CN103919738A - 一种甲氨喋呤前药及其胶束制剂和制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗肿瘤药物制剂领域，具体涉及一种防止恶性肿瘤生长和复发的甲氨喋呤前药及其胶束制剂和制备方法。本发明甲氨喋呤(MTX)前药靶向胶束制剂的制备方法，包括如下步骤：1)将DSPE-PEG-NH2溶于有机溶剂中，得溶液A；MTX溶于DMSO水溶液中，得到溶液B；将溶液A、B混合，得到溶液C；2)将溶液C透析去除杂质，冻干得冻干品；3)将MTX-PEG-DSPE化合物冻干品用有机溶剂溶解，通过超声乳化或透析法去除杂质后冻干，消毒得MTX前药靶向胶束制剂。本发明利用DSPE-PEG-NH2与MTX原料药化学健合制备MTX前药，然后进一步制成胶束，粒径在100nm左右，适合作为静脉用靶向肿瘤制剂。
Description
技术领域
本发明涉及抗肿瘤药物制剂领域，具体涉及一种防止恶性肿瘤生长和复发的甲氨喋呤前药及其胶束制剂和制备方法。
背景技术
甲氨喋呤(MTX)是一种叶酸类抗代谢药剂，能与肿瘤细胞表面的叶酸受体进行结合起到很好的靶向作用，常用于各种恶性肿瘤治疗，也是常用的抗风湿药物。MTX在药用上也有许多不利之处，治疗脑部肿瘤时很少量能通过血脑屏障。本品可增加肝肾功能毒性，由于药物作用机理是通过对二氢叶酸还原酶的抑制而达到阻碍肿瘤细胞DNA的合成，所以对正常的生物细胞也有药物作用，毒副作用较大。
经过两亲性高分子修饰的甲氨蝶呤前药具有提高药物的靶向性和药物的生物利用度，减少药物的毒副作用等优点，而且自组装形成的纳米粒子作为药物载体进入体内，可以有效地减少人体网状内皮系统(RES)巨噬细胞的吞噬。作为纳米级的粒子能穿越细胞间隙，可通过人体最小的毛细血管及血脑屏障(BBB)，并被细胞组织吸收，纳米粒子药物载体可以运载药物到达靶向部位控制药物释放、减少药物用量、增强药物疗效并降低药物毒性。同时，纳米粒子药物系统可以避免药物活性丧失，有利于药物的贮藏和运输。因为纳米粒子的诸多优点，使其成为一种很有前途的药物新剂型，故在癌症的治疗方面备受关注。
目前关于高分子前药的报道越来越多，应用越来越广泛，本发明人之前申请的中国专利申请号为：201310239345.8，名称为：一种甲氨喋呤靶向纳米粒缓释制剂及其制备方法，其是将甲氨蝶呤化学交联到高分子载体上，但该载体是MPEG-PLA，该制剂中的靶向纳米粒子粒径较大，一般大于200nm，属于实体粒子，该粒子释药非常缓慢，比较适合作为肿瘤局部注射用，静脉注射应用受到一定的限制。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种利用柔性分子载体制备的粒径小，适合作为静脉用靶向肿瘤制剂的甲氨喋呤前药及其胶束制剂和制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：提供一种甲氨喋呤前药，其原料包括甲氨喋呤原料药和载体材料，所述载体材料为DSPE-PEG-NH2。
本发明的另一技术方案为：提供一种甲氨喋呤前药靶向胶束制剂的制备方法，包括如下步骤：
1)将DSPE-PEG-NH2溶于有机溶剂中，得溶液A；MTX溶于DMSO水溶液中，得到溶液B；在溶液B中加入TEA和交联剂，所述交联剂为DCC和NHS，将溶液A、B混合，在氮气保护下反应12h，得到溶液C；
2)将步骤1)所得溶液C依次置于磷酸盐缓冲液和去离子水中透析去除杂质，透析液冻干得到MTX-PEG-DSPE化合物冻干品；
3)将步骤2所得MTX-PEG-DSPE化合物冻干品用有机溶剂溶解，通过超声乳化或透析法去除有机溶剂后冻干，消毒得MTX前药靶向胶束制剂。
本发明的又一技术方案为：提供一种上述的甲氨喋呤前药靶向胶束制剂的制备方法制备的甲氨喋呤前药靶向胶束制剂。
本发明解决了现有技术中甲氨喋呤靶向纳米粒子粒径较大，释药非常缓慢，只适合作为肿瘤局部注射用，静脉注射应用受到一定限制的技术问题。利用柔性分子载体(DSPE-PEG-NH2)与MTX原料药化学健合制备MTX前药，然后进一步制成胶束，该胶束为柔性粒子，粒径在100nm左右，适合作为静脉用靶向肿瘤制剂，其静脉注射具有靶向性强、长循环和低毒性的特点，使其更容易达到肿瘤组织发挥药效。
附图说明
图1为本发明实施例中DSPE-PEG-NH2与MTX合成MTX-PEG-DSPE的简要示意图；
图2为本发明实施例中MTX-DSPE-PEG的核磁共振图谱，其中8.6，7.7，6.8是MTX的特征峰；
图3为本发明实施例中MTX-DSPE-PEG和载体材料DSPE-PEG-NH2的紫外及可见分光光谱；
图4为本发明实施例中MTX前药靶向胶束制剂的透射电镜照片，其标尺为200nm；
图5为本发明实施例中MTX前药靶向胶束制剂在不同pH的PBS缓冲液中的释药曲线图；
图6为本发明实施例中MTX前药靶向胶束制剂肿瘤细胞靶向实验(包括激光共聚焦分析和流式细胞实验)的结果图；
图7为本发明实施例中MTX前药胶束制剂与裸药MTX的肿瘤细胞毒性实验结果图；
图8为本发明实施例中MTX前药靶向胶束在荷瘤裸鼠静脉注射后的肿瘤靶向实验及结果图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。
本发明使用的药品名称说明如表1：
表1
载体前体药物(简称前药)是指具有活性的化合物与其运输作用的载体通过共价键结合，在体内通过简单的水解作用卸掉载体，由活性化合物发挥药理作用。前药与母体化合物相比往往活性微弱或无活性。载体的结构，多是亲脂性，要求对生物体无害，且能及时释放活性化合物。
本发明最关键的构思在于：本发明利用柔性分子载体(DSPE-PEG-NH2)与MTX化学健合制备MTX前药，粒径在100nm左右，其静脉注射具有靶向性强、长循环和低毒性的特点，更容易达到肿瘤组织发挥药效。
实例1：称取聚乙二醇分子量为2000道尔顿的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇双亲性嵌段聚合物(DSPE-PEG-NH2)200mg，置烧杯中以5ml氯仿溶解得A液；另外，称取MTX原料药15mg，TEA20μL，DCC15mg和NHS6mg溶于DMSO中得到溶液B；将A和B液二者混合，并在氮气保护下反应12h得C液，将C溶液旋蒸去除氯仿，过0.45μm滤膜去除副产物，转移到最小通透分子量5000道尔顿的透析袋内，分别置于磷酸盐缓冲液和去离子水中透析去除杂质。透析完成得到的悬浮液冻干得MTX-PEG-DSPE化合物，然后再用丙酮溶解后透析8h，将所得悬浮液过滤，过滤液浓缩后冻干，冻干品钴射线消毒后既得MTX前药靶向胶束制剂。
实例2：称取聚乙二醇分子量为2000道尔顿二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000-NH2)200mg，置烧杯中以10ml DMF溶解得A液；另外，称取MTX原料药23.0mg，TEA36μL，DCC21mg和NHS12mg溶于DMSO中得到溶液B；将A液和B液二者混合，并在氮气保护下反应12h得含有MTX-PEG-DSPE化合物的C液，将C液转移到最小通透分子量5000道尔顿的透析袋内，依次置于磷酸盐缓冲液和去离子水中透析，悬浮液冻干得MTX-PEG-DSPE化合物冻干品，将其用丙酮溶解后透析10h，将所得悬浮液过滤，过滤液进一步浓缩后冻干，冻干品钴射线消毒后既得MTX前药靶向胶束制剂。
实例3：称取聚乙二醇分子量为2000道尔顿二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000-NH2)200mg，置烧杯中以10ml DMSO溶解得A液；另外，称取MTX原料药23.0mg，TEA36μL，DCC21mg和NHS12mg溶于DMSO中得到溶液B；将A和B液二者混合，并在氮气保护下反应12h得含有MTX-PEG-DSPE化合物的C液，将C液转移到最小通透分子量5000道尔顿的透析袋内，依次置于磷酸盐缓冲液和去离子水中透析去除杂质。透析液冻干得MTX-PEG-DSPE化合物冻干品，将其用DCM溶解，与一定体积的去离子水混合，超声乳化5min，将所得乳液过滤，过滤液进一步浓缩后冻干，冻干品钴射线消毒，既得MTX前药靶向胶束制剂。
实例4：称取PEG分子量为3000道尔顿二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG3000-NH2)300mg，置烧杯中以10ml二氯甲烷中溶解得A液；称取MTX原料药23.0mg，TEA36μL，DCC21mg和NHS12mg溶于DMSO中得到溶液B；将A和B液二者混合，并在氮气保护下反应12h得C液，将C液转移到最小通透分子量8000道尔顿的透析袋内，依次置于磷酸盐缓冲液和去离子水中透析去除杂质。所得透析液冻干得MTX-PEG-DSPE化合物冻干品，将其用丙酮溶解后透析8h，将所得悬浮液过滤，过滤液进一步浓缩冻干，冻干品钴射线消毒后既得MTX前药靶向胶束制剂。
实例5：称取用PEG分子量为5000道尔顿二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG5000-NH2)600mg，置烧杯中以50ml DMF溶解得A液；另外，称取MTX原料药40mg，TEA50μL，DCC40mg和NHS30mg溶于DMSO中得到溶液B；将A和B液二者混合，并在氮气保护下反应12h得C液，将C液转移到最小通透8000道尔顿的透析袋内，依次置于磷酸盐缓冲液和去离子水中透析去除杂质。所得透析液冻干得MTX-PEG-DSPE化合物冻干品，将其用丙酮溶解后透析8h，将所得悬浮液过滤，过滤液进一步冻干，冻干品钴射线消毒后既得MTX前药靶向胶束制剂。
实施例6上述MTX前药靶向胶束制剂特性分析实验如下
1、请参阅图1、图2和图3，图1为本发明实施例中DSPE-PEG-NH2与MTX合成MTX-PEG-DSPE的示意图；图2为本发明实施例中MTX-DSPE-PEG的核磁共振图谱。其中的8.6，7.7，6.8是MTX的特征峰；图3为本发明实施例中MTX-DSPE-PEG和载体材料DSPE-PEG-NH2的紫外及可见分光光谱。
2、请参阅图4(标尺长度为200nm)，其为MTX前药靶向胶束的电镜照片，由图4可以看出胶束的粒径大约在100nm左右，球形，分散性很好。
3、请参阅图5，其为MTX前药靶向胶束制剂在不同pH的PBS缓冲液中的释药曲线图，显示MTX前药靶向胶束具有pH敏感性释药特性，缓释效果明显。
4、请参阅图6，其为MTX前药靶向胶束肿瘤细胞靶向实验结果图，包括激光共聚焦分析和流式细胞实验)，其中A：MTX+空白胶束；B：MTX前药胶束。C：流式细胞实验：a：MTX+空白胶束；b：MTX前药胶束，可以看出MTX前药胶束比MTX和空白载体胶束混合物的细胞荧光强度明显提高，通过计算得知前者的荧光强度是后者的10倍左右，所以具有明显的靶向性。
5、请参阅图7，其为MTX前药靶向胶束制剂对肿瘤细胞(Hela细胞)和正常细胞(MT-3C3E1细胞)的毒性试验，，其中A：24h，B：48h，C：72h，D：MTX前药胶束与裸药MTX分别在不同的时间内对肿瘤细胞与正常细胞的细胞毒性试验，可以看出MTX前药靶向胶束对肿瘤细胞的毒性明显高于裸药和空白胶束的混合物。具有浓度依赖性。短时间内对肿瘤细胞的毒性没有差别，但经过48小时后MTX前药靶向胶束的对肿瘤细胞的毒性明显大于裸药的混合制剂。同时可以看出MTX前药靶向胶束对正常细胞的毒性不明显。
4、请参阅图8，其为MTX前药靶向胶束制剂在荷瘤裸鼠静脉注射后的肿瘤靶向实验及结果图，其中荷瘤裸鼠活体荧光显示图(A)，(B)和(C)是脏器荧光强度显示及量化图，(D)肿瘤组织冷冻切片激光共聚集显示图，空白载体胶束(a)，MTX前药胶束(b)，显示：肿瘤部位的前药胶束的荧光强度比裸药和空白载体混合物的荧光强度明显增强，存在显著性差异；冷冻切片中前药胶束的荧光强度比裸药和空白载体混合物的荧光强度明显增强；总之，活体荧光实验到离体肿瘤组织的荧光强度和组织切片的荧光照片可以证明前药胶束具有明显的靶向性。
本发明利用柔性分子载体(DSPE-PEG-NH2)与MTX化学健合制备MTX前药，然后进一步制成胶束，该胶束为柔性粒子，粒径在100nm左右，适合作为静脉用靶向肿瘤制剂，其静脉注射具有靶向性强、长循环和低毒性的特点，更容易达到肿瘤组织发挥药效。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (9)
1.一种甲氨喋呤前药，其特征在于，其原料包括甲氨喋呤原料药和载体材料，所述载体材料为DSPE-PEG-NH2。
2.根据权利要求1所述的甲氨喋呤前药，其特征在于，所述DSPE-PEG-NH2中聚乙二醇的分子量为2000-5000道尔顿。
3.一种甲氨喋呤前药靶向胶束制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将DSPE-PEG-NH2溶于有机溶剂中，得溶液A；MTX溶于DMSO水溶液中，得到溶液B；在溶液B中加入TEA和交联剂，所述交联剂为DCC和NHS，将溶液A、B混合，在氮气保护下反应12h，得到溶液C；
2)将步骤1)所得溶液C依次置于磷酸盐缓冲液和去离子水中透析去除杂质，透析液冻干得到MTX-PEG-DSPE化合物冻干品；
3)将步骤2所得MTX-PEG-DSPE化合物冻干品用有机溶剂溶解，去除有机溶剂杂质后冻干，消毒得MTX前药靶向胶束制剂。
4.根据权利要求3所述的甲氨喋呤前药靶向胶束制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中DSPE-PEG-NH2中聚乙二醇的分子量为2000-5000道尔顿。
5.根据权利要求3所述的甲氨喋呤前药靶向胶束制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤3)具体为：
将步骤2所得MTX-PEG-DSPE化合物冻干品有机溶剂溶解，去离子水透析8h，透析液过滤浓缩后冻干，钴射线消毒得到MTX前药靶向胶束制剂。
6.根据权利要求3所述的甲氨喋呤前药靶向胶束制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤3)具体为：
将步骤2所得MTX-PEG-DSPE化合物冻干品有机溶剂溶解，加水超声乳化后过滤，滤液冻干，钴射线消毒得MTX前药靶向胶束制剂。
7.权利要求3所述的甲氨喋呤前药靶向胶束制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤1)和步骤3)中的有机溶剂为二甲基亚砜，二氯甲烷，丙酮或N，N-二甲基甲酰胺。
8.权利要求3所述的甲氨喋呤前药靶向胶束制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
所述步骤1)具体为：将200-600mg聚乙二醇分子量2000-5000道尔顿的DSPE-PEG-NH2溶于5-50mL DMF中得溶液A；将MTX原料药15-40mg，TEA20-50μL，DCC15-40mg和NHS6-30mg溶于DMSO中得到溶液B；将溶液A、B混合，在氮气保护下反应12h，得到溶液C；
所述步骤2)具体为：将C液转移到最小通透8000道尔顿的透析袋内，依次置于磷酸盐缓冲液和去离子水中透析去除杂质，所得透析液冻干得MTX-PEG-DSPE化合物冻干品；
所述步骤3)具体为：将步骤2所得MTX-PEG-DSPE化合物冻干品用有机溶剂溶解，通过超声乳化或透析法去除有机溶剂后冻干，消毒得到MTX前药靶向胶束制剂。
9.如权利要求3-8任一项所述的甲氨喋呤前药靶向胶束制剂的制备方法制备的甲氨喋呤前药靶向胶束制剂。
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