CN103882136A - 一种简便灵敏通用型的基因检测方法 - Google Patents

Abstract

一种简便灵敏通用型的基因检测方法，该方法利用量子点掺杂产生的荧光信号对目标基因进行检测，通过荧光强度来检测待测靶基因的浓度以及靶基因中单个碱基的突变。其过程包括DNA探针的设计，探针与金属离子的结合，结合了金属离子的探针与待测靶基因的杂交从而释放金属离子，量子点与上述溶液中金属离子发生离子交换反应获得掺杂型量子点并产生特异性的荧光信号以进行检测。相较于传统的荧光探针检测方法，这种方法无需对探针进行任何化学标记和修饰，同时全过程均只需要在室温下操作即可；检测灵敏度高，检测限可以达到皮摩尔每升级别；特异性强，能够区分基因中单个碱基的突变；还具有通用性，理论上可以对所有的基因序列进行检测。

Description

一种简便灵敏通用型的基因检测方法

技术领域

本发明涉及功能纳米材料和生物化学领域，具体涉及一种简便灵敏的通用型基因检测方法，该基因检测方法包括量子点的制备与掺杂、DNA杂交、DNA与金属离子的相互作用、荧光分析方法等。

背景技术

基因一直以来都是科学家们研究的热点，其在疾病的诊断与治疗方面，尤其是癌症和遗传性疾病领域，具有极其重要的研究价值。基因的序列信息以及含量水平已经被发现是多种疾病的诊断指标。因此基因检测技术，特别是人体疾病相关的基因的检测技术，对于疾病的诊断、发生机制的研究以及靶向治疗等方面都具有尤为重要的意义。实用的基因检测技术不仅要求对靶基因具有灵敏的检测限，还需要具备相当的特异性，以实现区分基因中单个碱基突变的效果。

传统的基因检测技术一般包括直接测序和杂交检测。直接测序方法准确度高，但一般需要进行多聚酶链式反应（PCR）扩增过程，同时需要专门的仪器与人员，对操作技术的要求很高；杂交检测方法包括：化学发光法，酶标法，放射检测方法等，化学发光法同样操作复杂，需要对DNA进行特定的标记；酶标法涉及对底物的催化反应，影响因素多，过程复杂；放射性标记方法由于对健康和环境的威胁也逐渐被取代。因此，如何设计一种简便灵敏并且对各种与疾病相关基因的通用检测方法成为本发明研究的课题。

发明内容

本发明目的是提供一种简便灵敏通用型的基因检测方法，其目的在于解决目前基因检测方法操作复杂以及灵敏度有限的问题。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种简便灵敏通用型的基因检测方法，由以下两部分组成：

第一部分：

事先建立待测靶基因的浓度与对应产物合成的量子点的荧光光谱波峰强度之间的相关标准曲线，所述相关标准曲线的建立包括以下步骤：

第一步，根据待测靶基因的基因序列，设计含有T-T碱基对并且具有发卡结构的DNA探针；

第二步，将所述第一步中得到的DNA探针中的T-T碱基对与二价金属汞离子特异性结合，形成含有T-Hg²⁺-T结构并且具有发卡结构的DNA探针；其中，所述含有T-Hg²⁺-T结构并且具有发卡结构的DNA探针中的T-T碱基对与二价金属汞离子的物质的量之比为1:1；

第三步，将所述第二步中得到的DNA探针与多组已知梯度浓度的待测靶基因杂交，以完全释放或部分释放所述T-Hg²⁺-T结构中的二价金属汞离子；

第四步，在所述第三步的基础上，向各组体系中加入相同量的无荧光的ZnSe量子点以进行离子交换反应，得到掺杂型的ZnHgSe量子点；

第五步，将所述第四步中获得的掺杂型的ZnHgSe量子点经激光照射后，检测各组ZnHgSe量子点的荧光光谱波峰强度，最后根据已知梯度浓度的待测靶基因，做出荧光光谱波峰强度与待测靶基因浓度的相关标准曲线；

第二部分：未知浓度的待测靶基因的检测方法由以下步骤组成：

第一步，针对未知浓度的待测靶基因，按照所述第一部分中第一步至第四步的方法获得与未知浓度的待测靶基因对应的掺杂型的ZnHgSe量子点；

第二步，将所述第二部分的第一步获得的掺杂型的ZnHgSe量子点经激光照射后，检测出该ZnHgSe量子点的荧光光谱波峰强度，再将该荧光光谱波峰强度与所述第一部分中得到的相关标准曲线进行比对，最终获得所述未知浓度的待测靶基因的浓度值。

上述技术方案中的有关内容解释如下：

1、上述方案中，较佳的方案是所述含有T-T碱基对并且具有发卡结构的DNA探针的茎结构中含有6～9个碱基对，环结构中含有4～20个碱基。发卡结构是由茎结构和环结构组成。

2、上述方案中，所述第一部分的第一步中，当所述待测靶基因的基因序列中含有腺嘌呤时，直接设计与待测靶基因互补的含有T-T碱基对并且具有发卡结构的DNA探针序列，其中，T-T碱基对位于所述发卡结构的茎结构中。当所述待测靶基因的基因序列中不含有腺嘌呤时，在设计与待测靶基因互补的具有发卡型结构的DNA探针序列后，在该具有发卡型结构的DNA探针的茎结构末尾添加T-T碱基对，以形成所述含有T-T碱基对并且具有发卡结构的DNA探针。

3、上述方案中，所述第一部分的第二步中，二价金属汞离子是指含汞的水溶性化合物，如高氯酸汞、次氯酸汞、硝酸汞等。

4、上述方案中，较佳的方案是所述第一部分的第二步中，所述DNA探针中的T-T碱基对与二价金属汞离子特异性结合的条件为反应温度在0～40℃，反应时间在5～30分钟。

5、上述方案中，较佳的方案是所述第一部分的第三步中，所述DNA探针与待测靶基因杂交条件为反应温度在0～40℃，反应时间在30～120分钟，将DNA探针与待测靶基因混合静置即可完成杂交。

6、上述方案中，在所述第一部分的第三步中，与多组已知梯度浓度的待测靶基因杂交的DNA探针的浓度是相同的。比如设定待测靶基因的梯度浓度为1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001mol/L，与这七组待测靶基因杂交的DNA探针的浓度均为1mol/L，因为按照碱基互补配对的原则，DNA探针与靶基因在杂交时按1:1的比例来配对，也就是说，如果待测靶基因的浓度为1mol/L时，该DNA探针的T-Hg²⁺-T结构中的二价金属汞离子是完全释放出来的，当待测靶基因的浓度小于1mol/L的时候，则T-Hg²⁺-T结构中的二价金属汞离子是部分释放出来，从而引起后续步骤中掺杂量子点的荧光强度变化。

7、上述方案中，所述第一部分的第四步中，所述无荧光的ZnSe量子点的制备方法包括以下步骤：将含有锌离子的溶液与谷胱甘肽水溶液混合于pH值在7.4～12.5的pH缓冲溶液中形成混合溶液，其中，所述锌离子与谷胱甘肽的物质的量之比为1:1.2～1:3；再向所述混合溶液中加入硒氢化钠溶液，其中，硒氢化钠与锌离子的物质的量之比为1:2～1:5，振荡即获得无荧光的ZnSe量子点。所述pH缓冲溶液选自碳酸氢铵缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液、PBS缓冲溶液、MOPS缓冲溶液中的任意一种。所述pH缓冲溶液中还可以含有体积分数为0.1～1%的血清或尿液，即指上述pH缓冲溶液中血清或尿液的体积占溶液总体积的0.1～1%。；锌离子的材料是含锌的水溶性化合物，可以是醋酸锌、硝酸锌、氯化锌等。

8、上述方案中，所述第一部分的第四步中，所述各组体系中被释放出来的二价金属汞离子与无荧光的ZnSe量子点发生离子交换反应的条件为室温0～40℃，振荡0.5～2秒钟。

9、上述方案中，所述第一部分的第五步中，所述激光照射的条件为照射时间在1～10分钟，功率为110mw，发射波长为405nm。

本发明设计原理以及有益效果是：量子点（英文名称quantum dots，QDs）是一种尺度小于或者近似激子波尔粒径的半导体纳米晶体，具有独特的光学性质，比如激发谱宽且连续分布，发射波长可调节，荧光量子产率高，寿命长，因而在生物医学成像，光电子器件，太阳能光伏材料等领域有着广泛的应用前景。其中采用离子交换反应的方法可以快速简便地获得掺杂型量子点，其荧光性质也可以通过改变掺杂离子的投入量来进行有效地调控。如ZnSe量子点，在掺杂铜离子（Cu²⁺）和锰离子（Mn²⁺）后，荧光发射波长可从可见光区调控到近红外光区，其荧光强度经过光照后也可以增强数倍。这些优良性质预示着掺杂型量子点具有极高的应用潜力。

由于本身的结构特征，DNA中的某些错配的碱基对能够与金属离子实现特异性的结合，如错配的碱基对T-T之间，能够按1:1的摩尔比例特异性地嵌合汞离子（Hg²⁺），形成T-Hg²⁺-T的稳定结构。

本发明在上述研究基础上，创造性地利用掺杂型量子点的荧光效应以及DNA与金属离子的特异性嵌合特征，通过设计一段含有T-T碱基对的DNA探针，将DNA探针与金属离子结合，再利用待测靶基因与结合了金属离子的DNA探针的互补杂交，将探针中结合的金属离子Hg²⁺释放出来，然后快速掺杂入ZnSe量子点，ZnSe量子点能够与释放出的金属离子发生离子交换反应获得掺杂型量子点，并产生特异性的荧光信号，便可实现对待测靶基因未知浓度的简便而灵敏的检测。相对于传统的荧光探针检测方法，本发明的方法全过程均只需在室温下操作，同时DNA探针的设计可以根据待测靶基因的序列进行相应调整，无需对DNA探针进行额外修饰，因此是一种通用型的检测方法，可以实现对不同的待测靶基因的检测，而且简便又经济；特异性强，能够区分基因中单个碱基的突变；检测灵敏度高，检测限可以达到皮摩尔每升（pM）级别；对于生物医学领域的应用，特别是疾病基因的检测，具有极大的应用前景。

附图说明

附图1为本发明的基因检测方法的流程示意图；

附图2为本发明实施例一中DNA探针结合汞离子前后的熔点图；

附图3为本发明实施例一中DNA探针与待测靶基因以及含有单个突变碱基的靶基因杂交后的PAGE胶图谱；

附图4为本发明中制备的ZnSe量子点在标尺为50nm和5nm下的透射电镜图谱；

附图5为本发明中二价金属汞离子的投料浓度与ZnHgSe量子点经纯化和硝酸处理后通过ICP-AES测定的二价金属汞离子浓度的相关关系图；

附图6为本发明实施例一中梯度浓度的Hg²⁺掺杂的ZnHgSe量子点的荧光光谱图；

附图7为本发明实施例一中梯度浓度的Hg²⁺掺杂的ZnHgSe量子点的荧光强度与Hg²⁺投料浓度的相关关系图；

附图8为本发明实施例一中梯度浓度的完全匹配的待测靶基因、含有单个突变碱基的靶基因以及完全不匹配的基因分别与DNA探针杂交后，各自所生成的ZnHgSe量子点的荧光强度的关系图；

附图9为本发明实施例二的ZnHgSe量子点的荧光强度信号图；

附图10为本发明实施例三的ZnHgSe量子点的荧光强度信号图；

附图11为本发明实施例四的ZnHgSe量子点的荧光强度信号图；

附图12为本发明实施例五的梯度浓度的不含A碱基的待测靶基因和含有单个突变碱基的靶基因所获得的ZnHgSe量子点荧光强度的关系图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：一种简便灵敏通用型的基因检测方法

待测靶基因浓度的检测方法可参见图1所示。本实施例以一种人工合成的DNA作为待测靶基因。

第一步，根据待测靶基因序列设计DNA探针序列，以DNA（序列为5’-GGTCGGTGCAAAGATACGTACGAGGACA-3’）作为待测靶基因，设计探针（序列为5’-GCTTTGACGTACGTATCTTTGCACCGACC-3’），同时以含有单个突变碱基的DNA（序列为5’-GGTCGGTGCAAAGCTACGTACGAGGACA-3’）作为对照，其中探针序列中粗体字母为茎结构，其含有T-T碱基对，下划线部分为探针与待测靶基因配对区域，粗体加斜体的字母C为单个突变碱基；

第二步，将探针（含有三个T-T碱基对）与高氯酸汞以1:3摩尔比例在室温下（即在0～40℃之间）混合并静置15分钟，使T-T碱基对与二价金属汞离子（Hg²⁺）结合并形成含有T-Hg²⁺-T结构并且具有发卡结构的DNA探针；

第三步，结合了Hg²⁺的探针序列与已知梯度浓度的待测靶基因和含有单个突变碱基的靶基因在室温下（即在0～40℃之间）分别进行杂交，杂交时间为2小时，从而部分或者全部释放T-Hg²⁺-T结构中的Hg²⁺；

第四步，将上述第三步中获得的溶液与无荧光的ZnSe量子点进行离子交换反应，形成掺杂型的ZnHgSe量子点，最后经功率为110mw的激光（发射波长为405nm）照射10分钟后测定ZnHgSe量子点的荧光光谱，并做出荧光光谱强度与投入的待测靶基因浓度的相关曲线。

其中，无荧光的ZnSe量子点的制备步骤包括将锌离子（Zn²⁺）水溶液与谷胱甘肽（英文简称GSH）水溶液按摩尔比例1:1.5混合于pH=12.3的碳酸氢铵缓冲溶液中，再向其中加入硒氢化钠（即NaHSe）溶液，NaHSe与Zn²⁺摩尔比例为1:2.5，振荡1秒钟即获得ZnSe量子点。

最后，针对未知浓度的待测靶基因，按照第一步至第四步的方法获得与未知浓度的待测靶基因对应的掺杂型的ZnHgSe量子点；检测出该ZnHgSe量子点的荧光光谱波峰强度，再将该荧光光谱波峰强度与所述第四步得到的相关标准曲线进行比对，最终获得所述未知浓度的待测靶基因的浓度值。

实施例一的结果判定参见图2至图8所示。图2表明本实施例的Hg²⁺嵌入到DNA探针的T-T碱基对中；图3表明嵌合了Hg²⁺的DNA探针与待测靶基因杂交并释放了其中的Hg²⁺，在图3中，条带1～7分别指DNA探针、完全匹配的待测靶基因、含单个突变碱基的待测靶基因、结合了Hg²⁺的DNA探针、结合了Hg²⁺的DNA探针与完全匹配的待测靶基因的杂交条带、结合了Hg²⁺的DNA探针与含有单个突变碱基的待测靶基因的杂交条带、DNA梯状条带分子量标准；图6和图7分别表明ZnSe量子点在与Hg²⁺反应后有明显的与掺杂相关的荧光信号产生且荧光信号强度与投料的Hg²⁺浓度成相关关系，因此表明本实施例的ZnSe量子点与Hg²⁺在室温条件下发生离子交换反应后形成的ZnHgSe掺杂量子点有明显的与掺杂相关的荧光信号；图8表明本实施例的基因检测方法能够区分待测靶基因中单个碱基的突变，从图8可以看出，嵌合了Hg²⁺的DNA探针分别与相同浓度的完全匹配的待测靶基因和含有单个突变碱基的待测靶基因作用后释放Hg²⁺，再分别与ZnSe量子点作用，各自所生成的ZnHgSe掺杂型量子点的荧光信号有明显区别。此外，图8中方块组成的线也是代表待测靶基因的浓度与ZnHgSe量子点的荧光强度之间的相关标准曲线；圆点组成的线就是含单个突变碱基的待测靶基因的浓度与ZnHgSe量子点的荧光强度之间的相关标准曲线；根据标准曲线能够得知待测靶基因的浓度值。

实施例二：一种简便灵敏通用型的基因检测方法

一种简便灵敏通用型的基因检测方法包括以下步骤：

第一步，根据待测靶基因序列设计DNA探针序列，以HIV-1DNA（序列为5’-AGAAGATATTTGGAATAACATGACCTGGATGCA-3’）作为待测靶基因，设计探针（序列为5’-TGGTTTTATGCATCCAGGTCATGTTATTCCAAATATCTTCT-3’），同时以完全不匹配的DNA（序列为5’-CTAGCTGCATCCCGACGATCGAAGAGTCTGATC-3’）作为对照，其中探针中粗体字母为茎结构，其含有T-T碱基对，下划线部分为探针与待测靶基因配对区域；

第二步，将DNA探针(含三个T-T碱基对)与硝酸汞以1:3摩尔比例在室温下混合并静置10分钟，使T-T碱基对与二价金属汞离子（Hg²⁺）结合并形成含有T-Hg²⁺-T结构的发卡型探针；

第三步，结合了Hg²⁺的发卡型的DNA探针与梯度浓度的待测靶基因或者完全不匹配的对照基因在室温下进行杂交，杂交时间为1.5小时，从而部分或者全部释放T-Hg²⁺-T结构中的Hg²⁺；

第四步，将上述第三步中获得的溶液与无荧光的ZnSe量子点进行离子交换反应，形成掺杂型的ZnHgSe量子点，最后经功率为110mw的激光（发射波长405nm）照射后5分钟后测定ZnHgSe量子点的荧光光谱，并做出荧光光谱强度与投入的待测靶基因浓度的相关曲线；

其中，无荧光的ZnSe量子点的制备步骤包括将锌离子（Zn²⁺）水溶液与谷胱甘肽（GSH）水溶液按照摩尔比例1:1.2混合于pH=10.5的Tris-HCl缓冲溶液中（也即三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸缓冲溶液）（含体积分数为1%的血清），再向其中加入硒氢化钠（NaHSe）溶液，NaHSe与Zn²⁺摩尔比例为1:2，振荡1秒钟即可获得ZnSe量子点。

最后，针对未知浓度的待测靶基因，按照第一步至第四步的方法获得与未知浓度的待测靶基因对应的掺杂型的ZnHgSe量子点；检测出该ZnHgSe量子点的荧光光谱波峰强度，再将该荧光光谱波峰强度与所述第四步得到的相关标准曲线进行比对，最终获得所述未知浓度的待测靶基因的浓度值。

本实施例的结果参见图9所示。图9表示以HIV-1作为待测靶基因，设计相关的DNA探针。图中从左到右三个柱形条分别指：（1）DNA探针与汞离子(汞离子浓度为10nmol/L)结合，没有待测靶基因的杂交配对，因此没有汞离子的释放，与ZnSe不会发生交换反应，因而不会产生ZnHgSe掺杂量子点，也没有荧光，或者说荧光强度很低；（2）DNA探针与汞离子结合(汞离子浓度为10nmol/L)，然后与完全不配对的靶基因杂交，没有汞离子的释放，与ZnSe不会发生交换反应，因而不会产生ZnHgSe掺杂量子点，也因此没有荧光（或者荧光强度很低），以此来做对照组，说明只有配对的靶基因才能与探针杂交以释放其中的汞离子。（3）DNA探针与汞离子(汞离子浓度为10nmol/L)结合，然后与完全配对的靶基因杂交，汞离子全部释放，与ZnSe发生交换反应，产生ZnHgSe掺杂量子点，也因此发出荧光（或者说荧光强度很高）。

实施例三：一种简便灵敏通用型的基因检测方法

一种简便灵敏通用型的基因检测方法包括以下步骤：

第一步，根据待测靶基因序列设计DNA探针序列，以P53exon8DNA（序列为5’-CCTCTGTGCGCCGGTCTCTCCCAGGACAGGCA-3’）作为待测靶基因，设计DNA探针（序列为5’-TGCCTGTCCTGGGAGAGACCGTCTGGCT-3’），同时以含有单个突变碱基的R282W p53exon8DNA（序列为5’-CCTCTGTGCGCCAGTCTCTCCCAGGACAGGCA-3’）作为对照，其中探针序列中粗体字母为茎结构，其含有T-T碱基对，下划线部分为探针序列与待测靶基因配对区域，粗体加斜体的字母A为单个突变碱基；

第二步，将DNA探针（含有三个T-T碱基对）与次氯酸汞以1:3摩尔比例在室温下混合并静置5分钟，使T-T碱基对与二价金属汞离子（Hg²⁺）结合并形成含有T-Hg²⁺-T结构的发卡型探针；

第三步，结合了Hg²⁺的发卡型的DNA探针与梯度浓度的待测靶基因或含有单个突变碱基的对照基因在室温下进行杂交，时间为0.5小时，从而部分或者全部释放T-Hg²⁺-T结构中的Hg²⁺；

第四步，将上述第三步中获得的溶液与无荧光的ZnSe量子点进行离子交换反应，形成掺杂型的ZnHgSe量子点，最后经功率为110mw的激光（发射波长405nm）照射3分钟后测定ZnHgSe量子点的荧光光谱，并做出荧光光谱强度与投入的待测靶基因浓度的相关曲线；

其中，无荧光的ZnSe量子点的制备步骤包括将锌离子（Zn²⁺）水溶液与谷胱甘肽（GSH）水溶液按照摩尔比例1:2混合于pH=9.5的Tris-HCl缓冲溶液中（也即三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸缓冲溶液）（含体积分数为0.5%的血清），再向其中加入硒氢化钠（NaHSe）溶液，NaHSe与Zn²⁺摩尔比例为1:3，振荡1秒钟即可获得ZnSe量子点。

最后，针对未知浓度的待测靶基因，按照第一步至第四步的方法获得与未知浓度的待测靶基因对应的掺杂型的ZnHgSe量子点；检测出该ZnHgSe量子点的荧光光谱波峰强度，再将该荧光光谱波峰强度与所述第四步得到的相关标准曲线进行比对，最终获得所述未知浓度的待测靶基因的浓度值。

本实施例的结果参见图10所示。图10中从左到右三个柱形条分别指：（1）DNA探针与汞离子(汞离子浓度为10nmol/L)结合，没有待测靶基因的杂交配对，因此没有汞离子的释放，与ZnSe不会发生交换反应，因而不会产生ZnHgSe掺杂量子点，也因此没有荧光（或者荧光强度很低）；（2）DNA探针与汞离子(汞离子浓度为10nmol/L)结合，然后与含有单个突变碱基的靶基因杂交，汞离子部分释放，与ZnSe发生交换反应，产生ZnHgSe掺杂量子点，也因此产生荧光（或者荧光强度比较高）。（3）DNA探针与汞离子(汞离子浓度为10nmol/L)结合，然后与完全配对的靶基因杂交，汞离子全部释放，与ZnSe发生交换反应，产生ZnHgSe掺杂量子点，也因此发出荧光（或者荧光强度很高）。

实施例四：一种简便灵敏通用型的基因检测方法

一种简便灵敏通用型的基因检测方法包括以下步骤：

第一步，根据待测靶基因序列设计DNA探针序列，以tau DNA（序列为5’-GGAGGAGACATTGCTGAGATGCCGTGGA-3’）作为待测靶基因，设计探针（序列为5’-GTCTTTGACGGCATCTCAGCAATGTC-3’），同时以含有单个突变碱基的R406W tau DNA（序列为5’-GGAGGAGACATTGCTGAGATGCCATGGA-3’）作为对照，其中DNA探针中粗体字母为茎结构，其含有T-T碱基对，下划线部分为DNA探针与待测靶基因配对区域，粗体加斜体的字母A为单个突变碱基；

第二步，将DNA探针（含有两个T-T碱基对）与硝酸汞以1:2摩尔比例在室温下混合并静置30分钟，使T-T碱基对与二价金属汞离子（Hg²⁺）结合并形成含有T-Hg²⁺-T结构的发卡型探针；

第三步，结合了Hg²⁺的发卡型的DNA探针序列与梯度浓度的待测靶基因或者含有单个突变碱基的对照基因在室温下进行杂交，时间为2小时，从而部分或者全部释放T-Hg²⁺-T结构中的Hg²⁺；

第四步，将上述第三步中获得的溶液与无荧光的ZnSe量子点进行离子交换反应，形成掺杂型的ZnHgSe量子点，最后经功率为110mw的激光（发射波长405nm）照射1分钟后测定ZnHgSe量子点的荧光光谱，并做出荧光光谱强度与投入的待测靶基因浓度的相关曲线；

其中，无荧光的ZnSe量子点的制备步骤包括将醋酸锌（Zn²⁺）水溶液与谷胱甘肽（GSH）水溶液按照摩尔比例1:3混合于pH=8.5的MOPS缓冲溶液中（也即3-(N-吗啡啉)丙磺酸缓冲溶液）（含体积分数为0.1%的血清），再向其中加入硒氢化钠（NaHSe）溶液，NaHSe与Zn²⁺摩尔比例为1:4，振荡1秒钟即可获得ZnSe量子点；

最后，针对未知浓度的待测靶基因，按照第一步至第四步的方法获得与未知浓度的待测靶基因对应的掺杂型的ZnHgSe量子点；检测出该ZnHgSe量子点的荧光光谱波峰强度，再将该荧光光谱波峰强度与所述第四步得到的相关标准曲线进行比对，最终获得所述未知浓度的待测靶基因的浓度值。

实施例四的结果参见图11。图中从左到右三个柱形条分别指：（1）DNA探针与汞离子（汞离子浓度为10nmol/L）结合，没有待测靶基因的杂交配对，因此没有汞离子的释放，与ZnSe不会发生交换反应，因而不会产生ZnHgSe掺杂量子点，也因此没有荧光（或者荧光强度很低）；（2）DNA探针与汞离子(汞离子浓度为10nmol/L)结合，然后与含有单个突变碱基的靶基因杂交，汞离子部分释放，与ZnSe发生交换反应，产生ZnHgSe掺杂量子点，也因此产生荧光（或者荧光强度比较高）；（3）DNA探针与汞离子(汞离子浓度为10nmol/L)结合，然后与完全配对的靶基因杂交，汞离子全部释放，与ZnSe发生交换反应，产生ZnHgSe掺杂量子点，也因此发出荧光（或者荧光强度很高）。

实施例五：一种简便灵敏通用型的基因检测方法

一种简便灵敏通用型的基因检测方法包括以下步骤：

第一步，根据待测靶基因序列设计DNA探针序列，以p53exon8DNA’（序列为5’-CCTCTGTGCGCCGGTCTCTC-3’）作为待测靶基因，设计探针（序列为5’-TTCCTCTGAGAGACCGGCGCACAGAGGTA-3’），同时以含有单个突变碱基的R282W p53exon8DNA’（序列为5’-CCTCTGTGCGCCAGTCTCTC-3’）作为对照，其中DNA探针中粗体字母为茎结构，其含有T-T碱基对，下划线部分为探针与待测靶基因配对区域，粗体加斜体的字母A为单个突变碱基；

第二步，将DNA探针（含有一个T-T碱基对）与次氯酸汞以1:1摩尔比例在室温下混合并静置25分钟，使T-T碱基对与二价金属汞离子（Hg²⁺）结合并形成含有T-Hg²⁺-T结构的发卡型探针；

第三步，结合了Hg2+的发卡型的DNA探针与梯度浓度的待测靶基因或含有单个突变碱基的对照基因在室温下进行杂交，时间为1小时，从而部分或者全部释放T-Hg²⁺-T结构中的Hg²⁺；

第四步，将上述第三步中获得的溶液与无荧光的ZnSe量子点进行离子交换反应，形成掺杂型的ZnHgSe量子点，最后经功率为110mw的激光（发射波长405nm）照射10分钟后测定ZnHgSe量子点的荧光光谱，并做出荧光光谱强度与投入的待测靶基因浓度的相关曲线。

其中，无荧光的ZnSe量子点的制备步骤包括将氯化锌（Zn²⁺）水溶液与谷胱甘肽（GSH）水溶液按照摩尔比例1:2.5混合于pH=7.4的PBS缓冲溶液中，再向其中加入硒氢化钠（NaHSe）溶液，NaHSe与Zn²⁺摩尔比例为1:5，振荡1秒钟即可获得ZnSe量子点。

最后，针对未知浓度的待测靶基因，按照第一步至第四步的方法获得与未知浓度的待测靶基因对应的掺杂型的ZnHgSe量子点；检测出该ZnHgSe量子点的荧光光谱波峰强度，再将该荧光光谱波峰强度与所述第四步得到的相关标准曲线进行比对，最终获得所述未知浓度的待测靶基因的浓度值。

本实施的结果参见图12。图12表示本实施例的基因检测方法对于不含碱基“A”的待测靶基因是否同样具有通用性检测效果。根据待测靶基因序列，设计茎末端含有T-T碱基对的DNA探针，然后测定生成的ZnHgSe掺杂型量子点的荧光强度与待测靶基因浓度成相关关系。同时，图12也是本实施例的待测靶基因的浓度与ZnHgSe掺杂型量子点的荧光强度之间的相关标准曲线，其中，图12中的方块组成的线是不含碱基“A”的待测靶基因与ZnHgSe量子点的荧光强度之间的相关标准曲线，圆点组成的线是含单个突变碱基的待测靶基因的浓度与ZnHgSe量子点的荧光强度之间的相关标准曲线。

上述实施例一至实施例五的结果判定如下：

1、Hg²⁺是否能够嵌入DNA探针里的T-T碱基对中，其判定方法为嵌合了Hg²⁺的探针其熔解温度与没有嵌合Hg²⁺的探针相比是否会明显升高，可参见图2，DNA探针熔点图，若嵌合了Hg²⁺的探针其熔解温度明显升高，则Hg²⁺嵌入到DNA探针里的T-T碱基对中；

2、嵌合了Hg²⁺的探针能否与待测靶基因杂交以释放其中的Hg²⁺，其判定方法为聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是否形成探针与靶基因杂交的双链条带，可参见图3，若聚丙烯酰胺凝胶电泳形成了探针与靶基因杂交的双链条带，则嵌合了Hg²⁺的探针与待测靶基因杂交以释放其中的Hg²⁺；在图3中，条带1～7分别指DNA探针、完全匹配的待测靶基因、含单个突变碱基的待测靶基因、结合了Hg²⁺的DNA探针、结合了Hg²⁺的DNA探针与完全匹配的待测靶基因的杂交条带、结合了Hg²⁺的DNA探针与含有单个突变碱基的待测靶基因的杂交条带、DNA梯状条带分子量标准；

3、ZnSe量子点是否制备成功，其判定方法为ZnSe量子点的透射电镜图谱是否有纳米级晶体颗粒，参见图4，若显示有纳米级晶体颗粒，则ZnSe量子点制备成功；

4、Hg²⁺在室温条件下是否可以掺杂入ZnSe量子点，以形成ZnHgSe量子点，其判定方法为对纯化过的ZnHgSe量子点产物进行元素分析，使用电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-AES）对硝酸处理的ZnHgSe量子点中Hg²⁺的浓度进行测定，再确定其中的Hg元素的含量是否与投料的Hg²⁺浓度成相关关系，参见图5；若其中的Hg元素的含量与投料的Hg2+浓度成相关关系，则Hg²⁺在室温条件下掺杂入ZnSe量子点，以形成ZnHgSe量子点；

5、ZnSe量子点是与Hg²⁺在室温条件下发生离子交换反应后形成的ZnHgSe掺杂量子点是否有明显的与掺杂相关的荧光信号，其判定方法为ZnSe量子点在与Hg²⁺反应后是否有明显的掺杂相关的荧光信号产生且荧光信号强度是否与投料的Hg²⁺浓度成相关关系，参见图6和图7；若ZnSe量子点在与Hg²⁺反应后有明显的掺杂相关的荧光信号产生且荧光信号强度与投料的Hg²⁺浓度成相关关系，则ZnSe量子点是与Hg²⁺在室温条件下发生离子交换反应后形成的ZnHgSe掺杂量子点有明显的与掺杂相关的荧光信号；

6、此种方法是否能够区分待测靶基因中单个碱基的突变，其判定方法为嵌合了Hg²⁺的DNA探针分别与相同浓度的完全匹配的待测靶基因和含有单个突变碱基的待测靶基因作用后释放Hg²⁺，再分别与ZnSe量子点作用，测定各自所生成的ZnHgSe掺杂型量子点的荧光信号是否有明显区别，如图8；若测定各自所生成的ZnHgSe掺杂型量子点的荧光信号有明显区别，则能够区分待测靶基因中单个碱基的突变；

7、此种方法是否对于不同的待测靶基因具有通用性检测效果，其判定方法为根据不同的待测靶基因序列分别设计对应的DNA探针，按照上述操作步骤，分别测定各自生成的ZnHgSe掺杂型量子点的荧光信号是否相似，如图9、图10、图11；若测定各自生成的ZnHgSe掺杂型量子点的荧光信号相似，则表明本发明的基因检测方法对于不同的待测靶基因具有通用性检测效果；

8、此种方法对于不含碱基“A”的待测靶基因是否同样具有通用性检测效果，其判定方法为根据待测靶基因序列按照上述方法，设计茎末端含有T-T碱基对的DNA探针，然后测定生成的ZnHgSe掺杂型量子点的荧光强度是否与待测靶基因浓度成相关关系，如图12，若测定生成的ZnHgSe掺杂型量子点的荧光强度与待测靶基因浓度成相关关系，则表明本发明的基因检测方法对于不含碱基“A”的待测靶基因同样具有通用性检测效果。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种简便灵敏通用型的基因检测方法，其特征在于：

第一部分：

事先建立待测靶基因的浓度与对应产物合成的量子点的荧光光谱波峰强度之间的相关标准曲线，所述相关标准曲线的建立包括以下步骤：

第一步，根据待测靶基因的基因序列，设计含有T-T碱基对并且具有发卡结构的DNA探针；

第二步，将所述第一步中得到的DNA探针中的T-T碱基对与二价金属汞离子特异性结合，形成含有T-Hg²⁺-T 结构并且具有发卡结构的DNA探针；其中，所述含有T-Hg²⁺-T 结构并且具有发卡结构的DNA 探针中的T-T 碱基对与二价金属汞离子的物质的量之比为1:1；

第三步，将所述第二步中得到的DNA探针与多组已知梯度浓度的待测靶基因杂交，以完全释放或部分释放所述T-Hg²⁺-T 结构中的二价金属汞离子；

第四步，在所述第三步的基础上，向各组体系中加入相同量的无荧光的ZnSe量子点以进行离子交换反应，得到掺杂型的ZnHgSe 量子点； 

第五步，将所述第四步中获得的掺杂型的ZnHgSe 量子点经激光照射后，检测各组ZnHgSe 量子点的荧光光谱波峰强度，最后根据已知梯度浓度的待测靶基因，做出荧光光谱波峰强度与待测靶基因浓度的相关标准曲线；

第二部分：未知浓度的待测靶基因的检测方法由以下步骤组成：

第一步，针对未知浓度的待测靶基因，按照所述第一部分中第一步至第四步的方法获得与未知浓度的待测靶基因对应的掺杂型的ZnHgSe 量子点；

第二步，将所述第二部分的第一步获得的掺杂型的ZnHgSe 量子点经激光照射后，检测出该ZnHgSe 量子点的荧光光谱波峰强度，再将该荧光光谱波峰强度与所述第一部分中得到的相关标准曲线进行比对，最终获得所述未知浓度的待测靶基因的浓度值。

2.根据权利要求1所述的基因检测方法，其特征在于：所述含有T-T碱基对并且具有发卡结构的DNA探针的茎结构中含有6~9 个碱基对，环结构中含有4~20 个碱基。

3.根据权利要求1所述的基因检测方法，其特征在于：所述第一部分的第一步中，当所述待测靶基因的基因序列中含有腺嘌呤时，直接设计与待测靶基因互补的含有T-T碱基对并且具有发卡结构的DNA探针序列，其中，T-T 碱基对位于所述发卡结构的茎结构中。

4.根据权利要求1所述的基因检测方法，其特征在于：所述第一部分的第一步中，当所述待测靶基因的基因序列中不含有腺嘌呤时，在设计与待测靶基因互补的具有发卡型结构的DNA探针序列后，在该具有发卡型结构的DNA探针的茎结构末尾添加T-T 碱基对，以形成所述含有T-T碱基对并且具有发卡结构的DNA探针。

5.根据权利要求1所述的基因检测方法，其特征在于：所述第一部分的第二步中，所述DNA探针中的T-T碱基对与二价金属汞离子特异性结合的条件为反应温度在0~40 ℃，反应时间在5~30分钟。

6.根据权利要求1所述的基因检测方法，其特征在于：所述第一部分的第三步中，所述DNA探针与待测靶基因杂交条件为反应温度在0~40 ℃，反应时间在30~120分钟。

7.根据权利要求1所述的基因检测方法，其特征在于：所述第一部分的第四步中，所述无荧光的ZnSe量子点的制备方法包括以下步骤：将含有锌离子的溶液与谷胱甘肽水溶液混合于 pH值在7.4~12.5的pH缓冲溶液中形成混合溶液，其中，所述锌离子与谷胱甘肽的物质的量之比为1:1.2~1:3；再向所述混合溶液中加入硒氢化钠溶液，其中，硒氢化钠与锌离子的物质的量之比为1:2~1:5，振荡即获得无荧光的ZnSe量子点。

8.根据权利要求7所述的基因检测方法，其特征在于：所述pH缓冲溶液选自碳酸氢铵缓冲溶液、Tris-HCl 缓冲溶液、PBS缓冲溶液、MOPS缓冲溶液中的任意一种。

9.根据权利要求1所述的基因检测方法，其特征在于：所述第一部分的第四步中，所述各组体系中被释放出来的二价金属汞离子与无荧光的ZnSe量子点发生离子交换反应的条件为室温0~40 ℃，振荡0.5~2秒钟。

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