CN103910784A - 一种醋酸格拉默的简便制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种醋酸格拉默的制备方法。本发明用叔丁氧羰基保护L‐赖氨酸的伊普西龙氨基，用苄酯或者取代苄酯保护L‐谷氨酸的伽马羧基，用苄基或者取代苄基保护L‐酪氨酸的酚羟基，然后将三种保护后的氨基酸以及L‐丙氨酸做成氮羧酸酸酐；在引发剂的诱导下发生聚合反应生成未脱保护的混合多肽，然后利用酸解的方法将三种氨基酸的保护基一步脱去，再利用透析的方法除去小分子杂质得到醋酸格拉默的纯品。本发明的方法能够提高收率和产品质量，降低成本，操作简便，适合工业生产。

Description

一种醋酸格拉默的简便制备方法

技术领域

本发明涉及一种抗多发性硬化药物的制备方法，特别涉及醋酸格拉默的制备方法，属于化学技术领域。

背景技术

醋酸格拉默是一种临床上用于治疗多化性硬化的药物，其结构如下：(Glu,Ala,Lys,Tyr)_X·XCH₃COOH或(C₅H₉NO₄·C₃H₇NO₂·C₆H₁₄N₂O₂·C₉H₁₁NO₃)_X·XC₂H₄O₂，商品名为克帕松，是一种由以色列梯瓦制药公司研制的用于治疗多发性硬化的免疫调节药物。本药物1996年获得美国FDA批准用于治疗多发性硬化症。目前该药物已经在包括美国、以色列、加拿大、欧盟在内的世界上40多个国家批准上市。制备醋酸格拉默的方法在WO00/05250和美国专利3,849,550中有描述。

醋酸格拉默是一种由L-丙氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-酪氨酸四种氨基酸组成的多肽醋酸盐的混合物，四种氨基酸占总氨基酸的摩尔比分别为L-谷氨酸0.129-0.153；L-丙氨酸0.392-0.462；L-酪氨酸0.086-0.100；L-赖氨酸0.300-0.374。该混合多肽醋酸盐的平均分子量为4700到11000道尔顿。

目前已有文献报道的醋酸格拉默的合成工艺主要存在两个问题：一是脱保护的过程比较复杂或者成本较高；二是没有将L-酪氨酸中的酚羟基进行保护，从而增加副产物杂质的可能。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明目的在于提供一种能够提高收率和产品质量，降低成本，操作简便，适合工业化生产的醋酸格拉默的简便制备方法。

本发明技术方案如下：

一种醋酸格拉默的制备方法，包括下列步骤：

（1）将保护后的L-谷氨酸（式Ⅰ）、L-赖氨酸（式Ⅱ）、L-酪氨酸（式Ⅲ）以及未经保护的L-丙氨酸做成氮羧酸酸酐，在溶剂中、引发剂存在下进行聚合反应，得到未脱保护基的混合多肽；

式Ⅰ化合物为

其中R为H或者Cl，Br，NO₂，CH₃O；

式Ⅱ化合物为

式Ⅲ化合物为

其中R为H或者Cl，Br，NO₂，CH₃O；

所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、CH₂Cl₂、二氧六环之一或组合；

所述引发剂为二乙胺、三乙胺、二异丙胺之一或组合；

（2）将步骤（1）得到的未脱保护基的混合多肽在酸性条件下酸解脱去保护基,得到醋酸格拉默粗品；

（3）将步骤（2）得到的醋酸格拉默粗品通过透析的方法除去小分子杂质得到醋酸格拉默的纯品。

根据本发明优选的，

步骤（1）中L-谷氨酸的保护基为苄基；L-赖氨酸的保护基为叔丁氧羰基；L-酪氨酸的保护基为苄基。

步骤（1）中将保护后的L-谷氨酸（式Ⅰ）、L-赖氨酸（式Ⅱ）、L-酪氨酸（式Ⅲ）以及未经保护的L-丙氨酸做成氮羧酸酸酐的条件为加入0.5倍摩尔量的三光气并在四氢呋喃中70℃回流至固体全部溶解。

步骤（1）中保护后的L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-酪氨酸以及未经保护的L-丙氨酸的氮羧酸酸酐的加入量占四种氮羧酸酸酐总量的摩尔比例分别为：L-丙氨酸44%，L-赖氨酸32.6%，L-谷氨酸14%，L-酪氨酸9.4%。

步骤（1）中聚合反应在0-80℃的条件下进行，聚合反应的反应时间为5-50小时；优选反应温度为25℃，反应时间为24小时。

步骤（1）中聚合反应的溶剂的用量为：每克原料加入10-30毫升溶剂，优选10毫升。

步骤（1）中聚合反应的引发剂用量为四种氮羧酸酸酐总摩尔量的0.1%-3%，优选1%。

步骤（2）中所述的酸解所用的酸为三氟乙酸、溴化氢水溶液、溴化氢的冰醋酸溶液或者浓盐酸与冰醋酸的混合溶液中的一种，所用酸的加量为每克底物10-30毫升酸，优选每克底物20毫升酸。

步骤（2）中所述的脱去保护基酸解过程反应时间为1-10小时，优选10小时。

步骤（3）中所述的透析的方法是醋酸格拉默粗品通过对水透析的方法得到纯品，并通过用质量百分比0.3%醋酸水溶液透析的方法成盐。

步骤（3）中所述的小分子杂质是分子量小于2000的物质。

根据本发明，一个最优选的方案是，一种醋酸格拉默的制备方法，步骤如下：

（1）分别将7.12g L-谷氨酸-γ-苄酯、7.39gN-ε-叔丁氧羰基-L-赖氨酸、8.14gO-苄基-L-酪氨酸以及2.67g未经保护的L-丙氨酸加入0.5倍摩尔量即4.45g的三光气，并在四氢呋喃中70℃回流至固体全部溶解,蒸去大部分四氢呋喃，并用正己烷重结晶，得到四种氮羧酸酸酐；

将2.54g L-丙氨酸氮羧酸酸酐，1.85g L-谷氨酸-γ-苄酯氮羧酸酸酐，4.45gN-ε-叔丁氧羰基-L-赖氨酸氮羧酸酸酐，1.40gO-苄基-L-酪氨酸氮羧酸酸酐溶解在102mL N,N-二甲基甲酰胺中，并加入摩尔比为1%的二乙胺，混合物在室温下搅拌24个小时；之后将溶液倒入冷水500mL中，搅拌一个小时，过滤、洗涤、干燥；得到未脱保护的混合多肽8.3g；

（2）将未脱保护的混合多肽2g放入40毫升质量浓度为33%的溴化氢冰醋酸溶液中，在20℃的温度下搅拌10小时；

（3）将上一步中的反应液在旋转蒸发仪上蒸干，并加入100毫升水溶解，置于截留分子量为2000的透析袋中，于水中透析，除去分子量小于2000的物质，之后再在0.3%的醋酸水溶液中透析，将溶液冷冻干燥，得到固体产物1.4g。

本发明用叔丁氧羰基保护L‐赖氨酸的ε-氨基，用苄酯或者取代苄酯保护L‐谷氨酸的γ-羧基，用苄基或者取代苄基保护L‐酪氨酸的酚羟基，然后将三种保护后的氨基酸以及L‐丙氨酸做成氮羧酸酸酐；在引发剂的诱导下发生聚合反应生成未脱保护的混合多肽，然后利用酸解的方法将三种氨基酸的保护基一步脱去，再利用透析的方法除去小分子杂质得到醋酸格拉默的纯品。

本发明的合成路线如下：

其中R为H或者Cl，Br，NO₂，CH₃O。

试剂和条件：a.四氢呋喃，三光气，70℃回流b.引发剂，溶剂c.酸解，透析。

本发明的优良效果：

本发明与已有文献报道的醋酸格拉默合成路线相比，其技术特点是对组成醋酸格拉默的四种氨酸酸中几种保护基以及脱保护基的方法进行了改进。本发明的醋酸格拉默的制备方法，利用四种氮羧酸酸酐，只经过一步聚合反应和一步去保护反应即可得到产品，操作简单，收率高，并且本发明对所有氨基酸侧链进行了保护，减少了杂质产生的可能，具有广泛的应用价值。

具体实施方式

下面结合实例对本发明做进一步的说明，但不限于此。

以下实施例步骤（1）中将保护后的L-谷氨酸（式Ⅰ）、L-赖氨酸（式Ⅱ）、L-酪氨酸（式Ⅲ）以及未经保护的L-丙氨酸做成氮羧酸酸酐的方法可按照现有技术。

实施例1、醋酸格拉默的制备方法

（1）分别将L-谷氨酸-γ-苄酯（7.12g，30mmol）、N-ε-叔丁氧羰基-L-赖氨酸（7.39g，30mmol）、O-苄基-L-酪氨酸（8.14g，30mmol）以及未经保护的L-丙氨酸（2.67g，30mmol）加入0.5倍摩尔量的三光气（4.45g，15mmol）并在四氢呋喃中70℃回流至固体全部溶解,蒸去大部分四氢呋喃，并用正己烷重结晶，得到四种氮羧酸酸酐；

L-丙氨酸氮羧酸酸酐（2.54g，22mmol），L-谷氨酸-γ-苄酯氮羧酸酸酐（1.85g，7.01mmol），N-ε-叔丁氧羰基-L-赖氨酸氮羧酸酸酐（4.45g，16.3mmol），O-苄基-L-酪氨酸氮羧酸酸酐(1.40g，4.7mmol)溶解在N,N-二甲基甲酰胺（102mL）中，并加入摩尔比为1%的二乙胺，混合物在室温下搅拌24个小时；之后将溶液倒入冷水（500mL）中，搅拌1小时，过滤、洗涤、干燥。得到未脱保护的多肽8.3g。产率为81%。

（2）将未脱保护的多肽2g放入40毫升质量浓度为33%的溴化氢冰醋酸溶液中，在20℃的温度下搅拌10小时。

（3）将上一步中的反应液在旋转蒸发仪上蒸干，并加入100毫升水溶解，置于截留分子量为2000的透析袋中，于水中透析，除去分子量小于2000的物质，之后再在0.3%的乙酸水溶液中透析，将溶液冷冻干燥，得到固体产物1.4g，收率为70%。

实施例2、醋酸格拉默的制备方法

（1）分别将L-谷氨酸-γ-苄酯（7.12g，30mmol）、N-ε-叔丁氧羰基-L-赖氨酸（7.39g，30mmol）、O-苄基-L-酪氨酸（8.14g，30mmol）以及未经保护的L-丙氨酸（2.67g，30mmol）加入0.5倍摩尔量的三光气（4.45g，15mmol）并在四氢呋喃中70℃回流至固体全部溶解,蒸去大部分四氢呋喃，并用正己烷重结晶，得到四种氮羧酸酸酐；

L-丙氨酸氮羧酸酸酐（2.54g，22mmol），L-谷氨酸-γ-苄酯氮羧酸酸酐（1.85g，7.01mmol），N-ε-叔丁氧羰基-L-赖氨酸氮羧酸酸酐（4.45g，16.3mmol），O-苄基-L-酪氨酸氮羧酸酸酐(1.40g，4.7mmol)溶解在二氧六环（102mL）中，并加入摩尔比为1%的二异丙胺，混合物在室温下搅拌24个小时。之后将溶液倒入冷水（500mL）中，搅拌一个小时，过滤、洗涤、干燥。得到未脱保护的多肽7.9g。产率为77.1%。

（2）将未脱保护的多肽2g放入40毫升浓盐酸与冰醋酸的混合溶液（质量分数37%的浓盐酸与冰醋酸按体积比1：1混合）中，在20℃的温度条件下搅拌10小时。

（3）将上一步中的反应液在旋转蒸发仪中蒸干，并用100毫升水溶解，置于截留分子量为2000的透析袋中，于水中透析，除去分子量小于2000的物质，之后再在0.3%的乙酸水溶液中透析，将溶液冷冻干燥，得到固体产物1.45g，收率为72.5%。

实施例3、产物中四种氨基酸比例的测定

称取实施例1的产物25毫克，溶于10mL6mol/L的盐酸中，氮气保护，密封，于110摄氏度下水解24小时，将盐酸蒸干，用上样缓冲液溶解并稀释至80mL，利用Biochrom30专用自动氨基酸分析系统测出每100g样品中各种氨基酸的含量分别为丙氨酸27.1326g，谷氨酸13.0177g，赖氨酸31.5618g，酪氨酸11.981g，计算出的四种氨基酸占氨基酸总量的摩尔份数分别为丙氨酸0.451，谷氨酸0.131，赖氨酸0.320，酪氨酸0.098，符合产品的规定。

实施例4、产物多肽分子量分布的测定

取实施例1的产物，利用SDS不连续电泳的方法，配制20%(w/v)的分离胶，在80V的条件下跑0.5h，在150V条件下跑2.5小时，利用低分子量蛋白marker比对，多肽分子量分布集中在2000到10000，平均分子量约为6000，符合产品的规定。

Claims (10)

1.一种醋酸格拉默的制备方法，包括下列步骤：

（1）将保护后的L-谷氨酸（式Ⅰ）、L-赖氨酸（式Ⅱ）、L-酪氨酸（式Ⅲ）以及未经保护的L-丙氨酸做成氮羧酸酸酐，在溶剂中、引发剂存在下进行聚合反应，得到未脱保护基的混合多肽；

式Ⅰ化合物为

其中R为H或者Cl，Br，NO₂，CH₃O；

其中R为H或者Cl，Br，NO₂，CH₃O；

所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、CH₂Cl₂、二氧六环之一或组合；

所述引发剂为二乙胺、三乙胺、二异丙胺之一或组合；

（2）将步骤（1）得到的未脱保护基的混合多肽在酸性条件下酸解脱去保护基,得到醋酸格拉默粗品；

（3）将步骤（2）得到的醋酸格拉默粗品通过透析的方法除去小分子杂质得到醋酸格拉默的纯品。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于步骤（1）中L-谷氨酸的保护基为苄基；L-赖氨酸的保护基为叔丁氧羰基；L-酪氨酸的保护基为苄基。

3.根据权利要求1的方法，其特征在于步骤（1）中保护后的L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-酪氨酸以及未经保护的L-丙氨酸的氮羧酸酸酐的加入量占四种氮羧酸酸酐总量的摩尔比例分别为：L-丙氨酸44%，L-赖氨酸32.6%，L-谷氨酸14%，L-酪氨酸9.4%。

4.根据权利要求1的方法，其特征在于步骤（1）中聚合反应在0-80℃的条件下进行，聚合反应的反应时间为5-50小时；优选反应温度为25℃，反应时间为24小时。

5.根据权利要求1的方法，其特征在于步骤（1）中聚合反应的溶剂的用量为：每克原料加入10-30毫升溶剂，优选10毫升。

6.根据权利要求1的方法，其特征在于步骤（1）中聚合反应的引发剂用量为四种氮羧酸酸酐总摩尔量的0.1%-3%，优选1%。

7.根据权利要求1的方法，其特征在于步骤（2）中所述的酸解所用的酸为三氟乙酸、溴化氢水溶液、溴化氢的冰醋酸溶液或者浓盐酸与冰醋酸的混合溶液中的一种，所用酸的加量为每克底物10-30毫升酸，优选每克底物20毫升酸。

8.根据权利要求1的方法，其特征在于步骤（2）中所述的脱去保护基酸解过程反应时间为1-10小时，优选10小时。

9.根据权利要求1的方法，其特征在于步骤（3）中所述的透析的方法是醋酸格拉默粗品通过对水透析的方法得到纯品，并通过用质量百分比0.3%醋酸水溶液透析的方法成盐。

10.一种醋酸格拉默的制备方法，包括下列步骤：

（1）分别将7.12g L-谷氨酸-γ-苄酯、7.39gN-ε-叔丁氧羰基-L-赖氨酸、8.14gO-苄基-L-酪氨酸以及2.67g未经保护的L-丙氨酸加入0.5倍摩尔量即4.45g的三光气，并在四氢呋喃中70℃回流至固体全部溶解,蒸去大部分四氢呋喃，并用正己烷重结晶，得到四种氮羧酸酸酐；

将2.54g L-丙氨酸氮羧酸酸酐，1.85g L-谷氨酸-γ-苄酯氮羧酸酸酐，4.45gN-ε-叔丁氧羰基-L-赖氨酸氮羧酸酸酐，1.40gO-苄基-L-酪氨酸氮羧酸酸酐溶解在102mL N,N-二甲基甲酰胺中，并加入摩尔比为1%的二乙胺，混合物在室温下搅拌24个小时；之后将溶液倒入冷水500mL中，搅拌一个小时，过滤、洗涤、干燥；得到未脱保护的混合多肽8.3g；

（2）将未脱保护的混合多肽2g放入40毫升质量浓度为33%的溴化氢冰醋酸溶液中，在20℃的温度下搅拌10小时；

（3）将上一步中的反应液在旋转蒸发仪上蒸干，并加入100毫升水溶解，置于截留分子量为2000的透析袋中，于水中透析，除去分子量小于2000的物质，之后再在0.3%的醋酸水溶液中透析，将溶液冷冻干燥，得到固体产物1.4g。