CN103898115A - 一种与发育时期相关的水稻高表达启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与发育时期相关的水稻高表达启动子及其应用。该启动子序列为SEQIDNO.1所示，其驱动的GUS报告基因在水稻苗的根、茎、叶中有较强的表达；在成熟的植物中，只在花中有表达，到花发育后期只在花粉粒中有表达。本发明中的启动子可被用于构建需要在幼苗中高表达的转基因表达载体，或者在成熟植株中基因只在花中表达的转基因表达载体，在科研和农业生产上均具有重要的应用价值。

Description

一种与发育时期相关的水稻高表达启动子及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种启动子序列的克隆、植物转基因载体的构建、及在不同组织中驱动基因表达的活性分析，进一步来说，涉及一种与发育时期相关的水稻高表达启动子，以及该启动子在植物转基因中的应用。

背景技术

启动子是指被RNA聚合酶识别、结合并起始基因转录的一段DNA序列，通常位于基因上游。一个典型的启动子包括CAAT-box 和TATA-box，它们分别是依赖于DNA的RNA聚合酶的识别和结合位点，一般位于转录起始位点上游几十个碱基处。植物基因的启动子按其基因的表达方式分为组成型启动子(constitutive promoter)、诱导型启动子(inducible promoter)和组织特异性启动子(tissue-specific promoter)。

组成型启动子是指在所有组织中均有表达活性的启动子，而组织特异性启动子所驱动的基因只在某些特定的器官和组织中表达，并常表现发育调节的特性，例如花特异性启动子、叶片特异性启动子。对这些启动子的研究，不仅有助于阐明基因在植物形态、发育、代谢途径等中的作用，而且可以借助这些启动子，驱动目的基因在特定的位点进行表达，从而达到生产实践或科研上所设定的特定目的。

启动子的活性分析常用到GUS(β-glucuronidase ，编码葡萄糖醛酸酶)作为报告基因，它可以作为外源基因插入到启动子的下游，根据组织化学染色分析就可以直观地得到基因在植物的不同部位的表达时空信息。在本发明申请中，即采用GUS基因来报告启动子的活性。

本发明中涉及的EXPANSIN基因在植物的生长发育过程中起重要的作用，它编码的EXPANSIN蛋白是一类细胞壁酶蛋白，在植物的细胞扩张中起松弛、扩张细胞壁的作用。EXPANSIN蛋白几乎参与了植物的整个发育过程，包括细胞伸长、种子萌发、根系生长、叶原基形成、果实成熟、器官脱离，以及花粉管生长等方面。EXPANSIN基因家族包含4个亚族，本发明所涉及的EXP启动子，是从水稻的EXPANSIN基因(OS03g0106500)的上游克隆到的一段约2.7kb大小的DNA序列。

本发明提供了这种启动子的驱动活性，该启动子对于构建驱动基因在单子叶植物幼苗中高表达的转基因载体，或者在生殖器官高表达的转基因载体有很好的效果，在科研或者生产实践上均具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种与发育时期相关的水稻高表达启动子；其可以驱动目的基因在苗期的所有组织器官中高表达，或者只在成熟植株的花中高表达。

本发明提供的启动子，是从水稻的EXPANSIN基因(OS03g0106500)的上游克隆到的一段约2.7kb大小的DNA序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。该启动子在水稻苗期的幼嫩组织和成熟植株的花器官中具有活性。称该启动子为EXPANSIN启动子。

将该启动子构建在含有报告基因的载体中，通过转基因技术发现它所驱动的GUS报告基因在水稻苗期组织器官中均有较高表达；而在成熟植物中，仅在花中有表达。因此，EXPANSIN启动子可以驱动外源基因在特定的组织中表达，从而达到定向地转基因的目的。将外源基因在转基因植物中定位表达可以提高外源基因在特定部位的表达水平，增加转基因的目的性。

本发明还利用EXPANSIN启动子构建植物转基因表达载体，以改良植物性能，具体是将水稻EXPANSIN启动子通过酶切位点连接到转基因载体的外源基因起始密码的上游，以驱动外源或内源基因在植物中过表达。

具体步骤如下：

将克隆到的EXPANSIN启动子通过BamHⅠ/NcoⅠ双酶位点插入到载体（如pCAMBIA 1301）GUS报告基因的上游，构成以GUS为报告基因的植物转基因载体。

所述的植物转基因载体通过构建转基因植物在改造植物性状中的应用。例如在改造水稻性状方面的应用。

具体的，本发明通过浸泡水稻愈伤组织的方法，将上述以GUS为报告基因的植物转基因载体转化到水稻愈伤中，进而诱导愈伤分化、再生，成功获得转基因植株。

通过GUS组织化学染色可以检测该启动子在不同时期的组织中有活性。外源基因可以替代GUS报告基因插入在EXPANSIN启动子的下游。

本发明利用该启动子来驱动外源或内源基因在水稻苗期的高表达，或者在水稻花器官中的特异性表达，进而研究这些基因在发育过程中的作用。该启动子可用于改造单子叶植物花发育过程。 

附图说明

图1为菌落PCR鉴定EXPANSIN启动子。箭头所示为启动子片断。

图2为重组转基因载体示意图。 将启动子通过酶切位点插入pCAMBIA1301载体的GUS报告基因上游。

图3为GUS报告基因在转基因水稻各组织的表达。其中：

A.生长1周的根；B.水培2个月的根；C.幼嫩的茎；D.成熟的茎；E.生长1周的叶片；F.生长2个月的叶片；G.颖花，长度分别为0-2mm、2-3mm、3-4mm、4-5mm、5-7mm；H. 5-7mm颖花的纵截面；I.雌蕊和雄蕊；J.成熟花药。

图4为定量PCR检测OsEXPB1基因在成熟水稻植株各组织中的表达水平。

图5为OsEXPB1基因在干旱胁迫下不同组织中的表达水平变化。

具体实施方式

以下结合具体实施例阐明本发明，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列是实例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook分子克隆实验手册中所叙述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1  EXPANSIN基因启动子片段的克隆

1．DNA的提取  取水稻暗培养7d的黄化苗，液氮研磨，加1ml 1.5× CTAB（1.5×CTAB，100 mM Tris-Cl pH8.0，20 mM EDTA pH8.0，1.4M NaCl，β-巯基乙醇0.2%），混匀；65℃ 水浴20min；离心，取上清，加入0.7ml氯仿，混匀；5000 rpm，离心15 min，转移上清到新的离心管；加入同体积异丙醇，混匀，室温静置10 min；12000 rpm，离心10 min；弃上清，70%乙醇洗涤；室温干燥5min，加20μlMilliQ水溶解。用0.8%琼脂糖凝胶检测DNA的质量。

EXPANSIN启动子的扩增和重组载体的构建  根据EXPANSIN基因5’上游序列设计两对引物；

一对不含酶切位点的引物：

上游引物：5’-ACTCAACTTTCGGGTCCTTTCCAA-3’；（SEQ ID NO.2）

下游引物：5’- GTAGAAGGGAGGAGGATGCCATTG-3’。 （SEQ ID NO.3）

一对含有酶切位点：

上游引物：5’-CGGGATCCACTCAACTTTCGGGTCCTTTCCAA-3’； （SEQ ID NO.4）

下游引物：5’- CATGCCATGGGTAGAAGGGAGGAGGATGCCATTG-3’。 （SEQ ID NO.5）。

首先用不含酶切位点的一对引物和KOD-Plus高保真酶(TOYOBO)针对水稻黄化苗总DNA进行扩增，按以下条件：94℃ 3min；94℃ 30s；60℃ 30s；72℃ 2min30s，30个循环，回收约2.7kb大小的DNA片段，用T₄ DNA连接酶连接至PCR-Blunt中间载体，PCR鉴定有预期大小外源片段的克隆（图1），再用含酶切位点的引物，利用KOD-Plus高保真酶(TOYOBO)再次进行PCR，条件为：94℃ 3min；94℃ 30s；60℃ 30s；72℃ 2min30s，共30个循环，回收约2.7kb的DNA片段，分别用BamH I 和NcoI 酶切回收的DNA和pCAMBIA1301载体，回收后连接，得到ProEXPB1::GUS转基因载体，测序验证克隆的正确性。载体示意图见图2。

实施例2  OsEXPB1基因的生物学分析

在The Rice Annotation Project Database(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/)中查询OsEXPB1基因的序列，采用PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)在线分析OsEXPB1启动子起始密码子上游2.7 kb的启动子序列中特殊的顺式作用元件。

水稻EXPANSIN基因家族在蛋白质水平上高度保守，但启动子各有其特点，有的成员之间甚至有几乎完全相同的cDNA顺序，但启动子顺序不一样，从而决定了它们时空特表达的特异性。利用PLACE在线软件对OsEXPB1启动子序列进行分析，发现了2个与花粉特异性表达有关的顺式作用元件POLLEN1LELAT52(AGAAA)和GTGANTG10(GTGA)，其中，“AGAAA”有14个，“GTGA”有15个，所以推测该启动子在某个时期可能驱动基因在花粉中特异表达。

实施例3  转基因植株的获得

将测序正确的ProEXPB1::GUS重组载体采用液氮速冻法转化农杆菌EHA105感受态，在DYT培养基平板（含抗生素Kan^r、Str^r、Rif^r）上，28℃培养36h，然后对长出的菌落进行PCR鉴定筛选阳性转化子。

将鉴定正确的含有重组质粒的农杆菌DYT液体培养至OD₆₀₀=0.6，采用浸泡侵染水稻愈伤，进行转化。经过感染、共培养、除菌、筛选、分化、生根等过程获得转基因阳性苗。

实施例4  EXPANSIN启动子在不同组织中的活性分析

分别取阳性转基因水稻幼苗期的根、叶和生殖期的茎、颖花(长度为0-2mm、2-3mm、3-4mm、4-5mm、5-7mm)。材料先用90％的丙酮处理10min；水洗去除丙酮，再浸于GUS染液[0.2MNa₂HPO₄/NaH₂PO₄，0.1M K₃Fe(CN)₆/K₄Fe(CN)₆，0.1%X-Gluc，0.1%TritonX-100]中，真空抽气20min；37℃处理24h；分别用70％乙醇和无水乙醇脱色处理2h，最后用70％乙醇浸泡保存。在体视显微镜下观察并拍照。

将ProEXPB1::GUS载体通过农杆菌介导转化到水稻愈伤组织中，经过再生共获得25个独立的转基因株系。我们分别选择转基因植株的营养组织(根、茎、叶)和颖花(长度分别为0-2mm、2-3mm、3-4mm、4-5mm、5-7mm)进行染色，结果显示,水稻幼嫩的根、茎、叶均有较强染色信号(图3 A、C、E)；而成熟期的水稻根、茎、叶、种子均检测不到染色信号(图3 B、D、F、G)；在花发育过程中，花粉粒未成熟时，在花的各个部分均较强表达 (图3 G、I)，而在晚期花发育过程中，内外颖中表达明显下降(图3 G、H)，最终只在花粉粒中表达(图3 J)。GUS染色结果显示，在花发育晚期，OsEXPB1启动子具有花粉特异性的表达活性。

实施例5  Real-time检测EXPANSIN基因的表达部位及胁迫下的表达情况

1.   水稻总RNA的提取

抽提RNA所用的一切器皿均用0.1℅的DEPC水处理或者200℃烘烤2h，去除RNA酶，所用试剂均为RNA-free产品。在收集到生物材料之后，以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃深低温冰箱。 

采用Trizol法提取水稻组织RNA：液氮研磨，将上述组织转入eppendorf管，每100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；混匀，在室温下放置10分钟；室温，12000g离心15min，取上清；加同体积的氯仿，剧烈震荡混匀，在室温下放置10min后，12000g，4℃离心15min；取上层水相置于新eppendorf管中，加0.5ml异丙醇，在室温下放置10min，12000g，4℃离心10min；弃上清，加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g，4℃，离心5min，弃上清；沉淀的RNA在室温下自然干燥5min；用20μl RNase-free的MilliQ溶解RNA沉淀。

荧光定量PCR(qRT-PCR)

分析组织表达的材料分别取自水稻的根、茎、叶、雄蕊、雌蕊、内外颖、胚乳等组织；胁迫处理的材料取自生殖生长期的组织，所用引物见表1所示，内参为OsUBQ5，每个样品重复扩增三次，检测在上述不同组织中OSEXPB1的表达情况。

表1

qRT-PCR检测的结果(图4)显示，OsEXPB1基因在水稻成熟组织中，如在根、茎、叶、灌浆的胚乳中表达量很低，在花器官包括雄蕊和雌蕊中表达量最高，比其他组织高出约4-5个数量级。这个结果与GUS报告基因的染色结果一致，说明我们所选择的启动子片段是完整的，能驱动该基因的特异性表达。

一个好的组织特异性表达启动子应受环境因素影响较小。为了了解OsEXPB1基因在不同环境因素下的表达变化，我们采集了水稻的营养组织和花粉成熟期的颖花，然后利用qRT-PCR检测OsEXPB1基因的表达变化(图5)，重点关注了该基因在干旱胁迫下的表达变化，结果发现它在大多数组织中表达受环境因素的影响较小。如干旱处理的根、叶，以及茉莉酸处理的颖花中表达量变化均很小；花中的表达水平降低到原来的1/2左右，但由于初始表达水平较高，所以总体表达水平还是较高的；而茎中的表达水平上升到原来的5-6倍，意义并不大，因为正常情况下，OsEXPB1基因在茎中的表达的绝对值很低，其值与雄蕊中相差10⁶倍，几乎可以判定为不表达基因。总体来说，该基因在花中表达量高，且表达相对稳定。另外，根据目前网上收集的水稻基因芯片数据库http://signal.salk.edu，我们查询了OsEXPB1在其它胁迫条件下的表达数据并进行了比较，发现该基因在其它环境条件下如盐、重金属、冷胁迫下的表达量变化也很小。

本发明通过GUS报告基因系统给出了OsEXPB1启动子在水稻发育过程各组织中的活性，并且通过荧光定量PCR验证了这一结果。本发明充分表明了OsEXPB1启动子具有发育过程相关的活性。它在水稻营养生长阶段的根、幼茎、叶中都有活性，而在水稻转入生殖生长后，只在花中有表达，且表达水平非常高，活性受外界环境的影响较小。根据这一特性，可以利用该启动子来驱动外源或内源基因在水稻苗期的高表达，或者在水稻花器官中的特异性表达，进而研究这些基因在发育过程中的作用。它在利用启动子来改造单子叶植物花发育过程方面，具有应用价值。

<110>  复旦大学

<120>  一种与发育时期相关的水稻高表达启动子及其应用

<130>  001

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<170>  PatentIn version 3.3

 

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Claims (5)

1. 一种与发育时期相关的水稻高表达启动子，其特征在于：是从水稻的EXPANSIN基因的上游克隆到的一段约2.7kb大小的DNA序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，称该启动子为EXPANSIN启动子。

2. 一种由权利要求1所述的启动子构建的植物转基因载体，其特征在于由下述方法得到：将水稻EXPANSIN启动子通过酶切位点连接到转基因载体的外源基因起始密码的上游，以驱动外源或内源基因在植物中过表达。

3. 根据权利要求2所述的植物转基因载体，其特征在于所述载体为pCAMBIA 1301。

4. 一种利用权利要求2所述的植物转基因载体通过构建转基因植物在改造植物性状中的应用。

5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于植物为水稻。

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