的目的之二在于提供上述久洛尼定母核的氟离子荧光染料的制备方法。

从有机合成方法角度来看，本发明所述的化合物的合成采用本领域最为经典的一些合成路线，首先以相应的[羟基][甲醛基]取代久洛尼定化合物与氯代硅烷ClSi(R₃)(R₄)(R₅)反应，后者与前者母核上的-OH发生取代反应，生成母核上原羟基取代位置被取代基ii取代的化合物；

所得化合物进一步与R₁CH₂R₂反应，后者与久洛尼定母核上的甲醛基反应，脱除H₂O，生成目标化合物。

该制备方法中所述及的取代基与同样表述的取代基在本文中其它位置所述及的含义相同。

上述本发明久洛尼定母核的氟离子荧光染料的制备方法的具体实施方式包括：

首先，针对通式I化合物的制备方法，包括如下步骤：

（1）二氯甲烷或四氢呋喃作为溶剂，在DMAP和三乙胺存在条件下，式III的化合物和式IV的化合物按照摩尔比为1:1～2，在氮气保护下常温搅拌反应，薄板层析（TCL）监测反应是否完成；反应结束后加入饱和碳酸氢钠溶液洗涤，二氯甲烷萃取三次，然后用卤水洗涤有机相3次，无水硫酸钠干燥，抽滤，减压旋蒸；经硅胶柱分离提纯后得到式V的化合物；

（2）用乙醇作溶剂，哌啶作为催化剂，式V的化合物和式VI的化合物按照摩尔比为1:1～1.5，在氮气保护下常温搅拌反应，薄板层析（TCL）监测反应是否完成；反应结束后减压旋蒸除去溶剂，硅胶柱分离提纯后得到式I的染料分子；

其次，针对通式II的化合物的合成方法，包括如下步骤：

（1）二氯甲烷或四氢呋喃作为溶剂，在DMAP和三乙胺存在条件下，式VII的化合物和式IV的化合物按照摩尔比为1:1～2，在氮气保护下常温搅拌反应，薄板层析（TCL）监测反应是否完成；反应结束后加入饱和碳酸氢钠溶液洗涤，二氯甲烷萃取三次，然后用卤水洗涤有机相3次，无水硫酸钠干燥，抽滤，减压旋蒸；经硅胶柱分离提纯后得到式VIII的化合物；

（2）用乙醇作溶剂，哌啶作为催化剂，式VIII的化合物和式VI的化合物按照摩尔比为1:1～1.5，在氮气保护下常温搅拌反应，薄板层析（TCL）监测反应是否完成；反应结束后减压旋蒸除去溶剂，硅胶柱分离提纯后得到式II的染料分子。

本发明所述的久洛尼定母核的氟离子荧光染料可以特征性地识别氟离子，高效灵敏专一的检测氟离子，并且通过MCF-7和COS-7活细胞成像实验成功验证了其应用于生物体系中氟离子检测的可应用性。因此，本发明的目的之三，还在于提供所述化合物在检测氟离子浓度以及用于制备氟离子检测试剂中的应用。该检测用途包括，并作为此类荧光染料的特别优势之一，在于其可应用于生物体系中的氟离子检测盒荧光成像。而本领域的技术人员根据现有技术信息，可以变通地将本发明所述的荧光染料制备成为适用于不同目的的氟离子检测试剂。

本发明所述的久洛尼定母核的氟离子荧光染料在水、DMSO等大极性溶剂中的溶解度较小，在CH₂Cl₂、乙腈等溶剂中溶解度很好。因此可利用此特性制备氟离子检测试纸。所述试纸是吸附了权利要求1所述的久洛尼定母核的氟离子荧光染料的滤纸。其优选通过如下方法制备：

a.将权利要求1所述的久洛尼定母核的氟离子荧光染料溶解于CH₂Cl₂或乙腈制成溶液；

b.将滤纸条浸入步骤a所配置的溶液中；

c.5～10min后，取出滤纸条并除去有机溶剂即可。

将该试纸浸入待检测氟离子浓度的纯水溶液中，染料不会从试纸上脱附进入水相中。因此，该试纸可用于检测纯水环境或水相为主的生物环境中的氟离子浓度，检测限可达到1微摩尔每升。

附图说明

本发明附图10幅，其中：

图1是5μM探针FP的乙腈溶液，加入0、5、10、15、20、25、30、40、60、100μM的TBAF溶液时的荧光强度变化。

图2是5μM探针FP的乙腈溶液，加入0、5、10、15、20、25、30、40、60、100μM的TBAF溶液时的紫外吸收的变化情况。

图3是5μM探针FP的乙腈溶液，分别加入50μM TBAF,100μM碳酸氢根离子、磷酸一氢根离子、碳酸根离子、醋酸根离子、次氯酸根离子、碘离子、溴离子、氯离子、硝酸根离子、磷酸二氢根离子、硫酸根离子、硫离子时的荧光强度变化。

图4是5μM探针FP的乙腈溶液，分别加入50μM TBAF,100μM碳酸氢根离子、磷酸一氢根离子、碳酸根离子、醋酸根离子、次氯酸根离子、碘离子、溴离子、氯离子、硝酸根离子、磷酸二氢根离子、硫酸根离子、硫离子时的紫外吸收强度变化。

图5是5μM探针FP的乙腈溶液，加入50μM的TBAF，然后分别再加入100μM的碳酸氢根离子、磷酸一氢根离子、碳酸根离子、醋酸根离子、次氯酸根离子、碘离子、溴离子、氯离子、硝酸根离子、磷酸二氢根离子、硫酸根离子、硫离子的荧光强度的柱状图。图中1到14分别代表探针FP加入TBAF、碳酸氢根离子、磷酸一氢根离子、醋酸根离子、次氯酸根离子、碘离子、溴离子、氯离子、硝酸根离子、磷酸二氢根离子、硫酸根离子、硫离子、碳酸根离子后的荧光强度。

图6是5μM探针FP的乙腈溶液，加入50μM的TBAF后在0至25分钟内的荧光强度变化，每隔30秒扫描一次荧光强度。

图7是探针FP对氟离子的检测限测定实验。5μM探针FP的乙腈溶液，加入0、1、2、3、4、5μM的TBAF时的荧光强度变化。将荧光强度取对数后和TBAF的浓度呈现出很好的线性关系。

图8是实施例7中的探针FP测试试纸分别检测0μM、1μM、10μM、100μM、1mM、10mM的TBAF时的荧光强度变化。用365nm的手提式紫外灯激发。图中从左到右的试纸分别代表氟离子的浓度为：0μM、1μM、10μM、100μM、1mM、10mM。

图9是探针FP的细胞成像实验。用2.5μM的探针FP孵育MCF-7和COS-7细胞10分钟，分别加入50μM的TBAF再孵育10分钟后的细胞成像。a、b两图为COS-7细胞成像，a为荧光图，b为明场图。c、d两图为MCF-7细胞成像，c图为荧光图，d图为明场图。

图10是探针FP的细胞器定位实验。用2.5μM的探针FP，50μM的TBAF孵育MCF-710分钟，再加入0.5μM的线粒体商业化染料Mito Tracker Deep Red FM孵育10分钟后的细胞成像。a图为接收探针FP加入氟离子以后的荧光图，b图为接收线粒体商业化染料Mito Tracker Deep Red FM的荧光图，c图为a和b的叠加图。

具体实施方式

除非指出并非如此，当化学结构特征例如芳基称作被“任意取代”时，指的是该特征可以没有取代基(即被未取代)或者可以具有一个或多个取代基。被“取代”的特征具有一个或多个取代基。术语“取代基”具有本领域普通技术人员所了解的通常意义。

本发明中，-COOEt是指甲酸乙酯基；卤素指代F、Cl、Br、I。

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更加全面地理解本发明内容，但不以任何方式限制本发明。

实施例1.制备探针化合物FP:

（1）化合物2的合成

将8-羟基久洛尼定-9-甲醛（65mg,0.3mM）、4-二甲氨基吡啶（DMAP,37mg,0.3mM）溶于10ml二氯甲烷中，加入几滴三乙胺，室温条件下搅拌10分钟。将叔丁基二甲基氯硅烷（TBDMSCl,53mg,0.35mM）溶于5ml二氯甲烷，在氮气保护下，逐滴加入到上述混合液中，滴加完毕后，继续氮气保护室温搅拌过夜反应。反应结束后加入10ml饱和碳酸氢钠溶液，用20ml二氯甲烷萃取三次，然后用饱和氯化钠水溶液洗涤有机相三次，用无水硫酸钠干燥，抽滤。旋转蒸发仪旋蒸后用硅胶柱分离提纯得到黄色油状物79mg，产率为80%。洗脱液为：正己烷/乙酸乙酯=20/1。

（2）化合物FP的合成

将化合物2（74mg,0.2mM）和丙二腈（15.2mg,0.23mM）溶于5ml乙醇，加入几滴哌啶，氮气保护，常温搅拌反应3小时。反应结束后旋蒸，用硅胶柱分离提纯得到黄色固体25mg，产率为31%.洗脱液为：正己烷/乙酸乙酯=10/1。化合物结构通过核磁氢谱、碳谱以及高分辨质谱表征。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃,Me₄Si)7.83(s,1H),7.69(s,1H),3.34-3.30(m,4H,J=4.00Hz),2.69(t,2H,J=8.00Hz),2.60(t,2H,J=8.00Hz),1.94(t,2H,J=4.00Hz),1.89(t,2H,J=4.00Hz),1.05(s,9H),0.15(s,6H)。MS(TOF MS ES+)，理论值：C₂₂H₂₉N₃OSi:379.2080，实测值：[C₂₂H₂₉N₃OSi+H]⁺380.2157。

实施例2.制备探针化合物FP-1、FP-2、FP-3、FP-4:

利用与实施例1中相似的合成条件，选择相应的起始原料化合物，我们合成了以下四个探针化合物：

R₁

R₂

R₃

R₄

R₅

R₆

FP-1

-COOEt

甲基

叔丁基

H

FP-2

-CN

苯基

叔丁基

H

FP-3

-CN

甲基

H

FP-4

-CN

甲基

叔丁基

OH

探针化合物FP-1、FP-2、FP-3、FP-4的物性数据如下：

FP-1：¹H NMR(400MHz,CDCl₃,Me₄Si)8.62(s,1H),6.62(s,1H),4.20(m,4H,J=4.00Hz),3.37(t,4H,J=8.00Hz),2.76(t,4H,J=8.00Hz),1.96(t,4H,J=4.00Hz),1.29(t,6H,J=8.00Hz),0.98(s,9H),0.21(s,6H)。MS(TOF MS ES+)理论计算值:C₂₆H₃₉N₃O₅Si:473.2597,实测值:[C₂₆H₃₉N₃O₅Si+H]⁺474.2564。

FP-2：¹H NMR(400MHz,CDCl₃,Me₄Si)8.06(s,1H),7.37-7.55(m,10H),6.62(s,1H),3.37(t,4H,J=8.00Hz),2.76(t,4H,J=8.00Hz),1.96(t,4H,J=4.00Hz),0.98(s,9H)。MS(TOF MS ES+)理论计算值：C₃₂H₃₃N₃OSi:503.2393,实测值：[C₃₂H₃₃N₃OSi+H]⁺504.2376。

FP-3：¹H NMR(400MHz,CDCl₃,Me₄Si)8.06(s,1H),6.60(s,1H),3.37(t,4H,J=8.00Hz), 2.76(t,4H,J=8.00Hz),1.96(t,4H,J=4.00Hz),0.21(s,9H)。MS(TOF MS ES+)理论计算值：C₁₉H₂₃N₃OSi:337.1610,实测值：[C₁₉H₂₃N₃OSi+H]⁺338.1605。

FP-4：¹H NMR(400MHz,CDCl₃,Me₄Si)8.06(s,1H),3.35(t,4H,J=8.00Hz),2.72(t,4H,J=8.00Hz),1.96(t,4H,J=4.00Hz),0.98(s,9H),0.21（s,6H）。MS(TOF MS ES+)理论计算值：C₂₂H₂₉N₃O₂Si:395.2029,实测值：[C₂₂H₂₉N₃O₂Si+H]⁺396.2018。

实施例3、制备探针化合物FP-Z：

以1,1,7,7-四甲基-8-羟基-久洛尼定-9-甲醛为原料，按照实施例1中的合成方法得到探针化合物FP-Z，通过了核磁和高分辨质谱表征了该化合物。

FP-Z：¹H NMR(400MHz,CDCl₃,Me₄Si)8.06(s,1H),6.77(s,1H),3.39(t,4H,J=8.00Hz),1.74(t,4H,J=8.00Hz),0.98(s,9H),0.89(s,12H),0.21(s,6H),。MS(TOF MS ES+)理论计算值：C₂₆H₃₇N₃OSi:435.2706,实测值：[C₂₆H₃₇N₃OSi+H]⁺436.2702。

实施例4、探针化合物FP对氟离子的浓度滴定实验：

使用实施例1合成的化合物FP先用二氯甲烷在10ml的容量瓶中溶解配成1×10^-3mol/L的溶液作为母液，然后用微量进样器取样，用乙腈将荧光探针FP的母液稀释至5.0μM，并确保二氯甲烷的加入体积小于总体积的千分之一。依次加入0、5、10、15、20、25、30、40、60、100μM的TBAF溶液，每加入一次TBAF需等7分钟后再检测其荧光强度变化和紫外吸收吸光度的变化。荧光光谱测试过程中的狭缝设置为2.5/2.5。测试结果如图1和2，可以看出随着加入氟离子的浓度增加，485nm处的荧光强度不断增强，而吸收强度逐渐减弱，同时吸收波长发生了蓝移现象，蓝移了20nm。

实施例5、探针化合物FP对氟离子的选择性实验

用微量进样器取实施例4中配制的母液少许，稀释成5.0μM的乙腈溶液，并确保二氯甲烷的加入体积小于总体积的千分之一。然后分别加入50μM TBAF,100μM碳酸氢根离子、磷酸一氢根离子、碳酸根离子、醋酸根离子、次氯酸根离子、碘离子、溴离子、氯离子、硝酸根离子、磷酸二氢根离子、硫酸根离子、硫离子。静置7分钟后检测其荧光强度和紫外吸收吸光度的变化，荧光光谱测试过程中的狭缝设置为2.5/2.5。测试结果如图3和4，从结果可以看出，该探针对其他阴离子基本没有响应，而对氟离子的响应较强。说明了探针FP对氟离子具有很好的选择性。

实施例6、探针化合物FP对阴离子的竞争性实验

将探针分子FP的母液稀释到5.0μM的乙腈溶液，并确保二氯甲烷的加入体积小于总体积的千分之一。加入50μM的TBAF，然后分别再加入100μM的碳酸氢根离子、磷酸一氢根离子、碳酸根离子、醋酸根离子、次氯酸根离子、碘离子、溴离子、氯离子、硝酸根离子、磷酸二氢根离子、硫酸根离子、硫离子。静置7分钟后检测其荧光强度变化，荧光光谱测试过程中的狭缝设置为2.5/2.5。测试结果如图5，从结果可以看出，其他阴离子的存在不会干扰探针对氟离子的检测。

实施例7、探针化合物FP对氟离子的响应时间实验

将探针分子FP的母液稀释到5.0μM的乙腈溶液，并确保二氯甲烷的加入体积小于总体积的千分之一。加入50μM的TBAF，然后用荧光分光光度计进行时间扫描荧光强度，每隔0.5分钟扫描一次，共扫描25分钟。最终取485nm处的荧光强度与时间做一条曲线，得图6。从图中可以看出，加入TBAF后荧光立刻有增强的趋势，10分钟后荧光强度可达到最大。由此说明了探针FP对氟离子的响应很快。

实施例8、探针FP在乙腈溶液中对氟离子的检测限测定实验

将探针分子FP的母液稀释到5.0μM的乙腈溶液，并确保二氯甲烷的加入体积小于总体积的千分之一。依次加入0、1、2、3、4、5μM的TBAF溶液，每加入一次TBAF需等7分钟后再检测其荧光强度变化，荧光光谱测试过程中的狭缝设置为2.5/2.5。然后取485nm处的荧光强度与加入的TBAF浓度做一条曲线，得到一条抛物线。将其荧光强度取对数后再与TBAF浓度可做得一条直线，如图7，线性系数为0.9967。测试三次空白对照，通过公式：检测限（LOD）=3σ/k，其中，σ为三次空白对照的标准差，k为图7中的线性系数。可计算得到探针FP对氟离子的检测限为0.169μM。

实施例9、探针FP的试纸制作以及应用

将滤纸剪成规格为3×0.5cm²的滤纸条待用。取5ml实施例2中配置的探针FP母液于10ml离心管中，将剪好的滤纸条完全浸入探针FP母液中5分钟，然后取出在空气中晾干。晾干后的滤纸条即可用于水溶液中氟离子的检测。分别配置1μM,10μM,100μM,1mM和10mM的TBAF水溶液，然后将五个探针FP试纸条分别完全浸入至五个不同浓度的 TBAF溶液中，5分钟以后取出在空气中晾干。完全晾干后用手提式紫外灯365nm的光激发，就可以观察到随着氟离子浓度的增加，试纸的荧光强度变化也越明显。如图8。

实施例10、探针FP的细胞成像实验

使用实施例1合成的化合物FP，用乙腈配成浓度为5mM的探针FP母液待用。取FP-CH₃CN溶液1μL（浓度为2.5μM）分别加入到MCF-7和COS-7细胞，在37℃，5%CO₂下培养基中孵育10分钟。然后再分别加入TBAF溶液2μL（浓度为50μM），在培养箱中继续孵育15分钟。然后，HEPES缓冲液震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，激光共聚焦成像。选取代表性区域，用油镜(60×)观察，重复三次。激发波长：405nm，接收波段为：445到545nm。成像结果如图9，a、b两图为COS-7细胞成像，a为荧光图，b为明场图。c、d两图为MCF-7细胞成像，c图为荧光图，d图为明场图。荧光图显示了探针化合物FP可以用于检测活细胞中的氟离子和进行细胞成像。

实施例11、探针FP的细胞器定位实验

使用实施例1合成的化合物FP，用乙腈配成浓度为5mM的探针FP母液待用。取FP-CH₃CN溶液1μL（浓度为2.5μM）、2μL TBAF溶液（浓度为50μM），加入到MCF-7细胞，在37℃，5%CO₂下培养基中孵育10分钟。然后再取1μL线粒体商业化染料Mito Tracker Deep Red FM（浓度为1mM）加入MCF-7细胞，在培养箱中继续孵育10分钟。然后，HEPES缓冲液震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，激光共聚焦成像。选取代表性区域，用油镜(60×)观察，重复三次。激发波长：405nm和635nm，接收波段分别为为：445到545nm、660到700nm。445到545nm波段接收的是染料化合物FP的荧光信号，660到700nm波段接收的是线粒体商业化染料Mito Tracker Deep Red FM的荧光信号。成像结果如图10，a图为用染料化合物FP处理细胞的成像，b图为用线粒体商业化染料Mito Tracker Deep Red FM处理细胞的成像，c图为a图和b图的叠加图。通过皮尔森相关性分析，皮尔森系数达到0.95。实验结果表明了氟离子进入MCF-7细胞后主要聚集在线粒体上，染料化合物FP可以示踪活细胞中的氟离子。

Claims

1.一类久洛尼定母核的氟离子荧光染料，包括：

a.由C₁-C₄烷基在含N杂环部分任意取代的久洛尼定母核；

b.连接于a苯环上的R_x，所述R_x具有通式i的结构：

通式i中，R₁和R₂各自独立地选自-CN和-COOEt；

c.连接于a苯环上的R_y，所述R_y具有通式ii的结构：

2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述的b和c取代于a苯环上的相邻位置。

3.根据权利要求2所述的化合物，其特征在于，所述的R₁和R₂相同。

4.根据权利要求2所述的化合物，其特征在于，所述的R₃、R₄和R₅各自独立地选自C₁-C₄烷基和未取代芳基。

5.根据权利要求4所述的化合物，其特征在于，所述的R₃、R₄和R₅各自独立地选自甲基、乙基、异丙基、叔丁基或苯基。

6.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述的R₆为氢或羟基。

7.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述的a是未取代久洛尼定母核或1和/或7位单取代或多取代的久洛尼定母核。

8.根据权利要求7所述的化合物，其特征在于，所述的化合物是通式I的化合物或通式II的化合物：

。

9.权利要求1所述的化合物在制备氟离子检测试剂中的应用。

10.一种氟离子检测试纸，其特征在于，所述试纸是吸附了权利要求1所述的久洛尼定母核的氟离子荧光染料的滤纸。