CN103898159A - 一种提高鱼类omega-3多不饱和脂肪酸的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高鱼类omega-3多不饱和脂肪酸的方法及应用，其步骤为：1，构建fat2转基因鱼类家系；2，构建fat1转基因鱼类家系；3，以两个转基因家系为亲本，杂交获得同时表达fat2和fat1基因的富含omega-3多不饱和脂肪酸的双转基因家系。在本方法中，通过转基因引入的fat2和fat1基因填补了鱼类体内从头合成多不饱和脂肪酸通路的断裂，使得转基因鱼获得从头合成omega-3多不饱和脂肪酸的能力，利用该方法可获得高omega-3多不饱和脂肪酸含量的鱼类产品，能有效运用到经济性鱼类的转基因育种中。

Description

一种提高鱼类omega-3多不饱和脂肪酸的方法及应用

技术领域

本发明属于水产经济动物基因工程育种技术领域，涉及一种提高鱼类omega-3多不饱和脂肪酸的方法及应用，具体涉及促进多不饱和脂肪酸合成的两个去饱和酶fat2和fat1重组基因，涉及这两个重组基因表达载体的制备方法，还涉及这两个重组基因共同配合使用的方法，以及该方法在鱼类基因工程育种中的用途。

背景技术

Omega-3多不饱和脂肪酸，包括DHA和EPA是一类有利于人体健康的脂肪酸。越来越多的流行病学和临床调查表明，EPA和DHA对很多疾病有预防和缓解的作用，这些疾病包括动脉粥样硬化、心血管疾病、中风、神经疾病、肥胖、2型糖尿病、癌症和自身免疫疾病。但是，包括人类在内的高等动物，缺少omega-3去饱和酶和delta-12去饱和酶，因此失去从头合成这类脂肪酸的能力(Nakamura,2004)，必需从食物中获取这类脂肪酸。

深海鱼类是omega-3脂肪酸的主要来源。从头合成的长链omega-3多不饱和脂肪酸的主要来源是海洋中的藻类，海洋鱼类通过摄食这些富含omega-3脂肪酸的海藻，使得omega-3多不饱和脂肪酸在它们体内积累。目前，海洋渔业资源逐渐地枯竭(FAO,2012)。鱼粉价格的上升，使得水产养殖中使用植物油脂和植物蛋白替代传统生产中使用的鱼油和鱼粉(Miller,2008)。这使得水产养殖鱼类中omega-3脂肪酸含量不断降低。这些矛盾和问题迫使人们不断寻找和开发新的omega-3脂肪酸的食物来源。

转基因技术作为一种新的育种手段(Chen,1996)(Fu,2005)(Zhu,2000)，可以赋予转基因动物本身不具备的能力。运用转基因技术促进鱼类多不饱和脂肪酸的合成已经在斑马鱼这种模式动物中尝试。这些研究的主要策略是通过转基因过表达涉及长链多不饱和脂肪酸合成的延长酶和去饱和酶(Alimuddin,2005;Alimuddin,2008;Alimuddin,2007;Kabeya,2014)，这些延长酶和去饱和酶能够以18:2n-6和18:3n-3底物，进一步合成长链的ARA、EPA和DHA多不饱和脂肪酸。

然而，包括斑马鱼在内的淡水鱼类自身拥有脂肪酸去饱和酶和延长酶(Monroig,2011)。淡水鱼从食物摄取短链不饱和脂肪酸（如18:2n-6,或18:3n-3）后，它们可以通过去饱和酶和延长酶生成长链多不饱和脂肪酸（20:4n-6,或20:5n-3）。并且omega-3长链多不饱和脂肪酸EPA和DHA的生成是底物浓度依赖(Senadheera,2011)(Thanuthong,2011)，即18:3n-3浓度依赖的。在鱼类中过表达脂肪酸去饱和酶和延长酶基因，从而提高长链多不饱和脂肪酸的合成通路活性，这种策略并不能从根本上解决鱼类缺少从头合成omega-3多不饱和脂肪酸能力的问题，即不能从头生成18:3n-3的能力。

fat2基因是线虫中的一个delta-12去饱和酶基因，它可以将18:1转化成18:2n-6(Peyou-Ndi,2000)，是一个填补不饱和脂肪酸从头合成通路断裂的一个重要的去饱和酶基因。fat1基因是在线虫中的一个omega-3去饱和酶，它可以将omega-6不饱和脂肪酸转变成omega-3不饱和脂肪酸(Spychalla,1997;Kang,2001),如将18:2n-6转变成18:3n-3；20:4n-6转变成20:5n-3。因此，我们提出，同时将两个脂肪酸去饱和酶fat2和fat1基因引入鱼类中，可以使鱼类获得从头合成omega3多不饱和脂肪酸的能力，即从18:1生成18:2n-6，18:2n-6生成18:3n-3；通过两个脂肪酸去饱和酶基因的同时配合作用，一方面fat2和fat1为omega-3长链多不饱和脂肪酸的生成提供更多的18:3n-3底物，另一方面，fat1基因还可以将omega-6长链多不饱和脂肪酸转变成omega-3长链多不饱和脂肪酸。因此，fat2和fat1重组基因的同时使用，可以增加鱼类的omega-3脂肪酸含量。这种方法为omega-3多不饱和脂肪酸的获取提供了新的食物来源。

发明内容

本发明的目的是提供了一种提高鱼类omega-3多不饱和脂肪酸的方法，方法简单，易行，可获得富含omega-3多不饱和脂肪酸的经济鱼类，适于大规模生产。

本发明的另一个目的是提供了一种提高鱼类omega-3多不饱和脂肪酸的方法的应用，通过将delta-12去饱和酶fat2基因和omega-3去饱和酶fat1基因通过转基因技术同时引入鱼类中，这两个基因的配合使用，填补了鱼类omega-3多不饱和脂肪酸合成通路的两处断裂，使鱼类获得从头合成omega-3多不饱和脂肪酸的能力。其中，鱼类密码子优化的delta-12脂肪酸去饱和酶（fat2）基因，delta-12去饱和酶可以将18:1转变成18:2n-6，从而填补了鱼类多不饱和脂肪酸从头合成通路的第一个断裂。omega-3去饱和酶fat1基因可以将18:2n-6和20:4n-6转化为18:3n-3和20:5n-3，填补了鱼类多不饱和脂肪酸从头合成通路的第二个断裂。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术措施：

设计和获得鱼类密码子优化的delta-12去饱和酶基因，其步骤如下：

1）根据线虫的delta-12去饱和酶基因的氨基酸序列和斑马鱼的密码子偏好，设计鱼类密码子优化的delta-12去饱和酶fat2基因序列，其序列为SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白质序列为SEQ ID NO.4所示。

2）人工合成鱼类密码子优化delta-12去饱和酶fat2基因序列。

构建fat2和fat1转基因表达载体，其具体步骤如下：

A、构建含有绿色荧光报告元件的转基因表达载体pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:EGFP-SV40poly(A)；

1）获得pTol2-SV40载体

设计含有多克隆位点的自退火引物：

MCS-F：CCGCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCT

MCS-R：CTATTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAA。

通过PCR自退火获得一段两侧含XhoI和XbaI酶切位点，中间含有SalI、EcoRI、HindIII和BamHI4个酶切位点的片段。用XhoI和XbaI酶切4xKGFP质粒(Distel,2009)，保留该质粒上的Tol2元件和SV40poly(A)终止序列，将该酶切片段与重叠延伸PCR所的片段连接，获得pTol2-SV40载体；

2）获得pTol2-CMV-SV40载体

设计扩增CMV启动子，并且两侧附XhoI和SalI位点的引物：

CMV-F：CCGCTCGAGGCGTTATCCCCTGATTCTGT

CMV-R：ACGCGTCGACCGGATCTGACGGTTCACTAA

以质粒pEGFP-N1（Invitrogen）为模板，用引物CMV-F和CMV-R通过PCR扩增出CMV启动子，酶切后插入pTol2-SV40载体，获得pTol2-CMV-SV40载体；

3）获得pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:EGFP-SV40poly(A)载体

设计引物重叠延伸PCR(Heckman,2007)引物：

SP1：GGAAGATCTGCGTTATCCCCTGATTCTGT

SP2：GTCTGGATCACTTGTACAGCTCGTCCATG

SP3：GCTGTACAAGTGATCCAGACATGATAAGATACA

SP4：CCGCTCGAGAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAAC

以质粒pEGFP-C1（Invitrogen）和pCS2+（Invitrogen）为模板，以引物SP1、SP2、SP3和SP4，通过重叠延伸PCR方法(Heckman,2007)通过两轮PCR获得CMV驱动EGFP表达，并且末端为SV40poly(A)信号的表达框，将这个表达框用BglII和XhoI酶切位点插入pTol2-CMV-SV40载体，最终获得pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:EGFP-SV40poly(A)载体；B、构建含有红色荧光报告元件的转基因表达载体pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:mCherry-SV40poly(A)；

设计扩增mCherry阅读框,并且两侧附NheI和XhoI酶切位点引物序列：

Cherry-F：CTAGCTAGCGCCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGG

Cherry-R：CCGCTCGAGAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAAC

以质粒TK5xC(Distel,2009)为模板，用引物Cherry-F和Cherry-R通过PCR扩增出mCherry片段。将PCR片段用NheI和XhoI酶切位点插入pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:EGFP-SV40poly(A)载体，将EGFP阅读框替换成为mCherry阅读框，获得pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:mCherry-SV40poly(A)表达载体；

C、构建fat2转基因表达载体pCMV:Cel.Fat2,CMV:mCherry；

设计扩增fat2阅读框，并两侧附HindIII和BamHI酶切位点的引物序列：

fat2Fr：CCCAAGCTTGCCGCCACCATGACCATCGCTACCAAAGTG

fat2Re：CGCGGATCCTTACTGTGCCTTCTTTGCC

以质粒fat2_pUC57为模板，用引物fat2Fr和fat2Re通过PCR将fat2基因扩增，通过HindIII和BamHI酶切位点将fat2克隆插入含有红色荧光报告元件的pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:mCherry-SV40poly(A)转基因表达载体；

最终获得pCMV:fat2,CMV:mCherry表达载体，其序列为SED ID NO.2所示。

D、构建fat1转基因表达载体pCMV:fat1;CMV:EGFP,；

设计扩增fat1阅读框，并且两侧附EcoRI and XbaI酶切位点的引物：

fat1Fr：CCGGAATTCGCCGCCACCATGGTCGCTCATTCCAGCGAAG

fat1Re：GCAAAACCGGTGAAAACG

以质粒pCAGGS-fat1(Kang,2004)为模板，用引物fat1Fr和fat1Re通过PCR将fat1基因扩增，通过EcoRI and XbaI酶切位点将fat1克隆插入含有绿色荧光报告元件的pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:EGFP-SV40poly(A)转基因表达载体，最终获得pCMV:fat1;CMV:EGFP表达载体，其序列为SED ID NO.3所示。

一种提高鱼类omega-3多不饱和脂肪酸的方法，其具体步骤如下：

A、建立fat2和fat1基因的转基因鱼家系，即Tg(CMV:fat2;CMV:mCherry)和Tg(CMV:fat1;CMV:EGFP)：

具体为：通过显微注射法(Zhu,1985)将fat2和fat1转基因表达载体pCMV:fat2,CMV:mCherry和pCMV:fat1;CMV:EGFP分别导入鱼类受精卵中，筛选出F0代转基因鱼；

所述的表达载体pCMV:fat2,CMV:mCherry的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；

所述的表达载体pCMV:fat1;CMV:EGFP的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示；

B、将步骤A中获得的F0代转基因鱼饲养至性成熟与野生型鱼交配，筛选出F1代转基因鱼，将F1代转基因鱼再与野生型鱼交配，筛选出F2代转基因鱼；

筛选方法：利用fat2和fat1基因转基因表达载体上存在的红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白报告基因，方便快捷地初步筛选获得表达fat2和fat1的转基因鱼。通过转基因PCR法和反转录PCR法进一步确证fat2和fat1的转基因鱼的成功获得;

设计fat2转基因鱼的检测引物：

fat2-F：AGACTATGAGTGGCTGAACG

fat2-R：GGGATGTCCTTTGTCCTTCT

设计fat1转基因鱼的检测引物：

fat1-F：TCTCCGATAATCAGAATCTCAATG

fat1-R：CGAAGAAAGAAAGTGGAACCC

C、步骤B中获得转基因F2或F1代鱼为亲本，杂交筛选出同时表达fat2和fat1的双转基因鱼即可。

一种提高鱼类omega-3多不饱和脂肪酸的方法在制备富含omega-3多不饱和脂肪酸斑马鱼中的应用，其步骤如下

将fat2和fat1的双转基因鱼、fat2转基因鱼、fat1转基因鱼和野生型鱼饲养于同一个鱼缸（鱼塘）中，投喂EPA和DHA低含量的饲料。比较fat2和fat1的双转基因鱼、fat2单转基因鱼、fat1单转基因鱼和野生型鱼的肌肉组织中脂肪酸组分的差异。

所述的鱼为斑马鱼、黄颡鱼、鲤鱼或团头鲂。

与现有技术相比，本发明专利具有如下优点和效果：

在水产养殖中，投喂高含量鱼油饲料可以获得富含omega-3多不饱和脂肪酸的养殖鱼类。鱼油来自于海洋捕捞的海水鱼类，随着海洋渔业资源的逐渐枯竭，这种办法显然是不可持续型的，并且不利于海洋资源保护。

通过转基因过表达涉及长链多不饱和脂肪酸合成的延长酶和去饱和酶，提高鱼类从18:2n-6和18:3n-3生成20:4n-6和20:5n-3的长链不饱和脂肪酸生成通路活性的这种策略，不能从根本上解决鱼类缺乏从头生成omega-3多不饱和脂肪酸能力的问题。

本发明专利通过基因工程的方法，即在鱼类中同时引入delat-12去饱和酶fat2基因和omega-3去饱和酶fat1基因，填补了鱼类omega-3多不饱和脂肪酸从头合成通路的断裂，赋予鱼类从头合成omega-3多不饱和脂肪酸的能力。这种基因工程育种方法赋予转基因动物新的能力，并且是一种适应当下资源环境要求的能力的基因工程育种方法。这也体现出基因工程方法在可持续发展，保护资源方面无法比拟的优势。

另外一方面，本发明专利从根本上解决了鱼类缺乏从头生成omega-3多不饱和脂肪酸能力的问题。在斑马鱼中通过转基因过表达脂肪酸延长酶和去饱和酶，DHA含量增加10%到26.8%。而本发明专利中，DHA可增加180%。由此可见，赋予鱼类从头合成omega-3多不饱和脂肪酸的能力的优势。

附图说明

图1为本发明构建fat2和fat1基因表达载体示意图。

其中A为fat2基因表达载体示意图，B为fat1基因表达载体示意图；CMV真核表达启动子，fat2为鱼类密码子优化的delta-12脂肪酸去饱和酶基因，mCherry为红色荧光蛋白基因，SV40poly(A)为稳定mRNA的3’端序列，Tol2为Tol2转座子转座元件。

图2为野生型和转基因斑马鱼胚胎示意图。

其中A为36hpf野生型斑马鱼胚胎，B为红色荧光蛋白标记36hpf的fat2转基因斑马鱼胚胎，C为绿色荧光蛋白标记36hpf的fat1转基因斑马鱼胚胎，D为红色和绿色荧光蛋白同时标记的36hpf的fat2和fat1转基因斑马鱼胚胎。

图3为fat2和fat1基因在转基因斑马鱼肌肉组织中的表达。

其中A为fat2基因在Tg(CMV:fat2;CMV:mCherry)转基因斑马鱼肌肉组织中的表达，泳道1-3：fat2转基因，泳道4：野生型，B为fat1基因在Tg(CMV:fat1;CMV:EGFP)转基因斑马鱼肌肉组织中的表达，泳道1-3：fat1转基因，泳道4：野生型，C为fat2和fat1基因在Tg(CMV:fat1;CMV:EGFP)/Tg(CMV:fat2;CMV:mCherry)双转基因斑马鱼肌肉组织中的表达，泳道1-3：双转基因，泳道4：野生型。

图4为转基因斑马鱼肌肉组织中的脂肪酸组成。

注：*表示统计学上有显著差异（P<0.05）,***表示统计学上有非常显著性差异（P<0.005）。

图5为fat2和fat1双转基因填补了鱼类中多不饱和脂肪酸从头合成的断裂示意图。

在斑马鱼的体内，脂肪酸去饱和酶fadsd2基因和脂肪酸延长酶elovl2、elovl5基因经过一系列的连续反应，将18:2n-6和18:3n-3转化成20:4n-6和20:5n-3。20:5n-3生成22:6n-3可能存在Δ4去饱和酶通路或Δ6去饱和酶通路。fat2可以将18:1转化成18:2n-6，fat1可以将18:2n-6和20:4n-6转化成18:3n-3和20:5n-3。缺少delta-12去饱和酶fat2和omega-3去饱和酶fat1基因导致omega-3长链多不饱和脂肪酸合成通路断裂。

具体实施方式

本发明所述的试剂，如未特别说明，均购自生化商店，所述实验步骤，如未特别说明，均为本领域的常规步骤。

实施例1：

设计和获得鱼类密码子优化的delta-12去饱和酶基因

1）根据线虫的delta-12去饱和酶fat2基因的氨基酸序列(GenBank:AF240777.1)和斑马鱼的密码子使用偏好，设计鱼类密码子优化的delta-12去饱和酶基因序列，其序列为SEQ ID NO.1所示。

2）鱼类密码子优化delta-12去饱和酶fat2基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示。

3）人工合成鱼类密码子优化delta-12去饱和酶fat2基因序列（上海金斯瑞公司），fat2基因序列插入到pUC57载体中。

实施例2：

fat2和fat1转基因表达载体的构建：

A、构建含有绿色荧光报告元件的转基因表达载体pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:EGFP-SV40poly(A)

1）获得pTol2-SV40载体

设计含有多克隆位点的自退火引物：

MCS-F：CCGCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCT

MCS-R：CTATTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAA

通过PCR自退火获得一段两侧含XhoI和XbaI酶切位点，中间含有SalI、EcoRI、HindIII和BamHI4个酶切位点的片段。PCR自退火的条件是：MCS-F和MCS-R按照1：1混合，各自终浓度为50uM，以0.5℃/30秒的降温速度，从95℃下降至16℃。即95℃维持30秒，94.5℃维持30秒，94℃维持30秒，温度依次下降至16℃。

用XhoI和XbaI酶切4xKGFP质粒，保留该质粒上的Tol2元件和SV40poly(A)终止序列，将该酶切片段与自退火所的片段连接，获得pTol2-SV40载体，具体操作：

在37℃水浴条件下，用限制性内切酶XhoI和XbaI(Takara)双酶切4xKGFP质粒中4-6小时，参照Axygen公司的DNA胶回收试剂盒回收酶切产物。在室温中，将回收的DNA载体骨架和PCR自退火的多克隆位点片段，用T4连接酶(NEB)连接30分钟，然后将连接产物转化大肠杆菌TOP10菌株（购自Invitrogen公司）。转化的具体过程为：在冰上将连接产物加入冰上融解的感受态细胞中，轻混匀；冰浴30分钟；42℃热激90秒，冰浴2分钟；加入800ul LB培养基，37℃，120rpm培养45分钟；涂平板，37℃培养12-16h（常规方法，分子克隆实验指南，第二版，J.萨姆布鲁克等著，科学出版社，1993）。

用引物M13-F:GTAAAACGACGGCCAG，和M13-R：CAGGAAACAGCTATGAC进行PCR筛选阳性克隆，扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃复性30秒，72℃延伸100秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存。阳性克隆的扩增产物片段大小为1600bp。将阳性克隆送交上海英俊公司测定，获得pTol2-SV40载体。

2）获得pTol2-CMV-SV40载体

设计扩增CMV启动子，并且两侧附XhoI和SalI位点的引物：

CMV-F：CCGCTCGAGGCGTTATCCCCTGATTCTGT

CMV-R：ACGCGTCGACCGGATCTGACGGTTCACTAA

以质粒pEGFP-N1（Invitrogen）为模板，用引物CMV-F和CMV-R通过PCR扩增出CMV启动子。PCR扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃复性30秒，72℃延伸40秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存。扩增产物片段大小为575bp，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）PCR产物。

将CMV启动子DNA片段在37℃水浴中用限制性内切酶XhoI和SalI(Takara)双酶切4-6小时，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）酶切产物。

37℃水浴条件下，用限制性内切酶XhoI和SalI(Takara)双酶切pTol2-SV40载体4-6小时，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）酶切产物。

在室温中,将回收的pTol2-SV40载体骨架和CMV启动子DNA片段，用T4连接酶(NEB)连接30分钟，最后将连接产物转化大肠杆菌TOP10菌株。

用引物CMV-N-F:CTCTGCTTATATAGACCTCCCA，和M13-R：CAGGAAACAGCTATGAC进行PCR筛选阳性克隆，扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，56℃复性30秒，72℃延伸60秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存，阳性克隆的扩增产物片段大小为928bp。将阳性克隆送交上海英俊公司测定，获得pTol2-CMV-SV40载体。

3）获得pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:EGFP-SV40poly(A)载体。

设计引物重叠延伸PCR引物：

SP1：GGAAGATCTGCGTTATCCCCTGATTCTGT

SP2：GTCTGGATCACTTGTACAGCTCGTCCATG

SP3：GCTGTACAAGTGATCCAGACATGATAAGATACA

SP4：CCGCTCGAGAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAAC

以质粒pEGFP-C1（Invitrogen）和pCS2+（Invitrogen）为模板，以引物SP1、SP2、SP3和SP4，通过重叠延伸PCR方法，通过两轮PCR获得CMV驱动EGFP表达，并且末端为SV40poly(A)信号的表达框，将这个表达框用BglII和XhoI酶切位点插入pTol2-CMV-SV40载体，最终获得pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:EGFP-SV40poly(A)载体，具体操作如下：

以质粒pEGFP-C1（Invitrogen）为模板，用引物SP1和SP2通过PCR扩增出CMV启动子驱动EGFP表达的DNA序列。PCR扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃复性90秒，72℃延伸90秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存。扩增产物片段大小为1330bp，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）PCR产物。

以质粒pCS2+（Invitrogen）为模板，用引物SP3和SP4通过PCR扩增出SV40poly(A)信号。PCR扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃复性30秒，72℃延伸20秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存。扩增产物片段大小为196bp，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）PCR产物。

以50ng的CMV启动子驱动EGFP表达的DNA和50ng的SV40poly(A)信号DNA为PCR反应模板，用引物SP1和SP4通过PCR扩增出CMV驱动EGFP表达，并且末端为SV40poly(A)信号的表达框。PCR扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，58℃复性30秒，72℃延伸120秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存。扩增产物片段大小为1529bp，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）PCR产物。

37℃水浴条件下，用限制性内切酶BglII和XhoI(Takara)双酶切CMV驱动EGFP表达，并且末端为SV40poly(A)信号的表达框的PCR产物4-6小时，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）酶切产物。

37℃水浴条件下，用限制性内切酶BglII和XhoI(Takara)双酶切pTol2-CMV-SV40载体4-6小时，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）酶切产物。在室温中,将回收的pTol2-CMV-SV40载体骨架和CMV驱动EGFP表达，并且末端为SV40poly(A)信号的表达框的酶切DNA片段，用T4连接酶(NEB)连接30分钟，最后将连接产物转化大肠杆菌TOP10菌株。

用引物EGFP-F:GGATGTTGCCGTCCTCCTTG，和M13-R：CAGGAAACAGCTATGAC进行PCR筛选阳性克隆，扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃复性30秒，72℃延伸90秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存，阳性克隆的扩增产物片段大小为1300bp。将阳性克隆送交上海英俊公司测定，最终获得pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:EGFP-SV40poly(A)载体。

B、构建含有红色荧光报告元件的转基因表达载体pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:mCherry-SV40poly(A)

设计扩增mCherry阅读框,并且两侧附NheI和XhoI酶切位点引物序列：

Cherry-F：CTAGCTAGCGCCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGG

Cherry-R：CCGCTCGAGAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAAC

以质粒TK5xC(Distel,2009)为模板，用引物Cherry-F和Cherry-R通过PCR扩增出mCherry片段。将PCR片段用NheI和XhoI酶切位点插入pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:EGFP-SV40poly(A)载体，将EGFP阅读框替换成为mCherry阅读框，获得pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:mCherry-SV40poly(A)表达载体，具体操作如下：

以质粒TK5xC为模板，用引物Cherry-F和Cherry-R通过PCR扩增出mCherry片段。PCR扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，54℃复性30秒，72℃延伸45秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存。扩增产物片段大小为720bp，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）PCR产物。

37℃水浴条件下，用限制性内切酶NheI和XhoI(Takara)双酶切mCherry DNA片段4-6小时，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）酶切产物。

37℃水浴条件下，用限制性内切酶NheI和XhoI(Takara)双酶切pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:EGFP-SV40poly(A)载体4-6小时，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）酶切产物。

在室温中,将回收的pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:EGFP-SV40poly(A)载体骨架和mCherry DNA片段，用T4连接酶(NEB)连接30分钟，最后将连接产物转化大肠杆菌TOP10菌株。

利用引物mCherryN-F:CACGGAGCCCTCCATGTGC，和M13-R：CAGGAAACAGCTATGAC进行PCR筛选阳性克隆，扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃复性30秒，72℃延伸60秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存，阳性克隆的扩增产物片段大小为970bp。将阳性克隆送交上海英俊公司测定，最终获得pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:mCherry-SV40poly(A)表达载体。

C、构建fat2转基因表达载体pCMV:fat2,CMV:mCherry,其序列为SED ID NO.2所示；

设计扩增fat2阅读框，并两侧附HindIII和BamHI酶切位点的引物序列：

fat2Fr：CCCAAGCTTGCCGCCACCATGACCATCGCTACCAAAGTG

fat2Re：CGCGGATCCTTACTGTGCCTTCTTTGCC

以质粒fat2_pUC57为模板，用引物fat2Fr和fat2Re通过PCR将fat2基因扩增，通过HindIII和BamHI酶切位点将fat2克隆插入含有红色荧光报告元件的pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:mCherry-SV40poly(A)转基因表达载体，具体操作如下：

以质粒fat2_pUC57为模板，用引物fat2Fr和fat2Re通过PCR将fat2基因扩增，PCR扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，54℃复性30秒，72℃延伸80秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存。扩增产物片段大小为1131bp，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）PCR产物。

在37℃水浴条件下，用限制性内切酶HindIII和BamHI(Takara)双酶切fat2DNA片段4-6小时，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）酶切产物。

在37℃水浴条件下，用限制性内切酶HindIII和BamHI(Takara)双酶切pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:mCherry-SV40poly(A)载体4-6小时，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）酶切产物。

在室温中,将回收的pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:mCherry-SV40poly(A)载体骨架和fat2DNA片段，用T4连接酶(NEB)连接30分钟，最后将连接产物转化大肠杆菌TOP10菌株。

用引物M13-F：GTAAAACGACGGCCAG和fat2R:CCCTGGGTCACAGAGGAAGA进行PCR筛选阳性克隆，扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，54℃复性30秒，72℃延伸120秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存，阳性克隆的扩增产物片段大小为1955bp。将阳性克隆送交上海英俊公司测定，最终获得pCMV:fat2,CMV:mCherry转基因表达载体，其序列为SEQ ID NO.2所示，载体示意图见图1中A。

D、构建fat1转基因表达载体pCMV:Cel.Fat1,CMV:EGFP,其序列为SED ID NO.3所示；

设计扩增fat1阅读框，并且两侧附EcoRI and XbaI酶切位点的引物：

fat1Fr：CCGGAATTCGCCGCCACCATGGTCGCTCATTCCAGCGAAG

fat1Re：GCAAAACCGGTGAAAACG

从质粒pCAGGS-fat1(Kang,2004)为模板，用引物fat1Fr和fat1Re通过PCR将fat1基因扩增，通过EcoRI and XbaI酶切位点将fat1克隆插入含有绿色荧光报告元件的pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:EGFP-SV40poly(A)转基因表达载体,具体操作如下：

从质粒pCAGGS-fat1为模板，用引物fat1Fr和fat1Re通过PCR将fat1基因扩增，PCR扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，58℃复性30秒，72℃延伸80秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存。扩增产物片段大小为1206bp，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）PCR产物。

在37℃水浴条件下，用限制性内切酶EcoRI and XbaI(Takara)双酶切fat1DNA片段4-6小时，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）酶切产物。

在37℃水浴条件下，用限制性内切酶EcoRI and XbaI(Takara)双酶切pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:EGFP-SV40poly(A)载体4-6小时，DNA清洁试剂盒回收（Axygen）酶切产物。

在室温中,将回收的pTol2-CMV-SV40poly(A);CMV:EGFP-SV40poly(A)载体骨架和fat1DNA片段，用T4连接酶(NEB)连接30分钟，最后将连接产物转化大肠杆菌TOP10菌株。

利用引物M13-F：GTAAAACGACGGCCAG和fat1-R：TCTCCGATAATCAGAATCTCAATG进行PCR筛选阳性克隆，扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，54℃复性30秒，72℃延伸140秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存，阳性克隆的扩增产物片段大小为2086bp。将阳性克隆送交上海英俊公司测定，最终获得pCMV:fat1,CMV:EGFP转基因表达载体，其序列为SEQ ID NO.3所示，载体示意图见图1中B。

实施例3：

一种提高斑马鱼omega-3多不饱和脂肪酸的方法，其步骤是：

A、建立fat2和fat1基因的转基因斑马鱼家系，即Tg(CMV:fat2,CMV:mCherry)和Tg(CMV:fat1,CMV:EGFP)：

1）通过显微注射法(Zhu,1985)将fat2和fat1转基因表达载体分别导入斑马鱼受精卵中。

将25ng/ul的转基因载体DNA和25ng/ul的Tol2转座酶RNA的混合液注射入1细胞期的受精的斑马鱼胚胎中，注射24小时后，将表达红色或绿色荧光蛋白的胚胎挑选出来饲养至性成熟。

2）筛选转基因成功的斑马鱼。

利用fat2和fat1基因转基因表达载体上存在的红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白报告基因，方便快捷地初步筛选获得表达fat2和fat1的转基因斑马鱼。即将转基因F0代与野生型鱼交配，获得它们的子代胚胎，将表达红色或绿色荧光蛋白的子代胚胎饲养成熟，获得转基因F1代转基因鱼(Xiong,2013)。结果见图2中B、C。以相同方法获得F2代转基因鱼。

3）通过反转录PCR法进一步确证fat2和fat1的转基因鱼的成功获得：

设计fat2转基因鱼的检测引物：

fat2-F：AGACTATGAGTGGCTGAACG

fat2-R：GGGATGTCCTTTGTCCTTCT

设计fat1转基因鱼的检测引物：

fat1-F：TCTCCGATAATCAGAATCTCAATG

fat1-R：CGAAGAAAGAAAGTGGAACCC

用Trizol(Invitrogen)提取转基因阳性胚胎的总RNA。37℃水浴条件下用DNase I(Promega)酶切总RNA,去除总RNA中的基因组DNA的污染。以Oligod(T)为反转录引物，用反转录酶ReverTra Ace（TOYOBO）获得cDNA。反应条件为42℃孵育60分钟。PCR检测cDNA中fat2和fat1基因，PCR扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，58℃复性30秒，72℃延伸30秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存。扩增产物片段大小分别为102bp和423bp。结果见图3。

B、以fat2和fat1转基因F2代斑马鱼为亲本，杂交获得同时表达fat2和fat1的双转基因斑马鱼。通过红色和绿色荧光蛋白以及反转录PCR确定fat2和fat1双转基因斑马鱼的获得。结果见图2中D和图3中C。

实施例4：一种提高斑马鱼omega-3多不饱和脂肪酸的方法在制备富含omega-3多不饱和脂肪酸斑马鱼中的应用，其步骤如下：

A、将实施例3中制备的fat2和fat1的双转基因斑马鱼、fat2转基因斑马鱼、fat1转基因斑马鱼和野生型斑马鱼饲养于同一个鱼缸（鱼塘）中，投喂EPA(0.2%)和DHA(0%)低含量的饲料。

B、检测转基因斑马鱼肌肉组织中的脂肪酸含量。

在4℃条件下，用含有0.005%丁基羟基甲苯（Sigma）抗氧化剂的氯仿/甲醇（2：1）溶液抽提斑马鱼肌肉的总脂肪酸，氮气吹走有机溶剂。甲酯化总脂肪酸，即在100℃水浴条件下，用含有5%硫酸的甲醇溶液处理总脂肪酸1h。

用气象色谱(TRACE GC,Thermo Scientific)定量分析甲酯化的总脂肪酸组分。气象色谱以FID为检测器，氮气为载气，条件是40℃/分钟的升温速度从50℃升温至170℃，然后以18℃/分钟的升温速度升温至210℃，210℃维持28分钟。

fat2单转基因斑马鱼肌肉组织中，18:1与野生型相比减少10.3%(25.3%vs.28.2%;P<0.05)，18:2n-6含量与野生型相比增加30.8%(11.9%vs.9.1%;P<0.05)。这表明在斑马鱼中，Fat2去饱和酶能有效地将18:1转化成为18:2n-6。结果见图4

fat1单转基因斑马鱼肌肉组织中，18:3n-3含量与野生型相比增加52.5%(9.0%vs.5.9%;P<0.005)，20:5n-3含量与野生型相比增加81.3%(2.9%vs.1.6%;P<0.005)，22:6n-3含量与野生型相比增加135.2%(12.7%vs.5.4%;P<0.005)。同时，18:2n-6含量与野生型相比减少14.3%(7.8%vs.9.1%;P<0.005)。这表明在斑马鱼中，Fat1去饱和酶能有效地将n-6PUFA转化成为n-3PUFA。结果见图4。

fat2和fat1的双转基因斑马鱼肌肉组织中，18:1含量与野生型相比减少了37.6%(17.6%vs.28.2%;P<0.005)，18:2-6含量与野生型相比没有明显改变(9.7%vs.9.1%;P>0.05),但是与fat2单转基因斑马相比，减少了18.5%(9.7%vs.11.9%;P<0.005)，表明部分18:2-6被Fat1转化成18:3n-3。18:3n-3含量与野生型相比增加45.8%(8.6%vs.5.9%;P<0.05)，20:5n-3含量与野生型相比增加68.8%(2.7%vs.1.6%;P<0.005)，22:6n-3含量与野生型相比增加175.9%(14.9%vs.5.4%;P<0.005)。22:6n-3含量与fat1单独转基因相比增加了17.3%。这表明，fat2和fat1共同配合使用，能有效提高鱼类体内的omega-3多不饱和脂肪酸含量。结果见图4。

实施例5：

一种提高鲤鱼、团头鲂或黄颡鱼omega-3多不饱和脂肪酸的方法，其步骤是：

A、建立fat2和fat1基因的转基因鲤鱼、团头鲂或黄颡鱼家系，即Tg(CMV:fat2;CMV:mCherry)和Tg(CMV:fat1;CMV:EGFP)。

具体为：通过显微注射法(Zhu,1985)将fat2和fat1转基因表达载体（pCMV:fat2,CMV:mCherry和pCMV:fat1;CMV:EGFP表达载体）分别导入鲤鱼、团头鲂或黄颡鱼受精卵中，将表达红色或绿色荧光蛋白的胚胎挑选出来饲养至性成熟。将这些鱼饲养至性成熟，与野生型鱼交配，获得它们的子代胚胎(Xiong,2013);

B、利用fat2和fat1基因转基因表达载体上存在的红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白报告基因，方便快捷地初步筛选获得表达fat2和fat1的转基因鲤鱼、团头鲂或黄颡鱼。即将转基因F0代与野生型鱼交配，获得它们的子代胚胎，将表达红色或绿色荧光蛋白的子代胚胎饲养成熟，获得转基因F1代转基因鱼，以相同方法获得F2代转基因鱼。通过转基因PCR法和反转录PCR法进一步确证fat2和fat1的转基因鱼的成功获得;

设计fat2转基因鱼的检测引物：

fat2-F：AGACTATGAGTGGCTGAACG

fat2-R：GGGATGTCCTTTGTCCTTCT

设计fat1转基因鱼的检测引物：

fat1-F：TCTCCGATAATCAGAATCTCAATG

fat1-R：CGAAGAAAGAAAGTGGAACCC

用Trizol(Invitrogen)提取转基因阳性鲤鱼、团头鲂或黄颡鱼胚胎的总RNA。37℃水浴条件下用DNase I(Promega)酶切总RNA,去除总RNA中的基因组DNA的污染。以Oligod(T)为反转录引物，用反转录酶ReverTra Ace（TOYOBO）获得cDNA。反应条件为42℃孵育60分钟。PCR检测cDNA中fat2和fat1基因，PCR扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，58℃复性30秒，72℃延伸30秒，30个循环；72℃延伸10分钟；16℃保存。扩增产物片段大小分别为102bp和423bp。

C、以fat2和fat1转基因F2代鱼为亲本，杂交获得同时表达fat2和fat1的双转基因鲤鱼、团头鲂或黄颡鱼，通过红色和绿色荧光蛋白以及反转录PCR确定fat2和fat1双转基因的获得。

实施例6：

一种提高鲤鱼、团头鲂或黄颡鱼omega-3多不饱和脂肪酸的方法在制备富含omega-3多不饱和脂肪酸鲤鱼、团头鲂或黄颡鱼中的应用，其步骤如下：

A、将实施例5中制备的双转基因鲤鱼、团头鲂或黄颡鱼与其对应的野生鱼饲养于同一个鱼塘中，投喂EPA(0.2%)和DHA(0%)低含量的饲料。

B、检测转基因斑马鱼肌肉组织中的脂肪酸含量。

在4℃条件下，用含有0.005%丁基羟基甲苯（Sigma）抗氧化剂的氯仿/甲醇（2：1）溶液抽提鲤鱼肌肉的总脂肪酸，氮气吹走有机溶剂。甲酯化总脂肪酸，即在100℃水浴条件下，用含有5%硫酸的甲醇溶液处理总脂肪酸1h。

用气象色谱(TRACE GC,Thermo Scientific)定量分析甲酯化的总脂肪酸组分。气象色谱以FID为检测器，氮气为载气，条件是40℃/分钟的升温速度从50℃升温至170℃，然后以18℃/分钟的升温速度升温至210℃，210℃维持28分钟。

fat2和fat1双转基因鲤鱼肌肉组织中，18:3n-3含量与野生型相比增加6.3倍，20:5n-3含量与野生型相比增加3.8倍，22:6n-3含量与野生型相比增加57%。

fat2和fat1双转基因团头鲂和黄颡鱼和肌肉组织中，与野生型相比omega-3多不饱和脂肪酸（22:6n-3）的含量均显著增加。

              SEQUENCE LISTING

 

<110>  中国科学院水生生物研究所

<120>  一种提高鱼类omega-3多不饱和脂肪酸的方法及应用

<130>  一种提高鱼类omega-3多不饱和脂肪酸的方法及应用

<160>  4    

<170>  PatentIn version 3.1

<210>  1

<211>  1131

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  1

atgaccatcg ctaccaaagt gaataccaac aaaaaggatc tggatacaat caaagtgccc     60

gaactgccct ctgtcgctgc cgtgaaggct gccatcccag agcactgttt cgtgaaggac    120

cccctgacaa gcatctctta tctgattaaa gattacgtgc tgctggccgg cctgtatttt    180

gcagtcccct atatcgagca ttacctgggc tggattggtc tgctgggatg gtactgggca    240

atgggcatcg tgggtagcgc tctgttctgt gtcggccacg actgcggaca tggctccttt    300

tcagactatg agtggctgaa cgatctgtgc ggtcacctgg cacatgctcc aatcctggca    360

cctttctggc catggcagaa gtctcacaga cagcaccatc agtacacctc ccacgtggag    420

aaggacaaag gacatccctg ggtcacagag gaagattata acaataggac cgctatcgaa    480

aaatactttg ccgtgatccc catttcaggc tggctgcgct ggaatcctat ctatactatt    540

gtcggactgc ccgacggcag tcacttttgg ccttggagca gactgttcga gacaaccgaa    600

gatagggtga agtgtgctgt gtcaggtgtc gcctgtgcaa tctgcgctta cattgccttt    660

gtgctgtgcg attatagtgt gtacactttc gtcaaatact attacatccc tctgctgttt    720

cagggactga ttctggtgat cattacatat ctgcagcacc agaacgagga catcgaagtg    780

tacgaggccg atgaatgggg tttcgtccgc ggacagactc agacaattga cagacattgg    840

ggttttggac tggataatat catgcacaac attactaatg gccatgtggc ccaccatttc    900

tttttcacaa agatcccaca ctaccatctg ctggaggcaa cccctgctat taagaaagca    960

ctggaaccac tgaaggacac ccagtatgga tacaaaaggg aggtgaacta taattggttt   1020

ttcaagtatc tgcactacaa cgtcaccctg gattacctga ctcataaagc caagggtgtc   1080

ctgcagtata gaagtggcgt ggaagccgca aaggcaaaga aggcacagta a            1131

<210>  2

<211>  8255

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  2

caggaaacag ctatgaccat gattacgcca agcgcgcaat taaccctcac taaagggaac     60

aaaagctgga gctccaccgc ggcagaggtg taaaaagtac tcaaaaattt tactcaagtg    120

aaagtacaag tacttaggga aaattttact caattaaaag taaaagtatc tggctagaat    180

cttacttgag taaaagtaaa aaagtactcc attaaaattg tacttgagta ttagatctgc    240

gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccatg cattagttat taatagtaat    300

caattacggg gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg    360

taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt    420

atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac    480

ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg    540

acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact    600

ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt    660

ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc    720

ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc    780

gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata    840

taagcagagc tggtttagtg aaccgtcaga tccgctagcg ccgccaccat ggtgagcaag    900

ggcgaggagg ataacatggc catcatcaag gagttcatgc gcttcaaggt gcacatggag    960

ggctccgtga acggccacga gttcgagatc gagggcgagg gcgagggccg cccctacgag   1020

ggcacccaga ccgccaagct gaaggtgacc aagggtggcc ccctgccctt cgcctgggac   1080

atcctgtccc ctcagttcat gtacggctcc aaggcctacg tgaagcaccc cgccgacatc   1140

cccgactact tgaagctgtc cttccccgag ggcttcaagt gggagcgcgt gatgaacttc   1200

gaggacggcg gcgtggtgac cgtgacccag gactcctccc tgcaggacgg cgagttcatc   1260

tacaaggtga agctgcgcgg caccaacttc ccctccgacg gccccgtaat gcagaagaag   1320

accatgggct gggaggcctc ctccgagcgg atgtaccccg aggacggcgc cctgaagggc   1380

gagatcaagc agaggctgaa gctgaaggac ggcggccact acgacgctga ggtcaagacc   1440

acctacaagg ccaagaagcc cgtgcagctg cccggcgcct acaacgtcaa catcaagttg   1500

gacatcacct cccacaacga ggactacacc atcgtggaac agtacgaacg cgccgagggc   1560

cgccactcca ccggcggcat ggacgagctg tacaagtaac tcgaccgatc ctgagaactt   1620

cagggtgagt ttggggaccc ttgattgttc tttctttttc gctattgtaa aattcatgtt   1680

atatggaggg ggcaaagttt tcagggtgtt gtttagaatg ggaagatgtc ccttgtatca   1740

ccatggaccc tcatgataat tttgtttctt tcactttcta ctctgttgac aaccattgtc   1800

tcctcttatt ttcttttcat tttctgtaac tttttcgtta aactttagct tgcatttgta   1860

acgaattttt aaattcactt ttgtttattt gtcagattgt aagtactttc tctaatcact   1920

tttttttcaa ggcaatcagg gtatattata ttgtacttca gcacagtttt agagaacaat   1980

tgttataatt aaatgataag gtagaatatt tctgcatata aattctggct ggcgtggaaa   2040

tattcttatt ggtagaaaca actacaccct ggtcatcatc ctgcctttct ctttatggtt   2100

acaatgatat acactgtttg agatgaggat aaaatactct gagtccaaac cgggcccctc   2160

tgctaaccat gttcatgcct tcttctcttt cctacagctc ctgggcaacg tgctggttgt   2220

tgtgctgtct catcattttg gcaaagaatt aattcctcga cggatcgtag atccagacat   2280

gataagatac attgatgagt ttggacaaac cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt   2340

tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc attataagct gcaataaaca   2400

agttaacaac aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg tgtgggaggt   2460

tttttctcga ggcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc atgcattagt   2520

tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt   2580

acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg cccattgacg   2640

tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg   2700

gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt   2760

acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg   2820

accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg   2880

gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt   2940

ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac   3000

tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg   3060

tgggaggtct atataagcag agctggttta gtgaaccgtc agatccggtc gacggtatcg   3120

ataagcttgc cgccaccatg accatcgcta ccaaagtgaa taccaacaaa aaggatctgg   3180

atacaatcaa agtgcccgaa ctgccctctg tcgctgccgt gaaggctgcc atcccagagc   3240

actgtttcgt gaaggacccc ctgacaagca tctcttatct gattaaagat tacgtgctgc   3300

tggccggcct gtattttgca gtcccctata tcgagcatta cctgggctgg attggtctgc   3360

tgggatggta ctgggcaatg ggcatcgtgg gtagcgctct gttctgtgtc ggccacgact   3420

gcggacatgg ctccttttca gactatgagt ggctgaacga tctgtgcggt cacctggcac   3480

atgctccaat cctggcacct ttctggccat ggcagaagtc tcacagacag caccatcagt   3540

acacctccca cgtggagaag gacaaaggac atccctgggt cacagaggaa gattataaca   3600

ataggaccgc tatcgaaaaa tactttgccg tgatccccat ttcaggctgg ctgcgctgga   3660

atcctatcta tactattgtc ggactgcccg acggcagtca cttttggcct tggagcagac   3720

tgttcgagac aaccgaagat agggtgaagt gtgctgtgtc aggtgtcgcc tgtgcaatct   3780

gcgcttacat tgcctttgtg ctgtgcgatt atagtgtgta cactttcgtc aaatactatt   3840

acatccctct gctgtttcag ggactgattc tggtgatcat tacatatctg cagcaccaga   3900

acgaggacat cgaagtgtac gaggccgatg aatggggttt cgtccgcgga cagactcaga   3960

caattgacag acattggggt tttggactgg ataatatcat gcacaacatt actaatggcc   4020

atgtggccca ccatttcttt ttcacaaaga tcccacacta ccatctgctg gaggcaaccc   4080

ctgctattaa gaaagcactg gaaccactga aggacaccca gtatggatac aaaagggagg   4140

tgaactataa ttggtttttc aagtatctgc actacaacgt caccctggat tacctgactc   4200

ataaagccaa gggtgtcctg cagtatagaa gtggcgtgga agccgcaaag gcaaagaagg   4260

cacagtaagg atccactagt tctagaacta tagtgagtcg tattactcga ccgatcctga   4320

gaacttcagg gtgagtttgg ggacccttga ttgttctttc tttttcgcta ttgtaaaatt   4380

catgttatat ggagggggca aagttttcag ggtgttgttt agaatgggaa gatgtccctt   4440

gtatcaccat ggaccctcat gataattttg tttctttcac tttctactct gttgacaacc   4500

attgtctcct cttattttct tttcattttc tgtaactttt tcgttaaact ttagcttgca   4560

tttgtaacga atttttaaat tcacttttgt ttatttgtca gattgtaagt actttctcta   4620

atcacttttt tttcaaggca atcagggtat attatattgt acttcagcac agttttagag   4680

aacaattgtt ataattaaat gataaggtag aatatttctg catataaatt ctggctggcg   4740

tggaaatatt cttattggta gaaacaacta caccctggtc atcatcctgc ctttctcttt   4800

atggttacaa tgatatacac tgtttgagat gaggataaaa tactctgagt ccaaaccggg   4860

cccctctgct aaccatgttc atgccttctt ctctttccta cagctcctgg gcaacgtgct   4920

ggttgttgtg ctgtctcatc attttggcaa agaattaatt cctcgacgga tcgtagatcc   4980

agacatgata agatacattg atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc agtgaaaaaa   5040

atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa   5100

taaacaagtt aacaacaaca attgcattca ttttatgttt caggttcagg gggaggtgtg   5160

ggaggttttt taattcgcgg ccgccaccgc ggattaccct gttatcccta agctccagct   5220

tttgttccct ttagtgaggg ttaattgcgc gtcgagccgg gcccaagtga tctccaaaaa   5280

ataagtactt tttgactgta aataaaattg taaggagtaa aaagtacttt tttttctaaa   5340

aaaatgtaat taagtaaaag taaaagtatt gatttttaat tgtactcaag taaagtaaaa   5400

atccccaaaa ataatactta agtacagtaa tcaagtaaaa ttactcaagt actttacacc   5460

tctgggtacc caattcgccc tatagtgagt cgtattacgc gcgctcactg gccgtcgttt   5520

tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc   5580

cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt   5640

tgcgcagcct gaatggcgaa tggaaattgt aagcgttaat attttgttaa aattcgcgtt   5700

aaatttttgt taaatcagct cattttttaa ccaataggcc gaaatcggca aaatccctta   5760

taaatcaaaa gaatagaccg agatagggtt gagtgttgtt ccagtttgga acaagagtcc   5820

actattaaag aacgtggact ccaacgtcaa agggcgaaaa accgtctatc agggcgatgg   5880

cccactacgt gaaccatcac cctaatcaag ttttttgggg tcgaggtgcc gtaaagcact   5940

aaatcggaac cctaaaggga gcccccgatt tagagcttga cggggaaagc cggcgaacgt   6000

ggcgagaaag gaagggaaga aagcgaaagg agcgggcgct agggcgctgg caagtgtagc   6060

ggtcacgctg cgcgtaacca ccacacccgc cgcgcttaat gcgccgctac agggcgcgtc   6120

aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca   6180

ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa   6240

aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt   6300

ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca   6360

gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag   6420

ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc   6480

ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca   6540

gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt   6600

aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct   6660

gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt   6720

aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga   6780

caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact   6840

tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc   6900

acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga   6960

gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt   7020

agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga   7080

gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact   7140

ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga   7200

taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt   7260

agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca   7320

aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct   7380

ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta   7440

gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct   7500

aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc   7560

aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca   7620

gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga   7680

aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg   7740

aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt   7800

cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag   7860

cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt   7920

tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt   7980

tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga   8040

ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta   8100

atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa   8160

tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat   8220

gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcaca                              8255

<210>  3

<211>  7695

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  3

caggaaacag ctatgaccat gattacgcca agcgcgcaat taaccctcac taaagggaac     60

aaaagctgga gctccaccgc ggcagaggtg taaaaagtac tcaaaaattt tactcaagtg    120

aaagtacaag tacttaggga aaattttact caattaaaag taaaagtatc tggctagaat    180

cttacttgag taaaagtaaa aaagtactcc attaaaattg tacttgagta ttagatctgc    240

gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccatg cattagttat taatagtaat    300

caattacggg gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg    360

taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt    420

atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac    480

ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg    540

acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact    600

ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt    660

ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc    720

ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc    780

gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata    840

taagcagagc tggtttagtg aaccgtcaga tccgctagcg ctaccggtcg ccaccatggt    900

gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga    960

cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa   1020

gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt   1080

gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca   1140

cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa   1200

ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa   1260

ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct   1320

ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat   1380

caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca   1440

ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct   1500

gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct   1560

ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtgatccag   1620

acatgataag atacattgat gagtttggac aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat   1680

gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg ctttatttgt aaccattata agctgcaata   1740

aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt ttatgtttca ggttcagggg gaggtgtggg   1800

aggttttttc tcgaggcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgccatgcat   1860

tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg   1920

cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt   1980

gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca   2040

atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc   2100

aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta   2160

catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac   2220

catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg   2280

atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg   2340

ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt   2400

acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc ggtcgacggt   2460

atcgataagc ttgatatcga attcgccgcc accatggtcg ctcattccag cgaagggctg   2520

tccgccacgg ctccggtcac cggcggcgat gtgctggtgg atgcccgtgc atctctggag   2580

gagaaggagg ccccccgcga cgtgaatgca aacactaaac aggccaccac tgaggagccc   2640

cgcatccagt tacccactgt ggatgccttc cgccgcgcaa ttcccgcaca ctgcttcgag   2700

agggacctcg tgaaatcaat caggtatctg gtgcaggact ttgcggcact gacaattctg   2760

tactttgccc ttcccgcctt tgagtacttt ggcctgtttg gttacctggt gtggaacatt   2820

tttatgggcg tttttggctt cgcgctgttc gtcgttggac acgactgtct tcacggctca   2880

ttctccgata atcagaatct caatgatttc attggacata tcgccttcag cccactcttc   2940

tctccctact tcccctggca gaaaagtcac aagctgcacc acgccttcac caaccacatc   3000

gacaaagatc atggacacgt gtggatacag gataaggatt gggaagcaat gcccagctgg   3060

aaaagatggt tcaatcctat tcctttctct ggctggctga aatggttccc tgtgtacact   3120

ctgttcggtt tctgcgatgg atcccacttc tggccttact cctcactgtt tgtgcgcaac   3180

tctgaacgcg ttcagtgtgt aatctctgga atctgctgct gtgtgtgcgc atatattgct   3240

ctaacaattg ctggaagcta ttccaattgg ttctggtact attgggttcc actttctttc   3300

ttcggcttga tgctcgtcat tgttacctat ctgcagcacg tcgacgacgt cgctgaggtg   3360

tacgaggctg atgaatggag cttcgtccgg ggacagaccc agaccatcga tcgttactat   3420

ggcctcggct tggacacaac gatgcaccat atcacagacg gacacgttgc ccaccacttc   3480

ttcaacaaaa tcccacatta ccatctcatc gaagcaaccg aaggtgtcaa aaaggtcttg   3540

gagccgttgt ccgacaccca atacgggtac aaatctcagg tgaactacga tttctttgcc   3600

cggttcctgt ggttcaacta caagctcgac tatctcgttc acaagaccgc cggaatcatg   3660

caattccgaa caactctcga ggagaaggca aaggccaagt gaaagaatat cccgtgccgt   3720

tctagaacta tagtgagtcg tattactcga ccgatcctga gaacttcagg gtgagtttgg   3780

ggacccttga ttgttctttc tttttcgcta ttgtaaaatt catgttatat ggagggggca   3840

aagttttcag ggtgttgttt agaatgggaa gatgtccctt gtatcaccat ggaccctcat   3900

gataattttg tttctttcac tttctactct gttgacaacc attgtctcct cttattttct   3960

tttcattttc tgtaactttt tcgttaaact ttagcttgca tttgtaacga atttttaaat   4020

tcacttttgt ttatttgtca gattgtaagt actttctcta atcacttttt tttcaaggca   4080

atcagggtat attatattgt acttcagcac agttttagag aacaattgtt ataattaaat   4140

gataaggtag aatatttctg catataaatt ctggctggcg tggaaatatt cttattggta   4200

gaaacaacta caccctggtc atcatcctgc ctttctcttt atggttacaa tgatatacac   4260

tgtttgagat gaggataaaa tactctgagt ccaaaccggg cccctctgct aaccatgttc   4320

atgccttctt ctctttccta cagctcctgg gcaacgtgct ggttgttgtg ctgtctcatc   4380

attttggcaa agaattaatt cctcgacgga tcgtagatcc agacatgata agatacattg   4440

atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc agtgaaaaaa atgctttatt tgtgaaattt   4500

gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt aacaacaaca   4560

attgcattca ttttatgttt caggttcagg gggaggtgtg ggaggttttt taattcgcgg   4620

ccgccaccgc ggattaccct gttatcccta agctccagct tttgttccct ttagtgaggg   4680

ttaattgcgc gtcgagccgg gcccaagtga tctccaaaaa ataagtactt tttgactgta   4740

aataaaattg taaggagtaa aaagtacttt tttttctaaa aaaatgtaat taagtaaaag   4800

taaaagtatt gatttttaat tgtactcaag taaagtaaaa atccccaaaa ataatactta   4860

agtacagtaa tcaagtaaaa ttactcaagt actttacacc tctgggtacc caattcgccc   4920

tatagtgagt cgtattacgc gcgctcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa   4980

aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt   5040

aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa   5100

tggaaattgt aagcgttaat attttgttaa aattcgcgtt aaatttttgt taaatcagct   5160

cattttttaa ccaataggcc gaaatcggca aaatccctta taaatcaaaa gaatagaccg   5220

agatagggtt gagtgttgtt ccagtttgga acaagagtcc actattaaag aacgtggact   5280

ccaacgtcaa agggcgaaaa accgtctatc agggcgatgg cccactacgt gaaccatcac   5340

cctaatcaag ttttttgggg tcgaggtgcc gtaaagcact aaatcggaac cctaaaggga   5400

gcccccgatt tagagcttga cggggaaagc cggcgaacgt ggcgagaaag gaagggaaga   5460

aagcgaaagg agcgggcgct agggcgctgg caagtgtagc ggtcacgctg cgcgtaacca   5520

ccacacccgc cgcgcttaat gcgccgctac agggcgcgtc aggtggcact tttcggggaa   5580

atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca   5640

tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc   5700

aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc   5760

acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt   5820

acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt   5880

ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg   5940

ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact   6000

caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg   6060

ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga   6120

aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg   6180

aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa   6240

tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac   6300

aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc   6360

cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca   6420

ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga   6480

gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta   6540

agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc   6600

atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc   6660

cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt   6720

cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac   6780

cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct   6840

tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact   6900

tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg   6960

ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata   7020

aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga   7080

cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag   7140

ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg   7200

agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac   7260

ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca   7320

acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg   7380

cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc   7440

gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa   7500

tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt   7560

ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt   7620

aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg   7680

gataacaatt tcaca                                                    7695

<210>  4

<211>  376

<212>  PRT

<213>  人工合成

<400>  4

Met Thr Ile Ala Thr Lys Val Asn Thr Asn Lys Lys Asp Leu Asp Thr

1               5                   10                  15     

Ile Lys Val Pro Glu Leu Pro Ser Val Ala Ala Val Lys Ala Ala Ile

            20                  25                  30         

Pro Glu His Cys Phe Val Lys Asp Pro Leu Thr Ser Ile Ser Tyr Leu

        35                  40                  45             

Ile Lys Asp Tyr Val Leu Leu Ala Gly Leu Tyr Phe Ala Val Pro Tyr

    50                  55                  60                  

Ile Glu His Tyr Leu Gly Trp Ile Gly Leu Leu Gly Trp Tyr Trp Ala

65                  70                  75                  80 

Met Gly Ile Val Gly Ser Ala Leu Phe Cys Val Gly His Asp Cys Gly

                85                  90                  95     

His Gly Ser Phe Ser Asp Tyr Glu Trp Leu Asn Asp Leu Cys Gly His

            100                 105                 110        

Leu Ala His Ala Pro Ile Leu Ala Pro Phe Trp Pro Trp Gln Lys Ser

        115                 120                 125             

His Arg Gln His His Gln Tyr Thr Ser His Val Glu Lys Asp Lys Gly

    130                 135                 140                

His Pro Trp Val Thr Glu Glu Asp Tyr Asn Asn Arg Thr Ala Ile Glu

145                 150                 155                 160

Lys Tyr Phe Ala Val Ile Pro Ile Ser Gly Trp Leu Arg Trp Asn Pro

                165                 170                 175    

Ile Tyr Thr Ile Val Gly Leu Pro Asp Gly Ser His Phe Trp Pro Trp

            180                 185                 190        

Ser Arg Leu Phe Glu Thr Thr Glu Asp Arg Val Lys Cys Ala Val Ser

        195                 200                 205            

Gly Val Ala Cys Ala Ile Cys Ala Tyr Ile Ala Phe Val Leu Cys Asp

    210                 215                 220                

Tyr Ser Val Tyr Thr Phe Val Lys Tyr Tyr Tyr Ile Pro Leu Leu Phe

225                 230                 235                 240

Gln Gly Leu Ile Leu Val Ile Ile Thr Tyr Leu Gln His Gln Asn Glu

                245                 250                 255    

Asp Ile Glu Val Tyr Glu Ala Asp Glu Trp Gly Phe Val Arg Gly Gln

            260                 265                 270        

Thr Gln Thr Ile Asp Arg His Trp Gly Phe Gly Leu Asp Asn Ile Met

        275                 280                 285            

His Asn Ile Thr Asn Gly His Val Ala His His Phe Phe Phe Thr Lys

    290                 295                 300                

Ile Pro His Tyr His Leu Leu Glu Ala Thr Pro Ala Ile Lys Lys Ala

305                 310                 315                 320

Leu Glu Pro Leu Lys Asp Thr Gln Tyr Gly Tyr Lys Arg Glu Val Asn

                325                 330                 335    

Tyr Asn Trp Phe Phe Lys Tyr Leu His Tyr Asn Val Thr Leu Asp Tyr

            340                 345                 350        

Leu Thr His Lys Ala Lys Gly Val Leu Gln Tyr Arg Ser Gly Val Glu

        355                 360                 365            

Ala Ala Lys Ala Lys Lys Ala Gln

    370                 375    

Claims (4)

1.一种提高鱼类omega-3多不饱和脂肪酸的方法，其步骤如下：

A、建立fat2和fat1基因的转基因鱼家系：

将转基因表达载体pCMV:fat2,CMV:mCherry和pCMV:fat1;CMV:EGFP表达载体分别导入鱼类受精卵中，筛选出F0代转基因鱼；

所述的表达载体pCMV:fat2,CMV:mCherry的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；

所述的表达载体pCMV:fat1;CMV:EGFP的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示；

B、将步骤A中获得的F0代转基因鱼饲养至性成熟与野生型鱼交配，筛选出F1代转基因鱼，将F1代转基因鱼再与野生型鱼交配，筛选出F2代转基因鱼；

C、步骤B中获得转基因F2或F1代鱼为亲本，杂交筛选出同时表达fat2和fat1的双转基因鱼即可。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：建立转基因鱼品系是通过显微注射结合荧光蛋白表达筛选的方式进行。

3.权利要求1所述的方法在制备富含omega-3多不饱和脂肪酸转基因鱼中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的转基因鱼为转基因斑马鱼、鲤鱼、团头鲂或黄颡鱼。

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