CN103877576A - Caspase激活及募集结合域3（Card3）基因在冠状动脉粥样硬化性心脏病中的功能和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种Caspase激活及募集结合域3（Card3）基因在冠状动脉粥样硬化性心脏病中的功能和应用。本发明以Card3基因敲除小鼠和心脏特异性Card3转基因小鼠为对象，通过阻断小鼠心脏左冠状动脉前降支造成心肌梗死模型进行研究，结果表明与WT小鼠对比，Card3基因敲除小鼠心脏梗死比例、心肌肥厚和纤维化的程度明显被抑制，心功能明显好转；而Card3转基因小鼠与Card3基因敲除小鼠表型相反。表明Card3基因能够促进并加重冠状动脉粥样硬化性心脏病的发生发展，Card3可作为药物靶标筛选治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的的药物，Card3的抑制剂可用于制备治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的的药物。

Description

Caspase激活及募集结合域3(Card3)基因在冠状动脉粥样硬化性心脏病中的功能和应用

 

技术领域

本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种Caspase激活及募集结合域3（Card3）基因在冠状动脉粥样硬化性心脏病中的功能和应用。

背景技术

心血管疾病是全球范围引起死亡最高的疾病，是人类健康的头号杀手。缺血性心脏病是造成心血管疾病死亡最主要的原因，心肌梗死（myocardial infarction，MI）是缺血性心脏病的常见类型，心肌的血液供应阻断30分钟以上就会引起各细胞器超微结构的改变和功能障碍，导致心肌细胞不可逆的损伤乃至死亡。在急性心肌梗死发作后的几分钟内，缺血中央区的心肌细胞便会由于缺血而死亡，是严重威胁人类健康和生命的常见病之一，近年来冠心病发病率和死亡率逐步升。冠心病也是一个全球性的健康问题，为当今人类一大灾难性疾病，50年代以来，冠心病成为西方发达国家致死的首因，而我国的冠心病发病率也呈逐年增加趋势。

在心肌梗死急性期，梗死区心肌呈凝固性坏死，心肌间质充血、水肿，伴多量炎症细胞浸润。急性期过后，随着支持心肌细胞的胶原基质分解，坏死的心肌细胞发生滑脱，坏死组织伸展随后变薄，这是导致早期的左心室扩张原因之一，而非坏死区心肌间质也因神经内分泌的影响发生重构致使心脏的收缩和舒张功能受损并最终导致心力衰竭。心肌发生梗死后仅有少量心肌细胞发生分裂增生，无法有效、完整的修复心肌组织，因此，梗死区心肌只能通过纤维组织增生，由无收缩功能的疤痕组织代替，进而引发严重的心律失常、心功能不全甚至是死亡。如何让越来越多的冠心病人得到更有效的治疗，达到降低其病死率，提高生活质量的目的，已成为国内外医学界共同关注的问题。因此对于冠状动脉粥样硬化性心脏病的药物的开发显得尤为重要。

Card3（Caspase activation and recruitment domain 3）也被称作RIP2，受体相互作用蛋白2（receptor-interacting protein 2），属于RIP家族成员，在多种组织中均有分布，是一个丝/苏氨酸蛋白激酶，介于激酶域和CARD域之间的媒介领域，最初在1998年由3个独立的研究小组筛选RIP和CARD同源蛋白时发现的，Card3分布于胞质内，在组织表达广泛，其mRNA高表达于脾、外周血白细胞、胎盘、睾丸和心脏等组织中。Card3在固有免疫、适应性免疫和炎症反应中起重要作用，并参与多种疾病发生。许多研究发现当感染细菌及病毒时，Card3可介导NF-κB的激活并引起炎症反应，尤其在NOD/RIP2信号途径中，Card3作为其下游因子引起宿主适当的免疫反应。Card3的一个显著特征是其表达在转录水平以细胞特异的、时间依赖的方式被调控。Card3的表达增加反应于细胞特异的刺激，包括细菌的肽聚糖和脂多糖。

发明内容

为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种Card3及其抑制剂在制备治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明公开一种Caspase激活及募集结合域3（Card3）基因在冠状动脉粥样硬化性心脏病中的功能和应用。本发明以Card3基因敲除小鼠和心脏特异性Card3转基因小鼠为对象，通过阻断小鼠心脏左冠状动脉前降支造成心肌梗死模型进行研究，结果表明与WT小鼠对比，Card3基因敲除小鼠心脏梗死比例、心肌肥厚和纤维化的程度明显被抑制，心功能明显好转；而Card3转基因小鼠与Card3基因敲除小鼠表型相反。表明Card3基因能够促进并加重冠状动脉粥样硬化性心脏病的发生发展，Card3可作为药物靶标筛选治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的的药物，Card3的抑制剂可用于制备治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的的药物。

因此，Card3基因可作为药物靶点，构建Card3基因过表达的体外细胞模型或动物模型，用于筛选预防、缓解和/ 或治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的药物；Card3基因也可作为基因治疗中的靶基因，设计并制备预防、缓解和/或治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的药物和/或生物学试剂，通过基因工程技术达到预防、缓解和/或治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的目的。例如以Card3为靶基因，设计可干扰Card3表达的双链siRNA，通过化学方法合成以后，注射入人体通过RNA 干扰的方法使Card3基因沉默来治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病；还可以设计并构建Card3的突变体，注射后进入细胞，竞争Card3原形的作用底物，从而抑制Card3的功能，起到治疗目的；此外，还可以以Card3为靶点设计小分子化合物抑制剂，利用Card3基因过表达的体外细胞模型或动物模型，通过筛选，发现其中能够特异性抑制Card3的分子，从而为冠状动脉粥样硬化性心脏病的治疗提供新的治疗性分子。

针对Card3的上述功能，提供Card3作为药物靶标在筛选保护心脏功能的药物中的应用。

针对Card3的上述功能，提供Card3作为药物靶标在筛选治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的药物中的应用。

针对Card3的上述功能，提供Card3的抑制剂在制备保护心脏功能的药物中的应用。

一种保护心脏功能的药物，包含Card3的抑制剂。

针对Card3的上述功能，提供Card3的抑制剂在制备治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的药物中的应用。

一种治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的药物，包含Card3的抑制剂。

所述的Card3的抑制剂优选为Card3基因的siRNA、Card3基因的RNA干扰载体，Card3的抗体及其他能够抑制Card3表达的抑制剂中的一种。

本发明以Card3基因敲除小鼠和心脏特异性Card3转基因小鼠为实验对象，通过阻断小鼠心脏左冠状动脉前降支（LAD）造成心肌梗死模型进行研究，结果表明与WT小鼠（对照组）相比，Card3基因敲除小鼠死亡率明显降低，心脏梗死面积明显减少，心肌肥厚和纤维化的程度明显减轻，而心脏特异性Card3转基因小鼠的死亡率明显升高，心脏梗死面积则明显增加，且心肌肥厚和纤维化的程度明显加重。这提示Card3基因具有恶化心脏功能的作用，能加重促进心肌梗死、心肌肥厚及纤维化的发展，为研究防治冠状动脉粥样硬化性心脏病的新靶点和新策略提供了理论依据和临床基础。

本发明的研究成果表明，Card3-KO小鼠在结扎冠状动脉引起的损伤中，Card3敲除后，小鼠的心脏梗死面积明显减少，心肌肥厚和纤维化的程度明显减轻，心功能明显好转；而心脏特异性Card3转基因小鼠的死亡率明显升高，心脏梗死面积则明显增加，且心肌肥厚和纤维化的程度明显加重。证明Card3基因在冠状动脉粥样硬化性心脏病模型中有着重要的恶化作用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

（1）本发明发现Card3基因的新功能，即Card3基因能够恶化冠状动脉粥样硬化性心脏病的作用。

（2）基于Card3基因在恶化冠状动脉粥样硬化性心脏病中的功能，为研制冠状动脉粥样硬化性心脏病的药物提供靶标。

（3）Card3的抑制剂可用于制备保护心脏功能和治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的药物。

附图说明

图1是各组小鼠的生存曲线图。A为WT和Card3-KO小鼠的生存曲线图，B为NTG和Card3-TG小鼠的生存曲线图。

图2是WT和Card3-KO小鼠的表型结果图。A为小鼠心身比、肺身比及心胫比的统计柱状图；B为心脏组织HE染色、梗死比例及心肌细胞横截面积统计柱状图；C图为心脏组织天狼星红染色（红色代表胶原）及胶原容积比例统计柱状图；4W指4周。

图3是NTG和Card3-TG小鼠的表型结果图。A为小鼠心身比、肺身比及心胫比的统计柱状图；B为心脏组织HE染色、梗死比例及心肌细胞横截面积统计柱状图；C图为心脏组织天狼星红染色（红色代表胶原）及胶原容积比例统计柱状图；4W指4周。

图4是WT和Card3-KO小鼠的心功能检测结果图。A为超声检测心功能结果统计柱状图；B为PV检测血流动力学结果统计柱状图；4W指4周。

图5是NTG和Card3-TG小鼠的心功能检测结果图。A为超声检测心功能结果统计柱状图；B为PV检测血流动力学结果统计柱状图；4W指4周。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实验用动物及饲养

实验动物：8-10周龄、体重在23.5-27.5g，背景为C57BL/6品系的心脏特异性Cre小鼠（WT，购自Jackson Laboratory，货号005650）、心脏特异性Card3基因敲除小鼠（Card3-KO，购自Jackson Laboratory，货号007017）、心脏特异性Card3转基因小鼠（Card3-TG，心脏特异性Card3转基因小鼠由武汉大学心血管病研究所李红良教授实验室构建）及非转基因小鼠（NTG，同窝对照非转基因小鼠）为实验对象。

心脏特异性Card3转基因小鼠的构建如下：

转基因载体构建信息：扩增小鼠Card3全长基因（NCBI, Gene ID: 192656, XM_006537677.1），把cDNA连接于α-MHC启动子下游，将序列构造通过显微注射构造成受精胚胎（C57BL/6J背景），得到Card3-TG小鼠。

饲养环境：所有实验小鼠均饲养在武汉大学心血管病研究所SPF级实验动物中心。小鼠专用饲料由中国军事医学科学院动物中心提供。饲养条件：室温在22-24℃之间，湿度在40-70%之间，明暗交替照明时间为12h，自由饮水摄食。

【实施例1】  心肌梗死（MI）模型获得

1. 实验动物分组：雄性C57BL/6背景WT小鼠、Card3基因敲除小鼠（Card3-KO）及心脏特异性Card3转基因小鼠（Card3-TG）和非转基因小鼠（NTG），通过结扎小鼠心脏左冠状动脉前降支（LAD）造成心肌梗死（MI）模型。随机分为8组，每组：C57BL/6背景WT小鼠假手术组（WT Sham）及MI术组（WT MI）、Card3基因敲除小鼠假手术组（Card3-KO Sham）及MI术组（Card3-KO MI）、非转基因小鼠假手术组（NTG Sham）及MI术组（NTG MI）、心脏特异性Card3转基因小鼠假手术组（Card3-TG Sham）及MI术组（Card3-TG MI）。

2. MI模型采用阻断小鼠心脏左冠状动脉前降支（LAD）造成心肌梗死，模型操作流程： 

2.1 称重麻醉备皮：用电子天平于动态模式下准确称取小鼠体重（g），用双蒸水准确配置3%戊巴比妥钠溶液，轻轻摇动使其充分溶解，采用80mg/kg体重剂量，计算所需戊巴比妥钠溶液体积后用1mL注射器准确抽取相应体积溶液，行腹腔注射麻醉小鼠，待小鼠充分麻醉倒（约3min）后，用小鼠剃毛器剃除小鼠胸部及腋下毛发（充分暴露手术区）。

2.2 气管插管：麻醉一定时间（约20-30min）后，夹趾检测无反应即可开始手术。打开外置光源、显微镜开关，打开呼吸机，设置好各参数（呼吸频率100bpm、恒压16-17mmHg），将小鼠门齿用橡皮筋固定在自制斜面上，外置光源照向小鼠颈部，眼科镊拉出小鼠舌头，调节光源亮度及位置，此时可见小鼠声门随呼吸呈开闭运动，声门开启时将气管插管沿声门送入气管，取下小鼠接上呼吸机，观察小鼠呼吸状况，胸廓起伏与呼吸机频率一致表示插管成功，即可进行下步手术，整个手术过程用加热垫维持小鼠体温在37℃左右。

2.3 开胸：小鼠采用右侧卧位，用医用胶带固定好小鼠四肢（左前肢位于右前肢前以充分暴露手术区），用医用碘酊及75%医用酒精对手术区皮肤进行消毒清洁处理，用眼科剪在左前肢下0.5cm处沿肋骨走向剪开皮肤，逐层分离筋膜、肌肉等组织（尽量避开较大血管，若不能避免则先行阻断再剪断血管），用显微剪于三、四肋间打开胸腔充分暴露心脏，用显微直镊轻轻夹起少量心包并于左心耳下撕开少许心包，充分暴露左冠状动脉前降支（LAD）或所在区域。

2.4 结扎冠状动脉：于显微镜下找到LAD走向或可能所在位置（小鼠LAD走行于左心耳与肺动脉圆锥间，多发出于左心耳下缘处），用无齿持针器持取7-0带针缝合线，于左心耳下缘1mm处进针，肺动脉圆锥旁出针，进针深度0.5mm，宽度为1mm，缝线从LAD下方穿过，稳定5s后，在心脏表面结扎处放置一长度2mm，大小为10号的聚乙烯塑料棒（要求表面光滑，大小为取出棒后结扎线不会压迫血管），后在其上打一活结，轻拉以结扎LAD（力度以能完全阻断LAD血流为准，宁轻勿重），剪去线头，结扎成功，则可见左室前壁明显由鲜红色变为苍白而不再恢复，同时心电图显示sT段抬高和（或）T波高耸或者倒置呈弓背向上单向曲线。6-0缝线完全缝合胸腔开口关闭胸腔，5mL注射器接套管经切口插入胸腔，抽取1mL气体，平整各层肌肉，合拢皮肤切口暂不缝合（Sham组不结扎LAD，直接关胸）。

2.5 关胸：结扎完成后，6-0缝线完全缝合胸腔开口（保证无缝隙、无错位）关闭胸腔，5mL注射器接套管经切口插入胸腔，抽取1mL气体，6-0缝线由内向外逐层缝合各层肌肉，后用5-0缝线将皮肤切口缝合完整。

  2.6 术后管理：术后密切关注小鼠状态，有无呼吸异常等。待小鼠自然苏醒后将小鼠从呼吸机上取下并取下气管插管，放入干净的饲养笼，填写手术记录卡片，放回IVC笼架饲养，密切关注小鼠术后状态以及死亡情况并做好相应记录。

小鼠心肌梗死模型建立的过程中Sham组均无死亡小鼠，WT MI组有32只小鼠纳入实验，在术后4周（4W）的时间里死亡16只小鼠；Card3-KO MI组有34只小鼠纳入实验，术后4周（4W）死亡13只小鼠；NTG MI组有33只小鼠纳入实验，术后4周（4W）死亡16只小鼠；TG MI组有66只小鼠纳入实验，术后4周（4W）死亡44只小鼠。

通过术后各组小鼠生存状况的统计，可以明显发现Card3-KO MI组小鼠的死亡率明显低于其对照组WT小鼠，Card3-TG MI的死亡率则明显高于NTG MI组。应用软件Graph Pad Prism 5绘制各组小鼠的生存曲线（见图1），结果表明Card3-KO MI的生存率明显高于WT MI组，而Sham组无死亡小鼠，没有明显差异（A）；同样Card3-TG MI的生存率则明显低于NTG MI组（B），说明Card3-KO MI组小鼠较低的死亡率可能是由于Card3基因的缺失而引起的。

【实施例2】  小鼠心肌梗死（MI）模型心脏梗死比例、心肌肥厚及纤维化检测

1. 取材

（1）前期工作：预先准备装有20mL的10%甲醛的尿杯，并贴好标签（小鼠编号、组别、手术类型及取材日期）。将倒满10%KCl溶液的培养皿置于取材处。打开分析天平，调零备用，再称重处死小鼠。

（2）取材：眼科弯镊夹住心耳下方的血管蒂，剪下心脏，迅速置于10%KCl溶液中。待心脏停跳在舒张期后，置于灭菌纱布上，轻轻挤压心腔内液体，蘸干表面液体后，称重并记录，将心脏放入相应的尿杯中，固定48h后用于病理学检测。

（3）相关测量及计算：取出小鼠肺脏，修剪后滤纸吸干，称重并记录。剪开小鼠后肢胫骨处皮肤，测量并记录胫骨长度。计算心重与体重的比值（HW/BW），肺重与体重的比值（LW/BW）以及心重与胫骨长度的比值（HW/TL），测定结果见图2A。

2. 病理学检测

2.1 制备石蜡标本切片

由实验室专业病理工作人员制备石蜡标本切片，主要操作程序包括修剪心脏→包埋框处理→流水冲洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→摊片→晾干或烘烤后备用。

2.2 苏木精-伊红（HE）染色

主要步骤为：

55℃烘烤30min→二甲苯5min，3次→100%酒精1min→95%酒精1min→70%酒精1min→双蒸水1min→苏木素溶液5min→水洗1min→1%盐酸酒精1-3s→水洗1min→Scott液（碳酸氢钠0.35g，硫酸镁2g，蒸馏水100mL）1min→水洗1min→伊红溶液3-5min→蒸馏水洗去浮色→70%酒精1s→95%酒精1s→100%酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即封片→通风橱内吹干，显微镜拍照。

心脏梗死比例大小的计算参照公式如下：

梗死比例=心梗区域的左心室心内膜长度/左心室完整心内膜周长×100%；

心肌细胞横截面积统计：每张图片选择3个以上边界清楚，核大致位于中央的细胞，用Image-Pro Plus 6.0软件圈细胞面积。

心脏组织HE染色、梗死比例及心肌细胞横截面积统计结果见图2B。

2.3 天狼星红（PSR）染色

主要步骤为：

55℃烘烤30min→二甲苯2min，3次→100%酒精1min→95%酒精1min→70%酒精1min→流水冲洗10min→双蒸水1min→0.2%磷钼酸2min→0.1%天狼猩红苦味酸溶液滴于组织上，湿盒中染色90min→去除残液→0.01N盐酸4s→70%酒精1次→90%酒精1次→100%酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即盖玻片封片，显微镜拍照。

PSR染色图片统计：左室胶原容积分数比例=胶原面积/总面积×100%。

心脏组织天狼星红染色（红色代表胶原）及左室胶原容积分数比例统计柱状图如图2C。

HE染色结果可见，Sham组心肌排列整齐、细胞质丰富均匀、间质正常；MI组部分心肌细胞核丢失、心肌细胞呈空泡样变、梗死区可见心肌组织紊乱、梗死区心肌细胞消失，代之以纤维瘢痕组织。

WT和Card3-KO小鼠MI模型后的表型结果见图2。Sham组中WT小鼠和KO小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL之间的差异均无统计学意义；WT小鼠MI术后4周的HW/BW、LW/BW、HW/TL高于其Sham组；MI术后4周，Card3-KO小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL均较WT小鼠明显降低（A）。HE染色切片可观察到：大体可见MI术后4周（4W）梗死区明显变薄、成白色且疤痕，高倍显微镜可观察到Sham组心肌肌原纤维细胞排列整齐、致密，形态完整，胞核及核仁结构清晰；MI组肌丝排列紊乱、松散，心肌细胞体积明显增大，形态不规整，胞核深染、增大、畸形，核仁模糊，而KO组则无WT组明显；KO小鼠MI术后心肌梗死比例、心肌细胞横截面积均小于WT小鼠MI组，差异有统计学意义（B）。PSR染色后发现MI组心室心肌间质胶原含量较Sham组增加，胶原增粗，排列紊乱成网络状；KO小鼠MI术后胶原含量较WT小鼠MI术后增加较少；Sham组之间无统计学差异（C）。 

图3是NTG和Card3-TG小鼠MI模型后的表型结果。同样TG小鼠MI术后4周的HW/BW、LW/BW及HW/TL高于其Sham组；MI术后4周TG小鼠的HW/BW、LW/BWL及HW/TL增大的程度明显高于NTG小鼠（A）。HE染色切片表明，Sham组均无明显梗死，MI术后TG小鼠的梗死比例远大于NTG组，MI组较Sham组的心脏均增大，且MI术后TG小鼠心脏增大的程度远大于NTG小鼠，同时可观察到：TG小鼠MI术后心肌细胞横截面积也大于Sham组，同时显著高于NTG小鼠MI组（B）。PSR染色可见，TG小鼠MI术后心肌间质胶原含量远大于NTG小鼠MI组（C）。

【实施例3】  心肌梗死（MI）模型小鼠心功能检测

1 超声检测心功能

1.1 前期准备

（1）麻醉机准备：先连接氧气瓶和麻醉机上的进气接口，再拧开麻醉机上加药口密封盖，迅速加入异氟烷至安全刻度后拧紧密封盖。拧开氧气瓶上总阀门，调整流量控制阀的旋钮，出气压力维持在0.2-0.3mPa。

（2）待测小鼠准备：待检测小鼠用异氟烷迅速麻醉后，左胸前区剃毛，将处理好的小鼠头部伸入麻醉剂导管套头内，以1.5-2.0%异氟烷维持小鼠稳定的麻醉状态。

1.2 心功能检测

小鼠取左侧卧位或仰卧位，并在剃毛区均匀涂抹耦合剂。采用高频超声诊断仪，频率为15MHz，选取标准左心室乳头肌短轴切面，测量小鼠左室舒张末期内径（LVEDd）、左室收缩末期内径（LVESd）、射血分数（EF）及短轴缩短率（FS）。

2 PV检测血流动力学

2.1 前期准备

（1）麻醉机准备：同超声检测心功能部分。

（2）待测小鼠准备：待检测小鼠用异氟烷迅速麻醉后，颈部手术区剃毛，并用湿纱布擦拭去毛。将处理好的小鼠头部伸入麻醉剂导管套头内，以1.5-2.0%异氟烷以维持麻醉深度，避免麻醉过深或过浅。

2.2 PV检测

碘酒及75%酒精消毒后，剪开小鼠颈部皮肤，依次分离肌肉和软组织，并游离出右颈总动脉，于血管下穿过双线并结扎远心端，同时活结结扎近心端。用血管剪在远心端剪一切口（1/3-1/2管径），于体视显微镜下将Millar1.4F超微导管迅速插入右颈总动脉，同时穿一缝线将导管和血管结扎。打开近心端活结，将导管沿右颈总动脉-升主动脉插入左心室内，连接Powerlab生物信号采集处理系统。观察记录仪上波形情况，调节导管的位置使波形图清晰且稳定。监测小鼠的心率（HR）、射血分数（EF）、左室内压最大上升速率（dP/dt max）及左室内压最小上升速率（dP/dt min）等指标。

本研究运用M型超声心动图和血流动力学检测评价心肌肥厚和心功能。由Laplace定理可知：S=Pr/2h，P为心室内压，r为心腔内径，h为心壁厚度。在心脏压力负荷过重的情况下，为适应心脏做功增加，室壁厚度增加，左室室壁应力增加，提高心脏收缩功能起到早期代偿的机制；但持续的压力超负荷，可促进心肌肥厚，导致心肌细胞的坏死及凋亡，心脏的收缩和/或舒张功能受到损害，最终发展为慢性心力衰竭甚或心源性猝死。

图4是WT和Card3-KO小鼠的超声和PV检测结果。与WT Sham组相比，WT小鼠MI术后4周表现出心功能减弱和心肌肥厚。主要表现为反映心肌肥厚的指标LVEDd、LVESd增大，而反映心功能的指标EF、FS则下降。MI术后4周，KO小鼠心肌肥厚的指标增大的程度及反应心功能的指标下降的程度与WT小鼠相比较小。Sham组WT小鼠与KO小鼠的以上指标之间均无统计学差异（A）。通过血流动力学指标的检测，观察到WT小鼠在MI术后4周的EF、dp/dt max和dp/dt min均比其Sham组降低，KO小鼠MI术后EF、dp/dt max和dp/dt min降低的程度较WT组小，且有统计学差异，HR在Sham组和MI组均无明显差异（B）。因此Card3-KO小鼠MI术后较WT组的小鼠心功能明显好转。

图5是NTG和Card3-TG小鼠的超声和PV检测结果。MI术后4周，与NTG小鼠相比，TG小鼠心肌肥厚的指标LVEDd、LVESd增大的程度及反应心功能的指标EF、FS下降的程度则大于NTG组。Sham组NTG小鼠与TG小鼠的以上指标之间均无统计学差异（A）。通过血流动力学指标的检测，观察到MI术后4周NTG小鼠EF、dp/dt max和dp/dt min均比其Sham组降低，TG小鼠MI术后EF、dp/dt max和dp/dt min降低的程度则大于NTG组，差异有统计学意义，HR均无明显差异（B）。因此Card3-TG小鼠MI术后较NTG组的小鼠心功能明显恶化。

上述研究成果表明，Card3基因敲除小鼠在阻断心脏左冠状动脉前降支（LAD）造成心肌缺血中，Card3基因敲除后小鼠心脏梗死比例、心肌肥厚和纤维化的程度明显较WT组小鼠低，而心脏特异性Card3转基因小鼠的心脏梗死比例、心肌肥厚和纤维化的程度明显升高。证明了Card3基因在冠状动脉粥样硬化性心脏病模型中有着重要的恶化作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.Card3作为药物靶标在筛选保护心脏功能的药物中的应用。

2.Card3作为药物靶标在筛选治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的药物中的应用。

3.Card3的抑制剂在制备保护心脏功能的药物中的应用。

4.一种保护心脏功能的药物，其特征在于：包含Card3的抑制剂。

5.Card3的抑制剂在制备治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的药物中的应用。

6.一种治疗主动冠状动脉粥样硬化性心脏病的药物，其特征在于：包含Card3的抑制剂。

7.根据权利要求3或5所述的应用或权利要求4或6所述的药物，其特征在于：所述的Card3的抑制剂为Card3基因的siRNA、Card3基因的RNA干扰载体或Card3的抗体及其他能够抑制Card3表达的抑制剂中的一种。

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