CN103884797B - 延胡索酸泰妙菌素中残留溶剂4-甲基-2-戊酮的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种延胡索酸泰妙菌素中残留溶剂4-甲基-2-戊酮的检测方法，该方法包括对照品溶液的制备、供试品溶液的制备，之后采用气相色谱法以顶空进样的方式将上述对照品溶液和供试品溶液注入气相色谱仪中，根据外标法计算残留量。本发明通过对色谱条件的优选及供试品、对照品制备方法的试验，建立了延胡索酸泰妙菌素可能存在的残留物4-甲基-2-戊酮的气相色谱分析方法；通过对色谱分离系统的优化，建立了兽药延胡索酸泰妙菌素中溶剂残留的检测方法，通过方法学验证试验研究表明：所建立的方法准确度高、专属性强、重现性良好，通过对兽药延胡索酸泰妙菌素中残留溶剂量的控制，确保其安全性，从而更有效的防治猪、鸡等动物感染性疾病。
Description
技术领域
本发明涉及制药技术领域，特别是涉及一种延胡索酸泰妙菌素中残留溶剂4-甲基-2-戊酮的检测方法。
背景技术
延胡索酸泰妙菌素是一种动物专用的新型半合成抗生素，是由伞菌科北凤菌(Pleurotusmutilis)的培养液中提取的伯鲁罗母林(pleuromulin)的氢化延胡索酸盐。临床主要用于防治鸡的慢性呼吸道病；用于猪的支原体肺炎(气喘病)、支原体关节炎、放线菌性胸膜肺炎、密螺旋体性痢疾、回肠炎、结肠炎、水肿病等。该药具有抗菌活性强、药代动力学特征优良、用量少、毒性小等特点。临床应用表明：延胡索酸泰妙菌素是一种安全有效的新型兽药，具有广阔的应用前景。
延胡索酸泰妙菌素的药效学抗菌谱与大环内酯类抗生素相似，主要抗革兰氏阳性菌，对金色葡萄球菌、链球菌、支原体、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪痢疾密螺旋体等均有较强的抑制作用，对支原体的作用强于大环内酯类。对革兰氏阴性菌尤其是肠道菌作用较弱。抗菌作用机制也是与细菌核糖体50S亚基结合而抑制蛋白质合成。主要用于防治鸡的慢性呼吸道病，猪支原体肺炎、放线菌性胸膜肺炎和密螺旋体性痢疾等。低剂量还可促进生长、提高饲料利用率。
单胃动物内服吸收良好，血药浓度达峰时间在2～4小时，生物利用度85%以上。反刍动物内服可被胃肠道菌群灭活。吸收后在体内广泛分布，组织中和乳中的药物浓度高出血清浓度几倍。肺中浓度最高。泰妙菌素在体内被代谢成20多种代谢物，有的具有抗菌活性。其代谢主要经胆汁从粪中排泄，约30%从尿排泄。
LaberG(1988)报道了给普通犬分别皮下和肌内注射延胡索酸泰妙菌素的药动学特征，肌注10mg/kg.bw泰妙菌素的Cmax=0.61±0.15μg/mL，tmax=6h，消除半衰期t1/2=4.7±1.4h；皮下注射10mg/kg.bw和25mg/kg剂量组的Cmax=1.55±0.11μg/mL和3.14±0.04μg/mL，tmax均为8h，消除半衰期t1/2=4.28±0.18h和12.4±3.4h。LykkebergAnneKruse(2006)对泰妙菌素在猪肝细胞微粒体中的代谢进行研究，从中分离出5种代谢产物M1、M2、M3、M4和M5，其中M1、M2、M3已通过质谱和NMR确定了结构，M4、M5在二级质谱（MS2）基础上进行了结构推测。M1为2-β-羟基泰妙菌素，M2为8-α-羟基泰妙菌素，M3为N-去乙基泰妙菌素，M4推测为2-β-羟基-N-去乙基泰妙菌素，M5则为8-α-N-去乙基泰妙菌素。研究进一步指出，大约有20%原药转化为去乙基代谢物，有10%在2β位上被羟基化，另有7%原药的羟基化反应则发生在8β位上。
综上所述，延胡索酸泰妙菌素是动物专用抗生素，对支原体、胸膜肺炎放线杆菌、螺旋体、胞内劳森菌和部分革兰氏阳性菌有良好的抗菌活性，同时该药在动物物体内吸收迅速、组织内药物浓度较高、分解代谢较为完全、基本没有环境危害，在养殖体系的疾病防控中具有重要的作用。因此，建立延胡索酸泰妙菌素的质量控制体系，保证其产品质量就具有非常实际的意义。
延胡索酸泰妙菌素的合成过程中，使用过甲醇及4-甲基-2-戊酮（甲基异丁基甲酮），这些溶剂的残留不仅降低产品的质量，同时会对药品的安全性带来影响，但原标准没有对这两项溶剂进行测定。因此，建立4-甲基-2-戊酮的检测方法，对于确保延胡索酸泰妙菌素的安全性具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的就在于提供一种延胡索酸泰妙菌素中残留溶剂4-甲基-2-戊酮的检测方法。
本发明采用下述技术方案实现：
一种延胡索酸泰妙菌素中残留溶剂4-甲基-2-戊酮的检测方法，其特征是：
首先制备对照品溶液、空白溶液和供试品溶液，然后分别将对照品溶液、空白溶液和供试品溶液顶空平衡30min后，精密量取1ml采用顶空进样的方式注入到气相色谱仪中并记录色谱图至主峰保留时间的3倍，最后通过峰面积采用外标法计算含量；
上述气相色谱仪的色谱条件为：
色谱柱：涂有一层0.5μmG16固定膜的毛细管柱；
检测器：火焰离子检测器；汽化室温度：250℃；色谱柱温度：75℃；检测器温度：300℃；柱流量：1.07ml/min，分流比为50:1；载气为高纯氮气，溶剂为水；
顶空条件：顶空温度80℃加热30min，进样量1ml。
所述对照品溶液的制备方法为：精密吸取4-甲基-2-戊酮3.2ul，加10ml水稀释至顶空样品瓶中，加盖密封即可。
所述空白溶液的制备方法为：精密量取纯化水10ml至顶空样品瓶，加盖密封即可。
所述供试品溶液的制备方法为：精密称取延胡索酸泰妙菌素0.5g至顶空样品瓶中，加纯化水10ml溶解，加盖密封即可。
所述外标法计算公式为：
（Ws/Wu）·(Ru/Rs)×106
式中：Ws：配制对照溶液的溶质的质量，mg；
Wu：配制供试溶液中延胡索酸泰妙菌素的质量，mg；
Ru：供试溶液中溶剂的色谱峰响应值；
Rs：对照溶液中溶剂的色谱峰响应值。
本发明通过对色谱条件的优选及供试品、对照品制备方法的试验，建立了延胡索酸泰妙菌素可能存在的残留物4-甲基-2-戊酮的气相色谱分析方法，该方法采用顶空进样的方式，克服了以正丁醇和水为稀释液直接进样时，水在色谱柱中残留，影响后期的试验准确性及峰形曲线的缺陷，提高了检测准确性，同时恒温检测简单、易操作。
本发明同时对新建立的检测方法进行了验证。验证结果表明：3个浓度下4-甲基-2-戊酮平均回收率为101.6%，在90.0～110.0%范围内，回收率的相对标准偏差为6.0%，小于10.0%。精密度试验的RSD4.5%；线性关系良好，相关系数0.9978；专属性试验考察无阴性干扰。试验证明所建立的方法准确度高、专属性强、重现性良好，通过对兽药延胡索酸泰妙菌素中残留溶剂量的控制，确保其安全性，从而更有效的防治猪、鸡等动物感染性疾病。
附图说明
图1为4-甲基-2-戊酮标准曲线图。
具体实施方式
样品名称：延胡索酸泰妙菌素(来源：宁夏泰瑞制药股份有限公司)。
仪器：岛津GC-2014气相色谱仪
色谱条件：色谱柱：涂有一层0.5μmG16固定膜的毛细管柱(0.25mm×30m)；检测器：火焰离子检测器；汽化室温度：250℃；色谱柱温度：75℃；检测器温度：300℃；柱流量：1.07ml/min，分流比为50:1。载气为高纯氮气，溶剂为水，顶空平衡时间30min，用外标法计算结果。
顶空条件：顶空温度80℃加热30min，进样量1ml。
对照品溶液的制备：精密吸取4-甲基-2-戊酮3.2μl(在室温下，用液体比重天平测各自的密度ρ，根据M=ρV计算质量)加10ml水稀释至顶空样品瓶中，加盖密封，作为对照品溶液。
空白溶液：精密量取纯化水10ml至顶空样品瓶，加盖密封即可。
供试品溶液的制备：精密称取本品0.5g至顶空样品瓶中，加纯化水10ml溶解，加盖密封，作为供试品溶液。
含量测定：将上述对照品溶液、空白溶液和供试品溶液采用顶空进样的方式分别注入到气相色谱仪中，通过峰面积采用外标法计算含量。本发明中，延胡索酸泰妙菌素中含4-甲基-2-戊酮不得大于5000ppm。
计算公式：
（Ws/Wu）·(Ru/Rs)×106
式中：Ws：配制对照溶液的溶质的质量，mg；
Wu：配制供试溶液中延胡索酸泰妙菌素的质量，mg；
Ru：供试溶液中溶剂的色谱峰响应值；
Rs：对照溶液中溶剂的色谱峰响应值；
精密度：取含量测定项下供试品溶液，重复进样6次，结果4-甲基-2-戊酮的峰面积RSD为4.5%，重复性良好（见表1）。
表14-甲基-2-戊酮精密度试验结果表
线性试验：
供试品4-甲基-2-戊酮溶液制备：吸取4-甲基-2-戊酮0.37ml置1000ml容量瓶中，用水溶解并稀释定容至刻度，混匀。分别吸取0.27ml、1.7ml、3.3ml、6.7ml、10.0ml于10ml的容量瓶中用水稀释至刻度，配制成4-甲基-2-戊酮浓度为8μg/ml、50μg/ml、99μg/ml、199μg/ml、297μg/ml。
测定：取以上溶液至顶空平衡30min后注入气相色谱仪中，每个浓度进样3针记录色谱图，求每个浓度进样3次峰面积平均值。并按下式计算其相关系数r，数据及计算结果见表6-1，表6-2。
依法进样，以峰面积为纵坐标，溶液浓度为横坐标，计算回归方程为y=1138.8x-890.06r＝0.9978。试验结果表明，4-甲基-2-戊酮在8～297μg/ml范围内，呈良好的线性关系。测定结果见表2，线性关系曲线图见图1。
表24-甲基-2-戊酮测定线性范围
回收率试验：
溶液的制备及测定：吸取4-甲基-2-戊酮3.2ul加10ml水稀释至顶空样品瓶中作为对照品溶液。选取延胡索酸泰妙菌素一批，精密称取0.1g至10ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，转移至顶空样品瓶中，作为供试品1，配制平行样。再精密称取延胡索酸泰妙菌素0.1g九份置顶空样品瓶中，分别加入4-甲基-2-戊酮1.06ul、1.32ul、1.58ul各三份，加10ml水稀释即可，制备出浓度为80%、100%、120%的供试品2，取对照品溶液、供试品溶液顶空平衡30min后，注入气相色谱仪中并记录色谱图。(见表3)。
表3：4-甲基-2-戊酮准确度试验结果
Claims (5)
1.一种延胡索酸泰妙菌素中残留溶剂4-甲基-2-戊酮的检测方法，其特征是：
首先制备对照品溶液、空白溶液和供试品溶液，然后分别将对照品溶液、空白溶液和供试品溶液顶空平衡30min后，精密量取1ml采用顶空进样的方式注入到气相色谱仪中并记录色谱图至主峰保留时间的3倍，最后通过峰面积采用外标法计算含量；
上述气相色谱仪的色谱条件为：
色谱柱：涂有一层0.5μmG16固定膜的毛细管柱；
检测器：火焰离子检测器；汽化室温度：250oC；色谱柱温度：75oC；检测器温度：300oC；柱流量：1.07ml/min，分流比为50:1；载气为高纯氮气，溶剂为水；
顶空条件：顶空温度80℃加热30min，进样量1ml。
2.按照权利要求1所述的延胡索酸泰妙菌素中残留溶剂4-甲基-2-戊酮的检测方法，其特征在于所述对照品溶液的制备方法为：精密吸取4-甲基-2-戊酮3.2μl，加10ml水稀释至顶空样品瓶中，加盖密封即可。
3.按照权利要求1所述的延胡索酸泰妙菌素中残留溶剂4-甲基-2-戊酮的检测方法，其特征在于所述空白溶液的制备方法为：精密量取纯化水10ml至顶空样品瓶，加盖密封即可。
4.按照权利要求1所述的延胡索酸泰妙菌素中残留溶剂4-甲基-2-戊酮的检测方法，其特征在于所述供试品溶液的制备方法为：精密称取延胡索酸泰妙菌素0.5g至顶空样品瓶中，加纯化水10ml溶解，加盖密封即可。
5.按照权利要求1所述的延胡索酸泰妙菌素中残留溶剂4-甲基-2-戊酮的检测方法，其特征在于所述外标法计算公式为：
（Ws/Wu）·(Ru/Rs)×106
式中：Ws：配制对照溶液的溶质的质量，mg；
Wu：配制供试溶液中延胡索酸泰妙菌素的质量，mg；
Ru：供试溶液中溶剂的色谱峰响应值；
Rs：对照溶液中溶剂的色谱峰响应值。
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