CN103874429A

CN103874429A - 一种酪蛋白的水解产物

Info

Publication number: CN103874429A
Application number: CN201280018820.2A
Authority: CN
Inventors: D·菲茨杰拉德; D·奥沙利文
Original assignee: University of Limerick
Current assignee: University of Limerick
Priority date: 2011-02-17
Filing date: 2012-02-17
Publication date: 2014-06-18
Also published as: EP2675299B1; US20140213762A1; EP2675299A1; EP2489281A1; US20170037442A1; WO2012110652A1

Abstract

本发明公开了由源自曲菌属（真菌）的蛋白水解制剂，对酪蛋白底物可控水解形成酪蛋白水解产物。该可控水解采用了FlavorPro-Whey^TM制剂，水解度（%DH）从5%DH到15%DH。与完整的酪蛋白酸钠相比，水解产物的抗原性减少至少98%，并且苦味值平均值小于30%。本发明还提供了本发明酪蛋白水解产物的低分子量部分，其中基本上没有分子量大于5kDa的多肽。

Description

一种酪蛋白的水解产物

技术领域

本发明涉及乳蛋白酪蛋白的水解产物、生产所述水解产物的方法以及该酪蛋白水解产物作为低抗原性和中性香味食品添加剂的用途。

背景技术

酪蛋白水解产物是众所周知的食品添加剂，其一般通过水解酪蛋白底物通常是酪蛋白酸钠制备的，水解采用食品级蛋白水解/多肽水解（peptideolytic）制备至20%DH或更高的水解度。迄今为止所采用的高水解度是由生产具有可接受的感官特征，同时还提供低抗原性的酪蛋白水解产物所要求的，后者是酪蛋白水解产物用于婴儿配方食品中食品添加剂，以及免疫功能低下或老年病人个体的食品的关键要求。现存的酪蛋白水解产物存在一个问题，特别是那些广泛水解的酪蛋白水解产物，所得的水解产物或是不具有所需的降低抗原性，或是水解产物是苦的，或两者都有。数十年来，食品工业被生产具有可接受的苦味值以及大大地降低抗原性所难倒。

乳清（whey）水解产物与酪蛋白水解产物相比,具有不同的苦味特性。例如，以一给定水解度，特别是以20%或更低的水解度制备的乳清水解产物会具有比以相同水解度制备的酪蛋白水解产物明显低的苦味。FlavorPro-Whey^TM蛋白水解/多肽水解制剂（Biocatlaysts公司）是生产乳清水解产物所用以及为源自乳清的奶制品去苦味所用的食品级酶制剂。

EP2258208描述了使用Alcalase^TM水解酪蛋白酸钠得到的酪蛋白水解产物，并且其采用的水解度（%DH）从1到20%DH。与未水解的酪蛋白相比，发现所得的水解产物具有大大减少的抗原性，但是也具有不可接受的苦味（参见下面图5的比较例）。

本发明的一个目的是克服以上提到的关于酪蛋白水解产物的至少一个问题。

发明内容

根据本发明，提供了由源自曲霉属（真菌）的蛋白水解制剂可控水解酪蛋白底物形成酪蛋白水解产物。理想地，该可控水解采用FlavorPro-Whey^TM制剂。FlavorPro-Whey^TM蛋白水解/多肽水解制剂是从英国威尔士的Biocatlaysts有限公司购买的食品级蛋白水解/多肽水解制剂。我们发现，酪蛋白，例如酪蛋白盐在5-15%DH条件下水解生产出的水解产物具有低抗原性。出乎意料地，还发现该水解产物具有低的苦味。与根据EP2258208形成的水解产物相比，其采用Alcalase^TM来水解酪蛋白，而我们发现，本发明的水解产物具有大大减少的苦味值（参见图5，对比了Alcalase^TM的粗水解产物（苦味值=49）和FlavorPro^TM的粗水解产物（苦味值=17），同时抗原性具有可比的减少。

与完整的酪蛋白酸钠相比，该水解产物通常具有抗原性相对的降低，优选地，至少50、 100、200、300、400、450、500、600、700或750倍。词语“抗原性相对降低”指的是使用以下描述的方法，采用多克隆兔抗血清的ELISA方案测定到抗原性减少。例如，参考图1，与对照（完整的酪蛋白酸钠）相比，样品（水解产物）的抗原性降低56.23倍，相当于抗原性减少98.22%。因此，与完整的酪蛋白酸钠相比，该水解产物的抗原性减少至少98%、98.2%、98.4%、98.6%、98.8%、99%、99.2%、99.4%、99.6%、99.8%或99.9%。

在另一个实施例中，通常，与完整的酪蛋白酸钠相比，该水解产物的log抗原性减少至少1.5、1.7、2.5、2.7、2.8或2.9。词语“log抗原性相对减少”指的是使用以下描述的方法，采用多克隆兔抗血清的ELISA方案测定到抗原性减少。例如，参考图1，与对照（完整的酪蛋白酸钠）相比，样品（水解产物）的log抗原性减少1.75，相当于抗原性减少98.22%。

优选地，使用以下描述的苦味值评分方法测定该水解产物的苦味值平均值小于30%，其中，该评分方法中的100%苦味值相当于1g/L的咖啡因水溶液，而0%苦味值相当于Ballygowan^TM的无气矿泉水。理想地，该水解产物的苦味值平均值小于29%、28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%或18%。

我们发现，本发明的酪蛋白水解产物具有减少的抗原性，以及低的苦味值。这是令人惊讶的，因为没有想到水解酪蛋白到%DH为15%或更少会提供具有观察到的低水平抗原性，同时也具有中性的口味（参见下图图1和图5）。不受理论限制，我们相信这些贡献是由于选择了源自曲菌属的蛋白水解制剂和相对低的%DH，迄今为止，该蛋白水解制剂被用于生产乳清水解产物。

本发明还涉及一种酪蛋白水解产物，其特征在于通过水解酪蛋白底物，例如酪蛋白盐形成，水解度从5%DH到15%DH，理想地，使用源自曲菌属的蛋白水解制剂，例如该源自曲菌属的蛋白水解制剂包括源自曲菌属的丝氨酸蛋白酶和源自曲菌属的钙依蛋白酶，理想地，是FlavorPro-Whey^TM蛋白水解/多肽水解制剂，以及理想地，其特征在于，根据它们的分子量，包括覆盖以下分布的多肽：

＞10kD-0到30%

5-10kD-0.1到8%

＜5kD-60到99.7%。

本发明还涉及具有基本上与图10所示类似的多肽数据的酪蛋白水解产物，或基本上包含所有图10所示的多肽。在这个方面，词语“基本上类似”或“基本上包含所有”应当理解为包括至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的图10的酪蛋白多肽——序列号46到88（例如，包括43个多肽中的35个）。

本发明还提供了本发明酪蛋白水解产物的低分子量部分，其中所述低分子量部分是基本上没有分子量大于7kDa、6kDa、5kDa、4kDa或3kDa的多肽或蛋白。优选地，该低分子量部分是基本上没有分子量大于7kDa的多肽或蛋白。更优选地，该低分子量部分是基本上没有分子量大于6kDa的多肽或蛋白。理想地，该低分子量部分是基本上没有分子量大于5kDa的多肽或蛋白。出乎意料的，我们发现，与粗水解产物相比，将中和高分子量的多肽和蛋白部分去除会使滤液的抗原性减少高达千倍，同时保持粗水解产物的低苦味性质。例如，参见以下图2和图5。根据本发明，通过制备粗水解产物，然后分离出所需范围的多肽/蛋白，例如通过超滤，可获得该低分子量部分。

因此，在一个实施例中，本发明涉及酪蛋白水解产物的低分子量部分，其特征在于通过水解酪蛋白底物，例如酪蛋白盐形成，水解度从5%DH到15%DH，理想地，使用源自曲菌属的蛋白水解制剂，例如该源自曲菌属的蛋白水解制剂包括源自曲菌属的丝氨酸蛋白酶和源自曲菌属的钙依蛋白酶，理想地，是FlavorPro-Whey^TM蛋白酶制剂，以提供粗水解产物，然后从该水解产物中分离出分子量大于7kD、6kD或5kDa的多肽和蛋白，从而提供低分子量部分。理想地，该低分子量部分的进一步特征在于，根据它们的分子量，包含覆盖以下分布的多肽：

＞10kD–0到1%，理想地，0到0.1%

5-10kD–0.1到1%，理想地，0到0.9%

小于5kD–98到99.9%，理想地，99到99.9%。

本发明还涉及本发明酪蛋白水解产物的低分子量部分，其多肽数据基本上与图9所示的类似，或基本上包含所有图9所示的多肽。在这个方面，词语“基本上类似”或“基本上包含所有”应当理解为包括至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的图9的酪蛋白多肽——序列号1到46和55（例如，包括47个源自酪蛋白的多肽中的40个）。

本发明还涉及包含酪蛋白水解产物或其低分子量部分的固体状（即，粉末、片状、颗粒）或液体状的婴儿配方食品，任选地，本发明的婴儿配方食品进一步包括一种或多种碳水化合物源（如，乳糖）、维生素、矿物质和其他食品蛋白水解产物。婴儿配方食品的配方是本领域技术人员所熟知的，并且在EP0631731和WO2006/130204中有描述。

本发明还涉及酪蛋白或其低分子量部分的用途，如其在婴儿、老年病人或免疫功能低下个体的食品中，或运动营养食品配方中的用途。

本发明还涉及食品添加剂，特别是具有低抗原性和无苦味的食品添加剂，其包含本发明的酪蛋白水解产物或其低分子量部分。

本发明还涉及生产酪蛋白水解产物的方法，通常，该类酪蛋白水解产物与完整的酪蛋白酸钠相比，抗原性相对降低至少50，并且苦味值小于30%、25%或20%，该方法包括水解酪蛋白底物的步骤，水解度从5%DH到15%DH，理想地，从9%DH到15%DH，使用源自曲菌属的蛋白水解制剂，例如该源自曲菌属的蛋白水解制剂包括源自曲菌属的丝氨酸蛋白酶和源自曲菌属的钙依蛋白酶，理想地，是FlavorPro-Whey^TM蛋白水解/多肽水解制剂。

本发明还涉及生产酪蛋白水解产物的低分子量部分的方法，其中，该低分子量部分基本上没有分子量大于7kDa、6kDa、5kDa、4kDa或3kDa的多肽，以及通常地，与完整的酪蛋白酸钠相比，抗原性相对降低至少50倍，并且苦味值小于30%，该方法包括水解酪蛋白底物的步骤，水解度从5%DH到15%DH，使用源自曲菌属的蛋白水解制剂，例如该源自曲菌属的蛋白水解制剂包括源自曲菌属的丝氨酸蛋白酶和源自曲菌属的钙依蛋白酶，理想地，是FlavorPro-Whey^TM蛋白酶制剂，以提供粗水解产物，并从该水解产物中采用分离方法分离以分别提供基本上没有分子量大于7kD、6kD、5kDa、4kDa或3kDa的多肽的酪蛋白水解产物。

本发明还涉及一种生产去苦味的酪蛋白水解产物的方法，所述方法包括使用源自曲菌属的蛋白水解制剂水解酪蛋白底物的步骤，水解度（%DH）从5%DH到15%DH。适当地，该源自曲菌属的蛋白水解制剂是FlavorPro-Whey^TM蛋白酶制剂。理想地，水解酪蛋白底物的水解度（%DH）是从9%DH到15%DH。词语“去苦味的”应当理解为具有苦味值小于30%。

附图说明

图1是显示了一系列实验室规模的酪蛋白水解产物的抗原性值的表，包括本发明的四种酪蛋白水解产物-a%样品残留抗原性通过将完整的酪蛋白酸钠抗原性（给出标称值为1）除以样品中相对减少的抗原性（第3列），并将该分数乘以100以获得与完整NaCN的抗原性相比样品中的残留抗原性%。抗原性减少%通过100%（完整NaCN的抗原性）减去残留活性%得到。

实例-6.46%DH样品

样品残留抗原性%=(1/56.23)×100%=1.7784%≈1.78%

样品抗原性减少%

相对于完整NaCN的抗原性=100%-1.78%=98.22%

即，除去了98.22%的抗原性=减少了1.75log=相对减少了56.23%；

图2是比较了本发明酪蛋白水解产物（粗水解产物-14.16%DH）与粗水解产物的低分子量部分（5kD滤液部分（permeate fraction））的抗原性值的表-a%样品残留抗原性通过将完整的酪蛋白酸钠抗原性（给出标称值为1）除以样品中相对减少的抗原性（第3列），并将该分数乘以100以获得与完整NaCN的抗原性相比样品中的残留抗原性%。

抗原性减少%通过100%（完整NaCN的抗原性）减去残留活性%得到。

实例-5kD滤液部分

样品残留抗原性%=(1/1000000)×100%=0.0001%

样品抗原性减少%

相对于完整NaCN的抗原性=100%-0.0001%=99.9999%

即，除去了99.9999%的抗原性=减少了6log=相对减少了1000000；

图3是显示了完整的酪蛋白酸钠、本发明的酪蛋白水解产物（粗水解产物-14.16%DH）以及粗水解产物的低分子量部分（5kD渗透部分）的分子量分布情况的表；

图4是显示了本发明实验室规模酪蛋白水解产物、本发明中试规模酪蛋白水解产物和中试规模酪蛋白水解产物的低分子量部分（5kD渗透）的氮溶解指数的表；

图5是对比（a）商业产品酪蛋白水解产物（比较例）、（b）Alcalase^TM酪蛋白水解产物（比较例）、（c）Alcalase^TM酪蛋白水解产物的低分子量部分（比较例）、（d）本发明酪蛋白水解产物（14.16%DH）以及（c）本发明酪蛋白水解产物的低分子量部分的平均苦味值的图；

图6是显示了随pH值变化，使用FlavorPro Whey^TM酶制剂以不同%DH值制备的酪蛋白酸钠水解产物的氮溶解指数函数图；

图7是显示了随pH值变化，使用FlavorPro Whey^TM以不同%DH值制备的酪蛋白酸钠水解产物的热凝固时间（HCT）函数图；

图8A和8B是（a）半中试规模HavorPro Whey^TM制备的粗水解产物（14.16%DH）、（b）（a）的低分子量部分（5kD渗透）和（c）实验室规模FlavorPro Whey^TM制备的粗水解产物（10.76%DH）在4℃（图8A）和20℃（图8B）、660nm下的透光度曲线；

图9是显示了FlavorPro Whey^TM制备的本发明14.16%DH酪蛋白水解产物的低分子量部分（＜5kD）多肽的序列和分子量数据图，其中Alpha S1多肽1-23对应于序列号1-22和55，Alpha S2酪蛋白多肽1-9对应于序列号23-31，Beta酪蛋白多肽1-12对应于序列号32-43，以及Kappa酪蛋白多肽1和2对应于序列号44和45；

图10是显示了FlavorPro Whey^TM制备的本发明14.16%DH酪蛋白水解产物多肽的序列和分子量数据图，其中Alpha S1多肽1-19对应于序列号46-64，Alpha S2酪蛋白多肽1-7对应于序列号65-71，以及Beta酪蛋白多肽1-12对应于序列号72-83。

具体实施方式

本发明提供一种酪蛋白水解产物，以及其作为食品添加剂的用途，通常地但不限制于例如，婴儿配方食品、老年病人食品产品、运动和营养食品和补充品、饮料以及免疫功能低下个体的食品产品。所述酪蛋白水解产物是使用源自曲霉属真菌的蛋白水解/多肽水解制剂，对酪蛋白底物的可控水解（例如，水解度达到大约5%DH到15%DH）形成的。理想地，该可控水解采用FlavorPro-Whey^TM蛋白水解制剂。图10中显示了本发明酪蛋白水解产物中的低分子量多肽数据，以及附加了序列表。本发明还提供本发明酪蛋白水解产物的低分子量部分，以及其作为食品添加剂的用途，通常用于婴儿配方食品、老年病人食品产品、运动和营养食品和补充品以及免疫功能低下个体的食品产品。与酪蛋白酸钠和酪蛋白酸钠水解产物相比，以下显示了本发明酪蛋白水解产物的低分子量部分具有大大减少的抗原性。图9中显示了本发明酪蛋白水解产物中多肽的数据，以及附加了序列表。

词语“低分子量部分”应当理解为水解产物中基本上没有分子量大于7kDa、6kDa以及理想地，5kDa的多肽。一般地，这通过分离本发明的水解产物以去除分子量大于界定值，即5kD的多肽或蛋白，而保留透过的多肽或蛋白。在一个实施例中，该低分子量部分是基本上没有分子量大于4kDa、3.5kDa以及理想地，3kDa的多肽。去除分子量大于特定界定值的多肽或蛋白部分的方法是本领域中众所周知的，例如超滤和透析。

词语“基本上没有分子量大于XkDa的多肽”应当理解为水解产物包含少于2%（占水解产物中所有多肽的重量）的分子量大于XkDa的多肽或蛋白，以及理想地，少于1.5%或1%（w/w）的分子量大于XkDa的多肽或蛋白。在这个方面，应该注意，本发明的水解产物及其部分可包含微量的来源于其它乳蛋白的多肽，例如，乳球蛋白。

在本说明书中，词语“可控水解”应当理解为将酪蛋白底物水解至水解度高达15%（15%DH），优选地，高达14%DH、13%DH或12%DH。理想地，这个词语应当理解为水解度至少为5%DH、6%DH、7%DH、8%DH、9%DH或10%DH。在一个实施例中，这个词语应当理解为%DH是从5%DH到15%DH，6%DH到14%DH，7%DH到13%DH，或8%DH到12%DH。

%DH是采用下面描述的技术测量的。

词语“源自曲菌属的蛋白水解制剂”应当理解为一种源自曲菌属真菌的蛋白酶或蛋白酶制剂，例如，米曲霉。具有合适的蛋白酶活性的例子包括源自曲菌属的丝氨酸蛋白酶，以及源自曲菌属的钙依蛋白酶。在一个实施例中，该蛋白水解制剂采用多于一种的蛋白酶，例如，至少两种、三种、四种或五种蛋白酶。在一优选实施例中，采用源自曲菌属的丝氨酸蛋白酶和源自曲菌属的钙依蛋白酶。理想地，所述源自曲菌属的蛋白酶包含FLAVORPRO-WHEY^TM家族的蛋白酶制剂，例如，FLAVORPRO-WHEY^TM750-P或FLAVORPRO-WHEY^TM192-P。

所述酪蛋白底物通常包含一酪蛋白盐，例子是本领域技术人员熟知的，包括酪蛋白酸钠。在一优选实施例中，酪蛋白底物是乳酪蛋白（milk casein），理想地牛乳酪蛋白。通常，酪蛋白底物（和/或酪蛋白水解产物）基本上没有（即，少于5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.2%、0.1%（w/w））其他乳蛋白，例如乳清蛋白。水解采用的酪蛋白底物通常具有5-15%、8-12%，以及理想地，大约9-11%（w/v）的浓度。

通常，蛋白酶与酪蛋白底物（w.w）的比是从0.1到1.0%，优选地，0.2到0.8%，更优选地0.4到0.6%，以及理想地，大约0.6%。（0.625-0.658%（w:w）-参见水解产物的生成部分）。通常，采用的蛋白酶活性为＞55酪蛋白酶单位/g。

适当地，使用蛋白酶的酪蛋白底物水解在温度从45℃到55℃下进行，优选地，从49℃到51℃，以及理想地，大约50℃。通常，使用蛋白酶的酪蛋白底物水解在pH值从5到9时进行，适当地，pH值从5.5到8，优选地，pH值从6到8，以及理想地，大约为7。

在一优选实施例中，本发明的酪蛋白水解产物的多肽数据与图10中显示的基本上类似。在这个方面，词语“基本上类似”应当理解为包括至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的图10的酪蛋白多肽-序列号46到83（例如，包括图10中38个多肽中的35个）。

在一优选实施例中，本发明的酪蛋白水解产物的低分子量部分的多肽数据与图9中显示的基本上类似。在这个方面，词语“基本上类似”应当理解为包括至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的图9的酪蛋白多肽-序列号1到45和55（例如，包括图9中46个源自酪蛋白的多肽中的40个）。

因此，在一个优选的实施例中，本发明提供了酪蛋白水解产物的一低分子量部分，其由源自曲菌属的丝氨酸蛋白酶和源自曲菌属的钙依蛋白酶混合物，优选地，由FlavorPro Whey^TM蛋白酶制剂水解乳（通常地，牛乳）酪蛋白底物形成，水解度为5%DH到15%DH，6%DH到14%DH，7%DH到13%DH，或8%DH到12%DH，其中，水解产物基本上没有分子量大于5kDa的多肽。

在另一个实施例中，本发明提供了一酪蛋白水解产物，其由源自曲菌属的丝氨酸蛋白酶和源自曲菌属的钙依蛋白酶混合物，优选地，由FlavorPro Whey^TM蛋白酶制剂水解乳（通常地，牛乳）酪蛋白底物形成，水解度为8%DH到14%DH，其中水解产物基本上没有分子量大于7kDa、6kDa或理想地，5kDa的多肽。

本发明还涉及脱水形式的本发明的酪蛋白水解产物，例如粉末状的。将本发明酪蛋白水解产物脱水的方法是本领域技术人员所熟知的，包括流化床干燥、滚筒干燥和喷雾干燥。

优选地，根据分子量，本发明的酪蛋白水解产物包含覆盖以下分布的多肽：

＞10kD-0到30%

5-10kD-0.1到8%

＜5kD-60到99.7%。

优选地，根据分子量，本发明的酪蛋白水解产物的低分子量部分包含覆盖以下分布的多肽：

＞10kD-0到1%

5-10kD-0.1到1%

＜5kD-98到99.9%。

实验方法及材料

水解产物的生成-实验室规模

酪蛋白酸钠（NaCN，蛋白85.92%w/w）由爱尔兰蒂珀雷里的Arrabawn Co-op Society有限公司提供。水解实验前一天，将适当量的NaCN粉末加入到4.5L的蒸馏水中，制备9.3%（w/v）的NaCN溶液（4.8L）。在密闭的反应容器内，50℃下使用Heidolph顶置式搅拌器温和搅拌2到3小时进行蛋白水解，然后在4℃下保存过夜。第二天，将这些溶液细分成不同的等份，以生成不同DH值的水解产物。

表1使用FlavorPro Whey制备NaCN水解产物

样品水解度（%）	^*E:S之比，%
		0（完整的NaCN）	-
0.40	0.031
		1.35	0.313
2.50	0.625
		6.46	“
7.54	“
		9.66	“
10.76	“

^*%（w:w）=酶粉末/NaCN蛋白的质量的%

采用不同的E:S比值生成具有不同DH值的酪蛋白水解产物。采用0.625%（w:w）的E:S比值生成10.76%DH的FlavorPro Whey水解产物（表1）。

在加入商业产品的蛋白水解制剂时，蛋白溶液的pH值采用Titrino718pH统计滴定仪保持恒定为7。水解NaCN溶液的温度保持在50℃。将水解产物样品的温度提升到80℃，并保持在这一温度20分钟，从而减除蛋白水解的活性。

水解产物的生成-半中试规模

在一密封的300L水套罐中，在pH为7、温度为50℃条件下，使用Silverson高剪切混合搅拌器混合制备300L8.85%（w/v）NaCN溶液。将FlavorPro Whey（174.70g）加入到搅拌的溶液中，酶粉末:底物（E:S）比值为0.658%（w:w）。溶液在50℃下，300L的罐中孵育4小时，并且pH值通过加入NaOH保持在7.0。将300L溶液的温度提升到80℃，并保持在这一温度20分钟，从而减除蛋白水解的活性。使用Niro Minor喷雾干燥器来喷雾干燥一等份的水解产物。然后，剩余的粗水解产物溶液冷却到5℃，并保存过夜。第三天早上，将该溶液重新加入到50℃，然后通过安装在DSS MemProc膜过滤单元上的5kDa有效截留分子量的膜进行超滤来澄清。然后，使用Niro Minor喷雾干燥器来喷雾干燥所得滤液和保留物。

使用TNBS来定量水解度

用1%（w/v）SDS将等份的NaCN水解产物稀释成含～0.09%或0.05%（w/v）的蛋白，并在80℃加热20分钟，以完全分散水解的蛋白。然后，使用如Spellman等人（2003）描述的Adler-Nissen的TNBS法（1979）测量NaCN水解产物的水解度（DH，%）。

残留抗原性

使用三文治形式的酪蛋白ELISA方案来定量，采用多克隆兔IgG（血清纯化得到）抗未水解的酪蛋白酸钠。将纯化的IgG固着在标准的中结合力的96微孔板上，并且结合辣根过氧化物酶（HRP）来制备“抗体偶联体”。为获得校准用标准，使用用于免疫兔子的酪蛋白酸钠来构建校准曲线。该校准曲线的范围在10ng/m/L和10000ng/m/L之间，该曲线以数据的1到4Log ng/mL来描点绘制。使用多克隆兔抗血清来分析NaCN水解产物样品的等份完整酪蛋白的残留抗原性。基于样品的蛋白含量，制备浓度10mg/mL、1mg/mL、0.1mg/mL和.01mg/mL（7、6、5、4Log ng/mL）。绘制随Log蛋白浓度变化的ELISA读数（A450/600）曲线来确定完整酪蛋白的残留抗原性相对减少量。

凝胶渗透色谱法和分子量分布

基本上如Spellman等人（2005）描述的，使用Waters HPLC系统进行凝胶渗透HPLC（GP-HPLC）。由标准蛋白和多肽的平均保留时间来绘制校准曲线（Smyth和FitzGerald，1998）。分子量分布图通过使用Breeze^TM第3.30版软件整合GP-HPLC色谱图来生成，使用对应于5000Da和10000Da的保留时间将色谱图分成3个部分：0-5000Da、5000-10000Da和＞10000Da。每个部分的整合区域用在214nm处获得的整个色谱图的该整合区域的百分率表示。

苦味评价

用无气矿泉水（Ballygowan）制备水解产物样品，蛋白质当量为4.5g/L，随机分配给10人感官测试小组，每人三份。小组成员经过训练，可检测和定量用无气矿泉水溶解的咖啡因的苦味。训练小组成员确定未知溶液的苦味值，基于0-100%的等级，其中100%的苦溶液是与1g咖啡因/L苦味值等同的。无气矿泉水用作0苦味标准。在每一个座位上，提供给小组成员0.00、0.25、0.50、0.75和1.00g咖啡因/L的溶液，它们标记为0、25、50、75和100，以及测试的水解产物。为了让小组成员熟悉0、25、50、75和100溶液的味道强度，首先要求他们尝试。然后，要求他们尝试水解产物，并基于他们尝试0、25、50、75和100溶液的味道强度的评级，接着对测试的水解产物的强度在100内评级。在尝试每个苦味标准品和水解产物之间，要求小组成员吃一块不加盐的饼干，并用无气矿泉水彻底漱口（Spellman等人（2005））。结果通过苦味值均值±平均数标准误差（SEM）表示。

氮溶解指数的测定

本试验基本上根据Flanagan和FitzGerald（2002）来进行。离心（1620×g；15分钟）4g100g^-1蛋白水溶液，然后使用凯氏定氮法（IDF，1993）来修饰上清液，测定上清液的氮。采用凯氏定氮片而非硫酸钾和硫酸铜，并且在滴定步骤的最后达到pH为4.6。所有的氮溶解度分析都进行两次。

测试样品的质谱特征

在装备有一电喷射离子源的MicrOTOF II质谱仪（德国不来梅港市道尔顿公司），由MicrOTOF控制软件（版本2.3，道尔顿公司）控制进行MS和串联MS试验。获得的数据的质量/电荷（m/z）范围是300-2500。获得全扫描质谱图后，对在MS扫描中存在的5个信号最强的母离子进行碰撞诱导解离（CID）来进行串联质谱分析。电喷射条件如下：毛细管温度130℃；毛细管电压-1500V；干燥气流速，6.0L min^-1。使用数据分析软件（版本4.0，道尔顿公司），BioTool（版本3.1，道尔顿公司）以及MASCOT（Perkins等人，1999）来对多肽序列进行数据处理和评估。

清晰度确定

基本上如Sin等人（2006）描述那样，在室温（20℃）和储存温度（4℃）下，用蒸馏水作为空白，测定水解产物水溶液在660nm处的吸光度。

热稳定性的确定

采用0.1M和1M的HCl或NaOH将各等份NaCN水解产物水溶液（2.0%（w/v）的pH值调整到在2.0和8.0之间。然后，将样品置于室温中至少1小时来平衡。然后，如果需要的话，在热稳定性分析前重新测量和调整样品的pH值。最终pH调整后，马上将样品（2mL）放置于玻璃管（10mm，内部尺寸（i.d.）120mm，爱尔兰都柏林AGB Scientific），用硅树脂塞密封，浸入140℃恒温控制的油浴（Elbanton BV，荷兰Kerkdriel）中，在电动机转速设定为3时连续震荡。在将样品放置到油浴中和凝聚开始之间的热凝固时间长以分钟计算（Ryan等人，2004）。这些分析进行三次。

本发明不限于上文详细描述的实施例，其在不违背本发明精神的情况下，可在结构、细节和工艺步骤上进行变化。

参考文献

Adler-Nissen J(1979).Determination of the degree of hydrolysis of food protein hydrolysates by trinitrobenzenesulfonic acid.Journal of Agricultural and Food Chemistry27:1256-1262

Flanagan,J.and FitzGerald,R.J.(2002).Physicochemical and nitrogen solubility properties of Bacillus proteinase hydrolysates of sodium caseinate incubated with transglutaminase pre-and post-hydrolysis.J.Agric.Food Ckem.50(19):5429-5436.

IDF.(1993).Block Digestion(Macro)Method.International Standard20B,Part2.Brussels, Belgium:International Dairy Federation

Perkins,D.N.,Creasey,D.M.and Cottrell,J.S.(1999).Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data.Electrophoresis,20，3551-3567.

Ryan,M.,McEvoy,E.,Duignan,S.,Crowley,C.,Fenelon,M.O’Callaghan,D.M.and FitzGerald,R J.(2008).Thermal stability of soy protein isolate and hydrolysate ingredients.Food Chem.108:503-510.

Sin,H.N.,Yusof,S.,Hamid,N.Sheikh Abdul and Rahman,R.Abd.(2006).Optimization of enzymatic clarification of sapodilla juice using response surface methodology.Journal of Food Engineering73:313-319.Smyth M&FitzGerald R.J.1998.Relationship between some characteristics of WPC hydrolysates and the enzyme complement in commercially available proteinase preparations.Int Dairy Journal8:819-827

Spellman,D.O′Cuinn,G.and FitzGerald,R.J.(2005)Physicochemical and sensory characteristics of whey protein hydrolysates generated at different total solids levels.J.Dairy Res.72:138-143.

Spellman D,McEvoy E,O′Cuinn G&FitzGerald RJ(2003).Proteinase andexopeptidase hydrolysis of whey protein:Comparison of the TNBS,OPA and pH stat methods for the quantification of degree of hydrolysis.International Dairy Journal 13:447-453 。