CN103901124B - 一种鸡屎藤的乙酸乙酯提取物的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鸡屎藤的乙酸乙酯提取物的检测方法，该方法是通过UPLC/Q-TOF-MS进行的。本发明公开的UPLC图谱具有较大的稳定性和重现性，该研究为鸡屎藤的乙酸乙酯提取物质量评价提供了一种手段，有利于进一步制定鸡屎藤的乙酸乙酯提取物的质量监控。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药的检测方法，具体涉及一种鸡屎藤的乙酸乙酯提取物的检测方法。
背景技术
鸡屎藤，中药名。为茜草科鸡矢藤属多年生草质藤本植物鸡矢藤的全草及根。《纲目拾遗》云：“搓其叶嗅之，有臭气，未知其正名何物，人因其臭，故名臭藤。”鸡屎藤及诸“臭”、诸“屎”之名皆的义于其臭气。鸡矢藤在栽后9-10月除留种的外，每年都可割取地上部分，晒或凉干即成。或秋季挖根，洗净，切片，晒干供药用。具有祛风除湿，消食化积，解毒消肿，活血止痛至功效。
鸡屎藤的鉴别方法有性状鉴别、显微鉴别及叶表面观，具体为：
性状鉴别为：鸡矢藤茎呈扁圆柱形，稍扭曲，无毛或近无毛，老黄牛茎灰棕色，直径3-12mm，栓皮常脱落，有纵皱纹及叶柄断痕，易折断，断面平坦，灰黄色；嫩茎黑褐色，直径1-3mm，质韧，不易折断，断面纤维性，灰白色或浅绿色。叶对生，多皱缩或破碎，完整者展平后呈宽卵形或披针形，长5-15cm，宽2-6cm，先端尖，基部楔形，圆形或浅心形，全缘，绿褐色，两面无柔毛或近无毛；叶柄长1.5-7cm，无毛或有毛。聚伞花序顶生或腋生，前者多带叶，后者疏散少花，花序轴及花均被疏柔毛，花淡紫色。气特异，味微苦、涩。以条匀、叶多、气浓者为佳。
显微鉴别为：幼茎横切面：呈扁圆形，表皮细胞1列，外壁稍增厚，被角质层；有的可见非腺毛残基。皮层7-8列细胞，外侧1-2列为厚角细胞，维管束外韧型。韧皮部有没细胞，韧皮部外侧有纤维，单个或数个成群断续排列成环，壁非木化。木质部导管常数个至十数个相聚成12-14个导管群，木纤维发达，木薄壁细胞稀少。髓部较大，呈长圆形。本品薄壁细胞含草酸钙针晶。老茎横切面：呈圆形，韧皮部外侧可见木栓层，木质部呈圆形环，髓部扁圆形，略偏心形。叶横切面：表皮细胞1列，外被角质层，有非腺毛，长50-500μm由3-5个细胞组成，壁上有角质层纹理，栅栏细胞1列，海绵组织中有大型含晶细胞，针晶束长约140μm。主脉的上面微凸起，下面呈弧形突出，上、下表皮内方均有厚角组织。
叶表面观：表皮细胞多角形，垂周壁较平直，平周壁有明显角质层纹理。上、下表皮均有平轴式气孔，副卫细胞2个。草酸钙针晶束较我，长达150μm。叶脉部分常有非腺毛分布，长50-500μm，由3-15个细胞组成，壁具角质层纹理。
而关于鸡屎藤提取物及有效成分的检测也很少有报道，例如：
鸡屎藤中含有鸡屎藤苷，其检测方法通常为高效液相色谱，如CN201110210039.2公开了其含量由HPLC检测。
CN201210209139.8公开了一种鸡屎藤的乙酸乙酯提取物，其制备方法为：鸡屎藤用石油醚浸泡18-36h，渗滤提取至3-8倍药材量，回收残渣，挥干残渣中的石油醚，用70%-90%乙醇提取，提取液浓缩得乙醇浓缩液，相对密度为1.15-1.20，用乙酸乙酯萃取，倒出上层，即得乙酸乙酯提取物。但是没有提及该产品的检测或鉴别方法。
CN200710301964.X公开了一种红鸡屎藤的提取物，但是并没有公开其检测方法。
UPLC/Q-TOF-MS分析方法是超高效液相色谱-四极杆联合飞行时间串联质谱分析方法，通过高效液相的联用，可以方便得到每个样品的主要结构信息，并针对每个组分进行准确的定性分析。四级杆质谱是在交变电场的作用下没事某些符合要求的离子通过四级杆到达检测器，飞行时间质谱（TOF）是应用不同的m/z离子的飞行速度不同，离子飞行通过相同的路径到达检测器的时间不同而获得质量分离。四级杆串联飞行时间质谱不仅用于一级质谱的分析而且可以实现二级质谱分析，一级质谱可得出化合物的分子量信息，二级质谱则可以得到化合物的碎片离子等结构信息。
目前，UPLC/Q-TOF-MS可以广泛运用中药化学成分的快速鉴定定性分析，它可以使样品的分离和定性及定量成为一个连续的过程，费时费力而且对环境不好，UPLC/Q-TOF-MS的快速分析鉴别，能够在短时有效成分分离的基础上，获得大量的化合物结构信息，在中药化学成分分析中发挥了重要的作用。
目前，尚未见到UPLC/Q-TOF-MS在鸡屎藤及相关提取物鉴别方面的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种CN201210209139.8提供的鸡屎藤的乙酸乙酯提取物的检测方法。
本发明提供的一种鸡屎藤的乙酸乙酯提取物的检测方法，该方法是通过UPLC/Q-TOF-MS进行的。
具体的，所述UPLC/Q-TOF-MS检测方法包括以下条件：
色谱分析条件为：色谱柱：WatersACQUITYUPLCTMBEHC18Column(50mm×2.1mm.id.,1.7μm)柱；二元梯度洗脱，A相为水溶液，B相为甲醇，流速0.3mL/min；进样量3μL；
所述Q-TOFMS条件，质谱采用电喷雾电离源，TOF离子飞行方式采用正离子模式检测。
优选地，所述UPLC/Q-TOF-MS检测方法包括以下条件：
色谱分析条件为：色谱柱：WatersACQUITYUPLCTMBEHC18Column(50mm×2.1mm.id.,1.7μm)柱；柱温：35℃；流动相：二元梯度洗脱，A相为水溶液，B相为甲醇；流速0.3mL/min；每次进样量3μL，其梯度洗脱的的条件为：
Q-TOFMS条件，质谱采用电喷雾电离源（ESI），TOF离子飞行方式采用正离子Ⅴ模式；四级杆质量扫描m/z范围50-1200，一次扫描时间为0.1s，离子源温度120℃，去溶剂温度300℃，锥孔气体流速为50L/h，脱溶剂氮气流速800L/h，正离子电离模式，毛细管电离电压3kV，锥孔电压40V，碰撞气体压力为2.5×10-3Mbar。电子倍增器电压650V。
另外，在仪器使用前用校正液校正，对目标离子进行精确质量锁定。
数据处理，LC-MC的原始数据文件通过WatersMicromassMassV4.1数据处理系统获得，对于每个离子的鉴定通过正离子和负离子模式下的二级质谱进一步确认。
本发明提供的鸡屎藤的乙酸乙酯提取物的检测方法具有以下优点：
1、本发明应用超高效液相色谱-质谱联机分析技术及结果构建鸡屎藤的乙酸乙酯提取物的指纹图谱的方法。该方法包括鸡屎藤的乙酸乙酯提取物的UPLC-MS分析条件。色谱峰的特征、色谱组分的质谱提供的化合物结果信息等。本发明公开的指纹图谱及其技术可用于鸡屎藤的乙酸乙酯提取物的品种鉴别及鸡屎藤提取物的质量监控。
2、经UPLC/Q-TOF-MS分析，能够较全面的反映出鸡屎藤的乙酸乙酯提取物主要成分为环烯醚萜苷类，其中4个分别是鸡屎藤苷，鸡屎藤苷酸，甲基鸡屎藤苷，咖啡酸-4-O-b-D-吡喃葡萄糖-鸡屎藤苷B,4个未知的环烯醚萜苷类。
本发明提供的UPLC/Q-TOF-MS测定的鸡屎藤的乙酸乙酯提取物中的主要成分为环烯醚萜类成分与鸡屎藤生品有本质区别。
附图说明
图1：鸡屎藤的乙酸乙酯提取物UPLC分析色谱图；
图2：鸡屎藤的乙酸乙酯提取物UPLC-ESI-MS(+)分析总离子流色谱图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例：
1、实验试剂
甲醇为色谱纯，美国Fisher公司;
超纯水，实验室ELGAPURELABClassic-UVF纯水机制备，该纯水机购自英国；
其他试剂均为市售国产分析纯。
2、实验样品
专利样品：CN201210209139.8的实施例1制备的鸡屎藤的乙酸乙酯提取物，其具体制备方法为：药材样品粉碎成粗粉，取粗粉500克，先用石油醚浸泡1天后渗滤提取至提取液颜色浅（或5倍药材量），回收石油醚，得石油醚提取物；残渣挥去石油醚，用80%乙醇湿润后，再用3倍量80%乙醇回流提取两次，合并提取液，减压回收乙醇至无醇味，用等体积乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯至干，得乙酸乙酯萃取物；母液浓缩至干，得乙醇提取物；残渣挥干乙醇，用3倍量水煮提2次，合并水提取液，浓缩至干，得水提取液。
3、实验条件
3.1色谱条件为：色谱柱：WatersACQUITYUPLCTMBEHC18Column(50mm×2.1mm.id.,1.7μm)柱；柱温：35℃；流动相：二元梯度洗脱，A相为水溶液，B相为甲醇；流速0.3mL/min；每次进样量3μL，其梯度洗脱的的条件为：
表1：梯度洗脱
3.2Q-TOFMS条件，质谱采用电喷雾电离源（ESI），TOF离子飞行方式采用Ⅴ模式；四级杆质量扫描m/z范围50-1200，一次扫描时间为0.1s，离子源温度120℃，去溶剂温度300℃，锥孔气体流速为50L/h，脱溶剂氮气流速800L/h，正离子电离模式，毛细管电离电压3kV，锥孔电压40V，碰撞气体压力为2.5×10-3Mbar,电子倍增器电压650V。
4、数据处理，LC-MC的原始数据文件通过WatersMicromassMassV4.1数据处理系统获得，对于每个离子的鉴定通过正离子和负离子模式下的二级质谱进一步确认。
5、实验结果：见图1、图2和表2
图1为鸡屎藤的乙酸乙酯提取物的UPLC图，图2为鸡屎藤的乙酸乙酯提取物的UPLC-ESI-MS(+)分析总离子流色谱图，对图2中的总离子流色谱峰组分进行指纹信息分析，得到表2内容：
表2：鸡屎藤提取物的总离子流色谱峰组分指纹信息
表2结果显从鸡屎藤的乙酸乙酯提取物中分析鉴定出9个化学物，主要成分为环烯醚萜苷类化合物，其中4个分别是鸡屎藤苷，鸡屎藤苷酸，甲基鸡屎藤苷，咖啡酸-4-O-b-D-吡喃葡萄糖-鸡屎藤苷B,4个未知的环烯醚萜苷类，一个黄酮类成分蒙花苷。
通过现有技术可知：鸡屎藤生品的主要化学成分为黄酮类，环烯醚萜苷和挥发油类成分，其中黄酮类成分主要含有表儿茶素，大豆苷元，芒柄花素，异甘草素等；环烯醚萜苷类主要含有SaprosmosideE，鸡屎藤苷，鸡屎藤酸，鸡屎藤酸甲酯以及去乙酰车叶草苷酸甲酯等，挥发油成分有20多种，各有差异。
本发明提供的UPLC/Q-TOF-MS测定的鸡屎藤的乙酸乙酯提取物中的主要成分为环烯醚萜类成分与鸡屎藤生品有本质区别。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (1)
1.一种鸡屎藤的乙酸乙酯提取物的检测方法，其特征在于，该方法是通过UPLC/Q-TOF-MS进行的，所述UPLC/Q-TOF-MS检测方法包括以下条件：色谱分析条件为：WatersACQUITYUPLCTMBEHC18Column柱，50mm×2.1mm.id.,1.7μm；二元梯度洗脱，A相为水溶液，B相为甲醇，流速0.3mL/min；进样量3μL，其梯度洗脱的的条件为：
Q-TOFMS条件，质谱采用电喷雾电离源，TOF离子飞行方式采用Ⅴ正离子模式；四级杆质量扫描m/z范围50-1200，一次扫描时间为0.1s，离子源温度120℃，去溶剂温度300℃，锥孔气体流速为50L/h，脱溶剂氮气流速800L/h，正离子电离模式，毛细管电离电压3kV，锥孔电压40V，碰撞气体压力为2.5×10-3Mbar，电子倍增器电压650V。
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