CN103911330B - 尖孢链霉菌及其在防治十字花科根肿病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种尖孢链霉菌链霉菌及其在防治十字花科根肿病中的应用，该尖孢链霉菌（Streptomyces cuspidosporus）WS-29246保藏号为CCTCC NO：M2012413。所述链霉菌经过发酵后产生具有强烈抑菌作用的发酵菌液，该发酵菌液可用于制备抗植物十字花科根肿病的生防悬浮剂和生防缓释胶囊剂，用于十字花科根肿病的生物防治。
Description
技术领域
本发明涉及生物农药技术领域，具体是指一种尖孢链霉菌及其在防治十字花科根肿病中的应用，其分案于申请号为2013100497448的中国发明专利“链霉菌及其在防治十字花科根肿病中的应用”。
背景技术
十字花科根肿病(plasmodiophoa brassicae Woron)是一种世界性土传病害，致病菌为芸苔根肿菌，属于一种专性寄生低等鞭毛菌(也有学者将其归入粘菌)，目前尚无法人工培养。主要危害十字花科蔬菜如：大白菜、甘蓝、萝卜等。其病菌以孢子囊在土壤或未腐熟的厩肥中越冬越夏，对不良环境抵抗力强，一般能存活十年以上。田间最初侵染源来自土壤和未腐熟的厩肥带菌。病菌又可随菜苗、泥土携带传播到无病区。病菌从菜苗的幼根或根毛侵入，并刺激根部细胞加速分裂，造成根部畸形肿大，导致植株输导组织受阻，地上部生长缓慢，叶片萎蔫，重者根部腐烂，植株死亡。近年，根肿病在湖北、云南、四川、贵州、浙江、福建等地高山十字花科蔬菜种植区发生严重，已成为制约我国高山大白菜、甘蓝、萝卜反季节生产的主要因素之一，其中尤以大白菜、甘蓝受害最重，严重地块甚至绝收，每亩损失3000元以上。
目前，防治十字花科根肿病常用方法主要包括撒石灰调节土壤pH、轮作、种植抗病品种等，但由于存在土壤板结、经济效益差、不耐储运等缺点，上述措施均未大面积推广。常规杀菌剂有多菌灵、福美双、代森锰锌等，但防效均不明显，防效表现较好的是日本石原株式会社的50％氟啶胺SC与10％氰霜唑SC组合，但由于抑制种子萌发及使用成本高昂(每亩近400元)等原因，也尚未得到大面积推广应用。关于十字花科根肿病生物农药在真菌、放线菌、芽孢杆菌等方面均有一定的研究报道，并且取得了一定的成绩，如日本研究者将大白菜播种在从麦田、油菜田、白菜地及草地采回的土壤中，从大白菜根中分离得到大量内生真菌，通过盆栽试验筛选获得2株内生真菌(Heteroconium chaetospira)H4007，M4006，病指分别为23，15，显著高于其他属种处理及空白对照，通过种子处理显示有促生作用；有研究者利用(Phoma glomerata)JCM 9972有效控制根肿病的发生；也有国外研究者通过温室和田间试验得到可抑制根肿病菌的3个木霉菌株(TC32，TC45和TC63)和1个链霉菌菌株(S99)；韩国研究人员从大白菜根部分离获得81株内生放线菌，通过大白菜根肿病盆栽试验，获得3株具有开发潜力的内生放线菌，其中2株(Microbisporarosea)和(subsp.rosea)防效分别为58％和33％，1株(Streptomycesolivochromogenes)防效达42％；我国四川农大研究人员从四川根际土中分离出1株灰红链霉菌(Streptomyces griseoruber)，其对大白菜根肿病盆栽实验防效达到73.69％；何月秋等研究人员从大白菜根际土壤中分离到1株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XF-1，其对根肿病的室内防效达85％，田间防效达68.6～84.8％；长江大学将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)与固氮类芽孢杆菌(Paenibacillus azotofixans)用于根肿病综合防治，防效达到85％。
链霉菌具有抗生作用，还具有可田间定殖等作为生物农药予以开发的优点。美国环境保护署美国环保局2012年公布了1项疮痂链霉菌(Streptomyces acidiscabies)RL-110用于除草的生物农药研究计划。全球已登记在册的链霉菌农药共有6种，登记国家和地区分别为韩国、欧盟、乌克兰、加拿大、美国，具体为(Streptomyces colombiensis)(韩国)、(Streptomyces kasugaensis)(韩国)、(Streptomycesgriseoviridis)K61(欧盟、加拿大、美国)、(Streptomyces albus)(乌克兰)、(Streptomyces avermitilis)(乌克兰)、(Streptomyces lydicus)WYEC 108(加拿大、美国)，防治对象主要为真菌病害包括叶部病害与土传性病害(其中S.avermitilis用于防治甲虫与叶螨)。但截至目前，尚无防治十字花科根肿病的链霉菌农药登记。
发明内容
本发明的目的之一是要提供一种具有防治十字花科根肿病用途的链霉菌，该链霉菌包括疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei)WS-24926CCTCC NO：M 2012393和/或尖孢链霉菌(Streptomycescuspidosporus)WS-29246CCTCC NO：M 2012413。本发明所提供的疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei)WS-24926已于2012年10月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)；保藏登记号为CCTCC M 2012393；尖孢链霉菌(Streptomyces cuspidosporus)WS-29246已于2012年10月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)；保藏登记号为CCTCC M 2012413。
所述疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei)WS-24926是从湖南浏阳远郊植物根际土壤中分离得到的。
综合疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei)WS-24926的形态学特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析的结果，将其鉴定为疮痂链霉菌。具体鉴定结果如下：
(1)菌体的形态特征
疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei)WS-24926菌株在ISP-2固体培养基上，菌落干燥、表面不光滑，有突起，浅灰色；孢子多，链状，短棍状，大小(长1.5μm-2μm，宽0.6μm-0.8μm)，灰色，气丝乳白色或灰色，有螺旋孢子丝产生；色素不明显；在察氏固体培养基上无色素产生，气丝及孢子堆白色，基丝无色。在天门冬素固体培养基上培养基丝黄色，气丝及孢子堆灰白色，无色素产生。
(2)生理生化特性
不产生黑色素，能利用糊精、吐温40、L－阿拉伯糖、D-木糖、琥珀酸单甲酯、丙酮酸、丙三醇、D-核糖、D-L-α-磷酸甘油。不能利用：吐温80、α-环糊精、糖原、甘露聚糖、D-阿拉伯糖、D-果糖、D-纤维二糖、D-半乳糖、D-半乳糖醛酸、D-甘露醇、α-D-葡萄糖、D-葡萄糖酸、麦芽糖、乳果糖、D-甘露糖、L-丙氨酸、D-丙氨酸、琥珀酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-丙氨酸胺、L-谷氨酸、腺苷、肌苷、胸苷、L-鼠李糖、尿苷、蔗糖、水杨苷、6-磷酸-D-果糖、6-磷酸-D-葡萄糖。
(3)16SrDNA序列分析
疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei)WS-24926菌株经PCR技术，DNA测序仪分析，该菌株的16SrDNA序列由1391个碱基组成。用BLAST程序对疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei)WS-24926的16SrDNA序列和GenBank中已登录的16SrDNA序列进行核苷酸同源性比较，结果与已报道的疮痂链霉菌(S.scabiei)ATCC 49173(T)(登录号AB026199)的16SrDNA序列同源性达到100％，鉴定其为疮痂链霉菌。
所述尖孢链霉菌(Streptomyces cuspidosporus)WS-29246是从湖南浏阳远郊植物根际土壤中分离得到的。
综合尖孢链霉菌(Streptomyces cuspidosporus)WS-29246的形态学特征、生理生化特性和16SrDNA序列分析的结果，将其鉴定为尖孢链霉菌。具体鉴定结果如下：
(1)菌体的形态特征
尖孢链霉菌(Streptomyces cuspidosporus)WS-29246在ISP-2固体培养基上，菌落干燥、表面不光滑，有突起，有褶皱，乳白色或微黄色，有螺旋状孢子丝，2-5圈不等；基丝黄褐色，无分隔，不断裂，呈波浪型，多分枝，直径0.4μm-0.6μm。在察氏固体培养基上无色素产生，菌落表面光滑，不产孢。在PDA培养基上产生柠檬黄色素。
(2)生理生化特性
不产生黑色素，利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-果糖、蔗糖、鼠李糖、棉子糖、肌醇、D-甘露醇以及D-半乳糖、乳糖、甘露糖、蜜二糖、海藻糖、D-麦芽糖、柠檬酸钠、琥珀酸钠。
(3)16SrDNA序列分析
尖孢链霉菌(Streptomyces cuspidosporus)WS-29246经PCR技术，DNA测序仪分析，获得该菌株的16S rDNA序列，然后用BLAST程序对尖孢链霉菌(Streptomyces cuspidosporus)WS-29246的16SrDNA序列和GenBank中已登录的16S rDNA序列进行核苷酸同源性比较，结果与已报道的尖孢链霉菌(Streptomyces cuspidosporus)的16S rDNA序列同源性达到100％，鉴定其为尖孢链霉菌(Streptomycescuspidosporus)。
所述疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei)WS-24926和所述尖孢链霉菌(Streptomyces cuspidosporus)WS-29246采用液体发酵培养，其使用的培养基如下：
(1)斜面培养基：培养基配方如下：称取麦芽提取物：1.0～2.0g/L，可溶性淀粉：0～5g/L，酵母提取物：0.4～1.0g/L，葡萄糖：0～2.0g/L，蔗糖：0～2.0g/L，琼脂：1.5～2.0g/L，pH值7.0～8.0，定容至1000mL。
(2)种子培养基：甘露醇：10～20g/L，大豆蛋白胨：5～20g/L，鱼粉：0～5.0g/L，豆油：0.5～5.0g/L，K2HPO4：0.15～0.5g/L，CaCO3：0.1～0.4g/L，pH值7.0～8.0，定容至1000mL。
(3)发酵培养基：葡萄糖：2～8g/L，葡萄糖：2～8g/L，可溶性淀粉：5～10g/L，大豆粉：0～10g/L，棉子粉：0～25g/L，酵母提取物：1～3g/L，CaCO3：2～5g/L，NaCl：2～5g/L，pH值7.0～8.0，定容至1000mL。
培养流程：
(1)将所述疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei)WS-24926和所述尖孢链霉菌(Streptomyces cuspidosporus)WS-29246菌种分别接种试管斜面培养基上，在温度28±1℃条件下，活化培养5d；
(2)将活化的菌种接种至种子培养基中，在温度28±1℃的摇床内培养3～4d；
(3)将步骤2)中培养的菌种接种到发酵培养基中，在温度28±1℃的条件下发酵培养3～4d。
本发明提供了所述链霉菌在防治十字花科根肿病中的应用。
本发明还提供了所述链霉菌制备而成的防治十字花科根肿病的生防悬浮剂及其制备方法。所述生防悬浮剂按重量百分比由10～80％的发酵菌液、0.4～10％的分散剂、0.5～5％的乳化剂、0.4～10％的增稠剂、0.4～10％的防腐剂、0～3.0％的消泡剂、0～10.0％的防冻剂和余量的水组成，其中，所述发酵菌液是由所述链霉菌发酵得到的菌液。
进一步地，所述分散剂选用木质素磺酸钠、木质素磺酸钙、萘磺酸钠甲醛缩合物NNO、脂肪酰胺-N-甲基牛磺酸盐、烷基磺基琥珀酸钠盐、二丁基萘磺酸钠、十二烷基硫酸钠、多芳基酚聚氧乙烯醚和乙二胺四乙酸盐中的任选一种或者几种；所述乳化剂为烷基苯磺酸盐、烷基醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚、苯乙基酚聚氧乙烯醚、山梨酸酯和多元醇脂肪酸酯中任选一种或者几种；所述增稠剂选用黄原胶、明胶、阿拉伯胶、瓜胶、海藻酸钠、可溶性淀粉、杂多糖、羧甲基纤维素钠、羧乙基纤维素钠、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、聚丙烯酸胺、尿素、硅酸镁铝、二氧化硅、硅藻土、膨润土和凹凸棒任选一种或者几种；所述防腐剂选用苯甲酸钠、山梨酸钾和对羟基苯甲酸乙酯任选一种或者几种；所述防冻剂为乙二醇、丙二醇、丙三醇、二甘醇、三甘醇和聚乙二醇中的任选一种或者几种；所述的消泡剂为异辛醇、异戊醇、硬脂酸、月桂酸、聚乙二醇醚和有机硅中任选一种或者几种。
所述生防悬浮剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将所述链霉菌发酵得到的发酵液，在4000～10000r/min条件下离心5～20min，得到发酵菌液；
2)按照所述重量百分比将所述发酵菌液、分散剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、消泡剂、防冻剂和余量的水混合均匀，得到混合物料；
3)将混合物料剪切分散均匀后，研磨至物料粒度达到5μm以下，搅拌均匀，调节pH至4.0～5.0，即得到生防悬浮剂。
实验表明：本发明的生防悬浮剂对十字花科根肿病田间试验防治效果达55～68％，高于氟啶胺与氰霜唑等对照药剂。
本发明的生防悬浮剂使用方法为：移栽前进行土壤处理，按亩用所述悬浮剂1000～2000mL的使用量将所述悬浮剂稀释50～100倍喷雾使用。移栽时灌根处理土壤：按每株灌根所述悬浮剂50～100mL的使用量加水，将悬浮剂稀释50～100倍，亩用所述悬浮剂剂量为3000mL。
本发明还提供了一种所述链霉菌制备而成的防治十字花科根肿病的生防缓释胶囊剂及其制备方法。所述生防缓释胶囊剂包括1～3份重量的发酵菌液、1～3份重量的阿拉伯胶或者海藻胶、1～3份重量的明胶或者羧甲基纤维素钠，其中，所述发酵菌液是由所述链霉菌发酵得到的菌液。
所述生防缓释胶囊剂的制备方法：包括以下步骤：
1)先将所述链霉菌发酵得到的发酵液，在4000～10000r/min条件下离心5～20min，得到发酵菌液，取1～3份重量的发酵菌液加入反应容器；
2)其次，取1～3份重量的明胶或者羧甲基纤维素钠加水配置成重量百分比为3～8％的水溶液后，加入反应容器，并用醋酸溶液调节反应物的pH值至3～5；
3)再次，取1～3份重量的阿拉伯胶或者海藻胶加水配制成重量百分比为2～8％的水溶液后，加入然应容器，继续搅拌10～30min；
4)然后，向反应容器中中加入甲醛水溶液固化囊壁，继续搅拌10～30min，即得微胶囊水溶液；
5)最后，将得到微胶囊水溶液离心处理后喷雾干燥后即可获得生防缓释胶囊剂。
实验证明：本发明的生防缓释胶囊剂，对大白菜根肿病田间防效为75～80％，田间使用技术为大白菜或者甘蓝移栽时每穴撒施2g生防缓释胶囊剂。
附图说明
图1为疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei)WS-24926在ISP-2固体培养基上菌落形态。
图2为尖孢链霉菌(Streptomyces cuspidosporus)WS-29246在ISP-2上的菌落形态。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例和说明书附图对本发明的链霉菌及其在防治十字花科根肿病中的应用作进一步详细说明。
实施例1疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei)WS-24926及尖孢链霉菌(Streptomyces cuspidosporus)WS-29246菌株的分离、筛选
取土样，采用常规法进行分离、纯化和保存。我们从土壤中共分离出30000株放线菌，采用先导化合物活性追踪的办法，结合HPLC-MS天然产物化合物数据库，选择相对低毒、易培养具有产业化趋势的109株放线菌，通过大白菜根肿病盆栽试验及田间试验，实验结果见表1。最终确定WS-24926及WS-29246最优，其病情指数最小，校正防效分别为95％和79％。
盆栽试验实施步骤：将各供试菌株菌种活化后，采用二级摇瓶发酵法，初级摇瓶发酵采用种子培养基，培养温度为28℃，150rpm，二级发酵采用发酵培养基，接种量为5～10％，培养条件28℃，转速150rpm，培养时间4～6d，装液量每500mL三角瓶中装入培养液100mL。每菌株培养5瓶，每瓶装100mL发酵培养基。
采用穴盘培养大白菜健康苗，长至2～3片真叶期供实验用。
盆栽试验采用菌土法接种，将收集的大白菜根肿切碎与盆栽土按1：100(v/v)混合均匀，装入花钵(ф上＝15cm，ф下＝10cm，h＝13cm)中供实验用。移栽时，灌入各菌株摇瓶发酵液，每钵100mL，之后每隔10d灌根1次，每次100mL，整个生长期共灌根4次。结果显示WS-24926及WS-29246对大白菜根肿病的防治效果最好，校正防效分别为95％和79％。
根肿病分级标准:
0级：没有附着根肿；
1级：根肿附着在侧根上，数量占1～25％；
2级：主根上有根肿附着，侧根上根肿数量占25％以上；
3级：根肿数量占50～75％；主根上有根肿附着；
4级：主根上有根肿附着，根肿数量占75％以上的根系。
计算公式：
表1 109株放线菌对十字花科根肿病的盆栽试验结果
注：菌株编号前已省“WS-”。
实施例2疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei)WS-24926及尖孢链霉菌(Streptomyces cuspidosporus)WS-29246菌种鉴定
筛选到的菌株经过形态学观察，生理生化实验以及分子生物学鉴定，最终确定WS-24926为链霉菌属疮痂链霉菌，WS-29246为链霉菌属尖孢链霉菌。
本发明疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei)WS-24926及尖孢链霉菌(Streptomyces cuspidosporus)WS-29246菌株在ISP-2平板上菌落形态分别见附图1、图2。
16S rDNA序列分析：提取疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei)WS-24926及尖孢链霉菌(Streptomyces cuspidosporus)WS-29246基因组DNA，在50μL体系中进行PCR扩增。采用引物：
PrimerA：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；
PrimerB：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。
反应条件：94℃预变性5min，94℃1min，55.5℃1min，72℃3min，35个循环，72℃延伸10min。16SrDNA测序结果在GenBank中利用BLAST软件进行同源性检索及序列比对分析。WS-29246菌株16SrRNA基因序列GenBank登录号为JQ712974。
通过盆栽试验和多次田间试验，获得疮痂链霉菌(Streptomycesscabie)i WS-24926和尖孢链霉菌(Streptomyces cuspidosporus)WS-29246。将疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei)WS-24926和尖孢链霉菌(Streptomyces cuspidosporus)WS-29246，分别在4000～10000r/min条件下离心5～20min，分别得到疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei)WS-24926的发酵菌液、尖孢链霉菌(Streptomyces cuspidosporus)WS-29246的发酵菌液；将两种发酵菌液混合得到疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei)WS-24926和尖孢链霉菌(Streptomyces cuspidosporus)WS-29246的发酵菌液。将三种发酵菌液分别取样备用。
实施例3
取4kg黄原胶加入112kg的水中快速剪切调匀，之后加入800kg所述备用的发酵菌液(将所述三种备用的发酵菌液各取一次，本实施例即可制备得到三种链霉菌生防悬浮剂)、4kg木质素磺酸钠、20kg烷基苯磺酸盐、30kg山梨酸酯、20kg山梨酸钾、10kg丙二醇，得到混合物料，搅拌分散均匀，通过卧式砂磨机一级和二级研磨后，经粒度检测，90％以上的物料细度达到5μm以下，停止研磨并搅拌均匀，包装为成品，即得到生防悬浮剂。
针对高山反季节大白菜根肿病，采用灌根法，在移栽时灌根100mL，后每隔10d灌根1次，整个生长期灌根3次。本实施例的三种链霉菌生防悬浮剂与跨国农药公司日本石原株式会社化学农药50％氟啶胺SC与10％氰霜唑SC组合防治高山大白菜根肿病田间试验结果表明，本发明的链霉菌生防悬浮剂病情指数低于对照药剂。详细防治效果见表2所示。
表2 不同微生物菌株发酵液防治大白菜根肿病病情指数及防治效果
注：表2中“50％氟啶胺SC+50％氰霜唑SC”处理采用氟啶胺150克/亩(50％氟啶胺SC300mL)均匀喷雾土壤，生长期灌根2次氰霜唑(10％氰霜唑SC稀释1500倍液)。同列数据中标记了不同字母的平均数具有显著性差异(P<0.05，MDRT法)。
实施例4
取15kg黄原胶、25kg明胶、30kg阿拉伯胶、20kg瓜胶和10kg尿素加入611kg的水中快速剪切调匀，之后加入100kg备用的疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei)WS-24926发酵菌液、15kg二丁基萘磺酸钠、20kg十二烷基硫酸钠、25kg多芳基酚聚氧乙烯醚、25kg烷基醇聚氧乙烯醚、4kg对羟基苯甲酸乙酯、30kg丙三醇、20kg二甘醇、40kg三甘醇和10kg聚乙二醇，得到混合物料，搅拌分散均匀，通过卧式砂磨机一级和二级研磨后，经粒度检测，90％以上的物料细度达到5μm以下，停止研磨并搅拌均匀，包装为成品，即得到生防悬浮剂。
在湖北省利川高山甘蓝种植区，选择根肿病发生相对严重的地块，将所得悬浮剂稀释100倍，采用健康苗，在甘蓝移栽时每株灌根50～100mL，每亩地使用量为3kg，对甘蓝根肿病的防治效果达到66.67％，株重0.89kg。
实施例5
取25kg二氧化硅和25kg硅藻土加入265kg水中快速剪切调匀，之后加入500kg尖孢链霉菌(Streptomyces cuspidosporus)WS-29246的发酵菌液、50kg木质素磺酸钠、40kg木质素磺酸钙、10kg萘磺酸钠甲醛缩合物、5kg山梨酸酯、20kg苯甲酸钠、10kg山梨酸钾、12kg异辛醇、18kg异戊醇、50kg乙二醇、10kg丙二醇、20kg丙三醇和20kg二甘醇，得到混合物料，搅拌分散均匀，通过卧式砂磨机一级和二级研磨后，经粒度检测，90％以上的物料细度达到5μm以下，停止研磨并搅拌均匀，包装为成品，即得到生防悬浮剂。
在湖北省农业科学院武汉试验田，将根肿按1︰100(v/v)与盆栽土混匀后装钵备用，将疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei)WS-24926悬浮剂稀释50～100倍，在红菜薹移栽时每株灌根50～100mL，10d后再灌根1次，60d后调查防效，链霉菌对红菜薹根肿病的盆栽试验防治效果达到90％，对植株无药害。
实施例6
取10kg黄原胶加入300kg的水快速剪切调匀，之后加入395kg备用的疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei)WS-24926和尖孢链霉菌(Streptomyces cuspidosporus)WS-29246的发酵菌液混合液、30kg多芳基酚聚氧乙烯醚、50kg乙二胺四乙酸盐、15kg烷基酚聚氧乙烯醚、25kg苯乙基酚聚氧乙烯醚、100kg苯甲酸钠、20kg硬脂酸、55kg尿素，得到混合物料，搅拌分散均匀，通过卧式砂磨机一级和二级研磨后，经粒度检测，90％以上的物料细度达到5μm以下，停止研磨并搅拌均匀，包装为成品，即得到生防悬浮剂。
在湖北省利川高山甘蓝种植区，将所得生防悬浮剂稀释200倍每亩均匀喷雾土壤5桶水(每桶15～20kg水)，亩用悬浮剂1000mL。移栽健康苗，在甘蓝移栽打孔起穴时再次喷雾2～3桶水，每亩地使用量为500mL，对甘蓝根肿病的防效大于77.14％，株重1.09kg。
实施例7
取34kg可溶性淀粉和52kg杂多糖加入246kg水中快速剪切调匀，之后加入435kg备用的疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei)WS-24926发酵菌液、48kg多芳基酚聚氧乙烯醚、36kg烷基酚聚氧乙烯醚、75kg木质素磺酸钠、5kg聚乙二醇醚、69kg聚乙二醇，得到混合物料，搅拌分散均匀，通过卧式砂磨机一级和二级研磨后，经粒度检测，90％以上的物料细度达到5μm以下，停止研磨并搅拌均匀，包装为成品，即得到生防悬浮剂。
在湖北省农业科学院武汉试验田，将根肿按1︰100(v/v)与盆栽土混匀后装钵备用，将本实施例链霉菌悬浮剂稀释90倍，在红菜薹移栽时每株灌根60～100mL，10d后再灌根1次，60d后调查防效，链霉菌对红菜薹根肿病的盆栽试验防治效果达到92％，对植株无药害。
实施例8
取25kg聚丙烯酸胺加入和144kg水中快速剪切调匀，之后加入680kg尖孢链霉菌(Streptomyces cuspidosporus)WS-29246的发酵菌液、20kg十二烷基硫酸钠、30kg烷基酚聚氧乙烯醚、50kg山梨酸钾、15kg有机硅、36kg三甘醇，得到混合物料，搅拌分散均匀，通过卧式砂磨机一级和二级研磨后，经粒度检测，90％以上的物料细度达到5μm以下，停止研磨并搅拌均匀，包装为成品，即得到生防悬浮剂。
在湖北省利川高山甘蓝种植区，将所得生防悬浮剂稀释150倍每亩均匀喷雾土壤5桶水(每桶15～20kg水)，亩用悬浮剂1000mL。移栽健康苗，在甘蓝移栽打孔起穴时再次喷雾2～3桶水，每亩地使用量为500mL，对甘蓝根肿病的防效大于75.22％，株重1.13kg。
实施例9
取23kg聚乙烯醇和43kg聚丙烯酸钠加入414kg的水中快速剪切调匀，之后加入336kg疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei)WS-24926和尖孢链霉菌(Streptomyces cuspidosporus)WS-29246的发酵菌液混合液、11kg多芳基酚聚氧乙烯醚、66kg烷基磺基琥珀酸钠盐、22kg乙基酚聚氧乙烯醚、48kg对羟基苯甲酸乙酯、12kg硬脂酸、25kg丙二醇，得到混合物料，搅拌分散均匀，通过卧式砂磨机一级和二级研磨后，经粒度检测，90％以上的物料细度达到5μm以下，停止研磨并搅拌均匀，包装为成品，即得到生防悬浮剂。
在湖北省农业科学院武汉试验田，将根肿按1︰100(v/v)与盆栽土混匀后装钵备用，将本实施例的悬浮剂稀释150倍，在红菜薹移栽时每株灌根60～100mL，10d后再灌根1次，60d后调查防效，链霉菌对红菜薹根肿病的盆栽试验防治效果达到89.3％，对植株无药害。
实施例10
取33kg聚乙烯醇加入382kg的水中快速剪切调匀，之后加入442kg备用的疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei)WS-24926发酵菌液、43kg木质素磺酸钠、15kg山梨酸酯、42kg苯甲酸钠、28kg异辛醇、15kg二甘醇，得到混合物料，搅拌分散均匀，通过卧式砂磨机一级和二级研磨后，经粒度检测，90％以上的物料细度达到5μm以下，停止研磨并搅拌均匀，包装为成品，即得到生防悬浮剂。
在湖北省农业科学院武汉试验田，将根肿按1︰100(v/v)与盆栽土混匀后装钵备用，将本实施例链霉菌悬浮剂稀释120倍，在红菜薹移栽时每株灌根90～120mL，15d后再灌根1次，60d后调查防效，链霉菌对红菜薹根肿病的盆栽试验防治效果达到91.08％，对植株无药害。
实施例11
取86kg黄原胶加入449kg水中快速剪切调匀，之后加入230kg尖孢链霉菌(Streptomyces cuspidosporus)WS-29246的发酵菌液、95kg木质素磺酸钠、45kg烷基醇聚氧乙烯醚、60kg山梨酸钾、20kg消泡剂月桂酸、15kg乙二醇，得到混合物料，搅拌分散均匀，通过卧式砂磨机一级和二级研磨后，经粒度检测，90％以上的物料细度达到5μm以下，停止研磨并搅拌均匀，包装为成品，即得到生防悬浮剂。
在湖北省利川高山甘蓝种植区，将所得生防悬浮剂稀释120倍每亩均匀喷雾土壤5桶水(每桶15～20kg水)，亩用悬浮剂980mL。移栽健康苗，在甘蓝移栽打孔起穴时再次喷雾2～3桶水，每亩地使用量为600mL，对甘蓝根肿病的防效大于76.09％，株重0.98kg。
实施例12
取20kg聚丙烯酸胺加入177kg水中快速剪切调匀，之后加入723kg疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei)WS-24926和尖孢链霉菌(Streptomyces cuspidosporus)WS-29246的发酵菌液混合液、12kg木质素磺酸钠、15kg多元醇脂肪酸酯、35kg山梨酸钾、12kg聚乙二醇醚、6kg二甘醇，得到混合物料，搅拌分散均匀，通过卧式砂磨机一级和二级研磨后，经粒度检测，90％以上的物料细度达到5μm以下，停止研磨并搅拌均匀，包装为成品，即得到生防悬浮剂。
在湖北省利川高山甘蓝种植区，将所得生防悬浮剂稀释120倍每亩均匀喷雾土壤6桶水(每桶15～20kg水)，亩用悬浮剂1100mL。移栽健康苗，在甘蓝移栽打孔起穴时再次喷雾2～3桶水，每亩地使用量为600mL，对甘蓝根肿病的防效大于78.02％，株重1.03kg。
实施例13
取1kg备用的疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei)WS-24926发酵菌液采用砂磨机研磨1h加入至反应釜中，取3kg明胶加入至100kg水中溶解后加入至上述反应釜中，控温45℃，转速为400r/min旋转60min，加入10％醋酸将体系pH调至4～5。继续搅拌15min，加入60kg 5％阿拉伯胶水溶液，调节转速至300r/min，搅拌30min。加入1.8kg甲醛，搅拌反应10min，得到缓释微胶囊水溶液，再离心后采用水清洗1～2次，再离心得浓缩液，喷雾干燥后过筛整形后，即得到缓释胶囊剂。
在长阳高山反季节大白菜种植区(每年5～10月份)，在大白菜移栽打孔时，每穴撒施缓释颗粒剂2g，共处理0.5亩地，在商品菜成熟期调查根肿病发病情况，经统计计算，其对大白菜根肿病防治效果为69.4％。
实施例14
取3kg份重量的海藻胶，加97kg的水中溶解。取2kg尖孢链霉菌(Streptomyces cuspidosporus)WS-29246的发酵菌液、采用砂磨机研磨1h加入至反应釜中。取3kg明胶加入至100kg水中溶解后加入至上述反应釜中，控温45℃，转速为300r/min旋转60min，加入10％醋酸将体系pH调至4～5。继续搅拌15min，加入100kg海藻胶水溶液，调节转速至300r/min，搅拌30min。加入1.8kg甲醛，搅拌反应10min，得到缓释微胶囊水溶液，再离心后采用水清洗0～3次，再离心得浓缩液，喷雾干燥后过筛整形后，即得到缓释胶囊剂。
在长阳高山反季节大白菜种植区(每年5～10月份)，在大白菜移栽打孔时，每穴撒施缓释颗粒剂2g，共处理0.5亩地，在商品菜成熟期调查根肿病发病情况，经统计计算，其对大白菜根肿病防治效果为74.5％。
实施例15
取1kg份重量的海藻胶，加79kg的水中溶解，取3kg疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei)WS-24926和尖孢链霉菌(Streptomycescuspidosporus)WS-29246的发酵菌液混合液、采用砂磨机研磨1h加入至反应釜中。取3kg羧甲基纤维素钠加入至100kg水中溶解后加入至上述反应釜中，控温45℃，转速为400r/min旋转10min，加入10％醋酸将体系pH调至4～5。继续搅拌15min，加入80kg阿拉伯胶水溶液，调节转速至300r/min，搅拌30min。加入1.8kg甲醛，搅拌反应10min，得到缓释微胶囊水溶液，再离心后采用水清洗1～2次，再离心得浓缩液，喷雾干燥后过筛整形后得缓释胶囊剂。
在长阳高山反季节大白菜种植区(每年5～10月份)，在大白菜移栽打孔时，每穴撒施缓释颗粒剂2g，共处理0.5亩地，在商品菜成熟期调查根肿病发病情况，经统计计算，其对大白菜根肿病防治效果为71.6％。
实施例16
取2kg的阿拉伯胶，加78kg的水中溶解，取2kg疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei)WS-24926和尖孢链霉菌(Streptomycescuspidosporus)WS-29246的发酵菌液混合液、采用砂磨机研磨1h加入至反应釜中。取3～5kg明胶加入至100kg水中溶解后加入至上述反应釜中，控温45℃，转速为200r/min旋转60min，加入10％醋酸将体系pH调至4～5。继续搅拌15min，加入80kg的阿拉伯胶水溶液，调节转速至300r/min，搅拌30min。加入1.8kg甲醛，搅拌反应10min，得到缓释微胶囊水溶液，再离心后采用水清洗1～2次，再离心得浓缩液，喷雾干燥后过筛整形后，即得到缓释胶囊剂。
在长阳高山反季节大白菜种植区(每年5～10月份)，在大白菜移栽打孔时，每穴撒施缓释颗粒剂2g，共处理0.5亩地，在商品菜成熟期调查根肿病发病情况，经统计计算，其对大白菜根肿病防治效果为78.2％。
Claims (7)
1.一种尖孢链霉菌(Streptomyces cuspidosporus)WS-29246，其保藏号为CCTCC NO：M 2012413。
2.一种权利要求1所述尖孢链霉菌在防治十字花科根肿病中的应用。
3.一种利用权利要求1所述尖孢链霉菌制备而成的防治十字花科根肿病的生防悬浮剂，其特征在于：所述生防悬浮剂按重量百分比由10～80％的发酵菌液、0.4～10％的分散剂、0.5～5％的乳化剂、0.4～10％的增稠剂、0.4～10％的防腐剂、0～3.0％的消泡剂、0～10.0％的防冻剂和余量的水组成，其中，所述发酵菌液是由所述尖孢链霉菌发酵得到的菌液。
4.一种利用权利要求1所述尖孢链霉菌制备而成的防治十字花科植物根肿病的生防缓释胶囊剂，其特征在于：所述生防缓释胶囊剂包括1～3份重量的发酵菌液、1～3份重量的阿拉伯胶或者海藻胶、1～3份重量的明胶或者羧甲基纤维素钠，其中，所述发酵菌液是由所述尖孢链霉菌发酵得到的菌液。
5.根据权利要求3所述的生防悬浮剂，其特征在于：所述分散剂为木质素磺酸钠、木质素磺酸钙、萘磺酸钠甲醛缩合物、脂肪酰胺-N-甲基牛磺酸盐、烷基磺基琥珀酸钠盐、二丁基萘磺酸钠、十二烷基硫酸钠、多芳基酚聚氧乙烯醚和乙二胺四乙酸盐中的任选一种或者几种；所述乳化剂为烷基苯磺酸盐、烷基醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚、苯乙基酚聚氧乙烯醚、山梨酸酯和多元醇脂肪酸酯中任选一种或者几种；所述增稠剂为黄原胶、明胶、阿拉伯胶、瓜胶、海藻酸钠、可溶性淀粉、杂多糖、羧甲基纤维素钠、羧乙基纤维素钠、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、聚丙烯酸胺、尿素、硅酸镁铝、二氧化硅、硅藻土、膨润土和凹凸棒任选一种或者几种；所述防腐剂为苯甲酸钠、山梨酸钾和对羟基苯甲酸乙酯任选一种或者几种；所述的消泡剂为异辛醇、异戊醇、硬脂酸、月桂酸、聚乙二醇醚和有机硅中任选一种或者几种；所述防冻剂为乙二醇、丙二醇、丙三醇、二甘醇、三甘醇和聚乙二醇中的任选一种或者几种。
6.一种权利要求3所述生防悬浮剂的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：
1)将所述尖孢链霉菌发酵得到的发酵液，在4000～10000r/min条件下离心5～20min，得到发酵菌液；
2)按照所述重量百分比将所述发酵菌液、分散剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、消泡剂、防冻剂和余量的水混合均匀，得到混合物料；
3)将混合物料剪切分散均匀后，研磨至物料粒度达到5μm以下，搅拌均匀，调节pH至4.0～5.0，即得到生防悬浮剂。
7.一种权利要求4所述生防缓释胶囊剂的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：
1)先将所述尖孢链霉菌发酵得到的发酵液，在4000～10000r/min条件下离心5～20min，得到发酵菌液，取1～3份重量的发酵菌液加入反应容器；
2)其次，取1～3份重量的明胶或者羧甲基纤维素钠加水配置成重量百分比为3～8％的水溶液后，加入反应容器，并用醋酸溶液调节反应物的pH值至3～5；
3)再次，取1～3份重量的阿拉伯胶或者海藻胶加水配制成重量百分比为2～8％的水溶液后，加入反应容器，继续搅拌10～30min；
4)然后，向反应容器中加入甲醛水溶液固化囊壁，继续搅拌10～30min，即得微胶囊水溶液；
5)最后，将得到微胶囊水溶液离心处理后喷雾干燥处理，即可获得生防缓释胶囊剂。
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