CN103898146A - 一种重组人血管内皮细胞生长因子a的制备方法 - Google Patents
一种重组人血管内皮细胞生长因子a的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103898146A CN103898146A CN201210589088.6A CN201210589088A CN103898146A CN 103898146 A CN103898146 A CN 103898146A CN 201210589088 A CN201210589088 A CN 201210589088A CN 103898146 A CN103898146 A CN 103898146A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- growth factor
- human vascular
- vegf
- expression
- vascular endothelial
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及一种重组人血管内皮细胞生长因子A的制备方法，使用原核表达系统可溶性表达重组人血管内皮细胞生长因子A，其中，可溶性表达由重组人血管内皮细胞生长因子A与分子伴侣蛋白融合表达。本发明还涉及一种编码分子伴侣蛋白、重组人血管内皮细胞生长因子A的基因序列的重组质粒，将其转化至工程菌后可以得到可溶性表达的重组人血管内皮细胞生长因子A融合蛋白。本发明提供的重组人血管内皮细胞生长因子A的制备方法，在原核表达系统中可溶性大量表达出重组人血管内皮细胞生长因子，该方法产量高、蛋白收率高、工艺简便、便于放大、节约成本。
Description
技术领域
本发明是利用基因工程技术制备蛋白的方法，尤其涉及利用基因工程技术制备重组人血管内皮细胞生长因子A的方法。
背景技术
血管内皮细胞生长因子（VEGF，Vascular Endothelial Growth Factor），属于VEGF-PDGF（Platelet-derived growth factor，血小板衍生生长因子 ）超家族，由VEGF-A、B、C、D、E 和胎盘生长因子（PLGF）6 个成员组成，具有同源二聚体结构，在单体肽链上含有8个半胱氨酸残基。其中VEGF-A是诱导肿瘤血管形成作用最强、特异性最高的血管生长因子。人VEGF-A基因全长 28kb，其位于染色体 6P21.3，编码VEGF的cDNA长 14kb，由 8个外显子和 7个内含子组成。VEGF-A经剪切后有 7种不同的单体，根据氨基酸数目命名为 VEGF-A121、VEGF-A145、VEGF-A148、VEGF-A165、VEGF-A183、VEGF-A189、VEGF-A206。VEGF-A165（VEGF165）具有最佳的生物利用度和生物潜能，是最重要的同源单体。缺少由外显子 6编码的残基，有肝素结合位点，既可以分泌到细胞外也可以结合到细胞表面或细胞外基质。
血管内皮细胞生长因子是目前已知作用最强、专属性最高的促血管生长因子。作用强，其作用于血管内皮细胞，强烈刺激细胞增生，促细胞分裂，促进血管的生长和侧支循环的建立，并有升高血管通透性的作用。专属性高，是唯一对血管形成具有特异性的重要生长因子，其他生长因子如成纤维细胞生长因子、血小板衍生性生长因子等能作用于包括血管内皮细胞在内的多种细胞，是不具特异性的。
血管内皮细胞生长因子正常生理作用包括：（1）正常组织内促血管内皮细胞生长因子和抗血管内皮细胞生长因子同时存在，且保持相对平衡，这种平衡使得人体脉管可以正常地生成和分化。（2）人体血管内皮细胞表面分布着一定数量的VEGF受体，称为VEGFR。血液中的VEGF与受体结合，从而激活胞内酪氨酸激酶，启动下游细胞信号级联，进而促使新脉管生长。在肿瘤生长中促进大量不规则新血管生成。正常人体内促血管内皮细胞生长因子和抗血管内皮细胞生长因子数量相对平衡，在有肿瘤生长的情况下，多种致癌因素触发致使促血管内皮细胞生长因子的数量激增，远远超过抗血管内皮细胞生长因子的作用，以血管为主的脉管大量生长，为肿瘤提供了优越的生长环境。
基于VEGF 在体内所表现出的特异性促血管生成作用，通过抑制VEGF 的血管生成作用和应用VEGF 促进血管生成治疗疾病，正在作为一种新的治疗方法被应用于临床。VEGF治疗方法包括转基因治疗及应用VEGF 成品。VEGF基因治疗称为"分子搭桥术"，为动脉缺血性疾病的治疗提供了极其诱人的前景。它通过将含有表达VEGF 的cDNA 通过载体直接导入动物体内，使其在体内表达VEGF，从而实现体内的治疗作用。由于VEGF 在体内的半衰期较短，而应用VEGF的转基因治疗可以克服这一不足。众多研究表明VEGF可以缩小脑梗死体积、减轻脑水肿和减轻神经元损伤。外源性VEGF可诱发正常成体脑的血管生成，有助于增加脑梗死边缘的脑血流和代谢。
由于天然来源的血管内皮细胞生长因子很少，远远不能满足临床应用的需求，需要应用DNA重组技术大量生产VEGF蛋白。利用哺乳动物细胞及酵母细胞表达VEGF蛋白成本高、产量低、表达不稳定，并且后续分离纯化工艺繁琐。大肠杆菌由于遗传背景清楚，代时短，易控制，成为生产重组蛋白的主要工程菌。可是利用大肠杆菌表达系统得到的VEGF蛋白为不可溶的无活性包涵体，纯化复性困难，步骤复杂，总回收率低。
rhVEGF165在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达、纯化及其生物学活性（张甘良、张海峰等，生物工程学报，2011,27(6):935~942）中公开了将VEGFl65克隆于表达载体pCDNA4.0，与T-GS载体共同转染CHO-S(中国仓鼠卵巢细胞)细胞，表达VEGF165。该方法使用哺乳动物细胞表达蛋白，生产周期长、成本高、产量较低，不适合工业化生产。
Expression of human vascular endothelial growth factor (VEGF165) in Pichia pastoris and its biological activity（Ma L、Wang X N等，Biomedical and environmental sciences，2001,14 (4):302~311）中公开了将hVEGF165 cDNA编码165氨基酸残基插入含有AOX1启动子和alpha分泌信号肽的pIPC9K载体，转入毕赤酵母表达。酵母表达体系，发酵周期长，成本高，且表达量远低于原核表达系统。同时，此方法中表达系统采用pIPC9K载体，最终获得的蛋白N端有多余氨基酸残基，不能获得天然N端VEGF165。
CN03114994.4、CN201110006597.7、血管内皮细胞生长因子的表达及其单克隆抗体的制备（徐静、李树香等，中国生物制品学杂志，2008,21(11):1002~1005）、人血管内皮细胞生长因子cDNA克隆和在大肠杆菌的高效表达（何延政、刘建平等，中国普外基础与临床杂志2001,8(2):72~74）、人血管内皮细胞生长因子基因克隆、表达与纯化（胡志明、马骊等，中国生化药物杂志，2005,26(3):135~138）、血管内皮生长因子在原核细胞中的高效表达、纯化与活性研究（杨佩、王坤正等，南方医科大学学报2006,26(9):1263~1268）、VEGF165的载体构建、表达及其生物学活性（陈小波、黄锡全等，江苏大学学报;医学版，2007,17(2):121~123）、鸡VEGF基因的克隆及融合蛋白的表达与分离纯化（刘倩、唐亮等，沈阳农业大学学报，2008,39(4):447~450）、High-yield expression of human vascular endothelial growth factor VEGF(165) in Escherichia coli（Pizarro SA等，Protein Expression and Purification，2010,72(2):184~193）均公开了血管内皮细胞生长因子的原核表达及制备，采用以上制备方法所得蛋白为包涵体，纯化复性困难，步骤复杂，总回收率低。
VEGF189基因合成、原核表达及鉴定（陈丹、王宏等，免疫学杂志，2009,25(4):469~472）公开的方案中，融合蛋白肠激酶酶切后在N段依然会残留Ala氨基酸残基，不能得到天然N端VEGF189蛋白；且从文章图5可知，该技术方案只能实现融合蛋白很少量的可溶性表达，大部分融合蛋白依然为包涵体，最终收率不理想。
血管内皮生长因子D基因的原核表达及纯化（耿明伟、张春等，经济动物学报，2008,12(4):245~248）中利用GST融合基因表达系统原核表达血管内皮生长因子D，并进行纯化。虽然可以实现可溶性表达，但是所用pGEX-6p-1载体不能实现天然N-端蛋白的表达，经过3C-Protease酶切后，蛋白N端至少会残留GlyProLeu等氨基酸残基。
利用原核系统表达人血管内皮细胞生长因子与真核系统表达相比，具有代时短、易控制、成本低、产量高等优势。然而原核表达系统也会受到宿主表达蛋白时包涵体变复性操作繁琐重现性差、蛋白分离纯化收率较低纯度不高等因素的制约，因此需要寻找一种可溶性表达量高、纯化收率较高的同时，蛋白终产物（重组人血管内皮细胞生长因子）、特别是天然N-端蛋白纯度较高的基因重组技术。
发明内容
如上所述，现有技术的基因重组制备人血管内皮细胞生长因子方法中原核宿主表达蛋白时会以包涵体形式表达，需要变复性等繁琐的操作步骤，重现性差影响产品质量；蛋白分离纯化收率与纯度难以兼得，不能满足大规模生产的需求。
本发明的发明人经过长期大量试验，发现使用大肠杆菌二硫键形成蛋白A（DsbA）及其突变体DsbAmut、CKS、麦芽糖结合蛋白（maltose binding protein，MBP）作为分子伴侣蛋白与人血管内皮细胞生长因子融合表达，可有效解决蛋白以包涵体形式存在的问题。同时，经过Chelating-Sepharose 凝胶纯化、置换缓冲液、肠激酶酶切去除分子伴侣、Chelating-Sepharose 凝胶分离目的蛋白、Heparin Sepharose亲和层析进一步纯化等步骤，重组人血管内皮细胞生长因子在满足纯度高、外源DNA残留低的要求的同时，收率较高，适合工业化大生产需求。
本发明提供一种重组人血管内皮细胞生长因子A的制备方法，其特征在于：使用原核表达系统可溶性表达重组人血管内皮细胞生长因子A，其中，可溶性表达由重组人血管内皮细胞生长因子A与分子伴侣蛋白融合表达；所述重组人血管内皮细胞生长因子A可选自VEGF-A经剪接后的 7种不同的变体VEGF-A121、VEGF-A145、VEGF-A148、VEGF-A165、VEGF-A183、VEGF-A189、VEGF-A206。
本发明所述的重组人血管内皮生长因子，包括含有信号肽和不含有信号肽的重组人血管内皮细胞生长因子。本发明的发明人通过大量实验发现，重组血管内皮生长因子的信号肽不会影响其可溶性表达，表达纯化得到的含有或不含有信号肽的重组人血管内皮细胞生长因子均具有生物活性。VEGF-A其他剪接变体亦可应用本发明。
本发明提供的制备方法中，所述分子伴侣蛋白可选自DsbA、DsbAmut、CKS、MBP。
在进行融合表达时，DsbA可以辅助融合蛋白进行正确的空间折叠。因此，利用 DsbA 蛋白作为融合伴侣表达真核蛋白是很好的选择。DsbAmut(E.coli)与DsbA编码基因序列相比，DsbAmut基因去掉了信号肽，同时将DsbA氧化还原功能相关的两个半胱氨酸（cys）突变成丝氨酸（ser），突变后的DsbA蛋白不再具有氧化还原酶的功能,但仍然具有促目的蛋白可溶和细胞定位的作用。与DsbAmut融合可实现许多基因的胞内可溶性有活性的高表达。
MBP（麦芽糖结合蛋白）标签蛋白大小为40kDa，由大肠杆菌K12的malE基因编码。MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。
CKS (CTP:CMP-3-deoxy-D-manno-octulosonate cytidylyltransferase or CMP-KDO synthetase)是一个非常稳定且高度可溶的理想融合伴侣。利用CKS融合蛋白研制的HIV和HCV重组抗原成功实现可溶性表达并取得FDA认证在美国上市。
本发明的发明人在研究初期，为了实现重组血管内皮细胞生长因子在原核体系的可溶性表达，选择了大量的分子伴侣蛋白与重组血管内皮细胞生长因子进行融合表达。本发明的发明人利用基因工程技术构建融合表达载体。在融合表达载体多克隆位点插入目的基因后诱导表达，将菌体破碎，使用SDS-PAGE检测融合蛋白存在于破碎液上清还是破碎菌体沉淀，以此来检验融合蛋白是否可溶及其可溶性优劣。对于可溶性较好的融合蛋白，本发明的发明人进行了小量表达纯化，对所得重组血管内皮细胞生长因子测活分析，将纯化收率、终产物蛋白活性作为优化工艺步骤的考量标准。本发明的发明人经过大量的构建质粒、表达纯化、测活实验，最终选择DsbA、DsbAmut、CKS、MBP作为分子伴侣。
本发明提供的使用原核表达系统高效可溶性表达重组人血管内皮细胞生长因子的制备方法，包括以下步骤：
①利用基因工程技术获取含有编码重组人血管内皮细胞生长因子基因序列，所述基因工程技术可选自人工合成含有编码人血管内皮细胞生长因子的基因序列、PCR法制备含有编码人血管内皮细胞生长因子的基因序列；
②利用表达载体，运用基因克隆技术构建含有编码6×His标签、分子伴侣蛋白、肠激酶酶切位点、重组人血管内皮细胞生长因子的基因序列的重组质粒；
③将重组质粒转化至宿主菌中，获得表达含有重组人血管内皮细胞生长因子的融合蛋白的工程菌；
④培养并诱导工程菌，可溶性表达重组人血管内皮细胞生长因子融合蛋白；
⑤分离纯化得到的重组人血管内皮细胞生长因子。
本发明提供的制备方法，所述的表达载体为原核表达载体，可选自pET-DsbA表达载体、pET-DsbAmut表达载体、pET-MBP表达载体、pET-CKS表达载体。进一步地，所述表达载体的多克隆位点区引入了编码肠激酶酶切位点、重组人血管内皮细胞生长因子的基因序列。本领域技术人员可以直接购买得到的或通过简单酶切连接改造的含有DsbA、DsbAmut、CKS、MBP分子伴侣的表达载体均可应用于本发明。
肠激酶（Enterokinase, EK酶）是一种高度专一性识别Asp-Asp-Asp-Asp-Lys 序列的蛋白酶，在Lys的C端水解多肽，可以将带有这个识别序列的融合蛋白切开。本发明的发明人将其作为工具蛋白酶构建于重组血管内皮细胞生长因子的N端融合表达，在编码重组血管内皮细胞生长因子C端的基因序列后设计终止密码子，特异性切开重组血管内皮细胞生长因子与分子伴侣蛋白即可获得天然N端序列的重组人血管内皮细胞生长因子。
本发明的发明人利用商业可购得的载体，或利用基因工程技术在pET-28a载体的6×His标签后插入不同的分子伴侣蛋白构建融合表达载体。在融合表达载体多克隆位点插入目的基因后诱导表达，将菌体破碎，使用SDS-PAGE检测融合蛋白存在于破碎液上清还是菌体沉淀，以此来检验融合蛋白是否可溶及其可溶性优劣。对于可溶性较好的融合蛋白，本发明的发明人进行了小量表达纯化，对所得重组血管内皮细胞生长因子测活分析，将纯化收率、终产物蛋白活性作为优化工艺步骤的考量标准。本发明的发明人经过大量的构建质粒、表达纯化、测活实验，最终选择pET-DsbA表达载体、pET-DsbAmut表达载体、pET-MBP表达载体、pET-CKS表达载体。
本发明的发明人通过大量的研究发现，利用以上几种分子伴侣蛋白的重组质粒， pET-DsbAmut-血管内皮细胞生长因子、pET-DsbA-血管内皮细胞生长因子、pET-MBP-血管内皮细胞生长因子、pET-CKS-血管内皮细胞生长因子在宿主菌中均能较好的实现可溶性表达，遗传稳定性良好。菌种连续多次传代后分别进行发酵、诱导培养，菌体破菌后，经SDS-PAGE分离结果显示工程菌各次传代表达稳定，其融合蛋白含量占全菌蛋白的20％以上，可实现大量可溶性表达。同时，纯化后蛋白收率高，蛋白活性较好。
本发明提供的制备方法，步骤③所述的宿主菌为大肠杆菌，优选大肠杆菌BL21（DE3）、大肠杆菌BL21（DE3）pLySs。
本发明提供的制备方法，步骤⑤所述的重组人血管内皮细胞生长因子的分离纯化包括以下步骤：
a. 使用缓冲液重悬菌体，破碎，离心，收集可溶性蛋白富集的上清液；
b. Chelating Sepharos凝胶亲和层析分离纯化融合蛋白；
c. 将缓冲液置换为不影响肠激酶正常活性的缓冲体系；
d. 肠激酶酶切融合蛋白，得到重组人血管内皮细胞生长因子；
e. Chelating Sepharose亲和层析纯化目的蛋白；
f. Heparin Sepharose亲和层析分离得到的目的蛋白。
本发明提供的制备方法中步骤⑤所述的分离纯化方法中，步骤a及步骤b所用的缓冲液包含Chelating Sepharos凝胶可承受浓度范围内的Tris-HCl、NaCl及咪唑；其中步骤a中用于重悬菌体的缓冲液包含10mM~30mM Tris-HCl、0.15M~0.25M NaCl、10mM~30mM咪唑，pH为7.5~8.5；优选地，步骤a中用于重悬菌体的缓冲液（Buffer A）包含20mM Tris-HCl、0.2M NaCl、20mM咪唑，pH为8.0。
大肠杆菌中的表达的大部分杂蛋白由于没有6×His标签不能被Chelating Sepharos吸附，上样后会存在于流穿液中。在Chelating Sepharos凝胶柱中使用Tris-HCl、NaCl、咪唑缓冲体系可以较好的分离纯化目的蛋白。本发明的发明人经过研究发现，使用20mM Tris-HCl、0.2M NaCl、20mM咪唑，pH为8.0的缓冲液作为上样缓冲液，可以使目的蛋白极大程度上吸附在凝胶上，而杂蛋白大部分存在于流穿液中，弃掉流穿液后，通过进一步加大咪唑浓度可实现目的蛋白的洗脱。其他可以用于Chelating Sepharos凝胶柱分离目的蛋白的缓冲体系，如Na2EDTA缓冲体系，亦可应用于本发明中。
本发明提供的制备方法步骤⑤所述的分离纯化方法中，步骤c所用的置换方法可选自透析、超滤、脱盐柱脱盐。
本发明提供的制备方法中步骤⑤使用肠激酶酶切融合蛋白得到重组血管内皮细胞生长因子。肠激酶适用范围为pH 4.5-9.5，某些去垢剂和变性剂的存在会极大的影响肠激酶活性，常见影响肠激酶活性的因素包括尿素>2M、氯化钠>250mM、巯基乙醇>20mM、SDS>0.1% 、咪唑>50mM等。为保证肠激酶酶切效率，需要将Chelating Sepharos凝胶柱洗脱的蛋白缓冲液置换为不影响肠激酶正常活性的缓冲液，优选pH8.0的20mM Tris-HCl作为肠激酶酶切缓冲体系。
融合蛋白经过肠激酶酶切后形成两个蛋白/多肽：6×His标签+分子伴侣蛋白、重组血管内皮细胞生长因子，重组血管内皮细胞生长因子由于不带有6×His标签，因此不能被Chelating Sepharos凝胶吸附，过柱纯化时会存在流穿液中，而切掉的6×His标签+分子伴侣蛋白以及未切开的融合蛋白则被Chelating Sepharos凝胶吸附，从而和目的蛋白重组血管内皮细胞生长因子分离。目的蛋白经过Heparin Sepharose亲和层析进一步纯化，纯度可达到90%以上。
本发明还提供一种由制备方法步骤②所得的编码分子伴侣蛋白、重组人血管内皮细胞生长因子A的基因序列的重组质粒。该质粒转化至工程菌后，能实现分子伴侣蛋白重组人血管内皮细胞生长因子A融合蛋白的可溶性表达，经进一步分离、酶切、纯化后可得到天然重组人血管内皮细胞生长因子A。
本发明提供的使用原核表达系统高效可溶性表达重组人血管内皮细胞生长因子A的制备方法，在大肠杆菌原核表达系统中可溶性大量表达出重组人血管内皮细胞生长因子，该方法产量高、蛋白收率高、工艺简便、便于放大、节约成本。
附图说明
图1 pET-DsbA/DsbAmut载体物理图谱。
图2 pET-MBP载体物理图谱。
图3 pTrc-CKS载体物理图谱。
图4 实施例5中pET-DsbAmut-VEGF165/ BL21（DE3）工程菌诱导表达蛋白可溶性分析。其中，M为蛋白标准；泳道1为pET-DsbA-VEGF165/ BL21（DE3）未诱导菌体；泳道2为诱导菌体破碎后上清；泳道3为诱导菌体破碎后沉淀。
图5 实施例5中VEGF165蛋白各纯化步骤电泳图。其中，泳道1为破菌上清；泳道2为Chelating Sepharose Fast Flow纯化样品泳道3为置换缓冲液后样品；泳道4为酶切后样品；泳道5为Chelating Sepharose Fast Flow纯化样品；泳道6为Heparin Sepharose 6 Fast Flow纯化样品；泳道7为标准品对照。
图6 实施例5中VEGF165蛋白特异性鉴定。其中，泳道1为DsbAmut-VEGF165融合蛋白；泳道2、3为Ek酶切融合蛋白；泳道4为VEGF165蛋白。
图7实施例5中rhVEGF165蛋白活性。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的具体说明，不应对本发明的范围构成限制。
实施例1：构建pET-CKS载体
人工合成编码CKS的基因片段（Invitrogen公司合成），在编码CKS的基因片段5’端引入NdeI内切酶位点，3’端引入BamHI内切酶位点。将合成片段插入pMD18-T Simple载体，得到pMD18-T-CKS载体。pMD18-T-CKS载体和pET-28a载体分别经NdeI和BamHI双酶切，T4 DNA连接酶连接，常规转化DH5α感受态细胞，提取质粒，双酶切鉴定和DNA测序正确后，保存质粒为pET-CKS载体质粒。
实施例2：构建pET-MBP载体
人工合成编码MBP的基因片段（Invitrogen公司合成），在编码MBP的基因片段上游引入NdeI内切酶位点，下游引入BamHI内切酶位点。将合成片段插入pMD18-T Simple载体，得到pMD18-T-MBP载体。pMD18-T-MBP载体和pET-28a载体分别经NdeI和BamHI双酶切，T4 DNA连接酶连接，常规转化DH5α感受态细胞，提取质粒，双酶切鉴定和DNA测序正确后，保存质粒为pET-MBP载体质粒。
实施例3：不同分子伴侣融合蛋白可溶性表达分析。
1. 构建分子伴侣-VEGF融合表达载体
按照实施例1~2的方法改造pET-28a表达载体，构建pET-Trx表达载体、pET-GST表达载体。pET-DsbA、pET-DsbAmut载体为商业化载体。人工合成含有肠激酶（Ek酶）切位点的VEGF121、VEGF165、VEGF189基因片段（Invitrogen公司合成），5’端带有EcoR I内切酶位点的牛肠激酶（Ek酶）切位点位于VEGF121、VEGF165、VEGF189蛋白N端，编码VEGF基因片段末尾设计终止密码子。将合成片段插入pMD18-T Simple载体，得到pMD18-T- VEGF121/165/189载体。pMD18-T- VEGF121/165/189载体与所构建载体分别经EcoR I和Hind III双酶切，T4 DNA连接酶连接，常规转化DH5α感受态细胞，提取质粒，双酶切鉴定和DNA测序正确后，转入BL21（DE3）感受态细胞中，得到工程菌。
表1 分子伴侣-VEGF融合表达质粒
| DsbA | DsbAmut | MBP | CKS | Trx | GST | |
| VEGF121 | pET-DsbA- VEGF121 | pET-DsbAmut- VEGF121 | pET-MBP- VEGF121 | pET-CKS- VEGF121 | pET-Trx- VEGF121 | pET-GST- VEGF121 |
| VEGF165 | pET-DsbA- VEGF165 | pET-DsbAmut- VEGF165 | pET-MBP- VEGF165 | pET-CKS- VEGF165 | pET-Trx- VEGF165 | pET-GST- VEGF165 |
| VEGF189 | pET-DsbA- VEGF189 | pET-DsbAmut- VEGF189 | pET-MBP- VEGF189 | pET-CKS- VEGF189 | pET-Trx- VEGF189 | pET-GST- VEGF189 |
2. 小量培养表达
将工程菌过夜培养后，1:100接种于含100 μg/ml抗生素（pET-DsbA/pET-DsbAmut载体对应Amp抗性、其余载体对应Kan抗性）的LB液体培养基，37℃振荡培养至O.D值0.8左右。加IPTG至终浓度为0.5mM，30℃诱导4h，离心收集菌体。
3. 融合蛋白可溶性分析
用PBS洗涤菌体2次，离心弃上清，各称取10g湿菌体，悬浮于等量预冷的PBS中。冰浴中超声（240W，超声4s, 间隙 8s）破碎菌体，12000rpm离心30min，上清留存待测；沉淀用PBS洗涤2次后，再用同体积的上样缓冲液重悬，将等量（等体积混悬液）上清和沉淀分别进行SDS-PAGE检测，SDS-PAGE结果使用灰度统计分析，定性判断融合蛋白可溶性。融合蛋白可溶性表达情况见表2（+越多代表融合蛋白表达量越大）。
表2 分子伴侣-VEGF融合蛋白表达定性分析
。
结论：DsbA 、DsbAmut、MBP、CKS作为分子伴侣均能实现融合蛋白大量可溶性表达；Trx作为分子伴侣融合表达VEGF165及VEGF189存在表达量偏低的情况；而GST作为分子伴侣存在可溶性表达量偏低、部分融合蛋白以包涵体形式存在等问题。
4. 目的蛋白小量纯化
各称取10g湿菌体，以1:5（W/V）比例重悬于pH8.0的20mM Tris-HCl、0.2M NaCl、20mM咪唑（Buffer A）中，冰水浴中超声破碎菌体，4℃条件下12000rpm离心30min。取上清液过Chelating Sepharose Fast Flow层析柱对融合蛋白进行纯化，收集流穿液，使用Buffer B（20mM Tris-HCl，250mM咪唑，pH8.0）进行洗脱，收集洗脱液，SDS-PAGE鉴定流穿液、洗脱液样品，证实融合蛋白存在于洗脱液中并已初步纯化。初步纯化的样品超滤，将缓冲液置换为Buffer C（20mM Tris-HCl，pH8.0），加入适量的肠激酶，37℃反应4h。酶切后的样品过Chelating Sepharose Fast Flow层析柱，分别收集流穿液及洗脱液，取少量通过SDS-PAGE验证，目的蛋白VEGF121、VEGF165、VEGF189存在于流穿液中。流穿液上样Heparin Sepharose 6 Fast Flow层析柱进一步纯化，使用Buffer D（20 mM Tris-HCl，0.1 M NaCl，pH 7.5）洗杂蛋白，Buffe E（20 mM Tris-HCl，0.3 M NaCl，pH 7.5）进行洗脱，洗脱得到VEGF121、VEGF165、VEGF189经12%SDS-PAGE电泳分析，检测蛋白纯度。使用brandford法测定蛋白浓度，计算蛋白收率。目的蛋白纯度及收率结果见表3。
表3 目的蛋白表达情况
*分子伴侣已切除，得到的是天然VEGF蛋白，表头填写的分子伴侣仅为方便标记。
结论：DsbA 、DsbAmut、MBP、CKS作为分子伴侣所得目的蛋白收率及纯度均较高；使用Trx作为分子伴侣所得目的蛋白纯度较高、收率较DsbA、DsbAmut、MBP、CKS作为分子伴侣低；使用GST作为分子伴侣所得目的蛋白收率较其他几种分子伴侣低。
实施例4：重组VEGF-A121（rhVEGF121，VEGF121）的制备。
1. 重组VEGF121原核表达体系的构建及融合蛋白可溶性表达分析
设计上下游引物，利用带有EcoRI酶切位点及肠激酶酶编码基因的上游引物及带有HindIII酶切位点的下游引物，PCR制备VEGF121基因。将扩增片段插入pMD18-T Simple载体，得到pMD18-T- VEGF121载体。pMD18-T- VEGF121载体与pET-DsbA载体分别经EcoR I和Hind III双酶切，T4 DNA连接酶连接，常规转化DH5α感受态细胞，提取质粒，双酶切鉴定和DNA测序正确后，转入BL21（DE3）pLySs感受态细胞中，得到工程菌pET-DsbA- VEGF121/ BL21（DE3）pLySs。
将工程菌过夜培养后，1:100接种于含100 μg/ml 氨苄青霉素（AMP）的LB液体培养基，37℃振荡培养至O.D值0.8左右。加IPTG至终浓度为0.5mM，30℃诱导4h，离心收集菌体，用PBS洗涤2次，悬浮于预冷的上样缓冲液Buffer A（20mM Tris-HCl、0.25M NaCl、10mM咪唑，pH7.5）中。冰浴中超声破碎菌体，12000rpm离心30min，上清留存待测；沉淀用Buffer A洗涤2次后，再用同体积的Buffer A重悬，将上清和沉淀分别进行SDS-PAGE检测，可见融合蛋白可溶性表达在破菌上清中，融合蛋白大部分可溶性表达。
2. DsbA- VEGF121融合蛋白的反应器发酵
培养基为TB，发酵体积为5升，D.O控制在30％以上，pH控制在7.0，37℃培养。当O.D600达到6-8时，培养温度降至30℃，在发酵罐（B Braun，Biostat C-plus 5）中加入终浓度0.5mM的IPTG诱导。4小时后停止发酵培养。将发酵培养所得的发酵液，经大容量冷冻离心机（Sorvall，Evolution RC）离心 (8000rpm，10min)，收集菌体。
3. DsbA- VEGF121融合蛋白的纯化
将发酵后收获的菌体以1:5（W/V）比例重悬于pH7.5的20mM Tris-HCl、0.25M NaCl、10mM咪唑（Buffer A）中，冰水浴中超声破碎菌体，4℃条件下12000rpm离心30min。取上清液过Chelating Sepharose Fast Flow层析柱对DsbA-VEGF121融合蛋白进行纯化，收集流穿液，使用Buffer B（20mM Tris-HCl，250mM咪唑，pH7.5）进行洗脱，收集洗脱液，SDS-PAGE鉴定流穿液、洗脱液样品，证实融合蛋白存在于洗脱液中并已初步纯化。初步纯化的样品上样HiPrep 26/10 Desalting柱，将缓冲液置换为Buffer C（20mM Tris-HCl，pH7.5），加入适量的肠激酶，37℃反应4h。酶切后的样品过Chelating Sepharose Fast Flow层析柱，分别收集流穿液及洗脱液，取少量通过SDS-PAGE验证，目的蛋白VEGF121存在于流穿液中。流穿液上样Heparin Sepharose 6 Fast Flow层析柱进一步纯化，使用Buffer D（20 mM Tris-HCl，0.1 M NaCl，pH 7.5）洗杂蛋白，Buffe E（20 mM Tris-HCl，0.3 M NaCl，pH 7.5）进行洗脱，洗脱得到VEGF121经12%SDS-PAGE电泳分析，纯度在90%以上。
4. VEGF121蛋白的特异性鉴定
用鼠抗VEGF121单克隆抗体作为一抗，山羊抗鼠IgG-HRP为二抗，检测VEGF121蛋白特异性。实验步骤参照《分子克隆》(Sambrook et al., 1989)。经SDS-PAGE电泳分离重组蛋白质VEGF121后，转印硝酸纤维素滤膜上，5%脱脂牛奶（溶于PBST中）4℃封闭过夜，TBST洗涤3次。加入浓度为10 μg/ml的鼠抗VEGF121单克隆抗体，4℃温育1h，TBST洗涤3次。1:5000加入山羊抗鼠IgG-HRP，37℃温育1 h，TBST洗涤4次，胶片显影。所得VEGF121蛋白特异性好，可用于后续研究或大规模生产。
实施例5：重组VEGF-A165（rhVEGF165，VEGF165）的制备。
1. 重组VEGF165原核表达体系的构建及融合蛋白可溶性表达分析
人工合成含有牛肠激酶（Ek酶）切位点的VEGF165基因片段（Invitrogen公司合成），5’端带有EcoR I内切酶位点的牛肠激酶（Ek酶）切位点位于VEGF165蛋白N端，编码VEGF165基因片段末尾设计终止密码子。将合成片段插入pMD18-T Simple载体，得到pMD18-T- VEGF165载体。pMD18-T- VEGF165载体与pET-DsbAmut载体（商业化载体，购得）分别经EcoR I和Hind III双酶切，T4 DNA连接酶连接，常规转化DH5α感受态细胞，提取质粒，双酶切鉴定和DNA测序正确后，转入BL21（DE3）感受态细胞中，得到工程菌pET-DsbAmut- VEGFA165/ BL21（DE3）。
将工程菌过夜培养后，1:100接种于含100 μg/ml 氨苄青霉素（AMP）的LB液体培养基，37℃振荡培养至O.D值0.8左右。加IPTG至终浓度为0.5mM，30℃诱导4h，离心收集菌体，用PBS洗涤2次，悬浮于预冷的上样缓冲液Buffer A（20mM Tris-HCl、0.2M NaCl、20mM咪唑，pH8.0）中。冰浴中超声破碎菌体，12000rpm离心30min，上清留存待测；沉淀用Buffer A洗涤2次后，再用同体积的Buffer A重悬，将上清和沉淀分别进行SDS-PAGE检测，可见融合蛋白可溶性表达在破菌上清中，融合蛋白大部分可溶性表达。
2. DsbAmut- VEGF165融合蛋白的反应器发酵
培养基为TB，发酵体积为5升，D.O控制在30％以上，pH控制在7.0，37℃培养。当O.D600达到6-8时，培养温度降至30℃，在发酵罐（B Braun，Biostat C-plus 5）中加入终浓度0.5mM的IPTG诱导。4小时后停止发酵培养。将发酵培养所得的发酵液，经大容量冷冻离心机（Sorvall，Evolution RC）离心 (8000rpm，10min)，收集菌体。
3. DsbAmut- VEGF165融合蛋白的纯化
将发酵后收获的菌体以1:5（W/V）比例重悬于pH8.0的20mM Tris-HCl、0.2M NaCl、20mM咪唑（Buffer A）中，冰水浴中超声破碎菌体，4℃条件下12000rpm离心30min。取上清液过Chelating Sepharose Fast Flow层析柱对DsbAmut-VEGF165融合蛋白进行纯化，收集流穿液，使用Buffer B（20mM Tris-HCl，250mM咪唑，pH8.0）进行洗脱，收集洗脱液，SDS-PAGE鉴定流穿液、洗脱液样品，证实融合蛋白存在于洗脱液中并已初步纯化（附图5，泳道2）。初步纯化的样品通过超滤将缓冲液置换为Buffer C（20mM Tris-HCl，pH8.0），加入适量的牛肠激酶，37℃反应4h。酶切后的样品过Chelating Sepharose Fast Flow层析柱，分别收集流穿液及洗脱液，取少量通过SDS-PAGE验证，目的蛋白VEGF-A165存在于流穿液中。流穿液上样Heparin Sepharose 6 Fast Flow层析柱进一步纯化，使用Buffer D（20 mM Tris-HCl，0.1 M NaCl，pH 8.0）洗杂蛋白，Buffe E（20 mM Tris-HCl，0.3 M NaCl，pH 8.0）进行洗脱，洗脱得到VEGF-A165经12%SDS-PAGE电泳分析（附图5，泳道3），纯度在90%以上。
4. VEGF165蛋白的特异性鉴定
用人抗VEGF165单克隆抗体作为一抗，山羊抗人IgG-HRP为二抗，检测VEGF165蛋白特异性。实验步骤参照《分子克隆》(Sambrook et al., 1989)。经SDS-PAGE电泳分离重组蛋白质VEGF-A165后，转印硝酸纤维素滤膜上，5%脱脂牛奶（溶于PBST中）4℃封闭过夜，TBST洗涤3次。加入浓度为12.5 μg/ml的人抗VEGF165单克隆抗体，4℃温育1h，TBST洗涤3次。1:5000加入山羊抗人IgG-HRP，37℃温育1 h，TBST洗涤4次，胶片显影。所得VEGF165蛋白特异性好（附图6），可用于后续研究或大规模生产。
5. VEGF165活性测定
用rhVEGF165刺激新复苏的HUVEC细胞，37℃培养四天，随后加入alamarBlue继续37℃培养6-7h，通过检测530/590nm荧光值反映细胞的增殖情况（参考方法YaningWang, DavidFei, MartinVanderlaan, AnSong. Biological activity of bevacizumab, a humanized anti-VEGF antibody in vitro. Angiogenesis(2004)7:335–345）。rhVEGF对HUVEC细胞的促增殖作用见附图7。由图可知，rhVEGF诱导的HUVEC细胞增殖具有剂量依赖性，其EC50为13ng/ml(0.39nM)。rhVEGF165浓度为25-50ng/ml时，对接种量为1.25×104/孔的HUVEC细胞促增殖作用达到最大值。
实施例6：重组VEGF-A145（rhVEGF145，VEGF145）的制备。
1. 重组VEGF145原核表达体系的构建及融合蛋白可溶性表达分析
设计上下游引物，利用带有EcoRI酶切位点及肠激酶酶编码基因的上游引物及带有HindIII酶切位点的下游引物，PCR制备VEGF145基因。将扩增片段插入pMD18-T Simple载体，得到pMD18-T- VEGF145载体。pMD18-T- VEGF145载体与pET-DsbAmut载体分别经EcoR I和Hind III双酶切，T4 DNA连接酶连接，常规转化DH5α感受态细胞，提取质粒，双酶切鉴定和DNA测序正确后，转入BL21（DE3）感受态细胞中，得到工程菌pET-DsbAmut- VEGF145/ BL21（DE3）。
将工程菌过夜培养后，1:100接种于含100 μg/ml 氨苄青霉素（AMP）的LB液体培养基，37℃振荡培养至O.D值0.8左右。加IPTG至终浓度为0.5mM，30℃诱导4h，离心收集菌体，用PBS洗涤2次，悬浮于预冷的上样缓冲液Buffer A（30mM Tris-HCl、0.2M NaCl、20mM咪唑，pH8.0）中。冰浴中超声破碎菌体，12000rpm离心30min，上清留存待测；沉淀用Buffer A洗涤2次后，再用同体积的Buffer A重悬，将上清和沉淀分别进行SDS-PAGE检测，可见融合蛋白可溶性表达在破菌上清中，融合蛋白大部分可溶性表达。
2. DsbAmut- VEGF145融合蛋白的反应器发酵
培养基为TB，发酵体积为5升，D.O控制在30％以上，pH控制在7.0，37℃培养。当O.D600达到6-8时，培养温度降至30℃，在发酵罐（B Braun，Biostat C-plus 5）中加入终浓度0.5mM的IPTG诱导。4小时后停止发酵培养。将发酵培养所得的发酵液，经大容量冷冻离心机（Sorvall，Evolution RC）离心 (8000rpm，10min)，收集菌体。
3. DsbAmut- VEGF145融合蛋白的纯化
将发酵后收获的菌体以1:5（W/V）比例重悬于pH8.0的30mM Tris-HCl、0.2M NaCl、20mM咪唑（Buffer A）中，冰水浴中超声破碎菌体，4℃条件下12000rpm离心30min。取上清液过Chelating Sepharose Fast Flow层析柱对DsbAmut-VEGF145融合蛋白进行纯化，收集流穿液，使用Buffer B（30mM Tris-HCl，250mM咪唑，pH8.0）进行洗脱，收集洗脱液，SDS-PAGE鉴定流穿液、洗脱液样品，证实融合蛋白存在于洗脱液中并已初步纯化。初步纯化的样品上样HiPrep 26/10 Desalting柱，将缓冲液置换为Buffer C（30mM Tris-HCl，pH8.0），加入适量的肠激酶，37℃反应4h。酶切后的样品过Chelating Sepharose Fast Flow层析柱，分别收集流穿液及洗脱液，取少量通过SDS-PAGE验证，目的蛋白VEGF145存在于流穿液中。流穿液上样Heparin Sepharose 6 Fast Flow层析柱进一步纯化，使用Buffer D（30 mM Tris-HCl，0.1 M NaCl，pH 8.0）洗杂蛋白，Buffe E（30 mM Tris-HCl，0.3 M NaCl，pH8.0）进行洗脱，洗脱得到VEGF145经12%SDS-PAGE电泳分析，纯度在85%以上。
4. VEGF145蛋白的特异性鉴定
用鼠抗VEGF-A145单克隆抗体作为一抗，山羊抗鼠IgG-HRP为二抗，检测VEGF145蛋白特异性。实验步骤参照《分子克隆》(Sambrook et al., 1989)。经SDS-PAGE电泳分离重组蛋白质VEGF145后，转印硝酸纤维素滤膜上，5%脱脂牛奶（溶于PBST中）4℃封闭过夜，TBST洗涤3次。加入浓度为10 μg/ml的鼠抗VEGF145单克隆抗体，4℃温育1h，TBST洗涤3次。1:5000加入山羊抗鼠IgG-HRP，37℃温育1 h，TBST洗涤4次，胶片显影。所得VEGF145蛋白特异性好，可用于后续研究或大规模生产。
实施例7：重组VEGF-A148（rhVEGF148，VEGF148）的制备。
1. 重组VEGF148原核表达体系的构建及融合蛋白可溶性表达分析
设计上下游引物，利用带有EcoRI酶切位点及肠激酶酶编码基因的上游引物及带有HindIII酶切位点的下游引物，PCR制备VEGF148基因。将扩增片段插入pMD18-T Simple载体，得到pMD18-T- VEGFA148载体。pMD18-T- VEGF148载体与pET-CKS载体分别经EcoR I和Hind III双酶切，T4 DNA连接酶连接，常规转化DH5α感受态细胞，提取质粒，双酶切鉴定和DNA测序正确后，转入BL21（DE3）pLySs感受态细胞中，得到工程菌pET-CKS- VEGF148/ BL21（DE3）pLySs。
将工程菌过夜培养后，1:100接种于含100 μg/ml卡那霉素（Kan）的LB液体培养基，37℃振荡培养至O.D值0.8左右。加IPTG至终浓度为0.5mM，30℃诱导4h，离心收集菌体，用PBS洗涤2次，悬浮于预冷的上样缓冲液Buffer A（10mM Tris-HCl、0.15M NaCl、20mM咪唑，pH8.0）中。冰浴中超声破碎菌体，12000rpm离心30min，上清留存待测；沉淀用Buffer A洗涤2次后，再用同体积的Buffer A重悬，将上清和沉淀分别进行SDS-PAGE检测，可见融合蛋白可溶性表达在破菌上清中，融合蛋白大部分可溶性表达。
2. CKS- VEGF148融合蛋白的反应器发酵
培养基为TB，发酵体积为5升，D.O控制在30％以上，pH控制在7.0，37℃培养。当O.D600达到6-8时，培养温度降至30℃，在发酵罐（B Braun，Biostat C-plus 5）中加入终浓度0.5mM的IPTG诱导。4小时后停止发酵培养。将发酵培养所得的发酵液，经大容量冷冻离心机（Sorvall，Evolution RC）离心 (8000rpm，10min)，收集菌体。
3. CKS- VEGF148融合蛋白的纯化
将发酵后收获的菌体以1:5（W/V）比例重悬于pH8.0的10mM Tris-HCl、0.15M NaCl、20mM咪唑（Buffer A）中，冰水浴中超声破碎菌体，4℃条件下12000rpm离心30min。取上清液过Chelating Sepharose Fast Flow层析柱对CKS-VEGF-A148融合蛋白进行纯化，收集流穿液，使用Buffer B（10mM Tris-HCl，250mM咪唑，pH8.0）进行洗脱，收集洗脱液，SDS-PAGE鉴定流穿液、洗脱液样品，证实融合蛋白存在于洗脱液中并已初步纯化。初步纯化的样品4℃透析，将缓冲液置换为Buffer C（10mM Tris-HCl，pH8.0），加入适量的肠激酶，37℃反应4h。酶切后的样品过Chelating Sepharose Fast Flow层析柱，分别收集流穿液及洗脱液，取少量通过SDS-PAGE验证，目的蛋白VEGF148存在于流穿液中。流穿液上样Heparin Sepharose 6 Fast Flow层析柱进一步纯化，使用Buffer D（10 mM Tris-HCl，0.1 M NaCl，pH 8.0）洗杂蛋白，Buffe E（10 mM Tris-HCl，0.3 M NaCl，pH8.0）进行洗脱，洗脱得到VEGF148经12%SDS-PAGE电泳分析，纯度在90%以上。
4. VEGF148蛋白的特异性鉴定
用鼠抗VEGF148单克隆抗体作为一抗，山羊抗鼠IgG-HRP为二抗，检测VEGF148蛋白特异性。实验步骤参照《分子克隆》(Sambrook et al., 1989)。经SDS-PAGE电泳分离重组蛋白质VEGF148后，转印硝酸纤维素滤膜上，5%脱脂牛奶（溶于PBST中）4℃封闭过夜，TBST洗涤3次。加入浓度为12.5 μg/ml的鼠抗VEGF148单克隆抗体，4℃温育1h，TBST洗涤3次。1:5000加入山羊抗鼠IgG-HRP，37℃温育1 h，TBST洗涤4次，胶片显影。所得VEGF148蛋白特异性好，可用于后续研究或大规模生产。
实施例8：重组VEGF-A183（rhVEGF183，VEGF183）的制备。
1. 重组VEGF183原核表达体系的构建及融合蛋白可溶性表达分析
人工合成含有牛肠激酶（Ek酶）切位点的VEGF183基因片段（Invitrogen公司合成），5’端带有EcoR I内切酶位点的肠激酶（Ek酶）切位点位于VEGF183蛋白N端，编码VEGF183基因片段末尾设计终止密码子。将合成片段插入pMD18-T Simple载体，得到pMD18-T- VEGF183载体。pMD18-T- VEGF183载体与pET-MBP载体分别经EcoR I和Hind III双酶切，T4 DNA连接酶连接，常规转化DH5α感受态细胞，提取质粒，双酶切鉴定和DNA测序正确后，转入BL21（DE3）pLySs感受态细胞中，得到工程菌pET-MBP- VEGF183/ BL21（DE3）pLySs。
将工程菌过夜培养后，1:100接种于含100 μg/ml卡那霉素（Kan）的LB液体培养基，37℃振荡培养至O.D值0.8左右。加IPTG至终浓度为0.5mM，30℃诱导4h，离心收集菌体，用PBS洗涤2次，悬浮于预冷的上样缓冲液Buffer A（20mM Tris-HCl、0.25M NaCl、10mM咪唑，pH8.5）中。冰浴中超声破碎菌体，12000rpm离心30min，上清留存待测；沉淀用Buffer A洗涤2次后，再用同体积的Buffer A重悬，将上清和沉淀分别进行SDS-PAGE检测，可见融合蛋白可溶性表达在破菌上清中，融合蛋白大部分可溶性表达。
2. MBP- VEGF183融合蛋白的反应器发酵
培养基为TB，发酵体积为5升，D.O控制在30％以上，pH控制在7.0，37℃培养。当O.D600达到6-8时，培养温度降至30℃，在发酵罐（B Braun，Biostat C-plus 5）中加入终浓度0.5mM的IPTG诱导。4小时后停止发酵培养。将发酵培养所得的发酵液，经大容量冷冻离心机（Sorvall，Evolution RC）离心 (8000rpm，10min)，收集菌体。
3. MBP- VEGF183融合蛋白的纯化
将发酵后收获的菌体以1:5（W/V）比例重悬于pH8.5的20mM Tris-HCl、0.25M NaCl、10mM咪唑（Buffer A）中，冰水浴中超声破碎菌体，4℃条件下12000rpm离心30min。取上清液过Chelating Sepharose Fast Flow层析柱对MBP-VEGF-A183融合蛋白进行纯化，收集流穿液，使用Buffer B（20mM Tris-HCl，250mM咪唑，pH8.5）进行洗脱，收集洗脱液，SDS-PAGE鉴定流穿液、洗脱液样品，证实融合蛋白存在于洗脱液中并已初步纯化。初步纯化的样品4℃透析，将缓冲液置换为Buffer C（20mM Tris-HCl，pH8.5），加入适量的肠激酶，37℃反应4h。酶切后的样品过Chelating Sepharose Fast Flow层析柱，分别收集流穿液及洗脱液，取少量通过SDS-PAGE验证，目的蛋白VEGF183存在于流穿液中。流穿液上样Heparin Sepharose 6 Fast Flow层析柱进一步纯化，使用Buffer D（20 mM Tris-HCl，0.1 M NaCl，pH 8.5）洗杂蛋白，Buffe E（20 mM Tris-HCl，0.3 M NaCl，pH8.5）进行洗脱，洗脱得到VEGF183经12%SDS-PAGE电泳分析，纯度在85%以上。
4. VEGF183蛋白的特异性鉴定
用鼠抗VEGF183单克隆抗体作为一抗，山羊抗鼠IgG-HRP为二抗，检测VEGF183蛋白特异性。实验步骤参照《分子克隆》(Sambrook et al., 1989)。经SDS-PAGE电泳分离重组蛋白质VEGF183后，转印硝酸纤维素滤膜上，5%脱脂牛奶（溶于PBST中）4℃封闭过夜，TBST洗涤3次。加入浓度为10μg/ml的鼠抗VEGF183单克隆抗体，4℃温育1h，TBST洗涤3次。1:5000加入山羊抗鼠IgG-HRP，37℃温育1 h，TBST洗涤4次，胶片显影。所得VEGF183蛋白特异性好，可用于后续研究或大规模生产。
实施例9：重组VEGF-A189（rhVEGF189，VEGF189）的制备。
1. 重组VEGF-A189原核表达体系的构建及融合蛋白可溶性表达分析
人工合成含有牛肠激酶（Ek酶）切位点的VEGF189基因片段（Invitrogen公司合成），5’端带有EcoR I内切酶位点的肠激酶（Ek酶）切位点位于VEGF189蛋白N端，编码VEGF189基因片段末尾设计终止密码子。将合成片段插入pMD18-T Simple载体，得到pMD18-T- VEGFA189载体。pMD18-T- VEGF189载体与pET-CKS载体分别经EcoR I和Hind III双酶切，T4 DNA连接酶连接，常规转化DH5α感受态细胞，提取质粒，双酶切鉴定和DNA测序正确后，转入BL21（DE3）感受态细胞中，得到工程菌pET-CKS- VEGF189/ BL21（DE3）。
将工程菌过夜培养后，1:100接种于含100 μg/ml卡那霉素（Kan）的LB液体培养基，37℃振荡培养至O.D值0.8左右。加IPTG至终浓度为0.5mM，30℃诱导4h，离心收集菌体，用PBS洗涤2次，悬浮于预冷的上样缓冲液Buffer A（20mM Tris-HCl、0.2M NaCl、30mM咪唑，pH8.0）中。冰浴中超声破碎菌体，12000rpm离心30min，上清留存待测；沉淀用Buffer A洗涤2次后，再用同体积的Buffer A重悬，将上清和沉淀分别进行SDS-PAGE检测，可见融合蛋白可溶性表达在破菌上清中，融合蛋白大部分可溶性表达。
2. CKS- VEGF189融合蛋白的反应器发酵
培养基为TB，发酵体积为5升，D.O控制在30％以上，pH控制在7.0，37℃培养。当O.D600达到6-8时，培养温度降至30℃，在发酵罐（B Braun，Biostat C-plus 5）中加入终浓度0.5mM的IPTG诱导。4小时后停止发酵培养。将发酵培养所得的发酵液，经大容量冷冻离心机（Sorvall，Evolution RC）离心 (8000rpm，10min)，收集菌体。
3. CKS- VEGF189融合蛋白的纯化
将发酵后收获的菌体以1:5（W/V）比例重悬于pH8.0的20mM Tris-HCl、0.2M NaCl、30mM咪唑（Buffer A）中，冰水浴中超声破碎菌体，4℃条件下12000rpm离心30min。取上清液过Chelating Sepharose Fast Flow层析柱对CKS-VEGF-A189融合蛋白进行纯化，收集流穿液，使用Buffer B（20mM Tris-HCl，250mM咪唑，pH8.0）进行洗脱，收集洗脱液，SDS-PAGE鉴定流穿液、洗脱液样品，证实融合蛋白存在于洗脱液中并已初步纯化。初步纯化的样品通过超滤将缓冲液置换为Buffer C（20mM Tris-HCl，pH8.0），加入适量的肠激酶，37℃反应4h。酶切后的样品过Chelating Sepharose Fast Flow层析柱，分别收集流穿液及洗脱液，取少量通过SDS-PAGE验证，目的蛋白VEGF189存在于流穿液中。流穿液上样Heparin Sepharose 6 Fast Flow层析柱进一步纯化，使用Buffer D（20 mM Tris-HCl，0.1 M NaCl，pH 8.0）洗杂蛋白，Buffe E（20 mM Tris-HCl，0.3 M NaCl，pH8.0）进行洗脱，洗脱得到VEGF189经12%SDS-PAGE电泳分析，纯度在90%以上。
4. VEGF-A189蛋白的特异性鉴定
用鼠抗VEGF189单克隆抗体作为一抗，山羊抗鼠IgG-HRP为二抗，检测VEGF189蛋白特异性。实验步骤参照《分子克隆》(Sambrook et al., 1989)。经SDS-PAGE电泳分离重组蛋白质VEGF189后，转印硝酸纤维素滤膜上，5%脱脂牛奶（溶于PBST中）4℃封闭过夜，TBST洗涤3次。加入浓度为10 μg/ml的鼠抗VEGF189单克隆抗体，4℃温育1h，TBST洗涤3次。1:5000加入山羊抗鼠IgG-HRP，37℃温育1 h，TBST洗涤4次，胶片显影。所得VEGF-A189蛋白特异性好，可用于后续研究或大规模生产。
实施例10：重组VEGF-A206（rhVEGF206，VEGF206）的制备。
1. 重组VEGF-A206原核表达体系的构建及融合蛋白可溶性表达分析
人工合成含有牛肠激酶（Ek酶）切位点的VEGF206基因片段（Invitrogen公司合成），5’端带有EcoR I内切酶位点的肠激酶（Ek酶）切位点位于VEGF206蛋白N端，编码VEGF189基因片段末尾设计终止密码子。将合成片段插入pMD18-T Simple载体，得到pMD18-T- VEGF206载体。pMD18-T- VEGF206载体与pET-DsbAmut载体分别经EcoR I和Hind III双酶切，T4 DNA连接酶连接，常规转化DH5α感受态细胞，提取质粒，双酶切鉴定和DNA测序正确后，转入BL21（DE3）感受态细胞中，得到工程菌pET-DsbAmut- VEGF206/ BL21（DE3）。
将工程菌过夜培养后，1:100接种于含100 μg/ml氨苄青霉素（Amp）的LB液体培养基，37℃振荡培养至O.D值0.8左右。加IPTG至终浓度为0.5mM，30℃诱导4h，离心收集菌体，用PBS洗涤2次，悬浮于预冷的上样缓冲液Buffer A（20mM Tris-HCl、0.2M NaCl、10mM咪唑，pH8.0）中。冰浴中超声破碎菌体，12000rpm离心30min，上清留存待测；沉淀用Buffer A洗涤2次后，再用同体积的Buffer A重悬，将上清和沉淀分别进行SDS-PAGE检测，可见融合蛋白可溶性表达在破菌上清中，融合蛋白大部分可溶性表达。
2. DsbAmut- VEGF206融合蛋白的反应器发酵
培养基为TB，发酵体积为5升，D.O控制在30％以上，pH控制在7.0，37℃培养。当O.D600达到6-8时，培养温度降至30℃，在发酵罐（B Braun，Biostat C-plus 5）中加入终浓度0.5mM的IPTG诱导。4小时后停止发酵培养。将发酵培养所得的发酵液，经大容量冷冻离心机（Sorvall，Evolution RC）离心 (8000rpm，10min)，收集菌体。
3. DsbAmut- VEGF206融合蛋白的纯化
将发酵后收获的菌体以1:5（W/V）比例重悬于pH8.0的20mM Tris-HCl、0.2M NaCl、10mM咪唑（Buffer A）中，冰水浴中超声破碎菌体，4℃条件下12000rpm离心30min。取上清液过Chelating Sepharose Fast Flow层析柱对DsbAmut-VEGF-A206融合蛋白进行纯化，收集流穿液，使用Buffer B（20mM Tris-HCl，250mM咪唑，pH8.0）进行洗脱，收集洗脱液，SDS-PAGE鉴定流穿液、洗脱液样品，证实融合蛋白存在于洗脱液中并已初步纯化。初步纯化的样品通过超滤将缓冲液置换为Buffer C（20mM Tris-HCl，pH8.0），加入适量的肠激酶，37℃反应4h。酶切后的样品过Chelating Sepharose Fast Flow层析柱，分别收集流穿液及洗脱液，取少量通过SDS-PAGE验证，目的蛋白VEGF206存在于流穿液中。流穿液上样Heparin Sepharose 6 Fast Flow层析柱进一步纯化，使用Buffer D（20 mM Tris-HCl，0.1 M NaCl，pH 8.0）洗杂蛋白，Buffe E（20 mM Tris-HCl，0.3 M NaCl，pH8.0）进行洗脱，洗脱得到VEGF206经12%SDS-PAGE电泳分析，纯度在85%以上。
4. VEGF-A206蛋白的特异性鉴定
用鼠抗VEGF-A206单克隆抗体作为一抗，山羊抗鼠IgG-HRP为二抗，检测VEGF206蛋白特异性。实验步骤参照《分子克隆》(Sambrook et al., 1989)。经SDS-PAGE电泳分离重组蛋白质VEGF206后，转印硝酸纤维素滤膜上，5%脱脂牛奶（溶于PBST中）4℃封闭过夜，TBST洗涤3次。加入浓度为10μg/ml的鼠抗VEGF165单克隆抗体，4℃温育1h，TBST洗涤3次。1:5000加入山羊抗鼠IgG-HRP，37℃温育1 h，TBST洗涤4次，胶片显影。所得VEGF-A206蛋白特异性好，可用于后续研究或大规模生产。
Claims (10)
1.一种重组人血管内皮细胞生长因子A的制备方法，其特征在于：使用原核表达系统可溶性表达重组人血管内皮细胞生长因子A，其中，可溶性表达由重组人血管内皮细胞生长因子A与分子伴侣蛋白融合表达；所述重组人血管内皮细胞生长因子A选自VEGF-A经剪接后的 7种不同的变体VEGF-A121、VEGF-A145、VEGF-A148、VEGF-A165、VEGF-A183、VEGF-A189、VEGF-A206。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述分子伴侣蛋白可选自DsbA、DsbAmut、CKS、MBP。
3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
①利用基因工程技术获取含有编码重组人血管内皮细胞生长因子基因序列，所述基因工程技术可选自人工合成含有编码人血管内皮细胞生长因子的基因序列、PCR法制备含有编码人血管内皮细胞生长因子的基因序列；
②利用表达载体，运用基因克隆技术构建含有编码6×His标签、分子伴侣蛋白、肠激酶酶切位点、重组人血管内皮细胞生长因子A的基因序列的重组质粒；
③将重组质粒转化至宿主菌中，获得表达含有重组人血管内皮细胞生长因子A的融合蛋白的工程菌；
④培养并诱导工程菌，可溶性表达重组人血管内皮细胞生长因子A融合蛋白；
⑤分离纯化得到重组人血管内皮细胞生长因子A。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤②所述的表达载体为原核表达载体，可选自pET-DsbA表达载体、pET-DsbAmut表达载体、pET-MBP表达载体、pET-CKS表达载体。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述表达载体的多克隆位点区插入了编码肠激酶酶切位点、重组人血管内皮细胞生长因子的基因序列。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤③所述的宿主菌为大肠杆菌，优选大肠杆菌BL21（DE3）、大肠杆菌BL21（DE3）pLySs。
7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤⑤所述的重组人血管内皮细胞生长因子的分离纯化包括以下步骤：
a. 使用缓冲液重悬菌体，破碎，离心，收集可溶性蛋白富集的上清液；
b. Chelating Sepharos凝胶亲和层析分离纯化融合蛋白；
c. 将缓冲液置换为不影响肠激酶正常活性的缓冲体系；
d. 肠激酶酶切融合蛋白，得到重组人血管内皮细胞生长因子；
e. Chelating Sepharose亲和层析纯化目的蛋白；
f. Heparin Sepharose亲和层析分离得到目的蛋白。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤a及步骤b所用的缓冲液包含Chelating Sepharos凝胶可承受浓度范围内的Tris-HCl、NaCl及咪唑；其中步骤a中用于重悬菌体的缓冲液包含10mM~30mM Tris-HCl、0.15M~0.25M NaCl、10mM~30mM咪唑，pH为7.5~8.5；优选地，步骤a中用于重悬菌体的缓冲液包含20mM Tris-HCl、0.2M NaCl、20mM咪唑，pH为8.0。
9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤c所用的置换方法可选自透析、超滤、脱盐柱脱盐。
10.一种由权利要求4步骤②所得的编码分子伴侣蛋白、重组人血管内皮细胞生长因子A的基因序列的重组质粒。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210589088.6A CN103898146A (zh) | 2012-12-31 | 2012-12-31 | 一种重组人血管内皮细胞生长因子a的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210589088.6A CN103898146A (zh) | 2012-12-31 | 2012-12-31 | 一种重组人血管内皮细胞生长因子a的制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103898146A true CN103898146A (zh) | 2014-07-02 |
Family
ID=50989714
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210589088.6A Pending CN103898146A (zh) | 2012-12-31 | 2012-12-31 | 一种重组人血管内皮细胞生长因子a的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103898146A (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101955969A (zh) * | 2009-07-20 | 2011-01-26 | 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 | 一种通用型原核高效可溶性融合表达载体的构建及其应用 |
| CN102839182A (zh) * | 2012-08-07 | 2012-12-26 | 武汉海特生物制药股份有限公司 | 利用大肠杆菌表达系统制备重组人神经生长因子的方法 |
-
2012
- 2012-12-31 CN CN201210589088.6A patent/CN103898146A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101955969A (zh) * | 2009-07-20 | 2011-01-26 | 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 | 一种通用型原核高效可溶性融合表达载体的构建及其应用 |
| CN102839182A (zh) * | 2012-08-07 | 2012-12-26 | 武汉海特生物制药股份有限公司 | 利用大肠杆菌表达系统制备重组人神经生长因子的方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| 付小兵主编: "《再生医学原理与实践》", 31 March 2008 * |
| 徐洵主编: "《海洋生物基因工程实验指南》", 30 June 2004 * |
| 王云龙等: ""人脂联素原核表达纯化及活性检测"", 《动物医学进展》 * |
| 罗曼等: ""大肠杆菌二硫键形成蛋白A（DsbA）研究进展"", 《生物工程学报》 * |
| 贺师鹏等主编: "《受体研究技术第2版》", 31 January 2011 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102121023B (zh) | 突变型人纤溶酶原kringle5及其制备方法及应用 | |
| JPH10243800A (ja) | 上皮細胞に特異的な成長因子をコードするｄｎａ | |
| CN110950967B (zh) | 抗人血清白蛋白纳米抗体与il-2融合蛋白及制备方法 | |
| CN102839182B (zh) | 利用大肠杆菌表达系统制备重组人神经生长因子的方法 | |
| WO2017089016A1 (en) | Thermostable fgf2 polypeptide, use thereof | |
| AU2016359722A1 (en) | Thermostable FGF2 polypeptide, use thereof | |
| CN108840938A (zh) | 一种由猪白蛋白与猪干扰素γ组成的融合蛋白及其制备方法和一种重组猪长效干扰素γ | |
| CN108840946A (zh) | 犬白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白、制备方法及其编码基因、一种犬长效干扰素 | |
| CN110452288A (zh) | 一种人工合成信号肽 | |
| CN103898146A (zh) | 一种重组人血管内皮细胞生长因子a的制备方法 | |
| CN108840951A (zh) | 一种由猪白蛋白、猪干扰素γ和猪干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN105384828B (zh) | 长效干扰素-α及其改造方法 | |
| CN104342423B (zh) | 高活性重组人糜蛋白酶制备方法和应用 | |
| KR20230038903A (ko) | 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 vlrb 단백질에 폴돈 도메인이 연결된 융합 단백질 및 이의 용도 | |
| Xiang et al. | Expressions and purification of a mature form of recombinant human Chemerin in Escherichia coli | |
| CN108840953A (zh) | 一种由羊白细胞介素2、羊干扰素γ和羊干扰素τ组成的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN108864305A (zh) | 一种由羊白蛋白、羊干扰素γ和羊干扰素τ组成的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN105154497A (zh) | 一种利用重组大肠杆菌制备鸡白介素2的方法 | |
| CN103450358A (zh) | 一种猪gapdh蛋白抗体及其制备方法与应用 | |
| CN108840935A (zh) | 一种由羊白蛋白与羊干扰素γ组成的融合蛋白及其制备方法和一种重组羊长效干扰素γ | |
| CN108840934A (zh) | 一种重组羊长效干扰素τ及制备此长效干扰素的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN108864298A (zh) | 一种重组犬长效干扰素及制备此长效干扰素的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN108840941A (zh) | 一种重组羊长效干扰素γ及制备此长效干扰素γ的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN107365390A (zh) | 一种由猪白蛋白、猪干扰素γ和猪白细胞介素2组成的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN108794637A (zh) | 一种重组犬长效干扰素α及制备此长效干扰素的融合蛋白及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140702 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |