CN103898230B - 一种食源性致病微生物侵染叶类蔬菜的评估方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种评估食源性致病微生物侵染叶类蔬菜的方法，其步骤包括：(1)使消毒后叶类蔬菜种子萌芽；(2)选择无污染的萌芽种子接种到植物培养基上培养至2-3cm；(3)接种食源性致病微生物至小苗上，接种方式为根部接种或整株接种；(4)根据评估目的确定PCR检测细菌16SrDNA的时点，评估侵染内化和迁移是针对根部接种培养苗；评估残存是针对整株接种培养苗；(5)用食源性致病微生物的特异性基因验证16SrDNA的阳性结果。所述食源性致病微生物包括沙门菌、大肠杆菌O157：H7、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌等致病细菌。所述蔬菜为生菜、油菜、大白菜、甘蓝、菠菜、芹菜、快菜、茼蒿。
Description
技术领域
本发明属于叶类蔬菜生产过程中产品安全领域，具体地说，涉及一种食源性致病微生物侵染叶类蔬菜的评估方法。
背景技术
随着人们健康观念的加强，新鲜蔬菜的消费量不断增加。研究表明，多吃蔬菜可以减少罹患慢性非传染性疾病的风险。但在消费量增加的同时，新鲜蔬菜引起的微生物性食源性疾病也快速增长。例如，在美国70年代蔬果引起的微生物食物中毒不足1％，到90年代上升为6％。在中国，新鲜蔬果引起的致病微生物食源性疾病鲜有报道。这可能是由于以下原因：(1)我国的食物中毒的漏报率高；(2)中国人生食蔬菜的品种和比例远远低于欧美人；(3)我国蔬菜生产中所使用的化学品比例较高，一定程度上抑制了病原菌的生长、繁殖；(4)许多较轻的食物中毒现象被忽视了；(5)我们的监控系统还不完善，覆盖率较低。
食品安全问题越来越为广大民众所关注，中国食品安全评估中心认为我国的食品安全排位前三的风险分别为：(1)致病微生物引起的食源性疾病；(2)农药等化学性污染；(3)人为添加非法添加剂。
随着生活节奏的加快和生活方式的改变，近年来中国居民生食蔬菜的比例也在逐年上升。致病微生物引起的食源性疾病的潜在风险也同样提高。叶类蔬菜营养价值高，新鲜度好，以其茎叶为主要可食部分，是中国人的主要消费蔬菜品种，但因其表面积大、水分含量高、易于破损、不耐储存而容易携带食源性致病微生物。
在国外由于蔬菜携带的致病微生物引起食源性疾病不断增加，相应的也进行了广泛的研究，其中蔬菜生产过程中的食源性致病微生物侵染是一个重要方面。但迄今为止，并没有一个简单易行的规范方法来评估食源性致病微生物侵染蔬菜的能力，以及蔬菜抵御食源性致病微生物侵染的能力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种评估食源性致病微生物侵染叶类蔬菜的方法，其步骤包括：(1)使消毒后叶类蔬菜种子萌芽；(2)选择无污染的萌芽种子接种到植物培养基上培养至2-3cm；(3)接种食源性致病微生物至小苗上，接种方式为根部接种或整株接种；(4)根据评估目的确定PCR检测细菌16SrDNA的时点，评估侵染内化和迁移是针对根部接种培养苗，检测时间为接种后培养2-15天；评估残存是针对整株接种培养苗，检测时间为接种后2-30天；(5)用食源性致病微生物的特异性基因验证16SrDNA的阳性结果。
所述消毒是指蔬菜种子清水洗涤干净、浸泡后，选适当消毒剂消毒一定时间，所述消毒剂为乙醇、次氯酸钠、1000万单位农用链霉素300-500倍液、1％高锰酸钾、10％磷酸三钠、1％硫酸铜、福尔马林100倍液等的一种或几种。所述种子萌芽是指用无菌水冲净消毒后种子放入0.5％-0.8％琼脂培养皿中(含葡萄糖0.2％-0.5％)；每皿20-30粒，一定温度下发芽(20℃一28℃)，待种子发芽。所述无污染指萌芽种子中没有细菌和真菌污染的发芽种子。将萌芽种子放入组培瓶中，每瓶3-6粒；光照培养一定时间后，可根据需求以不同方式接入不同种类、不同浓度的食源性致病微生物；接入食源性致病微生物后，再培养一定时间，随后检测蔬菜不同部位的食源性致病微生物的存在情况，以评估某种蔬菜与某种食源性致病微生物的相关性。
所述食源性致病微生物包括沙门菌、大肠杆菌O157：H7、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌等致病细菌。所述食源性致病微生物菌种的制备方法是指将菌株分别在营养琼脂培养基上活化后，挑取单菌落，接种营养肉汤培养基，37℃培养16小时，制成接种用菌悬液备用，其浓度为103／mL至108／mL。
所述蔬菜为生菜、油菜、大白菜、甘蓝、菠菜、芹菜、快菜、茼蒿等可以种子发芽的叶类蔬菜。
所述PCR检测细菌的16SrDNA是指常规PCR检测细菌的16SrDNA的方法，所用引物为27F5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’，将其作为致病菌阳性指标，为防止检测过程杂菌污染，可以用不同致病菌的特异基因序列作为验证指标。
所述致病微生物的特异性基因包括：
沙门氏菌选择(引物1：ACCACGCAGGGAAAGACA，引物2：GCCCAGCCATACGGATAA425bp)引物扩增的基因序列：
Salmonellaentericasubsp.
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EsCherichiaCo1iO157：H7
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单核细胞增生李斯特菌(hlyF：CGAGCCTAACATATCCAG，hlyR：
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Gene=″hly″
gi|405748335：209130-210719
ATGAAAAAAATAATGCTAGTTTTTATTACACTTATATTAGTTAGTCTACCAATTGCGCAACAAACTGAAGCAAAGGATGCATCTGCATTCAATAAAGAAAATTTAATTTCATCCATGGCACCACCAGCATCTCCGCCTGCAAGTCCTAAGACGCCAATCGAAAAGAAACACGCGGATGAAATCGATAAGTATATACAAGGATTGGATTACAATAAAAACAATGTATTAGTATACCACGGAGATGCAGTGACAAATGTGCCGCCAAGAAAAGGTTATAAAGATGGAAATGAATATATCGTTGTGGAGAAAAAGAAGAAATCCATCAATCAAAATAATGCAGATATCCAAGTTGTGAATGCAATTTCGAGCCTAACATATCCAGGTGCTCTCGTGAAAGCGAATTCGGAATTAGTAGAAAATCAACCCGATGTTCTTCCTGTCAAACGTGATTCATTAACACTTAGCATTGATTTGCCAGGAATGACTAATCAAGACAATAAAATTGTTGTAAAAAATGCTACTAAATCGAACGTTAACAACGCAGTAAATACATTAGTGGAAAGATGGAATGAAAAATATGCTCAAGCTTATCCAAATGTAAGTGCAAAAATTGATTATGATGACGAAATGGCTTACAGTGAATCACAATTAATTGCAAAATTTGGTACGGCATTTAAAGCTGTAAATAATAGCTTGAATGTAAACTTCGGCGCAATCAGTGAAGGGAAAATGCAAGAAGAAGTCATTAGTTTTAAACAAATTTACTATAACGTGAATGTTAATGAACCTACAAGACCTTCCAGATTTTTCGGCAAAGCTGTTACTAAAGAGCAGTTGCAAGCGCTTGGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCTGCATATATCTCAAGTGTGGCATATGGCCGTCAAGTTTATTTGAAATTATCAACTAATTCCCATAGTACTAAAGTAAAAGCTGCTTTTGACGCTGCCGTAAGTGGGAAATCTGTCTCAGGTGATGTAGAACTGACAAATATCATCAAAAATTCTTCCTTCAAAGCCGTAATTTACGGTGGCTCCGCAAAAGATGAAGTTCAAATCATCGACGGTAACCTCGGAGACTTACGAGATATTTTGAAAAAAGGTGCTACTTTTAACCGGGAAACACCAGGAGTTCCCATTGCCTATACAACAAACTTCTTAAAAGACAATGAATTAGCTGTTATTAAAAACAACTCAGAATATATTGAAACAACTTCAAAAGCTTATACAGATGGAAAAATCAACATCGATCACTCTGGAGGATACGTTGCTCAATTCAACATCTCTTGGGATGAAATAAATTATGATCCTGAAGGTAACGAAATTGTTCAACATAAAAACTGGAGCGAAAACAATAAAAGTAAGCTAGCTCATTTCACATCGTCCATCTATTTGCCAGGTAACGCAAGAAATATTAATGTTTACGCTAAAGAATGCACTGGTTTAGCTTGGGAATGGTGGAGAACGGTAATTGATGACCGGAACCTACCGCTTGTGAAAAATAGAAATATCTCCATCTGGGGCACTACACTTTATCCGAAATATAGTAATAGTGTAGATAATCCAATCGAATAA
金黄色葡萄球菌(nucF：AATCATACGGGTCCTTTC，nucR：CAATGTTCTACCATAGCG297bp)，引物扩增的基因序列：
Staphylococcusaureus
Gene=″nuc″
NCBIReferenceSequence：NC_017340.1
ATGAAGTCAAATAAATCGCTTGCTATGATTGTGGTAGCCATCATTATTGTAGGTGTATTAGCATTTCAATTTATGAATCATACGGGTCCTTTCAAAAAGGGGACGAATCATGAAACTGTAGAAGATTTAAATGGTAAAGATAAAGTACATGTTCAAAGAGTTGTGGATGGTGATACATTTATTGCAAATCAAAATGGTAAAGAAATTAAAGTTAGGCTTATAGGGGTTGATACGCCAGAAACGGTGAAACCGAATACGCCTGTACAACCATTTGGCAAAGAAGCATCAAATTATAGTAAGAAGACATTAACAAATCAAGATGTTTATTTAGAATATGATAAAGAAAAACAAGATCGCTATGGTAGAACATTGGCGTATGTATGGATAAGTAAAGATCGTATGTACAATAAGGAATTAGTGGAAAAGGGACTTGCTAGAGAGAAGTATTTTTCACCAAATGGCAAATATAGAAATGTATTTATAGAAGCACAAAATAAAGCTAAACAACAGAAATTAAATATTTGGAGTAAATAA
本发明的有益效果如下：
蔬菜种子本身会携带多种微生物，本发明对比一般组培培养，增加了培养皿发芽阶段，这样可以挑选出消毒彻底、发芽力强的种子。一方面可以保障放入组培瓶内种子的发芽率，另一方面可以大大减少种子带菌率，使以后培养过程中的污染率降低到1％以下。本发明得到的组培瓶内的菜苗为无菌菜苗，可以直接接种不同的食源性致病微生物，以评估蔬菜与致病菌之间的关联性，如致病菌是否在蔬菜中内化，致病菌在蔬菜上留存的时间，以及内外环境因素对致病菌侵染蔬菜的影响等。因为此时组培瓶内没有其他微生物，使得蔬菜与致病菌之间的关系不受其他杂菌的影响，结果非常容易确定。本发明致病菌的接种可以采取根部接种(致病菌只接触菜苗的根部而不接触茎叶)，经过不同时间的培养后，检测菜苗茎叶部位是否存在食源性致病微生物，可以判断致病菌是否可以侵染菜苗并在菜苗内内化、迁移。此外，也可以用不同浓度的致病菌直接接种整株菜苗，经过不同时间的培养后，检测菜苗上留存的微生物，可以判断食源性致病微生物在该种蔬菜上存留时间的长短。
具体实施方式：
以下通过实施例进一步阐述本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
沙门菌对不同生菜品种的侵染内化和迁移差异性
实验菌株：猪霍乱沙门氏菌CICC21493；鼠伤寒沙门氏菌CICC10420(菌株购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)
生菜品种：1结球9160，表中用9160表示；2散生7400，表中用GS8；3结球4300，表中用4300表示(以上种子购自北京市开心格林种子公司)；4加州大速生，GJ12表示(购自北京京研益农种子公司)；5紫叶生菜，表中用PS16表示(购自绿金蓝种苗有限公司)。
实验过程：
1.菌种准备：将沙门氏菌株分别在营养琼脂培养基上活化后，挑取单菌落，接种营养肉汤培养基，37℃培养16小时，作为接种的菌液悬浊液。将菌悬液梯度稀释制成108／mL及104／mL稀释液准备接种。
2.菜苗准备及接种致病菌：先将生菜种子用清水洗净，再用无菌水浸泡30分钟，然后用75％乙醇+1％次氯酸钠消毒1分钟，无菌水洗涤3次。将消好毒的种子放入0.5％琼脂(含糖0.2％)培养皿内，每皿30粒种子左右，25℃温箱萌芽。2天后选取无污染的发芽种子放入盛有70mL的MS植物组培培养基的组培瓶，每瓶4粒种子，23℃-25℃湿度60-70％，光照室培养。3-4天后，待菜苗长到2-3cm高时，无菌操作接入沙门菌0.5mL。接入时沙门菌只接在菜苗的根部，而不接触茎叶部分。接入的沙门菌为108／mL及104／mL两个浓度，每个浓度8个重复。
3.光照室继续培养5天后进行微生物检测
4.检测致病微生物：检测菜苗的叶片及上面部分的茎部，常规PCR16SrDNA(27F和1492R)，阳性验证(引物1：ACCACGCAGGGAAAGACA，引物2：GCCCAGCCATACGGATAA425bp)
检测菜苗的叶片及上面部分的茎部，常规PCR16SrDNA(27F和1492R)检测：
组织DNA提取：采用天根生化科技有限公司的快速DNA提取检测试剂盒提取生菜苗及其中微生物的DNA，提取液1uL作为后续PCR实验的模板DNA。16SrDNA片段扩增采用引物为通用的保守区引物27F和1492R，PCR程序为95℃1min；94℃1min，53℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min。每批PCR反应均设负对照，即不加模板DNA，用无菌水代替模板进行扩增。扩增产物取10uL电泳，maker采用D2000DNAmarker，电泳后采用Gelred染色10min，采用北京六一凝胶成像分析系统WD-9413B观察，负对照在1500bp左右无条带，样品有条带则记为阳性，无条带为阴性。
阳性验证：
16SrDNA片段检测为阳性的样品采用沙门氏菌特异引物进行验证(引物1：ACCACGCAGGGAAAGACA，引物2：GCCCAGCCATACGGATAA425bp)。样品组织DNA提取采用天根生化科技有限公司的快速DNA提取检测试剂盒提取生菜苗及其中微生物的DNA，提取液1uL作为后续PCR实验的模板DNA。特异片段扩增采用引物为引物1：ACCACGCAGGGAAAGACA和引物2：GCCCAGCCATACGGATAA。PCR程序为95℃1min；94℃1min，55℃1min，72℃C30sec，30个循环；72℃5min。扩增产物取10uL电泳，maker采用D2000DNAmarker，电泳后Gelred染色10min，采用北京六一凝胶成像分析系统WD-9413B观察，样品在425bp有条带记为阳性，无条带为阴性。
5.检测结果见表1。
表1沙门菌不同菌株在不同生菜品种上侵染内化和迁移的结果
c：表示生莱组培苗接种沙门氏菌为猪霍乱沙门氏菌CICC21493
s：表示生菜组培苗接种沙门氏菌为鼠伤寒沙门氏菌CICC10420数字表示8个重复中阳性个数
6.结论：沙门菌在不同生菜品种侵染内化和迁移的能力不同。
沙门菌在不同生菜品种侵内化和迁移的能力大小：
结球9160>结球4300>加州大速生>紫叶生菜>散生7400
实施例2
沙门菌在生菜上残留时间比较
实验菌株：同实施例1
生菜品种：同实施例1
实验过程：
1.菌种准备：将沙门氏菌株分别在营养琼脂培养基上活化后，挑取单菌落，接种营养肉汤培养基，37℃培养16小时，作为接种的菌液悬浊液。将菌悬液浓度稀释制成108／mL菌悬液准备接种。
2.菜苗准备及接种致病菌：先将生菜种子用清水洗净，再用无菌水浸泡30分钟，然后用75％乙醇+1％次氯酸钠消毒1分钟，无菌水洗涤3次。将消好毒的种子放入0.5％琼脂(含糖0.2％)培养皿内，每皿30粒种子左右，25℃温箱发芽。2天后选取无污染的发芽种子放入盛有70mL的MS植物组培培养基的组培瓶，每瓶4粒种子，23℃-25℃湿度60-70％，光照室培养。3-4天后，待菜苗长到2-3cm高时，无菌操作接入沙门菌0.5mL。接入时用沙门菌悬液浇洒整个菜苗。接入的沙门菌浓度为108／mL，设8个重复。
3.继续光照培养，分别于2、4、6、12、24天后进行微生物检测
4.检测致病微生物：检测菜苗的任意部分，常规PCR16SrDNA(27F和1492R)，阳性验证(引物1：ACCACGCAGGGAAAGACA，引物2：GCCCAGCCATACGGATAA425bp)
常规PCR16SrDNA(27F和1492R)检测：
组织DNA提取：采用天根生化科技有限公司的快速DNA提取检测试剂盒提取生菜苗及其中微生物的DNA，提取液1uL作为后续PCR实验的模板DNA。16SrDNA片段扩增采用引物为通用的保守区引物27F和1492R，PCR程序为95℃1min；94℃1min，53℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min。每批PCR反应均设负对照，即不加模板DNA，用无菌水代替模板进行扩增。扩增产物取10uL电泳，maker采用D2000DNAmarker，电泳后采用Gelred染色10min，采用北京六一凝胶成像分析系统WD-9413B观察，负对照在1500bp左右无条带，样品有条带则记为阳性，无条带为阴性。
阳性验证：
16SrDNA片段检测为阳性的样品采用沙门氏菌特异引物进行验证(引物1：ACCACGCAGGGAAAGACA，引物2：GCCCAGCCATACGGATAA425bp)。样品组织DNA提取采用天根生化科技有限公司的快速DNA提取检测试剂盒提取生菜苗及其中微生物的DNA，提取液1uL作为后续PCR实验的模板DNA。特异片段扩增采用引物为引物1：ACCACGCAGGGAAAGACA和引物2：GCCCAGCCATACGGATAA。PCR程序为95℃1min；94℃1min，55℃1min，72℃30sec，30个循环；72℃5min。扩增产物取10uL电泳，maker采用D2000DNAmarker，电泳后Gelred染色10min，采用北京六一凝胶成像分析系统WD-9413B观察，样品在425bp有条带记为阳性，无条带为阴性。
5.检测结果见表2
表2沙门菌不同菌株在不同生菜品种上的残留时间结果
| 检测时间 | GJ12 | 4300 | PS16 | 9160 | GS8 |
| 2天 | 8c+8s | 8c+8s | 8c+8s | 8c+8s | 8c+8s |
| 4天 | 8c+8s | 8c+8s | 8c+8s | 8c+7s | 7c+6s |
| 6天 | 8c+8s | 8c+8s | 7c+6s | 5c+6s | 4c+4s |
| 12天 | 6c+6s | 4c+5s | 3c+3s | 1c+1s | 0c+0s |
| 24天 | 1c+2s | 0c+1s | 0c+0s | 0c+0s | 0c+0s |
c：表示生采组培苗接种沙门氏菌为猪霍乱沙门氏菌CICC21493；
s：表示生菜组培苗接种沙门氏菌为鼠伤寒沙门氏菌CICC10420数字表示8个重复中阳性个数
6.结论：沙门菌在不同生菜品种上残留时间有差异。
沙门菌在不同生菜品种上残留能力比较：
加州大速生>结球4300>紫色生菜>结球9160>散生7400。
Claims (5)
1.一种评估食源性致病微生物侵染叶类蔬菜的方法，其步骤包括：(1)使消毒后叶类蔬菜种子萌芽；(2)选择无污染的萌芽种子接种到植物培养基上培养至2-3cm；(3)接种食源性致病微生物至培养苗上，接种方式为根部接种或整株接种；(4)根据评估的目的，PCR检测所述微生物的16SrDNA，其中评估侵染内化和迁移是对所述培养苗根部接种所述微生物，检测时间为接种后培养2-15天；评估残存是对所述培养苗整株接种所述微生物，检测时间为接种后2-30天；(5)用食源性致病微生物的特异性基因验证16SrDNA为阳性结果的培养苗；
其中，所述食源性致病微生物为沙门菌、大肠杆菌0157：H7、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌；
其中，所述PCR检测所述微生物的16SrDNA是指常规PCR检测细菌的16SrDNA的方法，所用引物为27F5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’，将PCR检测结果作为致病菌阳性指标；
其中，所述沙门菌、大肠杆菌0157：H7、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌的特异性基因及其检测引物分别为：
沙门菌：
特异性基因：
ATGCGCAGCGTACCACGCAGGGAAAGACACCGCCGTTTAAGAAATGCTAAAGACTGCGCCTGCCGTTA
TCACTCTCCAACGCCGCAGATATTTGATCGCCTTGAGTTACTGAACCAACAGCTCAATTATGCCTTGC
CGGTTGGTATCATTTCTCAGGCAATAATTACAACTGACAACTACCTCGGCTATTCATTGAGTCACTAC
TTATTTTCCGGAAAACGTACCGCAGCATTCCGCTCATTAGATGACATTTCTTTGTGGATTGAAAAGGG
GTCGCTCAGACAACTGATTGTAGATATGGAGGCGCTACCTGTCTCCTGTATTGAGGCGCTTAACCAGC
TACGCGCGCTCAGTTGGCAACAAAGCGATATCCAGATTTACCTGCTGGTATCAGATAAAACCTCCGCT
ATAACACAGTTTATCCGTATGGCTGGGCGTTTTTTTGTCCTGTCGCGACGACAAAATCTGGCCTCAGT
ACGCGAAGCCTTGTTATCAGCCTCCAAACCTCGCTTATCGGAAAGCTTTAGCCGTACTGACTGGTTGA
TGATTGAAACTTTAGCGCAAGGCGCCTCTTTAAAAGAAATAGCACGTCAGCAAAGCGTACCTTATCAT
CGTGTAGTTTACCGGCTTAAACAACTTATCACCCTCCTTAACCTTCCCCACAGGCAAAGCTTTCTTCG
GCTGATCCAGCAGCTAAACGTTACTTTCCACGACATTTTTTAA，
检测引物：引物1：ACCACGCAGGGAAAGACA，引物2：GCCCAGCCATACGGATAA；
大肠杆菌0157：H7：
特异性基因：
ATGGCACAAGTCATTAATACCAACAGCCTCTCGCTGATCACTCAAAATAATATCAACAAGAACCAGTC
TGCGCTGTCGAGTTCTATCGAGCGTCTGTCTTCTGGCTTGCGTATTAACAGCGCGAAGGATGACGCCG
CAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTTACTTCTAACATTAAAGGCCTGACTCAGGCGGCCCGTAACGCC
AACGACGGTATTTCTGTTGCGCAGACCACCGAAGGCGCGCTGTCCGAAATCAACAACAACTTACAGCG
TATTCGTGAACTGACGGTTCAGGCCACTACAGGGACTAACTCCGATTCTGACCTGGACTCCATCCAGG
ACGAAATCAAATCTCGTCTTGATGAAATTGACCGCGTATCCGGCCAGACCCAGTTCAACGGCGTGAAC
GTGCTGGCGAAAGACGGTTCAATGAAAATTCAGGTTGGTGCGAATGACGGCGAAACCATCACGATCGA
CCTGAAAAAAATCGATTCTGATACTCTGGGTCTGAATGGCTTTAACGTAAATGGTAAAGGTACTATTA
CCAACAAAGCTGCAACGGTAAGTGATTTAACTTCTGCTGGCGCGAAGTTAAACACCACGACAGGTCTT
TATGATCTGAAAACCGAAAATACCTTGTTAACTACCGATGCTGCATTCGATAAATTAGGGAATGGCGA
TAAAGTCACAGTTGGCGGCGTAGATTATACTTACAACGCTAAATCTGGTGATTTTACTACCACTAAAT
CTACTGCTGGTACGGGTGTAGACGCCGCGGCGCAGGCTGCTGATTCAGCTTCAAAACGTGATGCGTTA
GCTGCCACCCTTCATGCTGATGTGGGTAAATCTGTTAATGGTTCTTACACCACAAAAGATGGTACTGT
TTCTTTCGAAACGGATTCAGCAGGTAATATCACCATCGGTGGAAGCCAGGCATACGTAGACGATGCAG
GCAACTTGACGACTAACAACGCTGGTAGCGCAGCTAAAGCTGATATGAAAGCGCTGYTCAAAGCAGCG
AGCGAAGGTAGTGACGGTGCCTCTCTGACATTCAATGGCACAGAATATACCATCGCAAAAGCAACTCC
TGCGACAACCACTCCAGTAGCTCCGTTAATCCCTGGTGGGATTACTTATCAGGCTACAGTGAGTAAAG
ATGTAGTATTGAGCGAAACCAAAGCGGCTGCCGCGACATCTTCAATTACCTTTAATTCCGGTGTACTG
AGCAAAACTATTGGGTTTACCGCGGGTGAATCCAGTGATGCTGCGAAGTCTTATGTGGATGATAAAGG
TGGTATCACTAACGTTGCCGACTATACAGTCTCTTACAGCGTTAACAAGGATAACGGCTCTGTGACTG
TTGCCGGGTATGCTTCAGCGACTGATACCAATAAAGATTATGCTCCAGCAATTGGTACTGCTGTAAAT
GTGAACTCCGCGGGTAAAATCACTACTGAGACTACCAGTGCTGGTTCTGCAACGACCAACCCGCTTGC
TGCCCTGGACGACGCAATCAGCTCCATCGACAAATTCCGTTCTTCCCTGGGTGCTATCCAGAACCGTC
TGGATTCCGCAGTCACCAACCTGAACAACACCACTACCAACCTGTCCGAAGCGCAGTCCCGTATTCAG
GACGCCGACTATGCGACCGAAGTGTCCAACATGTCGAAAGCGCAGATCATTCAGCAGGCCGGTAACTC
CGTGCTGGCAAAAGCTAACCAGGTACCGCAGCAGGTTCTGTCTCTGCTGCAGGGTTAA，
检测引物：引物1EOflicl：GCGCAGCTAAAGCTGATATG，引物2EOflic2：TTAACCCTGCAGCAGAGACA；
单核细胞增生李斯特菌：
特异性基因：
ATGAAAAAAATAATGCTAGTTTTTATTACACTTATATTAGTTAGTCTACCAATTGCGCAACAAACTGA
AGCAAAGGATGCATCTGCATTCAATAAAGAAAATTTAATTTCATCCATGGCACCACCAGCATCTCCGC
CTGCAAGTCCTAAGACGCCAATCGAAAAGAAACACGCGGATGAAATCGATAAGTATATACAAGGATTG
GATTACAATAAAAACAATGTATTAGTATACCACGGAGATGCAGTGACAAATGTGCCGCCAAGAAAAGG
TTATAAAGATGGAAATGAATATATCGTTGTGGAGAAAAAGAAGAAATCCATCAATCAAAATAATGCAG
ATATCCAAGTTGTGAATGCAATTTCGAGCCTAACATATCCAGGTGCTCTCGTGAAAGCGAATTCGGAA
TTAGTAGAAAATCAACCCGATGTTCTTCCTGTCAAACGTGATTCATTAACACTTAGCATTGATTTGCC
AGGAATGACTAATCAAGACAATAAAATTGTTGTAAAAAATGCTACTAAATCGAACGTTAACAACGCAG
TAAATACATTAGTGGAAAGATGGAATGAAAAATATGCTCAAGCTTATCCAAATGTAAGTGCAAAAATT
GATTATGATGACGAAATGGCTTACAGTGAATCACAATTAATTGCAAAATTTGGTACGGCATTTAAAGC
TGTAAATAATAGCTTGAATGTAAACTTCGGCGCAATCAGTGAAGGGAAAATGCAAGAAGAAGTCATTA
GTTTTAAACAAATTTACTATAACGTGAATGTTAATGAACCTACAAGACCTTCCAGATTTTTCGGCAAA
GCTGTTACTAAAGAGCAGTTGCAAGCGCTTGGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCTGCATATATCTCAAG
TGTGGCATATGGCCGTCAAGTTTATTTGAAATTATCAACTAATTCCCATAGTACTAAAGTAAAAGCTG
CTTTTGACGCTGCCGTAAGTGGGAAATCTGTCTCAGGTGATGTAGAACTGACAAATATCATCAAAAAT
TCTTCCTTCAAAGCCGTAATTTACGGTGGCTCCGCAAAAGATGAAGTTCAAATCATCGACGGTAACCT
CGGAGACTTACGAGATATTTTGAAAAAAGGTGCTACTTTTAACCGGGAAACACCAGGAGTTCCCATTG
CCTATACAACAAACTTCTTAAAAGACAATGAATTAGCTGTTATTAAAAACAACTCAGAATATATTGAA
ACAACTTCAAAAGCTTATACAGATGGAAAAATCAACATCGATCACTCTGGAGGATACGTTGCTCAATT
CAACATCTCTTGGGATGAAATAAATTATGATCCTGAAGGTAACGAAATTGTTCAACATAAAAACTGGA
GCGAAAACAATAAAAGTAAGCTAGCTCATTTCACATCGTCCATCTATTTGCCAGGTAACGCAAGAAAT
ATTAATGTTTACGCTAAAGAATGCACTGGTTTAGCTTGGGAATGGTGGAGAACGGTAATTGATGACCG
GAACCTACCGCTTGTGAAAAATAGAAATATCTCCATCTGGGGCACTACACTTTATCCGAAATATAGTA
ATAGTGTAGATAATCCAATCGAATAA，
检测引物：引物1hlyF：CGAGCCTAACATATCCAG，引物2hlyR：
GTAAGCCATTTCGTCATC；
金黄色葡萄球菌：
特异性基因：
ATGAAGTCAAATAAATCGCTTGCTATGATTGTGGTAGCCATCATTATTGTAGGTGTATTAGCATTTCA
ATTTATGAATCATACGGGTCCTTTCAAAAAGGGGACGAATCATGAAACTGTAGAAGATTTAAATGGTA
AAGATAAAGTACATGTTCAAAGAGTTGTGGATGGTGATACATTTATTGCAAATCAAAATGGTAAAGAA
ATTAAAGTTAGGCTTATAGGGGTTGATACGCCAGAAACGGTGAAACCGAATACGCCTGTACAACCATT
TGGCAAAGAAGCATCAAATTATAGTAAGAAGACATTAACAAATCAAGATGTTTATTTAGAATATGATA
AAGAAAAACAAGATCGCTATGGTAGAACATTGGCGTATGTATGGATAAGTAAAGATCGTATGTACAAT
AAGGAATTAGTGGAAAAGGGACTTGCTAGAGAGAAGTATTTTTCACCAAATGGCAAATATAGAAATGT
ATTTATAGAAGCACAAAATAAAGCTAAACAACAGAAATTAAATATTTGGAGTAAATAA，
检测引物：引物1nucF：AATCATACGGGTCCTTTC，引物2nucR：
CAATGTTCTACCATAGCG。
2.根据权利要求1所述的评估食源性致病微生物侵染叶类蔬菜的方法，其特征在于，采用乙醇、次氯酸钠、1000万单位农用链霉素300-500倍液、1％高锰酸钾、10％磷酸三钠、1％硫酸铜、福尔马林100倍液的一种或几种对所述种子消毒。
3.根据权利要求1-2之一所述的评估食源性致病微生物侵染叶类蔬菜的方法，其特征在于，所述使消毒后叶类蔬菜种子萌芽的方法为：用无菌水冲净消毒后的种子，将所述种子放入0.5％-0.8％重量琼脂培养皿中，其中含葡萄糖重量0.2％-0.5％；每皿20-30粒，20℃-28℃条件下，待所述种子发芽。
4.根据权利要求1-2之一所述的评估食源性致病微生物侵染叶类蔬菜的方法，其特征在于所述蔬菜为生菜、油菜、大白菜、甘蓝、菠菜、芹菜、快菜、茼蒿。
5.根据权利要求3所述的评估食源性致病微生物侵染叶类蔬菜的方法，其特征在于所述蔬菜为生菜、油菜、大白菜、甘蓝、菠菜、芹菜、快菜、苘蒿。
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Families Citing this family (4)
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|---|---|---|---|---|
| CN105525015A (zh) * | 2016-01-29 | 2016-04-27 | 郑州轻工业学院 | 用于沙门氏菌与大肠杆菌o157:h7的多重pcr-elisa检测试剂盒及应用 |
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102038121A (zh) * | 2010-08-31 | 2011-05-04 | 华南理工大学 | 蛭弧菌混合体菌液在消除蔬菜致病菌中的应用 |
| CN102399854A (zh) * | 2010-09-09 | 2012-04-04 | 上海海帝园艺有限公司 | 沙门氏菌的pcr检测方法及引物对 |
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-
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- 2014-04-18 CN CN201410155825.0A patent/CN103898230B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102038121A (zh) * | 2010-08-31 | 2011-05-04 | 华南理工大学 | 蛭弧菌混合体菌液在消除蔬菜致病菌中的应用 |
| CN102399854A (zh) * | 2010-09-09 | 2012-04-04 | 上海海帝园艺有限公司 | 沙门氏菌的pcr检测方法及引物对 |
| CN103667251A (zh) * | 2012-09-03 | 2014-03-26 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种高通量检测食源性致病菌的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 基于PCR技术的玉米丝轴黑粉菌侵染率及扩展进程的研究;倪深 等;《中国农业科学》;20061231;第39卷(第9期);1804-1809 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| CN103898230A (zh) | 2014-07-02 |
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